DE60024870T2 - Verfahren zur herstellung von thylakoiden aus pflanzen, reine thylakoide und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von thylakoiden aus pflanzen, reine thylakoide und deren verwendung Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Isolierung und Gewinnung von Thylakoiden, die im Wesentlichen in ihrem vollständigen und natürlichen Zustand vorhanden sind, wovon zumindest ein Teil funktional oder aktivierbar ist. Die Erfindung betrifft auch die Gewinnung anderer löslicher und unlöslicher Pflanzenfraktionen, die bei der Isolierung von Thylakoiden erhalten werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Thylakoiden als ROS-Fänger, als Fotoprotektoren, insbesondere gegen UV-Strahlung, ebenso wie als Biosensoren, Biofilter oder Bioreaktoren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Antioxidantien wurden zunehmend populär, nämlich auf dem Gebiet der Biomedizin, wegen ihrer Fähigkeit die Bildung und die schädliche Aktivität von reaktiven Sauerstoffarten (ROS) zu verhindern.
  • Pflanzen und andere fotosynthetische Organismen sind besonders gut angepasst, um der Wirkung von ROS zu widerstehen, insbesondere um lebenswichtige fotosynthetische Organellenmembranen, die Thylakoide genannt werden, gegen oxidative Schädigungen und die schädliche Einwirkung von UV-Strahlung zu schützen.
  • Sonnenlicht spielt eine viel größere Rolle bei unserer Erhaltung, als wir erwarten mögen: Alle Nahrung, die wir essen, und alle fossilen Brennstoffe, die wird verwenden, sind ein Produkt der Fotosynthese, die der Prozess ist, der die Energie im Sonnenlicht in chemische Formen der Energie umwandelt, die von biologischen Systemen verwendet werden können. Die Fotosynthese wird von vielen verschiedenen Organismen von Pflanzen bis Bakterien ausgeführt. Die am besten bekannte Art der Fotosynthese ist die, die von höheren Pflanzen und Algen ausgeführt wird, ebenso wie von Cyanobakterien und deren Verwandten, die verantwortlich sind für einen Großteil der Fotosynthese in den Ozeanen. All diese Organismen wandeln CO2 (Kohlendioxid) in organisches Material um, indem sie dieses Gas zu Kohlenhydraten in einer ziemlich komplizierten Reihe von Reaktionen reduzieren. Elektronen für diese Reduktionsreaktion kommen schließlich aus dem Wasser, das dann in Sauerstoff und Protonen umgewandelt wird. Die Energie für diesen Prozess wird von Licht geliefert, das von Pigmenten absorbiert wird (hauptsächlich Chlorophylle und Carotinoide). Chlorophylle absorbieren blaues und rotes Licht und Carotinoide absorbieren blau-grünes Licht, aber grünes und gelbes Licht werden von fotosynthetischen Pigmenten in Pflanzen nicht wirksam absorbiert; Licht dieser Farben wird daher entweder von den Blättern reflektiert oder geht durch die Blätter hindurch.
  • Andere fotosynthetische Organismen, wie Cyanobakterien (früher als blau-grüne Algen bekannt) und Rotalgen haben zusätzliche Pigmente, die Phycobiline genannt werden, die rot oder blau sind und die die Farben des sichtbaren Lichts absorbieren, die nicht wirksam von Chlorophyll und Carotinoiden absorbiert werden. Noch andere Organismen, wie die purpurfarbigen und grünen Bakterien (die im Übrigen unter vielen Wachstumsbedingungen ziemlich braun aussehen) enthalten Bacteriochlorophyll, das im Infrarotbereich absorbiert zusätzlich zum blauen Teil des Spektrums. Diese Bakterien entwickeln keinen Sauerstoff, sondern führen die Fotosynthese unter anaeroben (sauerstofffreien) Bedingungen durch. Diese Bakterien verwerten Infrarotlicht effizient für die Fotosynthese. Infrarot ist Licht mit Wellenlängen über 700 nm, das nicht vom menschlichen Auge gesehen werden kann; einige Bakterienarten können Infrarotlicht mit Wellenlängen von bis zu 1.000 nm verwerten. Die meisten Pigmente sind jedoch nicht sehr effektiv bei der Absorption von Ultraviolettlicht (< 400 nm), das auch nicht vom menschlichen Auge gesehen werden kann. Licht mit Wellenlängen unter 330 nm wird zunehmend schädigend für Zellen, aber praktisch alles Licht dieser kurzen Wellenlängen wird von der Atmosphäre (am stärksten von der Ozonschicht) herausfiltriert, bevor es die Erde erreicht. Obwohl die meisten Pflanzen Verbindungen erzeugen können, die Ultraviolettlicht absorbieren, hat eine längere Bestrahlung mit Licht von ungefähr 300 nm auf die Pflanzenproduktivität schädliche Wirkungen.
  • Fotosynthetische Pigmente kommen in einer riesigen Vielzahl vor: Es gibt viele verschiedene Arten von (Bacterio)chlorophyll, Carotinoiden und Phycobilinen, die sich von einander in ihrer präzisen chemischen Struktur unterscheiden. Pigmente sind im Allgemeinen an Proteine gebunden, die die Pigmentmoleküle in die geeignete Orientierung und Positionierung im Hinblick aufeinander bringen. Lichtenergie wird von einzelnen Pigmenten absorbiert, wird aber nicht sofort von diesen Pigmenten für die Energieumwandlung verwendet. Stattdessen wird die Lichtenergie zu den Chlorophyllen überführt, die in einer speziellen Proteinumgebung sind, wo die tatsächliche Energieumwandlung stattfindet: die Lichtenergie wird verwendet, um ein Elektron auf ein benachbartes Pigment zu übertragen. Pigmente und das an dem tatsächlichen primären Elektronentransferereignis beteiligte Protein werden zusammen Reaktionszentrum genannt. Eine große Anzahl von Pigmentmolekülen (100 bis 5.000), die insgesamt als Antenne bezeichnet werden, "ernten" Licht, fangen Photonen ein und überführen die Lichtenergie zu dem gleichen Reaktionszentrum. Der Zweck besteht darin, eine hohe Rate des Elektronentransfers im Reaktionszentrum aufrechtzuerhalten, auch bei geringeren Lichtintensitäten. Die Bezeichnung P680 ist den Chlorophyllpigmenten des Reaktionszentrums PSII zugeordnet, da das Paar von Chlorophyllen, das in ihre Zusammensetzung eintritt, Licht hauptsächlich bei einer Wellenlänge von 680 nm absorbiert.
  • Viele Antennenpigmente übertragen ihre Lichtenergie auf ein einziges Reaktionszentrum, indem sie diese Energie auf ein weiteres Antennenpigment übertragen und auf noch ein weiteres etc., bis die Energie im Reaktionszentrum "eingefangen" ist. Jede Stufe dieses Energietransfers muss sehr effizient sein, um einen großen Verlust bei dem Gesamttransferprozess zu vermeiden und die Assoziation der verschiedenen Pigmente mit Proteinen stellt sicher, dass die Transfereffizienzen hoch sind, indem die geeigneten Pigmente nahe beieinander sind und indem eine geeignete Molekülgeometrie der Pigmente im Hinblick aufeinander erhalten wird. Eine Ausnahme der Regel von proteingebundenen Pigmenten sind grüne Bakterien mit sehr großen Antennensystemen: Ein großer Teil dieser Antennensysteme besteht aus einem "Sack" (als Chlorosom bezeichnet) von bis zu mehreren tausend Bacteriochlorophyllmolekülen, die miteinander wechselwirken und nicht in direktem Kontakt mit Protein sind. Chlorophyll wird von allen fotosynthetischen Organismen als Verbindung zwischen Erregungsenergietransfer und Elektronentransfer verwendet. Besonders anzumerken ist die Rate, mit der diese Transferreaktionen erfolgen müssen. Da die Lebenszeit bzw. Halbwertszeit des angeregten Zustands nur wenige Nanosekunden (1 Nanosekunde (ns) ist 10–9 s) nach Absorption eines Quantums ist, müssen Energietransfer und Ladungstrennung im Reaktionszentrum innerhalb dieses Zeitraums stattfinden. Energietransferraten zwischen Pigmenten sind sehr schnell und die Ladungstrennung in Reaktionszentren dauert 3 bis 30 Picosekunden (1 Picosekunde (ps) ist 10–12 s). Die nachfolgenden Elektronentransferstufen sind erheblich langsamer (200 ps–20 ms), aber nichtsdestotrotz ist die Elektronentransportkette ausreichend schnell, dass mindestens ein wesentlicher Teil des absorbierten Sonnenlichts für die Fotosynthese verwendet werden kann. Die Pigmente haben eine spezifische Organisation, die bei Isolierung und Reinigung der Thylakoide bewahrt werden sollte, wenn die Aufrechterhaltung der Funktion der Letzteren erwünscht ist.
