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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft eine wirksame Behandlung zu Verbesserung der
Funktion des ischämischen und
wieder durchbluteten Gehirns.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Schlaganfälle oder
zerebrovaskuläre
Zwischenfälle
sind das Ergebnis einer akuten Verstopfung des zerebralen Blutflusses
zu einem Bereich des Gehirns. Es gibt ungefähr 500.000 Vorfälle jährlich in
den Vereinigten Staaten, von denen 30 % tödlich verlaufen. Damit ist
der Schlaganfall die dritthäufigste
Todesursache in den Vereinigten Staaten. Ungefähr 80 % der Schlaganfälle sind "ischämisch" und resultieren
aus einer akuten Verstopfung einer Zerebralarterie (normalerweise
ein Gerinnsel oder ein Thrombus) und einer damit einher gehenden
Verringerung des Blutflusses. Die verbleibenden Fälle sind "hämorrhagisch" und sind auf ein Zerreißen einer
Zerebralarterie mit Blutung in das Hirngewebe und daraus resultierender
Hemmung des Blutflusses aufgrund einer lokalen Gewebekompression
zurückzuführen, was
zu einer Ischämie
führt.
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Der
Schlaganfall betrifft normalerweise Individuen, die älter als
65 Jahre sind, und der wichtigste Risikofaktor ist Bluthochdruck.
Es gibt jedoch weitere bedeutende Risikofaktoren, von denen der
wichtigste Diabetes mellitus ist, der zu einem zwei- bis dreifach
erhöhten
Risiko führt
und mit einer steigenden Mortalität und Morbidität nach einem
Schlaganfall assoziiert ist. Darüber
hinaus liegen Hinweise darauf vor, dass eine Hyperglykämie als
solche (ob mit Diabetes assoziiert oder nicht) mit einer steigenden
durch Schlaganfall bedingten Mortalität und Morbidität korreliert
ist, obwohl die kausale Beziehung und die zugrundeliegenden Mechanismen
umstritten bleiben.
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Bis
vor kurzem gab es keine zugelassene Therapie für einen akuten Schlaganfall.
Dieser wurde lediglich durch eine allgemeine medizinische Versorgung
gefolgt von einer Rehabilitation des beobachteten Schadens behandelt.
Im Jahre 1996 erteilte die FDA die Zulassung für die Verwendung von Gewebe-Plasminogenaktivator
(tissue plasminogen activator, tPA) als Therapie bei einem akuten
ischämischen
Schlaganfall, wobei die Zulassung auf einer begrenzten Anzahl von
kontrollierten Untersuchungen basierte. Einige (jedoch nicht alle)
der Untersuchungen ergaben eine 30-55%ige Verbesserung im Hinblick
auf das klinische Ergebnis, wobei insgesamt eine Verringerung der
Mortalität
und Morbidität
erzielt wurde. Dieser Gesamtnutzen wurde erzielt, obwohl ein deutlich
verstärktes
Risiko für
eine intrakraniale Blutung auftrat (6,4 % in tPA-behandelten vs.
0,64 % in Placebo-behandelten Gruppen), von denen die Hälfte tödlich verliefen.
Aufgrund von Sicherheitsbedenken und aufgrund einer wechselhaften
Wirksamkeit ist die thrombolytische Therapie mit tPA von Medizinern, die
den akuten ischämischen
Schlaganfall behandeln, nicht allgemein anerkannt worden. Gegenwärtig ist
die thrombolytische Therapie auf große Zentren beschränkt, die
eine spezialisierte Expertise in Bezug auf die Behandlung des akuten
Schlaganfalls haben, und sie ist auf Patienten beschränkt, die
auf bei einem CT-Scan keinerlei Hinweis auf einen großen Infarkt
zeigen, weniger als 70 Jahre alt sind und keine wesentlichen Beschwerden
(einschließlich
Diabetes) aufweisen. Im Ergebnis erhalten lediglich ungefähr 1,5 %
der Patienten, die Kandidaten für
die tPA-Therapie sein könnten,
diese tatsächlich.
Es ist wahrscheinlich, dass sich diese Situation verbessern wird,
da sich die klinische Erfahrung hinsichtlich ihrer Verwendung vermehrt,
und die Untergruppe der Patienten, die am wahrscheinlichsten von
dieser profitiert, klarer definiert ist. Darüber hinaus gibt es zunehmende
Hinweise darauf, dass die spontane Reperfusion nach einem ischämischen
Schlaganfall das Ergebnis verbessert, was wieder um die Logik einer
Implementierung der Reperfusionstherapie unterstützt.
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Aus
diesen Erwägungen
heraus ist es ersichtlich, dass es ein enormes ungestilltes Bedürfnis nach neuen
wirksamen Therapien für
den akuten Schlaganfall gibt. Dies hat eine intensive Suche zur
Identifizierung von Strategien ausgelöst, die während des Zeitraums einer Ischämie (entweder
aufgrund eines ischämischen oder
eines hämorrhagischen
Schlaganfalls) für
eine Neuroprotektion sorgen können,
sowie von Therapien, die eine Reperfusionsverletzung nach Revaskularisierung
bei ischämischen
Schlaganfällen
vermeiden. Ziel ist es, Neuronen in der sogenannten ischämischen
Penumbra, die das Zentrum des Infarkts umgibt, zu erhalten. Kandidatensubstanzen
stammen aus drei Hauptgruppen: exzitotoxische Inhibitoren; Inhibitoren
der Leukozytenadhäsion;
und neurotrophische Faktoren. In der ersten Gruppe richten sich
die wesentlichen Bemühungen
auf die Blockierung der Wirkung des exzitotoxischen Neurotransmitters
Glutamat, wobei hauptsächlich
die NMDA-Klasse des Glutamatrezeptors blockiert wird. Andere Strategien
umfassen die Blockierung von Na+-Kanälen und
Ca2 +-Kanälen sowie
die Beseitigung von Stickoxid.
