DE60027273T2

DE60027273T2 - ASSAY ZUR IDENTIFIKATION VON IgE-ANTIKÖRPER-SUPPRESSOREN

Info

Publication number: DE60027273T2
Application number: DE60027273T
Authority: DE
Inventors: David H. La Jolla Katz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-02-17
Filing date: 2000-02-15
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2020-02-16
Also published as: ES2262512T3; WO2000049409A9; US6270746B1; WO2000049409A3; WO2000049409A2; DE60027273D1; EP1153297B1; CA2362583C; CA2362583A1; ATE323284T1; EP1153297A2

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der immunsuppressiven Wirkstoffe und der Screening-Assays für ihre Identifikation. Genauer gesagt betrifft die Erfindung einen Screening-Assay zur Verwendung für die Identifikation von Agenzien, die, selektiv oder nicht-selektiv, die Synthese oder Aktivität von Antikörpern des Immunglobulin-E-Isotyps (IgE) unterdrücken.
BESCHREIBUNG DES EINSCHLÄGIGEN STANDS DER TECHNIK
IgE-Antikörper vermitteln Aspekte der Immunantwort auf Antigene bei Säugern, die zum Einsetzen einer allergischen Attacke beitragen. Bei anfälligen Individuen kann IgE einen überempfindlichen Phänotyp hervorrufen, der eine übermäßige und schnelle Freisetzung von Mediatoren, z.B. Histamin, „slow reacting substance of anaphylaxis" und eosinophiler chemotaktischer Faktor, mit sich bringt, was im Extemfall zu potentiell tödlichen Bedingungen wie der Anaphylaxe führt.
Die Kontrolle der IgE-vermittelten Immunantwort ist daher ein wichtiges Ziel der Allergietherapie, insbesondere der Immuntherapien, die sich auf die Induktion einer Antigentoleranz durch wiederholte Antigen-Provokation des Wirtsimmunsystems richten. Für die Zwecke der Allergietherapie besteht die Herausforderung darin, das Wirtsimmunsystem in einer Weise zu unterdrücken, die die Aktivität von IgE dämpft und gleichzeitig die schutzbringenden und ansonsten günstigen Wirkungen aller anderen Wirtsimmunantworten auf bestimmte Antigene beibehält. Daher stellen immunsuppressive Agenzien, die selektiv IgE-vermittelte Immunantworten anzielen, potentiell wirkungsvolle Waffen im Arsenal gegen allergische Erkrankungen dar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt einen Screening-Assay zur Verwendung für die Identifikation von Agenzien bereit, die ein Potential für die pharmazeutische Anwendung als Suppressoren der IgE-vermittelten Antigen-spezifischen Immunantworten auf Antigene aufweisen. Zur Verwendung im Assay wird ein nicht-humanes Tier, das auf ein Antigen überreagiert, indem es übermäßige Mengen an IgE produziert, präpariert oder anderweitig erhalten. Die anfängliche Sensibilisierung des Tiers gegen das Antigen wird innerhalb eines spezifischen, durch die Erfindung definierten zeitbeschränkten Fensters der Empfindlichkeit vorgenommen. Das Tier behält daraufhin eine übermäßige IgE-Reaktivität auf das sensibilisierende Antigen trotz seiner Rückkehr zu einem ansonsten normalen IgE-Phänotyp bei.
Die Identifikation potentieller IgE-Suppressoren wird im Tier vorgenommen, indem dieses mit dem Kandidat-Suppressor mit oder nach der Primärimmunisierung behandelt wird. Eine Abnahme der Antigen-spezifischen IgE-Mengen nach der Behandlung zeigt an, dass der Kandidat eine suppressive Aktivität besitzt. Der Umfang der durch den Assay gelieferten nützlichen Information lässt sich durch Messen und Vergleichen weiterer Indizien der IgE-Immunreaktivität im Tier ausweiten, wie etwa der Mengen der Marker des Th2-Immunphänotyps, bei dem die IgE-Produktion normalerweise induziert wird.
Daher stellt die Erfindung ein Screening-Verfahren zum Identifizieren eines Agens mit IgE-Suppressoraktivität bereit, welches Verfahren umfasst:

(a) Bestimmen der IgE-Reaktion auf ein Antigen eines nicht-humanen Tiers vor und nach Verabreichung an das Tier eines Kandidat-IgE-Suppressors, wobei das Tier vor der Durchführung des Screening-Verfahrens mit einem IgE-Enhancer behandelt worden ist, welche Schritte zur Bestimmung dieser IgE-Reaktion umfassen:
(i) Sensibilisieren des Tiers durch ein sensibilisierendes Antigen innerhalb eines Tages nach der Behandlung des Tiers mit dem IgE-Enhancer; (ii) Verabreichen einer Primärimmunisierungs-Dosis eines Antigens an das Tier, wobei das Antigen mit dem sensibilisierenden Antigen immunologisch verwandt ist; (iii) Messen der Menge an Antigen-spezifischem und/oder Gesamt-IgE in dem Tier; (iv) Verabreichen des Kandidat-IgE-Suppressors an das Tier; und (v) Messen der Menge an Antigen-spezifischem und/oder Gesamt-IgE in dem Tier; dann (b) Vergleichen der Messungen, wie in Schritt (a)(iii) erhalten, mit den Messungen, wie in Schritt (a)(v) erhalten, wobei eine Abnahme bei einem der gemessenen Werte anzeigt, dass der Kandidat-IgE-Suppressor die Produktion und/oder Aktivität von IgE in dem Tier unterdrückt.