  • In vielen Systemen ist die Größe der fotosynthetischen Antenne flexibel und fotosynthetische Organismen, die bei wenig Licht wachsen (im Schatten z.B.), haben im Allgemeinen eine größere Anzahl von Antennenpigmenten pro Reaktionszentrum als solche, die bei höherer Lichtintensität wachsen. Bei hohen Lichtintensitäten (z.B. bei vollem Sonnenlicht) übersteigt jedoch die Menge an Licht, die von den Pflanzen absorbiert wird, die Fähigkeit zum Elektronentransfer, der durch die Reaktionszentren gestartet wird. Pflanzen haben Mittel entwickelt, um etwas von der absorbierten Lichtenergie in Wärme umzuwandeln, statt das absorbierte Licht notwendigerweise für die Fotosynthese zu verwenden. Insbesondere der erste Teil des fotosynthetischen Elektronentransfers in Pflanzen ist jedoch ziemlich empfindlich gegen übermäßig hohe Raten des Elektronentransfers und ein Teil der fotosynthetischen Elektronentransportkette kann heruntergefahren werden, wenn die Lichtintensität zu hoch wird; dieses Phänomen ist als Fotohemmung bzw. Lichthemmung bekannt.
  • Die Anfangselektronentransfer-(ladungstrennungs-)-reaktion in dem fotosynthetischen Reaktionszentrum setzt eine lange Reihe von Redox-(Reduktions-Oxidations-)-reaktionen in Gang, bei denen das Elektron über eine Kette von Cofaktoren geleitet wird und das "Elektronenloch" auf dem Chlorophyll auffüllt, ziemlich ähnlich einer Eimerbrigade. Alle fotosynthetischen Organismen, die Sauerstoff erzeugen, haben zwei Arten von Reaktionszentren, nämlich Fotosystem II und Fotosystem I (PSII und PSI, kurz gesagt), die beide Pigment/Proteinkomplexe sind, die in spezialisierten Membranen lokalisiert sind, die Thylakoide genannt werden. Bei Eukaryonten (Pflanzen und Algen) sind diese Thylakoide in Chloroplasten (Organellen in Pflanzenzellen) angeordnet und werden oft in Membranstapeln (Grana) gefunden. Prokaryonten (Bakterien) haben keine Chloroplasten oder andere Organellen und fotosynthetische Pigment-Protein-Komplexe sind entweder in der Membran rund um das Cytoplasma oder in Einbuchtungen darin (wie sie z.B. bei Purpurbakterien gefunden werden), oder sind in Thylakoidmembranen, die viel komplexere Strukturen innerhalb der Zelle bilden (wie im Fall der meisten Cyanobakterien).
  • Alles Chlorophyll in sauerstoffhaltigen Organismen ist in Thylakoiden angeordnet und ist mit PSII, PSI oder mit Antennenproteinen, die Energie in diese Fotosysteme bringen, assoziiert. PSII ist der Komplex, wo Wasserspaltung und Sauerstoffentwicklung auftreten. Bei Oxidation des Chlorophylls im Reaktionszentrum in PSII wird ein Elektron von einer in der Nähe befindlichen Aminosäure (Tyrosin) abgezogen, die Teil des umgebenden Proteins ist, das wiederum ein Elektron aus dem Wasserspaltungskomplex bekommt. Aus dem PS-II-Reaktionszentrum fließen Elektronen zu freie Elektronen tragenden Molekülen (Plastochinon) in der Thylakoidmembran und von dort zu einem weiteren Membran-Protein-Komplex, dem Cytochrom-b6f-Komplex. Das andere Fotosystem, PSI, katalysiert auch die durch Licht induzierte Ladungstrennung in einer Art und Weise, die im Wesentlichen der von PSII ähnlich ist: Licht wird von einer Antenne geerntet und die Lichtenergie wird auf ein Chlorophyll im Reaktionszentrum übertragen, wo die durch Licht induziere Ladungstrennung gestartet wird. In PSI werden Elektronen jedoch schließlich zu NADP (Nicotinamidadenosindinucleotidphosphat) überführt, dessen reduzierte Form für die Kohlenstofffixierung verwendet werden kann. Das oxidierte Chlorophyll im Reaktionszentrum erhält schließlich ein weiteres Elektron aus dem Cytochrom-b6f-Komplex. Daher führt der Elektro nentransfer durch PSII und PSI zu Wasseroxidation (was Sauerstoff erzeugt) und NADP-Reduktion, wobei die Energie für diesen Prozess von Licht (2 Quanten für jedes Elektron, das durch die gesamte Kette transportiert wird) geliefert wird.
  • Der Elektronenfluss von Wasser zu NADP erfordert Licht und ist an die Erzeugung eines Protonengradienten über die Thylakoidmembran gekoppelt. Dieser Protonengradient wird für die Synthese von ATP (Adenosintriphosphat), einem Molekül mit hoher Energie, verwendet. ATP und reduziertes NADP, das aus den Lichtreaktionen entsteht, werden für die CO2-Fixierung verwendet in einem Prozess, der von Licht unabhängig ist. Die CO2-Fixierung beinhaltet eine Reihe von Reaktionen, die als Calvin-Benson-Zyklus bezeichnet werden. Die Anfangs-CO2-Fixierungsreaktion betrifft das Enzym Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBis-CO), das entweder mit Sauerstoff (was zu einem Prozess führt der Fotorespiration oder Fotoatmung genannt wird und nicht zur Kohlenstofffixierung führt) oder mit CO2 reagieren kann. Die Wahrscheinlichkeit, mit der RuBisCo mit Sauerstoff bzw. mit CO2 reagiert, hängt von den relativen Konzentrationen der beiden Verbindungen an der Reaktionsstelle ab. In allen Organismen ist CO2 bei weitem das bevorzugte Substrat, aber wenn die CO2-Konzentration sehr viel geringer als die Sauerstoffkonzentration wird, tritt die Fotoatmung in erheblichem Umfang auf. Um die lokale CO2-Konzentration zu fördern und die Sauerstoffspannung zu minimieren, haben einige Pflanzen (als C4-Pflanzen bezeichnet) einige Zellen in einem Blatt (Bündelscheidenzellen genannt) beiseite gestellt, die hauptsächlich an der CO2-Fixierung beteiligt sind, und andere (Mesophyllzellen genannt), die auf Lichtreaktionen spezialisiert sind: ATP, CO2 und reduziertes NADP in Mesophyllzellen werden für die Synthese von organischen Säuren mit 4 Kohlenstoffatomen (wie Malat) verwendet, die zu den Bündelscheidenzellen transportiert werden. Hier werden die organischen Säuren unter Freisetzung von CO2 und reduziertem NADP, das für die Kohlenstofffixierung verwendet wird, umgewandelt. Die entstehende Säure mit 3 Kohlenstoffatomen wird zu den Mesophyllzellen zurückgebracht. Die Bündelscheidenzellen haben im Allgemeinen keine PS-II-Aktivität, um die lokale Sauerstoffkonzentration zu minimieren. Sie behalten jedoch PSI, wahrscheinlich, um die ATP-Synthese zu fördern.
  • Die Thylakoidorganisation ist sehr ausgefeilt, um Energie aus Licht zu extrahieren und diese Energie zum richtigen Ort zu bringen und/oder sie abzugeben. Die Übertragung wird möglich und wirksam, indem elektrische Ladungen getrennt werden und durch eine hohe Kapazität, um den neutralen elektrischen Zustand wieder herzustellen, bereit, um wieder eine Veränderung der Ladungen vorzunehmen (Blankenship et al., 1998).
  • Die Elektronenübertragung zwischen den obigen fünf Hauptkomponenten ist extrem schnell: Die Übertragung von einem aktivierten P680 auf Pheophytin dauert weniger als 1 ps. Die Elektronenübertragung stoppt, wenn alle Pigmente in einen neutralen elektrischen Ladungszustand zurückkehren, fertig, um einen neuen Zyklus zu durchlaufen.
  • Elektronen werden schließlich zu einem Kupplungsfaktor gebracht, um NADPH zu reduzieren, das für die ATP-Synthese notwendig ist, das für die Zuckersynthese dient.
  • Der Ausdruck "Thylakoide" wird unten verwendet und soll organisierte fotosynthetische Membrankomponenten bezeichnen, die aus fotosynthetischen Organismen, sowohl eukaryotischen als auch prokaryotischen, erhalten werden. Wenn der Organismus Chloroplasten hat, umfassen die Thylakoide die folgenden Membranbestandteile: PSII, Cytochrome b6 und f, PSI und den Kupplungsfaktor. Wenn die Integrität und Funktionalität der Thylakoide aus Pflanzenmaterial getestet wurde, wurde sie zwischen zwei Referenzpunkten gemessen: proximal zu PSII und distal zum Kupplungsfaktor. Für verschiedene Anwendungen müssen Thylakoide nicht aktiv sein, obwohl sie offensichtlich integral bzw. vollständig sind. Solche Thylakoide haben eine Leistung und sind mindestens so stabil wie jedes andere Antioxidans. Daher bedeutet "aktive Thylakoide" Thylakoide mit der Fähigkeit, bei Hydratisierung aktiviert zu werden, im Gegensatz zu inaktiven Thylakoiden, die integral sind, aber aktiv oder passiv inaktiviert sind. In diesem Fall ist das Reaktionszentrum inaktiv, obwohl die Thylakoidstruktur im Wesentlichen konserviert ist. Die "inaktiven" Thylakoide sind daher geeignete Antioxidantien, obwohl sie nicht die gleiche Dynamik haben noch die gleiche Fähigkeit zu regenerieren oder die gleiche Kapazität, auf ROS anzusprechen, wie in der aktiven/aktivierbaren Form.