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Die
zweite Strategie (die Blockierung der Leukozytenadhäsion) basiert
auf der Annahme, dass Neutrophile und Monozyten signifikant zur
Reperfusionsverletzung und zur Ausweitung des Infarkts beitragen,
und dass diese durch Verabreichung von Inhibitoren relevanter Adhäsionsmoleküle und inflammatorischer
Zytokine am Eintritt in die ischämische
Zone gehindert werden können
(Jean et al., 1998).
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Die
dritte Strategie betrifft die Verabreichung von neurotrophischen
Faktoren, die Neuronen schützen, indem
sie sowohl während
des Zeitraums der Ischämie
als auch während
des Zeitraums der Reperfusion für eine
allgemeine tropische Unterstüt zung
sorgen. Von dieser Gruppe umfasst sind Substanzen sind der basische
Fibroblastenwachstumsfaktor und Insulin. Zahlreiche Untersuchungen
haben gezeigt, dass Insulin starke neuroprotektive Wirkungen in
einer Vielzahl von Modellen für
den Schlaganfall ausüben
kann. Die Verwendung von Insulin wird jedoch durch die Ungewissheit
in Bezug auf die neurotoxischen Wirkungen einer Hyperglykämie, den
möglichen
Nutzen einer schwachen bis moderaten Hyperglykämie, und die möglicherweise
tödlichen Wirkungen
einer schweren Hyperglykämie
erschwert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung läßt sich
beobachten, dass es ein tatsächliches
und andauerndes Bedürfnis
nach einer wirksamen Behandlung zur Verbesserung der Funktion des
ischämischen
und des wieder durchbluteten Gehirns gibt. Das primäre Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es, diesem Bedürfnis nachzukommen.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, das ischämische oder
das wieder durchblutete Gehirn nach einem akuten Gehirnschlag oder
nach einer Blutung mit GLP-1 oder mit biologisch aktiven Analoga davon
zu behandeln, um die Sekretion von Insulin zu optimieren, die Wirksamkeit
von Insulin bei der Unterdrückung
des Glucagon-Antagonismus zu verstärken, und um eine Euglykämie oder
eine milde Hypoglykämie ohne
Risiko für
eine schwere Hypoglykämie
beizubehalten.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die oben
genannten Ziele mit einer Verbindung zu erreichen, die kein Risiko
für eine
schwere Hypoglykämie
darstellt, und die eine Hyperglykämie korrigieren kann.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Behandlung
mit einer biologisch aktiven Verbindung bereitzustellen, die keinerlei
Risiko für
Nebenwirkungen beliebiger Art aufweist.
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Die
Mittel und Vorgehensweisen zur Erreichung der oben genannten Ziele
werden aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung
ersichtlich sein.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Glucagon-ähnlichem
Peptid-1 (GLP-1) oder eines biologisch aktiven Analogs davon zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Linderung
einer Verletzung des Hirngewebes, die durch Reperfusion des Blutflusses
nach einem Zeitraum einer Ischämie
verursacht wird.
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Nach
einem Aspekt der Erfindung ist das Glucagon-ähnliche Peptid-1 oder das biologisch
aktive Analog davon ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10,
SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:13. Vorzugsweise ist das
Glucagon-ähnliche
Peptid-1 oder das biologisch aktive Analog davon SEQ ID NO:7 oder
SEQ ID NO:9.
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Gemäß eines
weiteren Aspekts der Erfindung ist das Glucagon-ähnliche Peptid-1 oder das biologisch aktive
Analog davon ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:6. Vorzugsweise ist
das Glucagon-ähnliche
Peptid-1 oder das biologisch aktive Analog davon SEQ ID NO:4.
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Erfindungsgemäß kann der
Zeitraum der Ischämie
durch einen Schlaganfall oder durch einen chirurgischen Eingriff
verursacht sein.
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Vorzugsweise
umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen pharmazeutischen
Träger,
der ausgewählt
sein kann aus der Gruppe bestehend aus Salzlösung, gepufferte Salzlö sung, Dextrose, Wasser,
Glycerol, Ethanol, Laktose, Phosphat, Mannitol, Arginin, Trehalose
oder Kombinationen derselben.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann für eine Verabreichung sein,
die innerhalb von 4 Stunden nach dem Ischämie-Vorfall beginnt. Vorzugsweise ist die
pharmazeutische Zusammensetzung für eine Verabreichung, die innerhalb
von 4 Stunden nach dem Ischämie-Vorfall
beginnt und danach andauert.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
kann die pharmazeutische Zusammensetzung für eine kontinuierliche intravenöse Infusion
bei einer Dosismenge von 0,1 pmol/kg/min bis 10 pmol/kg/min des
Glucagon-ähnlichen
Peptid-1 oder des biologisch aktiven Analogs davon sein. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die pharmazeutische Zusammensetzung für die kontinuierliche subkutane
Infusion bei einer Dosis von 0,1 pmol/kg bis 75 pmol/kg des Glucagon-ähnlichen
Peptid-1 oder des biologisch aktiven Analogs davon. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist pharmazeutische Zusammensetzung für eine einzelne intravenöse Injektion
bei einer Dosismenge von 0,1 nmol/kg bis 2,0 nmol/kg des Glucagonähnlichen
Peptid-1 oder des biologisch aktiven Analogs davon. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine einzelne subkutane Injektion
bei einer Dosismenge von 0,1 nmol/kg bis 100 nmol/kg des Glucagon-ähnlichen
Peptid-1 oder des biologisch aktiven Analogs davon.