Zu diesen Zwecken ist in einem Aspekt der Erfindung die Tier-Plattform des Screening-Assays ein nicht-humaner Säuger, dessen IgE-vermitteltes Allergiesystem mit den IgE-vermittelten Allergiesystemen von Menschen korreliert.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist der nicht-humane Säuger ein Nagetier.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das Nagetier eine Maus.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Tier-Plattform hyperreaktiv auf ein Antigen durch eine Niederdosis-Bestrahlung gemacht.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die erfolgreiche Induktion eines IgE-hyperreaktiven Phänotyps bei der Tier-Plattform für den Screening-Assay durch Ablation dieser Reaktivität mit CD23⁺-B-Zellen bestätigt, die dem Tier während des durch die Erfindung definierten Fensters der Empfindlichkeit verabreicht werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Daten, die den Allergiedurchbruch im Zusammenhang mit der IgE-vermittelten Immunantwort von SJL/J(H – 2^s)-Mäusen zeigen, die wie hierin beschrieben bestrahlt und immunisiert wurden.
2 zeigt Daten, die den Ausschluss von anderen Antigenen als dem primären Immunogen aus den in 1 beschriebenen übermäßigen IgE-Antworten der Mäuse nachweisen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Durch die Erfindung gebotene Vorteile
Die Erfindung besteht in einer praktischen Anwendung der "Allergiedurchbruch"-Hypothese zur Erzielung einer IgE-vermittelten Allergie in Säugern. Gemäß der Allergiedurchbruch-Hypothese werden Tiere, die zuvor keinen IgE-vermittelten Allergie-Phänotyp aufgewiesen haben, diesen bei Kontakt mit Antigen zeigen, wenn der native Dämpfmechanismus, der ihre IgE-Antikörperproduktion kontrolliert, unter Umständen überwunden wird, die die Entwicklung einer Allergie begünstigen.
Bezüglich dieser Umstände war eine bemerkenswerte und überraschende Entdeckung, die zu der Erfindung führte, die Feststellung, dass das Allergiedurchbruch-Phänomen von der zeitlichen Festlegung der anfänglichen Sensibilisierung eines Tiers gegenüber einem Antigen bezüglich des Verlusts der regulatorischen Kontrolle über die IgE-Produktion im Tier abhängig ist. Genauer muss zum Erfolgen des Allergiedurchbruchs diese anfängliche Sensibilisierung innerhalb eines Tages nach dem Verlust der regulatorischen Kontrolle stattfinden – ein kurzes und relativ starres Fenster der Empfindlichkeit, dessen Existenz aus einer einfachen Beobachtung der IgE-Antworten auf Antigen nicht hätte vorhergesagt werden können.
Spezifischer gesagt wird das Tier, wenn seine Sensibilisierung gegen das Antigen jenseits des durch die Erfindung definierten Fensters der Empfindlichkeit stattfindet, die übermäßige IgE-Reaktivität nicht erwerben, die den Allergiedurchbruch charakterisiert. Findet die Sensibilisierung jedoch vor dem Ende des Fensters der Empfindlichkeit statt, so erfolgt nicht nur eine Steigerung der IgE-Reaktion auf das Antigen, sondern wird diese auch beibehalten, selbst wenn das Tier zu einem ansonsten normalen Grad der IgE-Reaktivität auf andere Antigene zurückkehrt. Folglich stellt die Erfindung die Parameter bereit, mittels derer der Allergiedurchbruch induziert und als ein Werkzeug zur Identifikation von Antigen-spezifischen IgE-Suppressoren ausgenützt werden kann.
Zur Verwendung in der Auswertung IgE-selektiver Suppressoren stellt die Erfindung weiterhin die Mittel zum Induzieren einer übermäßigen IgE-Reaktivität in einem Tier bereit, wobei die anderen Immunfunktionen des Tiers relativ unbeeinflusst bleiben. Diesbezüglich stellt die Erfindung eine in vivo-Umgebung bereit, in der die Immunantwort induziert, gemessen und für die IgE- und Antigen-selektive Suppression angezielt werden kann.
II. Methoden zur Durchführung des Screening-Assay
1. Tier-Plattformen
Das als einer Plattform für den Screening-Assay genützte Tier kann jegliches Tier sein, dessen IgE-vermitteltes Immunsystem für eine Störung durch äußere Einflüsse, wie etwa eine sublethale Bestrahlung und bestimmte Toxine, anfällig ist. Unter diesen Tieren sind jene, deren IgE-vermittelte Allergiesysteme gut mit dem menschlichen System korrelieren, die bessere Wahl zur Verwendung im Screening-Assay der Erfindung. Die gewählten Tiere können, müssen aber nicht, immunologisch naiv bezüglich des für die Studie gewählten immunisierenden Antigens sein.
Mäuse liefern ein kostenwirksames, leicht erhältliches Modell, welches mit der humanen IgE-vermittelten Immunantwort auf der physiologischen und molekularen Ebene gut korreliert (siehe z.B. Katz, Prog. Allergy, 32: 105–160, 1982; und Richards und Katz, J. Immunol., 158: 263–272,1997). Jede Mäuse-Spezies kann in dem Screening-Assay effektiv genützt werden, doch sind jene, die für ihre geringe IgE-Reaktion bekannt sind, darin besonders nützlich, dass die Messung von Anstiegen und Abnahmen der IgE-Spiegel durch die niedrigen Hintergundmengen an IgE, die gewöhnlich in den Tieren produziert werden, vereinfacht sind. Mäuse der SJL/J-, C57BL/6(H – 2^b)- und DBA/2-Stämme (mit einer IgE-Reaktivität bei oder unterhalb von 80 (PCA-Titers von 80)) stellen Beispiele der gering IgE-reaktiven Tiere dar und können kommerziell bezogen werden von Quellen wie Jackson Labs (Standort Maine) und Charles River Labs (Standort Massachusetts).