  • Die Fotosynthese umfasst zwei fundamentale Prozesse, die in den zwei folgenden Reaktionen zusammengefasst werden können:
    Figure 00050001
    CO2ATP + NADPH + H+ → (CH2O)n + ADP + Pi + NADP+ (2)
  • Während der ersten Reaktion in Gegenwart von Licht werden Protonen von Chloroplasten aus Wasser aufgenommen, um ATP zu erzeugen. Die zweite Reaktion besteht darin, NADPH und ATP in einer Reihe von Reaktionen zu verwenden, die zur Reduktion von Kohlensäureanhydrid zu Glucosiden, hauptsächlich Stärke, führen. Diese zwei Reaktionen treten gleichzeitig auf; Produkte, die im Prozess (1) gebildet werden, werden in die Reaktion von Prozess (2) geleitet. Insgesamt führt die Fotosynthese zur Produktion von Zuckern in Form von Stärke und Saccharose und Energie in Form von ATP-Molekülen:
  • Figure 00050002
  • Die Lichtaktivierung folgt einem bestimmten Stoffwechselweg in den Thylakoiden. Licht wird zuerst durch die Lichtantenne (LHCII) gesammelt und die Energie wird in das Reaktionszentrum (PSII) gebracht und schließlich zu PSI, das auch einen unabhängigen Lichtkollektor (LHCI) hat. Thylakoide haben Funktionen, um Licht zu sammeln und Lichtenergie an den richtigen Ort für die weitere Fotosynthese zu bringen. Die Synthese von ATP und von Zuckern findet nicht in den Thylakoiden statt, sondern in anderen Chloroplastkompartimenten.
  • Chlorophylle sind die hauptsächlich aktiven Pigmente. Die Carotinoide haben mehr als eine Rolle, abhängig von ihrem Ort. Eine erste Rolle ist die Rolle als Lichtkollektoren, was zum Energietransfer von Carotinoiden zu Chlorophyllen führt. Eine zweite Rolle ist die Rolle als Fotoprotektoren, wobei dieses Mal der Energietransfer in die entgegengesetzte Richtung zwischen Chlorophyllen und Carotinoiden auftritt. Der Carotinoidsingulett-Zustand hat mehr Energie als ein Singulett-Chlorophyll, während im Gegensatz dazu der Carotinoidtriplett-Zustand weniger Energie hat als Triplett-Chlorophylle. Die Energiezustände haben eine natürliche Tendenz, von einem hohen zu einem niedrigeren Energieniveau zu gehen, es wird davon ausgegangen, dass das Singulett-Carotinoid hauptsächlich als Lichtkollektor wirkt, der Lichtenergie zu einem Singulett-Chlorophyllmolekül leitet, während Triplett-Chlorophyll leicht seine Energie auf Triplett-Carotinoid überträgt, wenn Letzteres als Fotoprotektor in dem Reaktionszentrum dient. Carotinoide nehmen verschiedene Konfigurationen an, wenn sie mit Antennen oder Reaktionszentren assoziiert sind, wobei die Konfiguration für ihren Energiezustand bei Aktivierung verantwortlich sein kann. Eine "cis"-Konfiguration ist mit der Fotoprotektion im Reaktionszentrum verbunden. Eine "all-trans"-Konfiguration ist mit der Lichtkollektorfunktion der Antenne verbunden.
  • Die Übertragung von Energie ist nur unter solchen Bedingungen wirksam, unter denen die Pigmente einander sehr nahe sind und in einer spezifischen Organisation sind. Es ist daher sehr wichtig, die natürliche Organisation der Pigmente nicht zu stören, und die Membranen in einem integralen Zustand aufzubewahren, wenn man aktive oder voll aktivierbare Thylakoide isolieren möchte.
  • Ein Vorteil bei der Gewinnung von intakten Thylakoiden findet sich in ihrer Fähigkeit, ROS zu behandeln. Solche ROS sollen freie Radikale bezeichnen (einschließlich Superoxide) ebenso wie nicht radikalische Oxidationsmittel, wie Singulett-Sauerstoff (1O2) und Peroxide. Ein guter Überblick über die Definition und den Ursprung dieser Molekülarten findet sich in der Internationalen Veröffentlichung WO 94/13300.
  • Freie Radikale sind Atome, Ionen oder Moleküle, die ein ungepaartes Elektron enthalten. Freie Radikale sind gewöhnlich instabil und haben eine kurze Halbwertszeit. Elementarer Sauerstoff ist hoch elektronegativ und akzeptiert leicht Einzelelektronenübertragungen aus Cytochromen und anderen reduzierten zellulären Komponenten; ein Teil des von den Zellen verbrauchten O2, das an der aeroben Atmung beteiligt ist, wird einwertig reduziert zu dem Superoxidradikal (•O2 –). Die sequenzielle univalente Reduktion von •O2 – erzeugt Wasserstoffperoxid (H2O2), ein Hydroxylradikal (•OH) und Wasser.
  • Freie Radikale können aus vielen Quellen entstehen, einschließlich der aeroben Atmung, durch Cytochrom P 450 katalysierte Monooxygenierungsreaktionen von Wirkstoffen und Xenobiotika (z.B. Trichlormethylradikale, CCl3•, die durch Oxidation aus Tetrachlorkohlenstoff gebildet werden) und ionisierende Strahlung. Wenn z.B. Gewebe einer Gammastrahlung ausgesetzt werden, wird die meiste an die Zellen abgegebene Energie durch Wasser absorbiert und führt zur Spaltung der kovalenten Sauerstoff-Wasserstoff-Bindungen in Wasser, was ein einzelnes Elektron am Wasserstoff und eines am Sauerstoff zurücklässt, was zwei Radikale H• und •OH erzeugt. Das Hydroxylradikal, •OH, ist das reaktivste in der Chemie bekannte Radikal. Es reagiert mit biologischen Molekülen und startet Kettenreaktionen und kann mit Purin- oder Pyrimidinbasen von Nucleinsäuren wechselwirken. Tatsächlich kann die durch Strahlung induzierte Carcinogenese durch Schädigungen von freien Radikalen initiiert werden. Auch der "oxidative Burst" von aktivierten Neutrophilen erzeugt z.B. überschüssiges Superoxidradikal, von dem angenommen wird, dass es ein wesentlicher Faktor bei der Erzeugung der cytotoxischen Wirkung von aktivieren Neutrophilen ist. Die Reperfusion in ischämischen Geweben erzeugt auch große Konzentrationen an Oxyradikalen, typischerweise Superoxid. Außerdem kann Superoxid physiologisch durch Endothelzellen erzeugt werden zur Reaktion mit Stickoxid, einem physiologischen Regulator, was Peroxynitrit, ONOO– bildet, das abgebaut werden kann und ein Hydroxylradikal •OH entstehen lassen kann. Zusätzliche Quellen für Oxyradikale sind eine "Leckage" von Elektronen aus aufgerissenen Mitochondrien oder Elektronentransportketten aus dem endoplasmatischen Retikulum, die Prostaglandinsynthese, die Oxidation von Catecholaminen und die Plättchenaktivierung. Viele radikalische Reaktionen sind für Zellkomponenten äußerst schädigend; sie vernetzen Proteine, mutagenisieren DNA und peroxidieren Lipide. Freie Radikale können, sobald sie gebildet sind, wechselwirken, um weitere freie Radikale und nicht radikalische Oxidationsmittel, wie Singulett-Sauerstoff (1O2) und Peroxide zu erzeugen.
  • Singulett-Sauerstoff ist eine besonders schädliche Verbindung, die an der Initiation oder dem Fortschreiten vieler Krankheiten oder Leiden beteiligt ist. Der Singulett-Sauerstoff ist auch am Abbau von Proteinen, wie Chlorophyllen beteiligt. Das ist der Grund, warum eine Fotoprotektion, die durch die Gegenwart von Carotinoiden beigetragen wird, wichtig wird. Carotinoide schützen die Chlorophylllebensdauer und Aktivität, sie schützen weiterhin die Integrität der Membranen, indem sie eine Proteindenaturierung verhindern. Carotinoide können die Energie von Triplett-Chlorophyllmolekülen einfangen; sie werden Triplett-Carotinoidmoleküle, die sich selbst regenerieren, während sie Wärme abgeben, wodurch die Ansammlung von Triplett-Chlorophyll vermieden wird und die Chance, dass Chlorophyll abgebaut wird, minimiert wird.
  • In Gegenwart von überschüssigem Licht kann jedoch eine Schädigung auftreten, die durch Bildung von Chlorophyll im "Triplett-Zustand" entstehen kann. In einem Triplett-Zustand haben zwei Elektronen in der äußeren Schale eine identische statt eine entgegengesetzte Spin-Orientierung. Dieses Triplett-Chlorophyll reagiert leicht mit Sauerstoff, was zu dem sehr reaktiven Singulett-Sauerstoff führt, der Proteine schädigen kann. Um dieser schädigenden Reaktion entgegenzuwirken, sind die Carotinoide gewöhnlich in enger Nachbarschaft zu Chlorophyllen vorhanden. Viele Carotinoide "fangen" Triplett-Zustände von Chlorophyll wirksam ab, wodurch die Bildung von Singulett-Sauerstoff vermieden wird. Chlorophyll in der freien Form ist sehr toxisch im Licht in Gegenwart von Sauerstoff, da eine enge Wechselwirkung mit Carotinoiden nicht immer unter solchen Umständen verfügbar ist. Daher wird alles Chlorophyll in einer Zelle in aeroben Organismen an Proteine gebunden, wobei im Allgemeinen Carotinoide an das gleiche Protein gebunden sind.