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Alternativ
dazu kann die pharmazeutische Zusammensetzung für die Verabreichung durch subkutane Injektion,
durch Mikrodruck-Injektion, durch Lungen-Insufflation, durch eine
externe Pumpe, durch eine implantierte Pumpe, durch eine Depotinjektion,
durch bukkale Verabreichung, durch eine über die Haut erfolgende Verabreichung
oder durch eine über
eine Membran erfolgende Verabreichung sein.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Zahlreiche
Untersuchungen am Tier und am Menschen haben eine starke Korrelation
zwischen einer Hyperglykämie
und der Ernsthaftigkeit einer Schlaganfall-bedingten Morbidität und Mortalität gezeigt.
Es gibt jedoch erhebliche Meinungsverschiedenheiten, ob hohe Blutglucosespiegel
tatsächlich
zu einer neuronalen Verletzung während
einer Ischämie
beitragen, oder ob die Hyperglykämie
lediglich eine sekundäre
Stressantwort auf die neuronale Verletzung ist. Eine kürzlich durchgeführte retrospektive
Verlaufsuntersuchung von 811 Patienten mit akutem Schlaganfall im
Vereinigten Königreich
kam zu dem Schluss, dass eine Hyperglykämie unabhängig von anderen nachteiligen
prognostischen Faktoren auf eine höhere Mortalität und Morbidität verweist
und folglich in einem kausalen Zusammenhang zum neuronalen Schaden
stehen kann. Andere jedoch haben diese Schlußfolgerung aufgrund von statistischen
Erwägungen
angezweifelt, und es besteht vielerseits ein Konsens, dass eine
Hyperglykämie
in Schlaganfallpatienten reaktiv in Bezug auf eine zerebrale Schädigung ist
und nicht kausal. Dennoch ist bemerkenswert, dass 20 % bis 43 %
der Patienten mit akutem Schlaganfall bei ihrer Einlieferung hyperglykämisch sind.
Dies kann teilweise durch einen vorbestehenden Diabetes bedingt
sein (25 % bis 50 % der hyperglykämischen Patienten), wobei es
sich jedoch größtenteils
um die Widerspiegelung einer akuten Stressantwort mit einer erhöhten Produktion
von Kortison, Glucagon und Catecholaminen handeln dürfte. Ob
die resultierende Hyperglykämie
tatsächlich
kausal für
die neuronale Verletzung in humanen Schlaganfallpatienten ist, kann
gegenwärtig
nicht abschließend
beantwortet werden.
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Die
Versuche, die Rolle der Hyperglykämie bei der Erzeugung des neuronalen
Schadens aufzuklären, konzentrieren
sich auf geeignete Tiermodelle für
den akuten Schlaganfall. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass
in Rattenmodellen für
eine transiente, fokale, zerebrale Ischämie gefolgt von einer Reperfusion
(ein Modell, das für
die klinische Situation eines ischämischen Schlaganfalls relevant
ist, der durch tPA-Revaskularisierung
behandelt wird) die Hyperglykämie
im kausalen Zusammenhang mit der Verstärkung eines neuronalen Schadens
zu stehen scheint. Im Vergleich zur fokalen Ischämie zeigten Modelle für die globale
Ischämie (die
entweder durch vorübergehenden
Herzstillstand oder durch bilateralen Gefäßverschluss in Ratten induziert
wurde) eine weniger signifikante neurotoxische Wirkung der Hyperglykämie. Experimente
in diesen globalen Ischämie-Modellen
haben gezeigt, dass die durch Insulin induzierte Normoglykämie oder
Hypoglykämie neuroprotektiv
ist, wobei diese Wirkungen jedoch direkt von Insulin vermittelt
zu sein scheinen, unabhängig von
seiner Blutglucose-verringernden Wirkung. Daher verweisen Experimente
in Tieren darauf, dass die neuronalen Wirkungen von Blutglucose
während
und nach dem akuten Schlaganfall komplex sind, und sowohl vom Ausmaß der ischämischen
Zone als auch vom dem Zeitpunkt der Blutglucose-Manipulationen abhängen.
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Die
Folgen von Ischämie-Reperfusion-Ereignissen
(entweder fokal oder global) sind ein reversibler und irreversibler
Hirnzellschaden, Zelltod und eine verringerte Organfunktionseffizienz.
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Das
Paradoxon des zellulären
Schadens, der mit einem beschränkten
Zeitraum einer ischämischen Anoxie
gefolgt von einer Reperfusion assoziiert ist, besteht darin, dass
die Zellschädigung
und der Zelltod nicht nur das direkte Ergebnis eines Zeitraums von
Sauerstoffentzug zu sein scheinen, sondern darüber hinaus eine Folge der Reoxygenierung
von Geweben zu sein scheinen, die während des ischämischen
Zeitraums in hohem Maße
empfindlich gegenüber
einer oxidativen Schädigung
gemacht wurden. Die Schädigung
durch die Reperfusion beginnt mit dem ersten oxidativen "Ausbruch" (burst) unmittelbar
bei Rückfluss und
verschlimmert sich über
mehrere Stunden weiter, da sich in denselben post-ischämischen
Geweben Entzündungsprozesse entwickeln.
Es ist gezeigt worden, dass Maßnahmen
zur Verringerung der Empfindlichkeit von post-anoxischen Zellen
gegenüber
einer oxidativen Schädigung
und darüber
hinaus Maßnahmen
zur Verringerung der Entzündungsreaktionen
in denselben Geweben die reversible und irreversible Schädigung bei
post-anoxisch wieder durchbluteten Organen verringern. Eine Kombination
von Verfahren zur Verringerung sowohl des Schadens durch den anfänglichen
oxidativen Ausbruch als auch des Schadens, der mit der nachfolgenden
Entzündung
einher geht, könnte
einen synergistischen Schutz gegen einen Schaden durch Reperfusion
bereitstellen. GLP-1 und seine biologisch aktiven Analoga können dies
durch Erzeugen einer starken anabolischen Wirkung auf Zellen des
Gehirns erreichen.