Fachleute werden bei üblicher Sachkenntnis mit der Identität weiterer geeigneter Tiermodelle, einschließlich gering IgE-reaktiver Tiere, der humanen IgE-vermittelten Allergie vertraut sein oder sich leicht damit vertraut machen können. Die Empfänglichkeit dieser Tiere für eine IgE-Immunmodulation kann, wenn nicht bekannt, durch eine Behandlung des Tiers mit einem IgE-Immunverstärker und durch Messen der Wirkung des Enhancers auf das Tier mittels herkömmlicher Assay-Messungen ihrer IgE-Immunantwort bestimmt werden (siehe z.B. bezüglich der spezifischen Tiere, Katz, Prog. Allergy, 32: 105–160, 1982 [Nagetiere]; Chen, et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 116: 269–277, 1998 [murines Anaphylaxemodell]; Ohta, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 7: 212–223, 1983 [Antigen-stimulierte humane B-Zellen]; Vriesendorp, et al., Transplantation, 39: 583–588, 1985 [Empfänglichkeit von Hunden für eine Modulation der IgE-Immunantwort durch sublethale Bestrahlung]; Dombrowicz, et al., J. Immunol., 15: 1645–1651, 1996 [transgene Tiermodelle des humanen IgE-Immunsystems]).
2. Vorbereitung der Tier-Plattform für den Screening-Assay
Bestimmte äußere Einflüsse („IgE-Enhancer"), wie etwa eine sublethale Bestrahlung und Toxine, z.B. Ricin (Castorbohnenlectin), weisen signifikante stimulatorische Wirkungen auf IgE-Antworten auf ein Antigen auf. Zur Entwicklung einer übermäßigen IgE-Reaktivität der Tier-Plattform der Erfindung stellt die Anwendung einer sublethalen Bestrahlung eine bequem geeignete Wahl dar, deren physiologische Wirkung wohl charakterisiert ist (zum Beispiel ist eine Niederdosen-Bestrahlung beim Menschen und experimentell bei niederen Tieren therapeutisch angewendet worden).
Zwar zeigt eine Exposition an hohe Bestrahlungsmengen die Tendenz zu einem immunsuppressiven Gesamteffekt auf Säuger, doch liefert die Erfindung die Entdeckung, dass die Exposition an einzelne und relativ geringe Bestrahlungsdosen, gekoppelt mit einer Antigen-Immunisation, die IgE-Reaktivität auf das Antigen stark erhöhen wird, sofern die Bestrahlung und Immunisation innerhalb der korrekten zeitlichen Beziehung erfolgt, d.h. die Immunisation sollte innerhalb der nächsten 24 Stunden nach der Bestrahlung erfolgen. Dieselbe zeitliche Begrenzung gilt auch für andere IgE-Enhancer, was anzeigt, dass die optimale Empfindlichkeit der aktivierten IgE-produzierenden B-Zellen gegenüber der Antigensensibilisierung innerhalb eines 24- Stunden-Fensters liegt, welches sich auf die Ausschaltung der IgE-Dämpfmechanismen des Tiers hin öffnet.
Tageszeitabhängige Schwankungen spielen ebenfalls eine Rolle bei der Optimierung der Empfindlichkeit der IgE-Erzeugerzelle gegenüber einer nicht-antigenen Stimulierung. Die Empfindlichkeit der IgE-erzeugenden B-Zellen gegenüber IgE-Enhancern, wie etwa die Bestrahlung, ist bei Mäusen am größten, wenn sie durch geringe Mengen an endogenen Corticosteroiden begleitet ist und zu bestimmten Zeiten am Tag erfolgt. Zum Beispiel ist bei SJL/J-Mäusen die IgE-Erhöhung durch Ganzkörperbestrahlung während des frühen Nachmittags (12 Uhr bis 16 Uhr) größer, wenn zirkulierende Mengen an Corticosteroiden sich auf einem natürlichen Tiefstand befinden, als zu anderen Zeiten am Tage (für weitere Einzelheiten bezüglich der tageszeitabhängigen Schwankungen bei Mäusen und dem Effekt auf die IgE-Reaktivität, siehe z.B. Bargatze und Katz, J. Immunol., 125: 2306–2310, 1980). So kann die Tageszeit, zu der der IgE-Enhancer einem Tier verabreicht wird, die Größe der Erhöhung der erzielten IgE-Mengen beeinflussen, wobei die zeitliche Beziehung zwischen der Verabreichung des Enhancers und des Antigens bestimmt, ob überhaupt erhöhte IgE-Mengen erreicht werden.