  • Eine Hauptschwierigkeit beim Messen der Enzymkinetik mit relativ kurzen Zeitskalen (weniger als 1 ms) besteht darin, dass "traditionelle" Enzymreaktionen ein Vermischen von Substrat und Enzym erfordern, was gewöhnlich eine relativ lange Zeit dauert. Die kinetische Analyse von durch Licht ausgelösten Reaktionen, wie ein fotosynthetischer Elektronentransport, haben einen großen Vorteil in dieser Hinsicht: Die Reaktionen können einfach durch einen Lichtpuls angeschaltet werden, der sogar noch kürzer als 1 ps sein kann. Außerdem haben viele der Komponenten, die an dem Elektronentransfer teilnehmen, unterschiedliche Absorptionsspektren abhängig davon, ob sie in oxidierter oder reduzierter Form sind. Unter Verwendung von Laserspektroskopiemethoden oder der standardmäßigeren optischen Spektroskopie ist es relativ einfach, das Elektron in einer Zeitskala zwischen 1 ps und mehreren ms zu verfolgen. Die primäre Ladungstrennung tritt während mehrerer ps auf und die Reaktionen werden nach und nach langsamer, wenn sie Komponenten beteiligen, die weiter weg vom Reaktionszentrum sind. Wegen der schnellen Geschwindigkeit der frühen Reaktionen werden Elektron und "Elektronenloch" physikalisch schnell durch einen großen Abstand getrennt (das Elektron innerhalb 1 ns nach der Ladungstrennung ist etwa 2 nm zur anderen Seite der Membran gewandert), so dass Rückreaktionen (Ladungsrekombinationen) nicht mehr begünstigt sind. Ungepaarte Elektronen auf Reaktanten, die vorübergehend während Redoxreaktionen gebildet werden unter Beteiligung des Transfers eines einzelnen Elektrons können in vielen Fällen unter der Verwendung von Elektronen-paramagnetischer-Resonanz (EPR) und abgeleiteten Techniken (einschließlich ENDOR, Elektronenkerndoppelresonanz und ESEEM, Elektronenspinecho-Hüllenmodulation) nachgewiesen werden. Viele dieser Techniken können verwendet werden, um Redoxreaktionen kinetisch zu verfolgen und liefern detaillierte Informationen im Hinblick auf die Elektronenspinverteilungen etc. Daher haben fotosynthetische Membranen und Reaktionszentren einen prominenten Platz als Versuchssysteme in der Biochemie und Biophysik.
  • Das antioxidative Potenzial einer Verbindung, wie Chlorophyll, ist beispielhaft in Gleichung (1) ausgeführt: 3Chl* + 3O2 → Chl + 1O2* (1)
  • Chlorophyll, das in Gegenwart von Sauerstoff angeregt worden ist, kommt in einen Triplettzustand (3Chl–) und desaktiviert, um in einen Grundzustand zurückzukehren, indem in Zellen Singulettsauerstoff (eine schädliche Molekülart) erzeugt wird. Es wurde gefunden, dass Pflanzen ein wirksames Mittel haben, mit dem sie das Problem der Überproduktion von Singulettsauerstoff lösen können. Die Pflanzen übertragen die Chlorophyllenergie auf ein anderes Pigment, das einen niedrigeren Energiezustand hat. Dieses Pigment, das Carotinoid genannt wird (Gleichung 2) ist reichlich in Pflanzen vorhanden. 3Chl* + Car → Chl + 3Car* (2)
  • Obwohl Triplettchlorophyll mehr Energie hat als das entsprechende Carotinoid, trifft das Gegenteil für den Singulettzustand zu. Wie in den Gleichungen 3a und 3b gezeigt, überträgt ein aktiviertes Singulettcarotinoid seine Energie auf ein Chlorophyllmolekül, das in einem Singulettzustand aktiviert wird. Car + Energie → 1Car* (3a) 1Car* + Chl → Car + 1Chl* (3b)
  • Carotinoide in einem Triplettzustand desaktivieren ohne Bildung einer schädlichen Sauerstoffart. Die Gleichung 4 zeigt, dass Carotinoide inaktiviert werden, indem sie in einen Grundzustand zurückkehren und durch Ableitung von Wärme. 3Car* → Car + Wärme (4)
  • Offensichtlich ist es wichtig, kein ROS zu erzeugen, um die Eigenschaften der Pigmente in einem Extrakt zu konservieren, aber es ist auch wichtig, solches ROS zu entfernen, das während der Isolierung erzeugt worden sein könnte. Um dies zu erreichen, haben wir einen Weg begünstigt, um das Gleichgewicht von Gleichung 1 umzukehren. Demzufolge wird die umgekehrte Gleichung 1 in Gleichung 5 gefunden. Chl + 1O2* → 3Chl* + 3O2 (5)
  • Um eine Umkehr der Gleichung 5 zu vermeiden, muss das aktivierte Triplettchlorophyllmolekül in engem Kontakt zu einem Carotinoid im Grundzustand sein, das die übertragene Energie aufnimmt und letztere als Wärme abgibt. Dieser Weg der Reversibilität von Gleichung 5 ist insoweit beschränkt, als Chlorophyll und Carotinoidpigmente sehr eng beieinander gefunden werden können, um ihre Energie aufeinander zu übertragen.
  • Aus der obigen Gleichung 5 ist es offensichtlich, dass es, um einen Extrakt zu erhalten, der optimal aktiv ist, es bevorzugt ist, jede mögliche Maßnahme zu ergreifen, um beide Pigmente (Chlorophyll und Carotinoid) in ihrem Grundzustand zu halten. Isolierte Carotinoide, z.B. Carotinoide, die nicht in Thylakoidstrukturen organisiert sind, könnten die Triplettchlorophyllmoleküle nicht wirksam löschen oder absättigen. Der Vorteil, organisierte Pigmente zu haben, besteht darin, dass der Extrakt die Dynamik der natürlichen Thylakoidmembranen aufrechterhält, was ihnen die Fähigkeit gibt, ROS einzufangen, die Energie zu übertragen und in einen Zustand zurückzukehren, bei dem neue Aktivierungszyklen durchlaufen werden können. Diese Dynamik und diese Fähig keit zu regenerieren sind einzigartig bei organisierten Pigmenten. Es ist wichtig anzumerken, dass die obigen Reaktionen spontan erfolgen und dies in Abwesenheit von Licht. Diese Beobachtung ist wichtig von einem therapeutischen Standpunkt aus gesehen, da die innere Verabreichung eines Thylakoidextraktes die Gegenwart von Licht ausschließen würde.
  • Thylakoide mit optimierter Konfiguration und optimierten Carotinoidanteilen behalten die volle Aktivität insbesondere im Hinblick auf ROS. Ein solches Antioxidans ist nützlich, um das Ausbrechen von Krankheiten oder Leiden zu vermindern, die die Produktion von ROS beinhalten. Solche Krankheiten oder Leiden können solche sein mit einer Etiologie, die mit Entzündung, Krebs und dem Kontakt mit Strahlung in Beziehung steht. Solche Krankheiten oder Leiden beinhalten solche, die die Haut betreffen: wie Brandwunden, Sonneneinstrahlung, Psoriasis, Dermatitis; Gehirn: wie Trauma, Schlaganfall, Parkinson, Neurotoxine, Demenz, Alzheimer; Gelenke: wie Polyarthritis und Arthrose; Gastrointestinaltrakt: wie Diabetes, Pankreatitis, Schädigung der Leber durch Endotoxin, ischämischer Darm; Auge: wie Kataraktogenese, Retinopathie, degenerative Netzhautschädigung; Gefäße: wie Atherosklerose und Vasculitis; Erythrozyten: wie Fanconi-Anämie, Malaria; Herz: wie Coronarthrombose; Lunge: wie Asthma, COPD; Niere: wie Transplantation, Glomerulonephritis; Multiorgan: wie Enzündung, Krebs, Ischämie-Rückflusszustände, Drogentoxizität, Eisenüberladung, Ernährungsmängel, Alkoholtoxizität, Strahlung, Alterung, Amyloidkrankheiten und toxischer Schock. Literatur, die sich mit der Beteiligung von ROS an einigen Krankheiten befasst, ist im Folgenden angegeben: Haut:
    Brandwunden Youn, 1992
    Sonnenstrahlung Golan, 1994
    Psoriasis Lange, 1998a, b
    Dermatitis Polla, 1992
    Gehirn:
    Trauma Juurlink, 1998
    Schlaganfall El Kossi, 2000
    Parkinson Ebadi, 1996
    Neurotoxine Foler, 2000
    Alzheimer Smith, 2000
    Gelenke:
    Polyarthritis Cimen, 2000
    Gastrointestinaltrakt:
    Diabetes Gerber, 2000
    Pankreatitis Sakorafas, 2000
    Schädigung der Leber durch Endotoxin McGuire, 1996
    Ischämischer Darm Lai, 2000
    Auge:
    Kataraktogenese Eaton, 1994
    Retinopathie bei Unreife Hardy, 2000
    Degenerative Netzhautschädigung Castagne, 2000
    Gefäße:
    Atherosklerose Singh, 1997
    Erythrozyten:
    Anämie Anastassopoulou, 2000
    Malaria Ginsburg, 1999
    Herz:
    Coronarthrombose Chen, 1995
    Lunge:
    Asthma Montuschi, 1999
    COPD Montuschi, 2000
    Niere:
    Glomerulonephritis Barros, 2001
    Multiorgan:
    Transplantation Jonas, 2000
    Entzündung El-Kadi, 2000
    Krebs Prior, 2000
    Ischämie Lewen, 2000
    Drogentoxizität Sinha, 1990
    Eisenüberladung Karbownik, 2000
    Ernährungsmängel Olszewski, 1993
    Alkoholtoxizität Lieber, 1997
    Alterung Cadenas, 2000
    Strahlung Bednarska, 2000
    Amyloidkrankheiten Floyd, 1999.