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Neben
GLP-1 oder seinen biologischen Analoga kann die Therapie die Verwendung
von freien Radikalfängern,
wie beispielsweise Glutathion, Melatonin, Vitamin E und Superoxiddismutase
(SOD) umfassen. Durch diese Kombination wird das Risiko einer Schädigung bei
Reperfusion sogar noch weiter verringert.
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Eine
gegenwärtig übliche Therapie,
die nunmehr zur Behandlung solcher Patienten verwendet wird, besteht
in dem Einsatz von thrombolytischen Mitteln, wie beispielsweise
Streptokinase und t-PA.
US-Patent Nr.
4,976,959 offenbart die Verabreichung von t-PA und SOD
zur Inhibierung der Gewebeschädigung
während einer
Reperfusion. Somit wird eine steigende Anzahl von Patienten der
Wahrscheinlichkeit eines Schadens durch Reperfusion und seinen Wirkungen,
die von den thrombolytischen Eingriffen herrühren, ausgesetzt.
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Die
Erfinder haben vorliegend entdeckt, dass die Verabreichung von humanem
GLP-1 oder seinen biologisch aktiven Analoga die Insulin-Sekretionsantworten
verstärkte
oder wiederher stellte, wobei Insulin neuroprotektiv war, vermutlich
aufgrund von direkten neurotrophischen Wirkungen, sowie auch durch
Kontrolle der Schlaganfall-bedingten Hyperglykämie.
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Der
Begriff "GLP-1" oder Glucagon-ähnliches
Peptid umfasst wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
verwendet GLP-1-Mimetika sowie seine biologisch aktiven Analoga,
und er kann Glucagon-ähnliche
Peptide und verwandte Peptide oder Analoga von Glucagon-ähnlichem
Peptid-1 umfassen, die an ein Rezeptorprotein von Glucagon-ähnlichem
Peptid-1 (GLP-1) binden, wie beispielsweise an das GLP-1 (7-36)
Amid-Rezeptorprotein, und die eine entsprechende biologische Wirkung
auf die Insulin-Sekretion ausüben
wie GLP-1 (7-36) Amid, eine native, biologisch aktive Form von GLP-1.
Siehe Göke,
B. und Byrne, M. Diabetic Medicine. 1996, 13:854-860. Die GLP-1-Rezeptoren
sind Zelloberflächenproteine,
die beispielsweise auf insulinproduzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse gefunden
werden. Glucagon-ähnliche
Peptide und Analoga werden Spezies umfassen, die insulinotrope Aktivität aufweisen
und Agonisten des GLP-1-Rezeptormoleküls und seiner
Sekundärbotenstoffaktivität sind,
d.h. dieses/diese aktivieren, u.a. auf insulinproduzierenden β-Zellen.
Agonisten von Glucagon-ähnlichem
Peptid, die eine Aktivität über diesen
Rezeptor ausüben,
sind beschrieben worden:
EP
0708179A2 ; Hjorth, S.A. et al., J. Biol. Chem. 269 (48):
30121-30124 (1994); Siegel, E.G. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th
Scientific Sessions, Boston (1997); Hareter, A. et al. Amer. Diabetes
Assoc. 57th Scientific Sessions, Boston (1997); Adelhorst, K. et
al. J. Biol. Chem. 269(9):6275-6278 (1994); Deacon C.F. et al. 16th
International Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia
Supplement (1997); Irwin, D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
94: 7915-7920 (1997); Mosjov, S. Int. J. Peptide Protein Res. 40:
333-343 (1992). Glucagon-ähnliche
Moleküle
umfassen Polynukleotide, die Agonisten von GLP-1 exprimieren, d.h.
Aktivatoren des GLP-1-Rezeptormoleküls und seiner
Sekundärbotenstoffaktivität, die unter
anderem auf insulinproduzierenden β-Zellen gefunden werden. GLP-1-Mimetika,
die ebenfalls Agonisten der β-Zellen
sind, umfassen beispielsweise chemische Verbindungen, die spezifisch
dazu erstellt wurden, um den GLP-1-Rezeptor zu aktivieren. Kürzliche
Publikationen offenbaren GLP-1 der Schwarzen Witwe und Ser
2 GLP-1, siehe G.G. Holz, J.F. Hakner/Comparative
Biochemistry and Physiology, Teil B 121 (1998) 177-184 und Ritzel,
et al., A Synthetic glucagon-like peptide-1 analog with improved
plasma stability, J. Endocrinol 1998 Oktober; 159(1):93-102. Antagonisten
des Glucagon-ähnlichen
Peptid-1 sind ebenfalls bekannt, siehe beispielsweise Watanabe,
Y. et al., J. Endocrinol. 140(1):45-52 (1994), und umfassen Exendin (9-39)
Amin, ein Exendin-Analog, das ein wirkungsvoller Antagonist von
GLP-1-Rezeptoren ist (siehe beispielsweise
WO 97/46584 ). Weitere Ausführungsformen
umfassen chemisch synthetisierte Glucagon-ähnliche Polypeptide sowie beliebige
Polypeptide oder Fragmente derselben, die im Wesentlichen homolog
sind. "Im Wesentlichen
homolog" bedeutet
im Zusammenhang sowohl mit Nukleinsäure- als auch mit Aminosäuresequenzen,
dass eine bestimmte Testsequenz, beispielsweise eine mutierte Sequenz,
von einer Referenzsequenz durch eine oder mehrere Substitutionen,
Deletionen oder Additionen abweicht, wobei die Nettowirkung davon
nicht zu einer nachteiligen funktionellen Verschiedenheit zwischen
der Referenzsequenz und der Testsequenz führt. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung werden Sequenzen, die mehr als 50 % Homologie und vorzugsweise
mehr als 90 % Homologie sowie eine äquivalente biologische Aktivität bei der
Verstärkung von β-Zellantworten
auf Plasmaglucosespiegel und äquivalente
Expressionseigenschaften aufweisen, als im Wesentlichen homolog
ansehen. Für
die Zwecke der Bestimmung der Homologie sollten Trunkierungen der reifen
Sequenz vernachlässigt
werden. Sequenzen mit einem geringeren Grad an Homologie, vergleichbarer Bioaktivität und äquivalenten
Expressionseigenschaften werden als Äquivalente angesehen.