Zu diesen Zwecken wird das beim Screening-Assay der Erfindung zu verwendende Tier mit einem IgE-Enhancer behandelt und dann innerhalb eines Tages immunisiert. Wo der IgE-Enhancer eine Ganzkörperbestrahlung ist, wird die verabreichte Dosis notwendigerweise sublethal sein und sollte auch subtherapeutisch sein. Die optimale Menge kann von Spezies zu Spezies variieren, doch wird generell unter 700 rad liegen, und wird erwünschterweise innerhalb des Bereichs von 150–400 rad liegen. Fachleute werden bei üblicher Sachkenntnis mit geeigneten Protokollen für die Verabreichung einer sublethalen Ganzkörperbestrahlung oder anderer IgE-Enhancer vertraut sein oder können sich leicht damit vertraut machen, wobei ein Beispiel hierfür an späterer Stelle bereitgestellt wird.
A. Immunisierung der Tiere
Das gewählte Immunogen wird mit den klinischen Interessen und Zielen des ausführenden Arztes variieren und kann sich aus einem Allergen, Th2-stimulatorischen infektiösen Agenz, immunogenen Epitop, Allergenextrakt oder Polynukleotid, das ein Immunogen codiert, zusammensetzen (aus Gründen der Bequemlichkeit wird die Population der immunogenen Substanzen, die bei der Erfindung genützt werden können, hierin als „Antigene" bezeichnet, sofern nicht der Zusammenhang anderes erfordert, doch ist es selbstverständlich, dass die Immunisierungsschritte der Erfindung nicht auf die Verabreichung von Antigenen als solches beschränkt ist). Zu häufigen Allergenen, die für ein relativ hohes Vorkommen von IgE-bezogenen allergischen Ereignissen beim Menschen verantwortlich sind, zählen die wichtigsten IgE-reaktiven Staubmilben-Allergene Der pl und Der pll (Chua, et al., J. Exp. Med., 167: 175–182, 1988; und Chua, et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91: 124–129, 1990); T-Zellepitop-Peptide des Der pll-Allergens (Joost van Neerven, et al., J. Immunol., 151: 2326–2335, 1993); das hochabundante Antigen E (Amb al)-Ragweed-Pollen-allergen (Rafnar, et al., J. Biol. Chem., 266: 1229–1236, 1991); Phospholipase A₂ (Bienengift)-Allergen; das Fel dl-Hauskatzen-Hauptallergen (Rogers, et al., Mol. Immunol., 30: 559–568, 1993); und Lebensmittelallergene, besonders die Erdnuss- und Nussbaumallergene. Modellantigene, die im Fachgebiet als solche akzeptiert sind, umfassen Ovalbumin (OVA), Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) und Konjugate davon (z.B. mit 2-Dinitrophenyl-[2-DNP]) sind zur Verwendung bei der Erfindung ebenfalls gut geeignet.
Fachleute werden bei üblicher Sachkenntnis mit akzeptablen Methoden der Immunisierung von Tieren, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Methoden zur Immunisierung auf intravaskulären, subkutanen, intramuskulären, intraperitonealen, nasalen, topischen und ophthalmischen Verabreichungswegen gänzlich vertraut sein. Umfassende Protokolle zur Immunisierung von Tieren zur Verwendung bei der Erfindung werden daher hierin nicht bereitgestellt.
Kurz gesagt kann das Antigen in einem Träger (z.B. sterile Salzlösung) mit oder ohne ein Adjuvanz, wie z.B. Alaun, verabreicht werden. Das Tier wird für das Antigen innerhalb eines Tages, und erwünschterweise innerhalb von 6–10 Stunden, der Behandlung des Tiers mit einem IgE-Enhancer sensibilisiert. Die Primärimmunisierung mit einem immunologisch verwandten Antigen (weiter unten beschrieben) wird zu einem Zeitpunkt nach der Behandlung des Tiers mit dem IgE-Enhancer vorgenommen; bequemerweise wird die Primärimmunisierung etwa eine Woche nach der Sensibilisierung erfolgen. Der Primärimmunisierung können weitere Immunisierungen mit den selben oder immunologisch verwandten Antigenen folgen, um eine Auswertung der Wirkung des Kandidat-IgE-Suppressors auf die Reaktion des Tiers auf eine anschließende Antigen-Provokation zu ermöglichen.
Es wird zu erkennen sein, dass das anfänglich sensibilisierende Antigen eine immunologische Aktivität mit dem Antigen teilen muss, das bei nachfolgenden Immunisierungen verwendet wird, um eine Auswertung der Reaktion des Tiers auf die Immunisierung und die Behandlung im Anschluss an die Sensibilisierung zu ermöglichen. Um insbesondere eine Prozessierung des Antigens bei späteren Immunisierungen in einer gleichwertigen Weise zur Prozessierung des Antigens der anfänglichen Sensibilisierung zu ermöglichen, sollten die bei jedem Immunisierungsschritt verwendeten Antigene zumindest immunogene Epitope teilen (z.B. kann die Sensibilisierung mit Vollantigen erfolgen, gefolgt von einem immunogenen Extrakt oder Fragment desselben, oder umgekehrt, solange die Immunogenität der in jedem Schritt verabreichten Immunogene vergleichbar ist). Diese Antigene sind solche, die hierin als „immunologisch verwandt" bezeichnet werden.
Wo Immunantworten auf mehr als ein Antigen im Screening-Assay ausgewertet werden sollen, kann das zweite Antigen im anfänglichen Sensibilisierungsschritt und auf die Primäimmunisierung hin, oder lediglich während des letzteren Schritts, verabreicht werden, doch muss, wenn nicht während des Sensibilisierungsschritts verabreicht, an das sensibilisierende Antigen konjugiert oder anderweitig in einer Weise verabreicht werden, die die Prozessierung beider Antigene durch die Immunzellen des Tieres in ähnlicher Weise erlaubt. Ein Beispiel dieses Ansatzes ist im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben, bei dem die Sensibilisierung eines Tieres gegenüber KLH von einer Primärimmunisierung mit einem KLH-DNP-(2-Dinitrophenyl)-Konjugat gefolgt ist.