  • Es wurde gefunden, dass Thylakoide der Erfindung außer für therapeutische Anwendungen vorteilhaft von Chloroplasten abgeleitete Zusammensetzungen des Standes der Technik ersetzen können, die als Biosensoren oder Biofilter oder Bioreaktoren getestet wurden. Der Stand der Technik auf diesem Gebiet lehrt diese spezifischen Verwendungen, aber den von Chloroplasten abgeleiteten Zusammensetzungen fehlt die Stabilität und sie bauen sich sehr schnell ab, was sie aus wirtschaftlichen Gründen unpraktisch macht. Daher könnte ein stabiler und dynamischer Thylakoidextrakt vorteilhaft diese nicht funktionierenden von Chloroplasten abgeleiteten Zusammensetzungen ersetzen.
  • Biosensoren:
  • Der Nachweis toxischer Produkte ist wertvoll, um Umweltrisiken auszuwerten, die mit der Gegenwart von Kontaminanten verbunden sind. Richtige Bioassays würden normalerweise lebende Organismen beteiligen und würden die folgenden Minimalbedingungen erfüllen:
    • i) sie sollten repräsentativ für die natürliche Umgebung sein
    • ii) sie sollten reproduzierbar sein
    • iii) sie sollten zuverlässig sein, um keine oder fast keine falschen Ergebnisse zu liefern und
    • iv) sie sollten empfindlich sein.
  • Der Nachweis von Toxizität sollte auch eine ausreichende Flexibilität zur Analyse verschiedener Arten von kontaminierten Proben liefern. Die Toxizität sollte idealerweise in Echtzeit überwacht und nachgewiesen werden. Der Toxizitätsnachweis findet Anwendung in mindestens drei Industriebereichen: Papierindustrie, Analyse von kontaminierten Böden und Landwirtschaft. In all diesen Fällen sind Informationen notwendig über die Gegenwart von Kontaminanten, um schnell eine unerwünschte Situation zu korrigieren.
  • Ein Hauptproblem, das mit den aktuellen Technologien zum Nachweis von toxischen Produkten verbunden ist, ist die lange Verzögerung, bis die Ergebnisse von biologischen Tests erhältlich sind, von 48 bis 96 Stunden, wenn Organismen wie Forellen oder Daphnea magna verwendet werden. Eine gute Nachweiseinrichtung wäre eine, die sich von den verfügbaren üblichen biologischen Tests unterscheidet durch Verwendung von Material, das Messungen eines kontaminierten Potenzials eines Effluens in Echtzeit und kontinuierlich zulässt. Obwohl einige biologische Detektoren oder Biodetektoren im Handel erhältlich sind, die Fluoreszenz messen, die durch eine fotosynthetische Aktivität bei Pflanzen erzeugt wird, wäre ein System, das die Messung von elektrischen Ladungen zuließe, die durch Gegenwart von Licht induziert werden und durch die Gegenwart von Kontaminanten moduliert würden, ideal. Diese Technologie wäre viel billiger, als die fluorimetrische Technik. Es wird angenommen, dass für eine Technik, die die fotosynthetische Aktivität auswerten würde, Thylakoidmaterial insgesamt gegenüber fluorometrischen Methoden bevorzugt wäre, das die Aktivität eines spezifischen Proteinkomplexes, nämlich PSII misst. Eine Vorrichtung mit Thylakoidmaterial wäre daher von Vorteil, um die Toxizität in einem größeren Wirkungsspektrum zu messen. Eine solche Nachweiseinrichtung würde die Anzahl von Elektronen messen, die durch eine gegebene Lichtintensität erzeugt wird. Ein Strom (Epmax), der nach wenigen Sekunden erhalten wird, sollte proportional zur fotosynthetischen Aktivität der Thylakoide sein. Wenn der Fotostrom gegen die Konzentration der Kontaminanten aufgetragen wird, sollte eine typische sigmoidale Kurve erhalten werden, von der ein geschätzter EC50 abgeleitet werden könnte.
  • Ein Fotostrom wurde bereits 1976 von Allen und Crane gemessen. Es wurde gefunden, dass der Elektronentransport ein zuverlässiges und repräsentatives Maß der globalen fotosynthetischen Aktivität und der physiologischen Gesundheit einer Pflanze bildet. Aus der Arbeit von Allen und Crane ist ableitbar, dass ein Extrakt, der eine große Stabilität hätte und außerdem eine Dynamik und Fähigkeit den Zustand, in dem er auf Kontaminanten und Licht reagiert, zu regenerieren, höchst bevorzugt wäre gegenüber bekannten Vorrichtungen. Ein Detektor würde die Anzahl von Elektronen messen, die eine gegebene Lichtintensität erzeugt. Ein maximaler Wert für den Fotostrom (Ipmax), der nach wenigen Sekunden erhalten wird, ist proportional zu der fotosynthetischen Aktivität der Thylakoidmembranen. Wenn man Ipmax gegen die Konzentration eines fotosynthetischen Inhibitors (ein Kontaminant oder Schadstoff), das in der Fotoumwandlungskammer vorhanden ist, aufträgt, wird eine typische Sigmakurve erhalten. Die Inhibitorwirkung kann leicht ausgewertet werden (IC50). Eine Nachweiseinrichtung würde umfassen: eine Quelle für Weißlicht, eine Fotoumwandlungskammer, die zwei Elektroden aufnimmt, eine Nachweiseinrichtung, um elektrische Ströme zu messen, die durch Licht induziert werden, und einen Computer, um Daten zu sammeln und zu verarbeiten (elektrische Ströme). Eine Flüssigkeitsprobe mit einem toxischen Mittel, einem Kontaminanten oder einem Schadstoff, der zu identifizieren oder zu messen ist, wird mit einem Thylakoidmembranextrakt in Kontakt gebracht. Sobald die Mischung in die Kammer eingeführt worden ist, wird eine kurze Beleuchtung angewendet (weniger als 1 Minute). Die Vorrichtung oder das Instrument können an das Verfahren angepasst werden und eine Vielzahl von Proben gleichzeitig analysieren.
  • Biofilter/Bioreaktoren:
  • Da der Fotosyntheseapparat in Pflanzen nicht nur Photonen einfangen kann, sondern auch Moleküle einfangen und ansammeln kann mit einer Affinität für seine Komponenten wird davon ausgegangen, dass der vorliegende Extrakt auch die gleiche Fähigkeit hat, wie die Pflanze selbst. Da einige der eingefangenen Moleküle prozessiert werden können, würde der vorliegende Extrakt auch als Bioreaktor wirken. Die Moleküle, die dafür empfänglich sind, eingefangen zu werden, sind z.B. Herbizide, Insektizide, Fungizide, Harnstoff, Ionen und Schwermetalle ebenso wie Gase, z.B. O3, CO, H2S, NO, CO2, O2. Der erfindungsgemäße Biofilter wäre vielseitig und würde Temperaturvariationen widerstehen.
  • Es gibt kein bestehendes praktisches Verfahren im Stand der Technik, das lehrt, wie intakte funktionelle Thylakoide gewonnen werden können, die ihre Aktivität über einen praktischen Zeitraum erhalten.
  • Es ist offensichtlich aus dem obigen, dass die Pflanzen eine hohe natürliche Fähigkeit haben, mit bedrohlichen Situationen umzugehen. Die Thylakoide sind besonders angepasst, um solchen extremen Situationen zu widerstehen und sich daran anzupassen.
  • U.S.-Patent 4 698 360 beschreibt einen Pflanzenextrakt, der Proanthocyanidine enthält, die als Fänger für freie Radikale nützlich sind. Das Verfahren zur Herstellung dieses Extraktes beinhaltet die folgenden Stufen:
    • a) es wird ein grobes Pulver der Rinde von Meerkiefern erhalten;
    • b) dieses wird in siedendem Wasser extrahiert;
    • c) Flüssigkeiten und Feststoffe werden abgetrennt;
    • d) die Flüssigkeit wird auf Umgebungstemperatur gekühlt;
    • e) Filtration;
    • f) Ausfällung durch "Aussalyen", um unerwünschtes Material zu entfernen;
    • g) aktive Inhaltsstoffe werden in Ethylacetat extrahiert;
    • h) die organische Phase wird getrocknet;
    • i) Feststoffe werden wieder suspendiert und die aktiven Inhaltsstoffe mit Chloroform wieder ausgefällt und
    • j) die Feststoffe werden vor einer fortgeschrittenen Reinigung wieder suspendiert.
  • Diese Literaturstelle befasst sich mit der Isolierung einer spezifischen Art von aktivem Inhaltsstoff und nicht mit der Herstellung von Thylakoiden, die einen Hauptanteil an fotosynthetischen Komponenten enthalten würden, in anderen Worten, bei denen Pigmente nicht voneinander getrennt würden.