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GLP-Peptide
und Glucagon des Säugetiers
werden vom selben Gen kodiert. Im Ileum wird der Phänotyp in
zwei Hauptklassen von GLP-Peptidhormonen prozessiert, nämlich in
GLP-1 und GLP-2. Es sind vier GLP-1-verwandte Peptide bekannt, die
ausgehend von den phänotypischen
Peptiden prozessiert werden. GLP-1 (1-37) weist die Sequenz His
Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly (SEQ ID NO:1) auf. GLP-1 (1-37) wird durch post-translationale
Prozessierung amidiert, wobei GLP-1 (1-36) NH2 entsteht,
das die Sequenz His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe
Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe
Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ
ID NO:2) aufweist; oder es wird enzymatisch prozessiert, wobei GLP-1 (7-37)
entsteht, das die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
Val Lys Gly Arg Gly (SEQ ID NO:3) aufweist. GLP-1 (7-37) kann ebenfalls
amidiert werden, wobei GLP-1 (7-36)-Amid entsteht, das die natürliche Form
des GLP-1-Moleküls
ist und die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
Gly Arg (NH2) (SEQ ID NO:4) aufweist.
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Intestinale
L-Zellen scheiden GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO:3) und GLP-1 (7-36) NH2 (SEQ ID NO:4) in einem Verhältnis von
1:5 aus. Diese trunkierten Formen von GLP-1 weisen kürzere Halbwertszeiten
in situ auf, d.h. weniger als 10 Minuten, und sie werden durch eine
Aminodipeptidase IV inaktiviert, wobei Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp
Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp
Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ ID NO:5) bzw. Glu Gly Thr Phe Thr Ser
Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala
Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ ID NO:6)
entsteht. Es ist vermutet worden, dass die Peptide Glu Gly Thr Phe
Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe
Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ ID NO:5) und Glu Gly Thr
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2)
(SEQ ID NO:6) die Glucoseproduktion in der Leber beeinflussen, jedoch
die Produktion oder Freisetzung von Insulin aus der Bauchspeicheldrüse nicht
stimulieren.
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Es
gibt sechs Peptide in den Giften der Gila-Krustenechse (Gila monster),
die zu GLP-1 homolog sind. Ihre Sequenzen werden in Tabelle 1 mit
den Sequenzen von GLP-1 verglichen. TABELLE
1
| a.HAEGTFSDVSSYLEGQAAKEFAWLVKGRNH2 |
| b.HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2 |
| c.DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2 |
| d.HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2 |
| e.HSDATFTAEYSKLLAKLALKQYLESILGSSTSPRPPSS |
| f.HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPS |
| g.HSDAIFTEEYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2 |
| h.HSDAIFTQQYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2 |
- a = GLP-1(SEQ ID NO:4).
- b = Exendin 3 (SEQ ID NO:7).
- c = Exendin 4 (9-39) NH2 (SEQ ID NO:8).
- d = Exendin 4 (SEQ ID NO:9).
- e = Helospectin I (SEQ ID NO:10).
- f = Helospectin II (SEQ ID NO:11).
- g = Helodermin (SEQ ID NO:12).
- h = Q8, Q9 Helodermin
(SEQ ID NO:13).
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Wie
durch die umrandeten Bereiche in Tabelle 1 hervorgehoben, sind die
wesentlichen Homologien die folgenden: die Peptide c und h sind
von d bzw. von g abgeleitet. Alle sechs natürlich vorkommenden Peptide
(a, b, d, e, f und g) sind homolog in den Positionen 1, 7, 11 und
18. GLP-1 und die Exendine 3 und 4 (a, b und d) sind darüber hinaus
homolog in den Positionen 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 und
29. In Position 2 sind A, S und G strukturell ähnlich. In Position 3 sind
die Reste D und E (Asp und Glu) strukturell ähnlich. In den Positionen 22
und 23 sind F (Phe) und I (Ile) strukturell ähnlich zu Y (Tyr) bzw. L (Leu).
In ähnlicher
Weise sind L und I in Position 26 strukturell äquivalent.
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Somit
sind von den 30 Resten von GLP-1 die Exendine 3 und 4 in 15 Positionen
identisch und in fünf weiteren
Positionen äquivalent.
Die einzigen Positionen, an denen einschneidende strukturelle Änderungen
ersichtlich sind, sind die Reste 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 und
30. Exendine haben darüber
hinaus 9 zusätzliche Reste
am Carboxyterminus.
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Die
GLP-1-ähnlichen
Peptide können
durch chemische Festphasenpeptidsynthese hergestellt werden. GLP-1
kann darüber
hinaus durch herkömmliche
rekombinante Verfahren unter Verwendung der Standardvorgehensweise,
die beispielsweise in Sambrook und Maniatis beschrieben worden ist,
hergestellt werden. Wie vorliegend verwendet bedeutet "rekombinant", dass ein Protein
von rekombinanten (z.B. mikrobiellen oder Säugetier-)Expressionssystemen
erhalten wird, die genetisch modifiziert wurden, sodass sie ein
Expressionsgen für
GLP-1 oder für
biologisch aktive Analoga davon enthalten.