Im vorgestellten Beispiel ist das KLH-Molekül in dem Konjugat, das beim Primärimmunisierungsschritt verabreicht wird, mit dem sensibilisierenden KLH-Antigen „immunologisch verwandt". Da das DNP-Molekül an das KLH-Molekül konjugiert ist, wird es durch das Tier in einer ähnlichen Weise zur Prozessierung des KLH-Moleküls prozessiert, obschon DNP antigenisch von KLH verschieden ist. Obschon das Tier nicht gegen DNP während des Fensters der Empfindlichkeit sensibilisiert wurde, wird es also durch die Zellen des Tiers als immunologisch dem KLH verwandt „gesehen" werden, da beide Moleküle als eine Folge ihrer Verabreichung als ein Konjugat – einer einzigen immunogenen Komponente – gemeinsam prozessiert werden. Als solches wird in diesem Beispiel die übermäßige IgE-Antwort, die beim Primärimmunisierungsschritt erreicht wird, sowohl für KLH als auch DNP spezifisch sein. Wird DNP jedoch unabhängig von KLH im Primärimmunisierungsschritt verabreicht, so wird es durch das Tier nicht als immunologisch mit dem KLH-Sensibilisierungsantigen verwandt gesehen werden, und die übermäßige IgE-Antwort wird sich lediglich auf KLH richten. In dieser Weise können vielfache Antigene dem Tier verabreicht und im Primärimmunisationsschritt des Screening-Assays der Erfindung entsprechend ausgewertet werden.
Geübte Fachleute des Gebiets werden mit den Methoden zur Verabreichung vielfacher Immunogene an ein Tier als einer einzigen immunogenen Komponente (z.B. durch Konjugation oder gemeinsame Verabreichung in einem Liposom) vertraut sein oder sich ohne Weiteres damit vertraut machen oder können geeignete Zusammensetzungen zur diesbezüglichen Verwendung von kommerziellen Quellen beziehen.
3. Durchführung des Screening-Assays der Erfindung
Nach der anfänglichen Sensibilisierung eines Tiers, das zur Verwendung im Screening-Assay wie oben präpariert wurde, für ein Antigen wird das geprimte Tier behandelt (mehr als 24 Stunden nach seiner Exposition an einen IgE-Enhancer), entweder mit einem Kandidat-IgE-Suppressor oder, zur Verwendung als einer Kontrolle, mit Vehikel. Die Primärimmunisierung mit dem sensibilisierenden Antigen wird er wünschterweise zusammen mit der Verabreichung des Kandidat-IgE-Suppressors erfolgen, kann aber auch zu einem vorherigen Zeitpunkt erfolgen.
Zu festgelegten Zeitpunkten vor und nach der Primärimmunisierung (als auch vor der Behandlung mit dem IgE-Enhancer, sofern möglich) wird eine Immunprobe dem Tier entnommen und auf Antigen-spezifische und Gesamtmengen an IgE analysiert. In Abhängigkeit von dem Antigen und seinem Verabreichungsweg an das Tier kann die Immunprobe aus Flüssigkeiten wie Serum, Bronchoalveolar-Spülung und Schleimhaut-Abstrichen bestehen. Die IgE-Mengen werden mittels herkömmlicher Assays bestimmt, von denen viele im Fachbereich kommerziell beziehbar sind und Fachleuten des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis vertraut sein werden. Ein Beispiel solch eines Assays wird an anderer Stelle später in den Beispielen bereitgestellt.
Weitere Aspekte der IgE-vermittelten Immunantwort können ebenfalls in dem Assay untersucht werden. Diesbezüglich werden Fachleute bei üblicher Sachkenntnis verstehen, dass IgE-Antikörper prinzipiell im Zusammenhang mit einem „Th2-Phänotyp" produziert werden, d.h. einem Immunphänotyp, der mit der extrazellulären Exposition eines Wirts an ein Antigen assoziiert ist und durch die Aktivierung der Klasse 2-Helfer-T-Lymphozyten charakterisiert ist. Th2-Reaktionen beruhen auf der Allergieassoziierten IgE-Antikörperklasse; lösliche Proteinantigene neigen zur Stimulierung relativ starker Th2-Reaktionen. Im Gegensatz dazu werden Th1-Reaktionen durch die Antigenbindung an Makrophagen und dendritische Zellen induziert.
IgG₁-Antikörper sind serologische Marker für eine Immunantwort vom Th2-Typ, wohingegen IgG_2a-Antikörper für eine Immunantwort vom Th1-Typ indikativ sind. Der Th2-Immunphänotyp ist weiter durch die Freisetzung bestimmter Zytokine charakterisiert, z.B. IL-4, wohingegen der Th1-Immunphänotyp dazu tendiert, von der Freisetzung von Zytokinen wie IL-12 und/oder einem Anstieg des IFN (α-, β- oder γ-Mengen) begleitet zu sein. Da das Helfer-T-Lymphozytensystem zwischen den Th2- und Th1-Klassen der Th-Zellen negativ wechselwirkt, korreliert ein Anstieg der Mengen an Th1-Zytokinen (z.B. IL-12 und IFN α, β oder γ) und/oder der IgG_2a-Antikörper zur Suppression des Th2-Phänotyps und folglich einer Abnahme der Fähigkeit des Tiers, eine IgE-vermittelte Immunantwort zu erbringen.