  • Diese Literaturstelle ist tatsächlich typisch für Lehren im allgemeinen Stand der Technik, in dessen Bereich die vorliegende Erfindung gehört. Der Stand der Technik betrifft systematisch die Isolierung von einer oder mehreren gegebenen Pflanzenkomponenten und nicht die Isolierung von intakten Thylakoiden, die einen Hauptanteil ihrer Inhaltsstoffe enthalten, die in ihrem integralen und funktionellen Zustand konserviert sind.
  • Wang et al. (1988), Acta Phytophysiologica Sinica 14 (4): 380–384 offenbart die Isolierung und Reinigung von Chloroplasten CF1-ATPase aus Erbsensamen.
  • Yoshihira et al. (1988) beschreibt in Galaxea 7: 33–40 die Isolierung von Thylakoidpräparaten aus Mangrovenblättern. Die Autoren schließen, dass es keine beschränkenden Faktoren für die Isolierung von fotoaktiven Thylakoidpräparaten aus Mangrovenblättern, B. gymnorrhiza, gab, außer dem Erfordernis für PEG und ein bestimmtes Reduktionsmittel im Mahlmedium.
  • Glick et al. (1985) beschreiben in Planta 164: 487–494 die Variationen in stöchiometrischen Verhältnissen von Fotosystem II und I (PSII/PSI), wenn Erbsen verschiedenen Arten von Licht ausgesetzt werden. Die Elektronentransportfähigkeit von PSI und PSII in Gegenwart von Indikatoren, wie 2,5-Dimethyl-p-benzochinon und NADP, die für PSII bzw. PSI spezifische Indikatoren sind. Obwohl grünes Licht verwendet wird, das eine nicht aktivierende Lichtumgebung ist, wird es nicht verwendet, um die Pflanze zu konditionieren in einem Verfahren mit dem Ziel, intakte und aktivierbare Thylakoide zu isolieren. Die Literaturstelle betrifft im Wesentlichen die Untersuchung der Zusammensetzung von Chloroplasten und nicht die Konservierung der Thylakoidaktivität als Funktion einer gegebenen Lichtqualität und Intensität. Die Pflanzen werden stattdessen in verschiedenen Lichtarten konditioniert, die an roten Wellenlängen abgereichert oder angereichert sind. Diese Literaturstelle betrifft nicht die Tatsache, dass die fotosynthetischen Pigmente eng beieinander gehalten werden sollten, um die Energieübertragung zwischen Chlorophyllen und Carotinoiden zu begünstigen und das Einfangen von freien Radikalen zu begünstigen. Somit werden in dieser Literaturstelle die Bedingungen, die zur Isolierung von fotosynthetischen Pigmenten in ihrem natürlichen Zustand in Thylakoiden führen, nicht spezifisch angegeben und erfüllt.
  • Mason et al. (1991) lehren in Plant Physiol. 97: 1576–1580 ein Verfahren, um Chloroplasten zu isolieren, das eine Stufe der erzwungenen Passage einer Pflanzensuspension durch eine 27-Nadel mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/s verwendet, statt eine Dispersionsstufe mit Homogenisierung zu verwenden. Die Pflanzenlösung enthält einen Puffer mit einem pH von 7,5 und enthält 0,3 M Sorbit. Das Präparat, das durch die Nadel gedrückt worden ist, wird mit einem Percoll-Gradienten zentrifugiert und die Chloroplasten werden von anderen Bestandteilen, einschließlich der Thylakoide, getrennt. Dieses Verfahren ist daher verschieden von dem vorliegenden Verfahren, das im Wesentlichen die Gewinnung von Thylakoiden zum Ziel hat unter Verwendung von ziemlich einfachen Stufen und Reaktanten, wobei das vorliegende Verfahren auch leicht im Maßstab zu vergrößern ist. Die Lichtbedingungen werden in dieser Literaturstelle nicht erwähnt. Weiterhin sind die Bedingungen, um Chloroplasten integral zu halten, offensichtlich nicht die gleichen Bedingungen, um Chloroplasten zu zerstören. Im vorliegenden Verfahren werden die Chloroplasten zerstört, aber die Thylakoidmembranen werden im Wesentlichen intakt gewonnen. Diese Literaturstelle kann daher die vorliegende Erfindung nicht zeigen.
  • Die kanadische Patentanmeldung 2 110 038 beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung von Pflanzenextrakten. Diese Extrakte sind jedoch Zellfluide oder -säfte und nicht Thylakoidmembranen. Der Entzug von Wasser als natürlichem Elektronendonator aus Membranen, um Thylakoide zu stabilisieren, wird in dieser Literaturstelle nicht erwähnt.
  • Im Hinblick auf das vorher Gesagte wurde kein praktisches Verfahren im Stand der Technik gelehrt, das zur Isolierung von intakten und funktionellen Thylakoidmembranen führen würde. Es gibt weiterhin keine Lehre zu solchen Bedingungen, die Thylakoidkomponenten stabilisieren. Es gibt schließlich keine Lehre, isolierte Thylakoidmembranen zu verwenden, um Zellkomponenten von ROS zu befreien.
  • Es gibt daher eine offene Herausforderung, ein Verfahren zu entwickeln, um aktive Thylakoide zu erhalten, die über einen annehmbaren Zeitraum integral und gegebenenfalls aktivierbar bleiben und die bei Reaktivierung als Antioxidans wirken können durch ihre ROS abfangende Aktivität. Obwohl zunehmend Literatur erhältlich ist zu Fotosystemkomponenten, hat niemand ein praktisches Verfahren veröffentlicht, bei dem die Bedingungen der Isolierung und Konservierung der Thylakoidaktivität gelehrt werden.
  • Außerdem wird, da freie Radikale für den Abbau vieler Zellkomponenten verantwortlich sein könnten, erwartet, dass ihr Einfang andere Pflanzenbestandteile schützen könnte. Das vorliegende Verfahren würde daher eine verbesserte Ausbeute an Pflanzenkomponenten außer Thylakoiden erzeugen.
  • Weil ein Bedarf für starke Antioxidantien besteht, insbesondere auf dem pharmazeutischen Gebiet, wäre ein Verfahren, das solche Antioxidantien liefert ebenso wie Antioxidantien, die per se eine starke Wirkungskraft ebenso wie eine anhaltende Aktivität haben, sehr erwünscht. Weiterhin besteht ein Bedarf für biologisches Material, das als Sensor oder Detektor, Einfangmittel oder Filter, Bioreaktor oder Erzeuger von biologischen Molekülen nützlich ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, ein einfaches Verfahren bereitzustellen, um einen Extrakt mit funktionellen Thylakoiden zu erhalten. Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren, bei dem Thylakoide von anderen Zellkomponenten gereinigt werden. Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, einen stabilisierten Extrakt bereitzustellen, der nicht isolierte oder isolierte Thylakoide enthält. Der stabilisierte Extrakt ist im Wesentlichen frei von irgendwelchen Elektronendonatoren, die die Thylakoide aktivieren würden. Da der am reichlichsten vorhandene Elektronendonator Wasser ist, ist der stabilisierte Extrakt daher bevorzugt wasserfrei. Wasser kann durch ein Lösungsmittel oder z.B. durch Trocknen entfernt werden. Ein amphoteres Lösungsmittel, insbesondere ein Tensid, wie Propylenglycol, wurde mit Erfolg ausprobiert. Diese Art von Lösungsmittel zerstört die strukturellen Komponenten der Membran nicht und hat den Vorteil, Wassermoleküle zu ersetzen und die Bildung von Aggregaten bei Wiederauflösung in einer wässrigen Lösung zu verhindern. Der stabilisierte Extrakt hat eine längere Lebensdauer ohne wesentlichen Verlust der Aktivität, so lange kein Elektronendonator, wie Wasser, zugegeben wird. Der stabilisierte Extrakt wird unvorbereitet vor der Verwendung wieder hydratisiert, um die Aktivierung zu beginnen. Die Aktivität des Extraktes dauert, wenn sie einmal aktiviert ist, viel länger als bei jedem anderen bekannten Antioxidans, was auf einen bestimmten Grad von Regeneration der Aktivität hindeutet statt einer schnellen und vollständigen Erschöpfung. Weiterhin passt sich die antioxidative Wirksamkeit an, so dass sie sich erhöht oder abnimmt je nach dem Ausmaß des oxidativen Angriffs.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren, wie in Anspruch 1 definiert, zur Verfügung gestellt.
  • Die Erfindung liefert ein Verfahren, um einen Extrakt zu erhalten, der aus fotosynthetischen Organismen erhältlich ist, der Thylakoide aufweist, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, dass:
    • a) eine Suspension von Bestandteilen des Organismus bereitgestellt wird, der Thylakoide enthält;
    • b) die Bestandteile aufgerissen werden, während Thylakoide unter solchen Lichtbedingungen gewonnen werden, die die Aktivierung der fotosynthetischen Pigmente der Thylakoide minimieren in einem Medium mit einer Viskosität zwischen 1 und 1,3 centipoise und einem pH-Wert von mehr als 2 und weniger als 10, wobei das Medium in einem Volumen zugegeben wird, das nach der folgenden Gleichung berechnet wird:
      Figure 00150001
      wobei ein erster Extrakt, der im Wesentlichen aus Thylakoiden, Zellbruchstücken/Membranen gebildet wird, und eine flüssige Phase erhalten werden, wobei die Thylakoide organisierte fotosynthetische Pigmente in ihrem Grundzustand aufweisen;
    • c) Thylakoide, Zellbruchstücke/Membranen und flüssige Phase voneinander getrennt werden, um einen zweiten, dritten und vierten Extrakt zu bilden, der im Wesentlichen aus isolierten Thylakoiden, Zellbruchstücken/Membranen bzw. einer flüssigen Phase gebildet wird, und
    • d) jeglicher Elektronendonator aus dem ersten, zweiten und dritten Extrakt entfernt wird, um die fotosynthetischen Pigmente in ihrem Grundzustand zu stabilisieren.