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Die
GLP-1-ähnlichen
Peptide können
ausgehend von rekombinanten Zellkulturen erhalten und gereinigt
werden, wobei Verfahren angewendet werden, die eine Ammoniumsulfat-
oder Ethanolpräzipitation,
eine Säureextraktion,
eine Anionen- oder Ka tionen-Austauschchromatographie, eine Phosphocellulose-Chromatographie,
eine hydrophobe Interaktionschromatographie, eine Affinitätschromatographie,
eine Hydroxyapatit-Chromatographie und eine Lektin-Chromatographie
umfassen (jedoch nicht auf diese beschränkt sind). Eine Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) kann für
die letzten Reinigungsschritte verwendet werden.
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Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes
Produkt sein oder ein Produkt von chemisch-synthetischen Verfahren,
oder sie können
unter Verwendung von rekombinanten Verfahren ausgehend von prokaryontischen
oder eukaryontischen Wirten hergestellt sein (beispielsweise durch Bakterienzellen,
Hefezellen, Zellen von höheren
Pflanzen, Insektenzellen und Säugetierzellen,
in Kultur oder in vivo). Abhängig
vom Wirt, der in einem rekombinanten Herstellungsverfahren eingesetzt
wird, sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung gewöhnlich nicht
glykosyliert; sie können
jedoch auch glykosyliert sein.
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Die
GLP-1-Aktivität
kann unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt werden, gewöhnlich durch
Screening-Verfahren zur Rezeptorbindungsaktivität, bei denen man geeignete
Zellen bereitstellt, die den GLP-1-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren,
beispielsweise Insulinom-Zelllinien, wie beispielsweise RINmSF-Zellen
oder INS-1-Zellen. Siehe auch Mosjov, S. (1992) und
EP 0 708 170 A2 . Neben der
Messung der spezifischen Bindung von Tracern an die Membran unter
Verwendung von Radioimmunassay-Verfahren kann auch die cAMP-Aktivität oder die
Glucose-abhängige
Insulinproduktion gemessen werden. In einem Verfahren wird ein Polynukleotid,
das für
einen erfindungsgemäßen Rezeptor
kodiert, verwendet, um Zellen zu transfizieren, um dadurch das GLP-1-Rezeptorprotein
zu exprimieren. Somit können
diese Verfahren beispielsweise für
das Screening nach einem Rezeptoragonisten verwendet werden, indem
solche Zellen mit zu testenden Verbindungen in Kontakt gebracht
werden und bestimmt wird, ob solche Verbindungen ein Signal erzeugen,
d.h. den Rezeptor aktivieren.
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Polyklonale
und monoklonale Antikörper
können
verwendet werden, um GLP-1-ähnliche
Peptide zur Verwendung in den oben beschriebenen Verfahren nachzuweisen,
zu reinigen und zu identifizieren. Antikörper wie beispielsweise ABGA1178
weisen intaktes, ungespleißtes
GLP-1 (1-37) oder N-terminal trunkiertes GLP-1 (7-37) oder (7-36)-Amid
nach. Andere Antikörper
weisen das Ende des C-Terminus des Vorläufermoleküls nach, ein Verfahren, das
es anhand einer Subtraktion erlaubt, die Menge des biologisch aktiven,
trunkierten Peptids zu berechnen, d.h. GLP-1 (7-37) oder (7-36)-Amid
(Orskov et al., Diabetes, 1993, 42:658-661; Orskov et al. J. Clin.
Invest. 1991, 87:415-423).
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Andere
Screening-Verfahren umfassen die Verwendung von Zellen, die den
GLP-1-Rezeptor exprimieren, beispielsweise transfizierte CHO-Zellen,
in einem System, das den extrazellulären pH-Wert oder ionische Veränderungen
misst, die durch die Aktivierung des Rezeptors verursacht werden.
Beispielsweise können
potentielle Agonisten mit einer Zelle in Kontakt gebracht werden,
die den GLP-1-Proteinrezeptor exprimieren, und es kann eine Antwort
eines sekundären
Botenstoffs gemessen werden (z.B. eine Signaltransduktion oder eine
ionische Veränderung
oder eine Veränderung
des pH-Wert), um zu bestimmen, ob der potentielle Agonist wirksam
ist.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine,
die den Rezeptor des Glucagon-ähnlichen
Peptid-1 binden, können in
Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet
werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame
Menge des Polypeptids sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder
ein pharmazeutisch akzeptables Hilfsmittel. Solche Träger umfassen
(sind jedoch nicht beschränkt auf)
Salzlösung, gepufferte
Salzlösung,
Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol, Laktose, Phosphat, Mannitol,
Arginin, Trehalose und Kombinationen derselben. Die Formulierungen
sollten zur jeweiligen Verabreichungsart passen und können problemlos
vom Fachmann bestimmt werden. Das GLP-1-Peptid kann darüber hinaus
in Kombination mit Mitteln verwendet werden, von denen im Stand
der Technik bekannt ist, dass sie die Halbwertszeit des Peptids
in vivo verlängern,
um somit die biologische Aktivität
des Peptids zu verstärken
oder zu verlängern.
Beispielsweise kann ein Molekül
oder ein chemischer Rest kovalent an die erfindungsgemäße Zusammensetzung
vor Verabreichung derselben gebunden werden. Alternativ dazu kann
das verstärkende
Mittel gleichzeitig mit der Zusammensetzung verabreicht werden.
Des Weiteren kann das Mittel ein Molekül umfassen, von dem bekannt
ist, dass es die enzymatische Degradation von GLP-1-ähnlichen
Peptiden inhibiert, und dieses kann gleichzeitig mit oder nach der
Verabreichung der GLP-1-Peptid-Zusammensetzung verabreicht werden.
Ein solches Molekül
kann beispielsweise oral oder durch Injektion verabreicht werden.