Folglich kann der Screening-Assay der Erfindung auch angewendet werden, um einen ausführlichen Nachweis der IgE-Suppression durch eine Kandidat-Verbindung zu erhalten, geschlossen aus der Bestimmung der Klasse des vor und nach der Primärimmunisierung und Behandlung mit dem Kandidat-IgE-Suppressor vorhandenen Helfer-T-Lymphozyt-vermittelten Immunphänotyps. Insbesondere sind Abnahmen der Th2-Zytokin- und IgG₁-Antikörpermengen und Zunahmen der Th1-Zytokin- und IgG_2a-Antikörpermengen Indizien für eine mögliche Th2-Phänotyp-Induktion/IgE-Suppression; die umgekehrten Profile sind für eine Th2-Phänotyp-Induktion/IgE-Stimulation indikativ.
Vergleichende Messungen der anderen Antikörper-Isotypen als IgE (Prä- und Post-Primärimmunisierung) als auch weiterer Antigen-sensible Immunkomponenten (Zytokine, Effektoren, Eosinophileninfiltratmengen und Ähnliches) werden Informationen bezüglich der relativen Empfindlichkeit des Kandidat-IgE-Suppressors liefern; d.h. darüber, ob er lediglich die IgE-Produktion/Aktivität beeinflusst oder ob auch andere Aspekte des Immunsystems betroffen sind (erwünschterweise oder nicht). Bei der murinen Tier-Plattform der Erfindung unter Verwendung gering IgE-reaktiver Tiere kann von dem Assay jedoch erwartet werden, dass er einen hohen Grad an Spezifität für das IgE-Immunsystem aufweist; z.B. können die Effekte auf die Gesamt-IgG-Reaktionen als dürftig erwartet werden.
Alle diese Immunkomponenten können mittels herkömmlicher Assays nachgewiesen und gemessen werden, von denen viele für den Fachbereich kommerziell zur Verfügung stehen und mit denen Fachleute bei üblicher Sachkenntnis vertraut sein werden. Beispiele solcher Assays werden an anderer Stelle später in den Beispielen bereitgestellt und umfassen einen ELISA für die IgG₁- und IgG_2a-Isotypen unter Verwendung Subklassen-spezifischer Antikörper; einen ELISA für Antigen-spezifisches und Gesamt-IgE (Coligan, "Current Protocols In Immunology", Block 7.12.4, Bd. 1, Wiley & Sons, 1994); eine empfindliche (0,4 ng an IgE/ml) Festphasen-Radioimmunoassay (RAST)-Modifikation des IgE-ELISA (wobei gereinigte polyklonalr Ziegen-Antikörper, die für Maus-ϵ-Ketten spezifisch sind, durch Antikörper substituiert werden, die für humanen Fab spezifisch sind); und einen Anti-CD3-Antikörper (Phar mingen, La Jolla, CA) – basierten Splenozyten-Assay, bei dem Überstände auf ihre Zytokinmengen (z.B. IL-4-, IL-10- und IL-12-Mengen) unter Verwendung eines handelsüblichen Kits untersucht werden, und Interferon (z.B. INFγ) – Mengen mit einem Anti-INFγ-Maus-Antikörper-Assay untersucht werden (siehe z.B. Coligan, "Current Protocols in Immunology", Block 6.9.5., Bd. 1, Wiley & Sons, 1994).
Fachleute werden bei üblicher Sachkenntnis auch erkennen, dass ein verkürztes Protokoll für den Screening-Assay der Erfindung entworfen werden kann, um die Aktivität der IgE-Enhancer zu testen. Insbesondere bei der Messung der IgE-Mengen im Anschluss an die Behandlung eines Tiers mit einem mutmaßlichen IgE-Enhancer und seinem Priming mit Antigen stellt das Versagen eines Tiers, das einen hyperreaktiven IgE-Phänotyp entwickeln sollte, dies zu tun, den Nachweis dar, dass der mutmaßliche IgE-Enhancer jene Aktivität nicht besitzt, zumindest nicht in dem für den Assay genützten Tier.
Obschon nicht auf irgendeine Theorie darüber beschränkt, wie die IgE-Erhöhung in den Tieren, die für den Screening-Assay zur Auswertung der IgE-Suppression genützt werden, erfolgt, scheint es so zu sein, dass IgE-Enhancer, wie z.B. eine Niederdosis-Bestrahlung, die IgE-Bindung durch CD23⁺ (FcγRII)-B-Zellen zeitweilig einschränkt. Die Bindung des IgE durch B-Zellen mittels des CD23-Rezeptors reguliert ihre Differenzierung und kontrolliert das Auftreten des IgE-vermittelten Allergie-Phänotyps. Folglich ermöglicht eine Störung der IgE-Bindung durch CD23⁺-B-Zellen den Ablauf der IgE-vermittelten Reaktionen auf Antigen trotz der CD23⁺-B-Zell-Regulation.