  • Bevorzugt liegt das Ergebnis der obigen Gleichung zwischen 25 und 150.
  • Der pH-Wert des Mediums liegt bevorzugt zwischen 5 und 8, bevorzugter zwischen 7 und 7,5.
  • Die Suspension von Stufe a) kann erhalten werden, indem die Bestandteile oder Gewebe des Organismus in dem Medium mechanisch dispergiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform geht der Stufe a) eine Stufe voraus, in der der Organismus einem konditionierenden Parameter ausgesetzt wird, der ausgewählt ist aus Licht, osmotischer Belastung, Wärme, Kälte, Einfrieren, Trockenheit, Hormonen, chemischen und biologischen Induktoren.
  • In der am meisten bevorzugten Ausführungsform geht der Stufe a) eine Stufe voran, in der der Organismus in Lichtumgebung mit einer Wellenlänge, die zwischen 500 und 600 nm liegt, konditioniert wird und Stufe b) wird unter den gleichen Lichtbedingungen ausgeführt.
  • Die Viskosität wird teilweise durch Zugabe eines Zuckers erreicht. Der Zucker kann in einer Konzentration von bis zu 1,5 M und mehr zugegeben werden. Bevorzugt ist eine Saccharosekonzentration von etwa 0,2 bis 0,4 M in der Lösung vorhanden oder ein Zucker, der eine Viskosität erzielt, die 0,2 bis 0,4 M Saccharose äquivalent ist.
  • Ein spezifisches Beispiel für ein Medium, das für das obige Verfahren verwendet wird, ist: Tris- oder Acetat- oder Ascorbatpuffer (20 mM, pH 7,0 bis 7,5) und Sorbit oder Saccharose 350 mM.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgende Stufe c): dass Thylakoide, Zellbruchstücke/Membranen und flüssige Phase voneinander getrennt werden, um einen zweiten, dritten und vierten Extrakt zu bilden, die im Wesentlichen aus isolierten Thylakoiden, Zellbruchstücken und Membranen bzw. der flüssigen Phase gebildet werden.
  • Die Stufe des Trennens wurde insbesondere durchgeführt basierend auf der Differenz des Sedimentationskoeffizienten von Thylakoiden, Zellbruchstücken und Membranen und flüssiger Phase.
  • Ein spezifisches Beispiel einer solchen Trennungsstufe beinhaltet, dass der erste Extrakt 10 Minuten mit 10.000 g in einem Röhrchen zentrifugiert wird, das mit einem Filter im oberen Teil des Röhrchens ausgestattet ist, wobei der Filter eine geeignete Porosität hat, so dass sich Zellbruchstücke und Membranen abscheiden, während Thylakoide und die flüssige Phase durch den Filter hindurchtreten, wobei die Thylakoide im unteren Teil des Röhrchens ein Pellet bilden. Alternativ kann eine grobe Reinigung erreicht werden, indem Zellbruchstücke und Membranen zuerst gewonnen werden, indem sie z.B. gepresst und/oder filtriert werden, gefolgt z.B. von einer feineren Reinigung, z.B. indem Thylakoide von der flüssigen Phase getrennt werden.
  • Nach der Auftrennung kann vom ersten bis vierten jeder Extrakt stabilisiert werden, indem die folgende Stufe d) zugefügt wird: dass jeglicher Elektronendonator aus den Extrakten entfernt wird, um die fotosynthetischen Pigmente zu inaktivieren und zu stabilisieren, bevorzugt in Gegenwart von Zuckern (die Komponenten gegen Kälte schützen können). Der zweite und dritte Extrakt werden bei dieser Stufe besonders angesprochen.
  • Der erste in Betracht gezogene Elektronendonator ist Wasser, so dass die Extrakte so verarbeitet werden, dass sie wasserfrei sind.
  • Wasser kann durch Vakuumgefriertrocknung entfernt werden oder indem es gegen ein nicht denaturierendes amphoteres Lösungsmittel oder Tensid nach Stufe c) ausgetauscht wird, wobei nicht denaturierend bedeutet, dass es die strukturellen Komponenten des Thylakoids nicht dissoziieren oder schädigen kann.
  • Ein amphoteres Lösungsmittel, das mit Erfolg angewendet wurde, ist Propylenglycol.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, Produkte bereitzustellen, die mit dem obigen Verfahren entstehen. Ein reiner Thylakoidextrakt mit der Fähigkeit aktiviert zu werden, wird zuerst bereitgestellt. Ein stabilisierter Extrakt ist bevorzugt. Der obige dritte Extrakt, der reich an Thylakoiden und cellulosischem Material ist, kann in stabilisierter Form vorliegen. Die stabilisierte Form für Thylakoide kann getrocknet werden oder in einem Medium enthalten sein mit einem amphoteren Lösungsmittel, wie Propylenglycol. Ersterer ist in einem unlöslichen Zustand oder in Form einer Suspension, letzterer bildet eine Lösung. Extrakte, die Thylakoide enthalten, werden in Gegenwart eines Elektronendonators wieder aktiviert. Der erste in Betracht gezogene Elektronendonator ist Wasser. Die Extrakte wirken, sobald sie aktiviert sind, als dynamische Fänger von ROS.
  • Für nutrazeutische, kosmezcutische und pharmazeutische Anwendungen führt diese Fängeraktivität zur Behandlung oder Verhütung von Krankheiten oder Leiden, die durch die Bildung von ROS vermittelt werden, insbesondere solche mit einer Etiologie, die mit Entzündung, Krebs oder dem Kontakt mit Strahlung in Beziehung stehen.
  • Eine erste abfangende und schützende Wirkung wird gegenüber Strahlung im Ultraviolettspektrum verwendet. Daher wird die topische Verwendung der Thylakoide durch die vorliegende Erfindung beschrieben und topische Zusammensetzungen, die die Thylakoide enthalten, liegen im Schutzbereich der Erfindung.
  • Es wurde gefunden, dass die Thylakoide die Fähigkeit haben, einen Photonen absorbierenden Film oder eine Photonen absorbierende Beschichtung auf einer Körperoberfläche, wie Haut oder Schleimhaut zu bilden. Diese Eigenschaft scheint von der ROS abfangenden Aktivität unabhängig zu sein. Die Extrakte, die Thylakoide in einer aktivierbaren Form oder nicht enthalten, dienen daher als Filter für Strahlung, nämlich im Ultraviolettbe reich. Wenn die Extrakte weiterhin funktionelle Thylakoide enthalten, haben sie eine doppelte Rolle als UV-Filter und als ROS abfangende Verbindung. Die Extrakte können weiter in einem Verfahren oder einer Zusammensetzung oder einer Vorrichtung zum Nachweis oder zum Abfangen von Molekülen oder zur Erzeugung oder Verarbeitung von Molekülen mit einer Affinität für Thylakoide oder Wechselwirkung mit ihrer Aktivität verwendet werden.
  • Beispiele für solche Moleküle sind Herbizide, wie Triazine (z.B. Herbizide vom Atrazin- und Diurontyp), Chinone, Chlorpromazin, Harnstoff, Formaldehyd, Alkylaminocyanoacrylate, Trypsin, Cyanoacrylat, Tris, Adeninderivate, Disulfiran (Metallkomplexbildner), Acetyl-CoA-Carboxylase, Digitonin, Schwermetalle (z.B. Cu, Zn, Cd, Pb, Hg, ...), SO2, NO2, NH2OH, Co2, CO, O3, O2, H2S, Calciumantagonisten (Calmodulinart), Sulfat, Sulfit, Bisulfit, Nitrit, Acetat, Lactat, Anionen, wie NO3 –, HCO3 –, HCO2 –, F–, NO2 –, HSO3 –, ....
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung wird unten beschrieben unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen und die beigefügten Figuren, deren Zweck es ist, die Erfindung zu erläutern, nicht aber ihren Schutzbereich zu beschränken.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die relative Antioxidansaktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung als Funktion des pH-Werts der exogenen Extraktionsflüssigkeit.
  • 2 zeigt die relative Aktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung als Funktion der Sorbitkonzentration, die in der Extraktionsflüssigkeit enthalten ist.
  • 3 zeigt die relative Aktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung als Funktion von Zeit und Zuckerkonzentration in der Extraktionsflüssigkeit. Jede Probe wurde bei –20°C aufbewahrt.
  • 4 zeigt die relative Aktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung als Funktion der Art des Zuckers in der Extraktionsflüssigkeit.
  • 5 zeigt die relative Aktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung als Funktion von verschiedenen Salzen, die zur Extraktion verwendet werden.
  • 6 zeigt die relative Aktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung (FRTS nicht stabilisiert) als Funktion von Zeit und Temperatur.
  • 7 zeigt die Auswahl der Zentrifugenbedingungen zur Optimierung.