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Der
Dosisbereich der Konzentrationen, die wirksam sind, hängt in gewissem
Maße von
der Verabreichungsart ab, d.h. mit anhaltender Freisetzung oder
kontinuierlich, wie beispielsweise durch intravenöse Infusion
oder durch subkutane Infusion. Da GLP-1 jedoch keine Nebenwirkungen
aufweist, kann ein gewisser Spielraum toleriert werden. Es kann
als Bolus-Verabreichung gegeben werden, entweder i.v. oder auch
subkutan.
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Vorgeschlagene
Dosisbereiche für
verschiedene Anwendungen sind für
die kontinuierliche Infusion durch intravenöse (i.v.) Gabe 0,1 pmol/kg/min
bis 10 pmol/kg/min und durch subkutane (s.c.) Gabe 0,1 pmol/kg/min
bis 75 pmol/kg/min und für
eine einzelne Injektion (Bolus) durch i.v. Gabe 0,1 nmol/kg bis
2 nmol/kg und s.c. 0,1 nmol/kg bis 100 nmol/kg, wobei diese Be reiche
nicht als Einschränkung
zu verstehen sind und lediglich zur Veranschaulichung aufgeführt werden.
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Das
bevorzugte Verfahren zur Verabreichung des GLP-1-Peptids ist durch kontinuierliche Gabe
bei einer Dosisrate im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 pmol/kg/min
des GLP-1, das durch anhaltende Freisetzung, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal,
durch ein injiziertes Depot mit anhaltender Freisetzung, durch Lungen-Insufflation
sowie intravenös,
bukkal, durch Pflaster oder anhand von anderen Verabreichungsverfahren mit
anhaltender Freisetzung verabreicht wird.
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Die
möglichen
Mechanismen der Glucose-Neurotoxizität bleiben spekulativ und der
Anmelder möchte nicht
auf eine Theorie festgelegt sein. Während einer zerebralen Ischämie wird
jedoch wie auch in anderen Geweben eine anaerobe Glykolyse stimuliert,
und diese erzeugt Milchsäure,
was wahrscheinlich durch eine Hyperglykämie verstärkt wird. Laktat kann insbesondere
für ischämische neuronale
Zellen toxisch sein. Eine zweite Möglichkeit besteht darin, dass
eine Hyperglykämie
eine verstärkte
Austragung von roten Blutzellen durch das ischämische kapillare Endothel verursacht,
was zu mikrohämorrhagischen
Infarkten führt.
Ein dritter Mechanismus, der vorgeschlagen worden ist, besteht darin,
dass eine neuronale Exzitotoxizität (z.B. durch Glutamat induziert)
Glucose-sensitiv ist, und folglich verstärkt eine Hyperglykämie diese
starke Ursache eines neuronalen Schadens. Obwohl der genaue Mechanismus
nicht bekannt ist, steht fest, dass die Behandlung mit GLP-1 signifikante
Vorteile bereitstellt.
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Als
Vorsichtsmaßnahme
zur Vermeidung eines erhöhten
Schadens oder Risikos ist anzumerken, dass GLP-1 verabreicht werden
kann und verabreicht werden sollte, sobald festgestellt worden ist,
dass ein Ereignis aufgetreten ist oder auftritt. Folglich kann es
zu Hause oder in einem Rettungswagen verab reicht werden, da seine
sofortige anabolische Wirkung den Metabolismus des Gehirns verbessert.
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Im
Hinblick auf diese Erwägungen
ist es klar, dass eine potentiell wichtige Strategie bei der Behandlung
des akuten Schlaganfalls und bei der Verringerung der Infarktgröße darin
besteht, eine Hyperglykämie
zu kontrollieren und die Blutglucosespiegel auf einen normalglykämischen
oder einen moderat hypoglykämischen Bereich
zu verringern. Darüber
hinaus war Insulin bislang das einzig praktikable Mittel zur Behandlung
einer Hyperglykämie.
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Bis
zum jetzigen Zeitpunkt wurde keine randomisierte, kontrollierte
humane Versuchsreihe abgeschlossen, um die Vorteile einer Insulinbehandlung
bei akutem Schlaganfall zu untersuchen, obwohl solche Versuchsreihen
empfohlen wurden. Die Risiken in Bezug auf die Nebenwirkung von
Insulin ist jedoch zu schwerwiegend. Im Gegensatz zu diesem Mangel
an Daten aus humanen Versuchsreihen haben zahlreiche Untersuchungen
die Auswirkungen von Insulin in Tiermodellen des Schlaganfalls bewertet.
Nahezu ausnahmslos haben diese Untersuchungen starke Vorteile gezeigt,
die darauf verweisen, dass Insulin die funktionelle Leistung erhält, die
Infarktgröße verringert,
und die Mortalität
sowohl nach globaler Ischämie
als auch nach fokaler Ischämie
mit Reperfusion verringert. In Modellen der globalen Ischämie, in
denen beide Karotisarterien verschlossen waren (in einigen Fällen mit
induziertem Blutunterdruck oder mit induziertem asphyktischem Herzstillstand),
hatte Insulin eine bemerkenswerte protektive Wirkung, welche die
Größe des Infarkts begrenzte,
die neurologischen Defizite verringerte, und die metabolische Erholung
verstärkte.
Darüber
hinaus war der Effekt von Insulin weitgehend unabhängig von
seiner die Blutglucose verringernden Wirkung; tatsächlich war
eine schwere Hypoglykämie
durchgehend abträglich
für die
zerebrale Funktion und den Ausgang.
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In
Modellen für
eine zeitweilige, fokale zerebrale Ischämie zeigte Insulin eine starke
protektive Wirkung, die das Infarktvolumen und das Ausmaß der zerebralen
Nekrose verringerte (Yip, PK, He, YY, Hsu, CY, Garg, N, Marangos,
P, und Hogan, EL (1991) Effect of plasma glucose an infarct size
in focal cerebral ischemia-reperfusion. Neurology 41, 899-905; Hamilton,
MG, Tranmer, BI, und Auer, RN (1995) Insulin reduction of cerebral
infarction due to transient focal ischemia. J. Neurosurg. 82, 262-268).