Diese mögliche Erklärung für die biologische Wirkung von IgE-Enhancern auf Wirts-B-Zellen legt nahe, dass der Screening-Assay der Erfindung von besonderem Nutzen zur Auswertung von Agenzien sein wird, die die Bestrahlungs-vermittelte Störung der IgE-Bindung durch CD23⁺-B-Zellen (wie etwa ex vivo-Präparate dieser Zellen) überwinden. Außerdem können transplantierte CD23⁺-B-Zellen, oder jegliches andere Agenz, das für seine IgE-suppressive Aktivität bekannt ist (z.B. isolierte oder synthetische CD23⁺-Peptide einschließlich der IgE-Bindungsdomäne, oder Anti-IgE-Antikörper) zum Verifizieren der Brauchbarkeit der Tier-Plattform verwendet werden, da solche Zellen die IgE-Produktion und Aktivität zerstören können, wenn sie während des Fensters der Empfindlichkeit verabreicht werden.
Nachstehend sind Beispiele, die die Durchführung der Erfindung veranschaulichen, angegeben. Die Beispiele stellen keine Beschränkung des Rahmens der Erfindung, der durch die Ansprüche im Anhang definiert ist, dar und dienen auch nicht diesem Zweck.
BEISPIEL I
BESTRAHLUNGS-VERSTÄRKTE In Vivo-IgE-ANTIKÖRPERREAKTIONEN
Als Beweis des Prinzips, dass übermäßige IgE-Mengen in einer Antigen-spezifischen und Zeit-spezifischen Weise erzeugt werden können, wurden zwei Gruppen von gering IgE-reaktiven SJL/J (2 – H^s)-Mäusen wie folgt präpariert: Gruppe I wurde bei 250 rad kurz vor der Priming-Immunisierung mit 2 μg KLH in Alaun-Wasserstoffperoxid (Pierce Chemical; ein Th2-stimulatorisches Adjuvanz) bestrahlt. Die zweite Gruppe erhielt die Priming-Dosis von KLH in Alaun, wurde aber nicht bestrahlt. Sieben Tage später (Tag 0) erhielt jede Gruppe 2 μg DNP-KLH-Konjugat in Alaun, woraufhin die Antigen-spezifischen IgE-Mengen mittels ELISA in jeder Maus entnommenen Serumprobe gemessen wurden. Eine sekundäre Antigen-Provokation wurde am Tag 60 unter Verwendung des gleichen Antigens und Dosis vorgenommen, wie für die Primärimmunisierung am Tag 0 gegeben. Das Antigen-spezifische IgE wurde nochmals an Tagen 7, 14, 21, 60, 75, 120, 150 und 210 gemessen.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, worin die IgE-Mengen als PCA-Titer dargestellt sind. Die Anti-Antigen-IgE-Reaktionen, die in den bestrahlten Tieren durch Bestrahlungsbegleitendes Priming, gefolgt von einer Primärimmunisierung eine Woche später, induziert wurden, betrugen mehr als das 1000-fache der Größe der IgE-Mengen, die in den nicht-bestrahlten Tieren produziert wurden, und eine nahezu 5000-fache Größe im Anschluss an die Sekundärimmunisierung, was anzeigte, dass die Antigen-spezifische IgE-Reaktivität in den bestrahlten Tieren nicht nur induziert, sondern bei allergischen Höhen im Zeitverlauf und auf eine nachfolgende Antigen-Provokation hin gehalten wurden.
Um die Antigen-Spezifität der übermäßigen IgE-Reaktion der bestrahlten Tiere zu bestimmen, wurden zwei weitere Gruppen von Tieren präpariert und wie oben beschrieben am Tag 0 immunisiert, außer dass die Bestrahlung der Behandlungsgruppe bei 350 rad erfolgte. Am Tag 18 wurde eine Gruppe der bestrahlten und unbehandelten Mäuse mit dem primären Immunogen (2 μg DNP-KLH in Alaun) sekundärimmunisiert, wohingegen eine zweite Gruppe der bestrahlten und unbehandelten Mäuse ein unterschiedliches Antigen – 10 μg an OVA in Alaun – erhielt. Die IgE-Reaktionen auf das DNP-KLH-Antigen wurden vor und nach der Primärimmunisierung als auch bei der Sekundärimmunisierung bestimmt; das Anti-OVA-IgE wurde außerdem an Tagen 28 und 35 gemessen.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt, worin die IgE-Mengen als PCA-Titer dargestellt sind. Signifikanterweise lag kein nachweislicher Unterschied im Anti-OVA-IgE vor, das in den bestrahlten und unbehandelten Mäuse-Gruppen erzeugt wurde, obschon enorme Unterschiede im Anti-DNP-IgE vorlagen, das in den bestrahlten gg. unbehandelten Mäusegruppen produziert wurde (vergleichbar den in 1 gezeigten Reaktionen). Folglich wurde die übermäßige Antigen-Reaktivität der IgE-Abteilung der bestrahlten Mäuse bezüglich anderer Antigene als dem Primärimmunogen im Anschluss an das Priming und den Allergiedurchbruch nicht beibehalten.
Bei Anwendung eines aktiven IgE-Suppressors zu oder zeitnahe der Primärimmunisierung kann von Antigen-spezifischem IgE erwartet werden, dass es auf nahezu normale Mengen im Tier abfällt. Zum Beispiel würde bei gering IgE-reaktiven Mäusen die vollständige Beseitigung der übermäßigen IgE-Reaktion durch einen IgE-Suppressor die Antigen-spezifischen IgE-Mengen auf eine Größe zurückführen, die vergleichbar der wäre, die bei unbestrahlten Mäusen und bestrahlten Mäusen, die außerhalb des Fensters der Empfindlichkeit immunisiert wurden, erzielt wird (Daten nicht gezeigt).