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Die
starke neuroprotektive Wirkung von Insulin ist mechanistisch von
White und seinen Kollegen untersucht worden (White, BC, Grossman,
LI, und Krause, GS (1993) Brain injury by global ischemia and reperfusion:
A theoretical perspective an membrane damage and repair. Neurology
43, 1656-1665; White, BC, Grossman, LI, O'Neil, BJ, DeGracia, DJ, Neumar, RW,
Rafols, JA, und Krause, GS (1996) Global brain ischemia and reperfusion.
Ann. Emerg. Med. 27, 588-594). Diese Autoren haben argumentiert,
das Insulin als starker neurotrophischer Faktor agiert, der allgemeine
neuronale Reparaturwege aktivieren kann, die unabhängig von
seinen Auswirkungen auf den Glucosemetabolismus sind. Während eines
Schlaganfalls tritt ein Großteil der
strukturellen Schäden
während
der Reperfusion auf. Man nimmt an, dass dies durch eine Ischämie-induzierte
Membranlipolyse, eine lokale Akkumulation von Membranfettsäuren und
eine anschließende
Produktion von Superoxid während
der Reperfusion-stimulierten Oxidation dieser Fettsäuren bedingt
ist. Die während
der Reperfusion erzeugten Sauerstoffradikale schädigen dann die neuronalen Membranen
durch Lipidperoxidation. Dieser Schaden wird durch eine Reperfusioninduzierte
Suppression der Proteinsynthese, welche die Membranreparatursysteme
abschaltet, verschlimmert. Unter diesen Umständen haben Insulin und andere
Mitglieder der Familie der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren
(insulin-like growth factor; IGF) bedeutende Neuronen-erhaltene
Wirkungen, indem die Proteinsynthese stimuliert und die Maschinerie
für die
Synthese neuer Membranlipide hochreguliert wird. Dies kann wiederum
von einer Insulin-stimulierten Dephosphorylierung von eukaryontischem
Initiationsfaktor 2 (elF-2α)
herrühren,
wodurch eine wirksame Translation von mRNA-Transkripten gefördert wird.
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BEISPIELE
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung von GLP-1 (Glucagon-ähnliches
Peptid-1 [7-36]-Amid) bei der Behandlung eines akuten Schlaganfalls
eine ideale Alternative zu Insulin. Dies liegt an der Glucose-abhängigen,
insulinotropen Wirkung von GLP-1. Durch GLP-1 wird bei Vorliegen
einer Normoglykämie
bis zu einer Hyperglykämie
eine endogene Insulinsekretion stimuliert, jedoch nicht während einer
Hypoglykämie,
wodurch vor der Entwicklung einer schweren Hypoglykämie geschützt wird.
Dies bedeutet, dass GLP-1 in Typ 2-Diabetikern eine anhaltende Sekretion
von Insulin stimulieren und die Blutglucosespiegel normalisieren
wird. Beide Wirkungen können
von enormem Vorteil bei einem akuten Schlaganfall sein. Ähnliche Ergebnisse
können
in nicht-diabetischen Schlaganfall-Patienten mit reaktiver Hyperglykämie erzielt
werden. In Schlaganfall-Opfern mit Euglykämie wird GLP-1 zu einer moderaten
Insulinsekretion führen,
die in Abwesenheit von zusätzlicher
Glucose auf die Basiswerte zurückgehen
kann. In diesen Fällen
kann es erwünscht
sein, eine Co-Verabreichung von intravenöser Glucose (gering dosiert,
z.B. 5 %) durchzuführen,
um die Stimulation der Insulinsekretion beizubehalten. Anders als
bei einer Glucose-Insulin-Infusion wird es jedoch keine Notwendigkeit
für eine
sorgfältige
Dosistitration geben, da die Glucose-abhängige Wirkung von GLP-1 zu
einer "Auto-Titration" führen wird,
bei der eine Euglykämie
in Verbindung mit erhöhten
zirkulierenden Insulinwerten erhalten wird.
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Es
wird nunmehr angenommen, dass zirkulierende FFAs nicht in das Gehirn
eintreten und keine Kraftquelle für das Gehirn darstellen. Im
Zustand vollständiger
Oxygenierung verstoffwechselt das Gehirn ausschließlich Glucose,
und es schaltet nur bei lang anhaltenden Hungerphasen auf von der
Leber stammende Ketonkörper
um. Während
einer Ischämie
ist die aerobe Glucoseoxidation beeinträchtigt, und die Glykolyse ist verstärkt, wobei
diese jedoch keine ausreichende Menge ATP erzeugt. Als Folge davon
sind die Membranfunktionen beeinträchtigt, Ca2+ tritt
in die Zelle ein, und die enzymatische Lipolyse von neuronalen Membranphospholipiden
wird stimuliert, was zu intrazerebralen FFAs führt. Diese FFAs werden nicht
durch die Wirkung von Glucagon erzeugt. Dennoch kann die Suppression
von Glucagon im Allgemeinen das metabolische Milieu verstärken, indem
der stressbedingte Zustand des Insulin-Antagonismus verringert wird.
Bei einem verstärkten metabolischen
Milieu sollte es zu einer vorteilhaften Suppression der Entzündung kommen.
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Aus
den obigen Beispielen, die lediglich einen Aspekt der vorliegenden
Erfindung veranschaulichen sollen, ist ersichtlich, dass die vorliegende
Erfindung alle gesetzten Ziele erreicht. Es ist wichtig anzumerken, dass
diese Beispiele in keiner Weise als Begrenzung der Lehren oder der
Offenbarung oder des Umfangs oder der Äquivalenz der vorliegenden
Erfindung verstanden werden sollen, da diese lediglich beispielhafter
Natur sind.