Nachdem die Erfindung nun umfassend beschrieben worden ist, werden Abwandlungen und Erweiterungen daran den Fachleuten bei üblicher Sachkenntnis erkennbar sein. Alle diese Abwandlungen und Erweiterungen sind als innerhalb des Rahmens der beanspruchten Erfindung liegend zu betrachten.

Claims

Screening-Verfahren zum Identifizieren eines Agens mit IgE-Suppressoraktivität, welches Verfahren umfasst: (a) Bestimmen der IgE-Reaktion auf ein Antigen eines nicht-humanen Tiers vor und nach Verabreichung an das Tier eines Kandidat-IgE-Suppressors, wobei das Tier vor der Durchführung des Screening-Verfahrens mit einem IgE-Enhancer behandelt worden ist, welche Schritte zur Bestimmung dieser IgE-Reaktion umfassen: (i) Sensibilisieren des Tiers durch ein sensibilisierendes Antigen innerhalb eines Tages nach der Behandlung des Tiers mit dem IgE-Enhancer; (ii) Verabreichen einer Primärimmunisierungs-Dosis eines Antigens an das Tier, wobei das Antigen mit dem sensibilisierenden Antigen immunologisch verwandt ist; (iii) Messen der Menge an Antigen-spezifischem und/oder Gesamt-IgE in dem Tier; (iv) Verabreichen des Kandidat-IgE-Suppressors an das Tier; und (v) Messen der Menge an Antigen-spezifischem und/oder Gesamt-IgE in dem Tier; dann (b) Vergleichen der Messungen, wie in Schritt (a)(iii) erhalten, mit den Messungen, wie in Schritt (a)(v) erhalten, wobei eine Abnahme bei einem der gemessenen Werte anzeigt, dass der Kandidat-IgE-Suppressor die Produktion und/oder Aktivität von IgE in dem Tier unterdrückt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der IgE-Enhancer eine sublethale Ganzkörperbestrahlung ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Bestrahlung auf einer Höhe von zwischen 150 und 400 rad vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Tier, bei dem die IgE-Reaktion bestimmt wird, ein Nagetier ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Nagetier eine Maus ist, z.B. vom niedrigen IgE-Reaktions-Phänotyp.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Tier, bei dem die IgE-Reaktion bestimmt wird, ein solches ist, dessen IgE-vermitteltes Immunsystem zum humanen IgE-vermittelten Immunsystem in einem ausreichenden Maße korreliert, damit die Wirkung eines Kandidat-IgE-Suppressors in dem Tier berechtigterweise als sich im Menschen ähnlich verhaltend vorausgesagt werden kann.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei entweder: (A) (a)(ii) innerhalb von 7 Tagen nach Durchführung des Schritts (a)(i) vorgenommen wird oder (a)(v) innerhalb von 14 Tagen nach Durchführung des Schritts (a)(ii) vorgenommen wird oder; (B) (a)(iii) und (a)(iv) am gleichen Tag wie Schritt (a)(ii) vorgenommen werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem umfassend die Schritte (a)(iii)', (a)(v)' und (b)', wobei entweder; (a) die Menge mindestens eines Markers für den Th2-Immunophänotyp auch in Schritten (a)(iii)' und (a)(v)' gemessen und dann in Schritt (b)' verglichen wird; (b) die Menge mindestens eines Markers des Th1-Immunophänotyps auch in Schritten (a)(iii)' und (a)(v)' gemessen und dann in Schritt (b)' verglichen wird oder; (c) die Menge mindestens einer der IgG₁- und IgG_2a-Unterklassen auch in Schritten (a)(iii)' und (a)(v)' gemessen und dann in Schritt (b)' verglichen wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Tier mit einem IgE-Enhancer während einer Tageszeit behandelt worden ist, zu der bei dem Tier eine geringere Menge an endogen produzierten Corticosteroiden als zu anderen Tageszeiten bekannt ist oder bestimmt wurde.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Sensiblisierungschritt (a)(i) innerhalb von 6 bis 10 Stunden nach Behandlung des Tiers mit dem IgE-Enhancer durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, außerdem umfassend den Schritt (a)(i)', worin die Wirkung der Bestrahlung auf die IgE-Reaktion des Tiers bestätigt wird durch: (1) Messen der Menge an Antigen-spezifischem und/oder Gesamt-IgE im Tier nach Verabreichung der Primärimmunisierungs-Dosis des Antigens; (2) Behandeln des Tiers mit einem IgE-Suppressor nach Verabreichung der Primingdosis des Antigens an das Tier, doch vor Ablauf des 24-Stunden-Zeitraums nach der Bestrahlung; wobei eine weitere Ablation jegliches Antigen-spezifischen und/oder Gesamt-IgE, das in dem Tier während Schritt (a)(i)'(1) gemessen wird, bestätigt, dass die gewünschte Wirkung der Bestrahlung auf die IgE-Reaktion des Tiers eingetreten ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei entweder; (a) der IgE-Suppressor eine CD23'-Zelle ist; oder (b) der IgE-Suppressor ein Anti-IgE-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der IgE-Suppressor ein CD23'-Peptid ist, das eine IgE-Bindungsdomäne enthält.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Mengen an IgE, wie in Schritten (iii) und (v) gemessen, die des Gesamt-IgE sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Mengen an IgE, wie in Schritten (iii) und (v) gemessen, die von Antigen-spezifischem IgE sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Mengen an IgE, wie in Schritten (iii) und (v) gemessen, die von Gesamt-IgE und von Antigen-spezifischem IgE sind.