  • 8 zeigt die relative Aktivität des Extrakts der vorliegenden Erfindung als Funktion des Anteils an Propylenglycol (Propan-1,2-diol), das in der Resuspensionslösung enthalten ist.
  • 9 zeigt Oxidationskurven. Kurve A zeigt eine Lipidoxidation ohne irgendein Antioxidans, Kurve B zeigt die Lipidoxidation in Gegenwart eines Antioxidans, das eine gewisse Lipidoxidation "zulässt"; Kurve C zeigt die Lipidoxidation in Gegenwart eines wirksamen Radikalketten brechenden Antioxidans, wie Vitamin E.
  • 10 erläutert die Oxidationskinetik von Lipiden PLPC, wobei B für Lipide ohne den Extrakt der Erfindung steht, D für Lipide in Gegenwart von Trolox steht, L für Lipide in Gegenwart eines aktiven Extrakts, der erfindungsgemäß hergestellt wurde, steht, und T für Lipide in Gegenwart von Lipiden, die mit einem inaktiven Extrakt behandelt wurden, steht.
  • 11 erläutert den Schutz, der durch einen Extrakt der vorliegenden Erfindung (Verdünnung 1:1.000) auf IMR-32-Zellen gegen Schädigungen ausgeübt wird, die durch zwei Konzentrationen von TBHP verursacht werden; 11a): 25 μM; 11b): 50 μM.
  • 12 zeigt den Schutz, der von zwei verschiedenen Verdünnungen des Extrakts der vorliegenden Erfindung auf IMR-32-Zellen nach TBHP-Behandlung ausgeübt wird; 12a): Verdünnung 1:1.000; 12b): Verdünnung 1:10.000.
  • 13 erläutert das Verhalten von Gehirnhyppocampusschnitten auf eine 120 Sekunden dauernde Epoxie und Gewinnung in Gegenwart einer Lösung, die den Extrakt der vorliegenden Erfindung enthält oder nicht (Kontrolle).
  • Der Ausdruck "Antioxidans", wie er hier verwendet wird, ist eine Substanz, die, wenn sie in einer Mischung oder Struktur, die ein oxidierbares biologisches Substrat enthält, vorhanden ist, die Oxidation des biologischen Substrats erheblich verzögert oder verhindert. Antioxidantien können wirken, indem sie biologisch wichtige reaktive freie Radikale oder andere ROS (Singulettsauerstoff •O2–, H2O2, •OH, HOCl-Ferryl, Peroxyl, Peroxynitrit, Alkoxyl ...) abfangen oder deren Bildung verhindern oder indem sie das freie Radikal oder ein anderes ROS in eine weniger reaktive Molekülart katalytisch umwandeln.
  • Das Antioxidans der vorliegenden Erfindung wird als solches angesehen, wenn es dann, wenn es zu einer Zellkultur oder Testreaktion zugegeben wird, eine nachweisbare Absenkung der Menge an freien Radikalen, wie Superoxid oder nicht radikalischem ROS, wie Wasserstoffperoxid oder Singulettsauerstoff, erzeugt im Vergleich zu einer parallelen Zellkultur oder einer parallelen Testreaktion, die nicht mit dem Antioxidans behandelt wurde. Geeignete Konzentrationen (d.h. wirksame Dosen) können mit verschiedenen Methoden bestimmt werden, einschließlich der Erzeugung einer empirischen Dosis-Wirkungs-Kurve, der Vorhersage der Wirksamkeit und Effizienz eines Kongeners unter Verwendung von QSAR-Methoden oder von Molekülmodellen und anderen Methoden, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Wissenschaften verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung soll auf dem medizinischen Gebiet verwendet werden, um Symptome, die mit einer ROS-assoziierten Krankheit oder einem Leiden verbunden sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu lindern, oder die Expression einer solchen Krankheit oder eines solchen Leidens zu vermindern. Eine solche Krankheit oder ein solches Leiden bezieht sich auf einen Zustand eines Individuums, der mindestens teilweise durch Erzeugung von oder Kontakt mit freien Radikalen, insbesondere Oxyradikalen und anderen "ROS" in vivo entsteht. Auch wenn es nur wenige, wenn überhaupt pathologische Zustände gibt, die monofaktoriell sind, gibt es zunehmend Literatur und Wissen in Bezug auf die Beteiligung von ROS an der Etiologie von Krankheiten. Aus diesen Gründen umfasst der Ausdruck "mit ROS assoziierte Krankheit" pathologische Zustände, die im Stand der Technik als Zustände erkannt werden können, bei denen angenommen wird, dass eine Schädigung durch ROS zu der Pathologie des Krankheitszustandes beiträgt oder wobei die Verabreichung eines Radikalinhibitors (z.B. Desferrioxamin), Fängers (z.B. Tocopherol, Glutathion) oder Katalysators (z.B. SOD, Katalase) einen nachweisbaren Nutzen zeigt durch Verringerung der Symptome, steigende Überlebensraten oder Bereitstellung anderer nachweisbarer klinischer Vorteile bei der Behandlung oder Verhütung von pathologischen Zuständen. Die Krankheitszustände, die hier diskutiert werden, werden z.B. als ROS-assoziierte Krankheiten angesehen, ohne darauf beschränkt zu sein (z.B. ischämische Reperfusionsschäden, Entzündungskrankheiten, systemischer Lupus erythematodes, Herzinfarkt, Schlaganfall, traumatische Blutungen, Rückenmarkstrauma, Morbus Crohn, Autoimmunkrankheiten (z.B. Polyarthritis, Diabetes), Kataraktbildung, Uveitis, Emphysem, Magengeschwüre, Sauerstofftoxizität, Neoplasien, unerwünschte Zellapoptose, Strahlungskrankheit). Weiterhin werden viele entzündliche Krankheiten oder Leiden Nutzen ziehen aus der vorliegenden Erfindung, da es bekannt ist, dass ROS in den Entzündungsprozess eingreift. Z.B. erzeugt der "oxidative Burst" aktivierter Neutrophile reichlich Superoxidradikale, von denen angenommen wird, dass sie ein wesentlicher Faktor bei der Erzeugung der cytotoxischen Wirkung von aktivierten Neutrophilen sind. Da weiterhin Neutrophile an der frühen Mortalität von jeglichen übertragenen oder transplantierten Geweben oder Zellen beteiligt sind, würde ein Antioxidans das frühe Überleben transplantierter oder übertragener Zellen erhöhen, was kritisch für den Erfolg der Transplantation ist.
  • Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Thylakoide und ein Verfahren zur Isolierung von Thylakoiden, die ein wirkungsvolles Antioxidansmolekül bilden mit einer Fängeraktivität gegenüber ROS. Dieses Antioxidans ist natürlichen Ursprungs; es sollte keine Toxizität oder negative Wirkung haben, wenn es in vernünftiger Konzentration angewendet wird. Dieses Antioxidans kann stabilisiert werden, was die Stabilität über die Zeit und somit eine vernünftige Lebensdauer sicherstellt. Die Stabilisierung wird durchgeführt, indem Elektronendonatoren (nämlich Wassermoleküle) entzogen werden, was dazu führt, dass die Thylakoide in ruhendem Zustand bleiben. Thylakoide werden aktiviert durch Zugabe eines Elektronendonators (nämlich durch Hydratisierung).
  • Herstellung oder Konditionierung
  • Eine erste Stufe, die unternommen wird, bevor die Stufen zur Gewinnung der Thylakoide in einer rohen Suspension durchgeführt werden, kann eine Konditionierungsstufe sein. Diese Konditionierung ist optional und lässt es zu, die Zusammensetzungen der Extrakte zu variieren. Um den Gehalt an Pigmenten in ihrem nicht aktivierten Zustand (nämlich Chlorophyll und Carotinoide) zu optimieren, kann eine Konditionierungsstufe unter den gleichen Bedingungen wie den Arbeitsbedingungen durchgeführt werden, d.h. unter Grünlicht oder im Dunkeln. Unter solchen Umständen sind die Chlorophylle bevorzugt in einem Singulettzustand, während die Carotinoide bevorzugt in einem Grundzustand sind. Auf diese Weise werden die Carotinoide, wenn sie fertig zur Verwendung sind, aktiviert und können leicht die Energie aufnehmen, die aus einem Triplettchlorophyll kommt (Fotoprotektion).
  • Es ist auch möglich, die Thylakoidpigmente weiterhin durch Zugabe weiterer Xantophylle, wie Violaxanthin zum Extraktionsmedium zu schützen oder die Anzahl an Carotinoiden zu erhöhen, indem man unter Licht mit einem engen Wellenlängenbereich (465 bis 475 nm) arbeitet.
  • Es ist weiterhin möglich, den Organismus, nämlich eine Pflanze, und die Extrakte in Bezug auf spezielle Bestandteile anzureichern, indem der Organismus einer anderen Konditionierungsstufe als der Lichtkonditionierung unterzogen wird. Eine solche weitere Konditionierung beinhaltet osmotische Belastung, Wärme, Kälte, Einfrieren, Trockenheit, Hormone und chemische und biologische Induktoren. All diese Konditionierungspara meter führen zu einer Reaktion in empfindlichen Organismen, die dann an einigen speziellen Bestandteilen angereichert werden.
  • Als Beispiel hierfür würde eine Wärmebehandlung die Anhäufung von Hitzeschockproteinen fördern, die nützlich sind, um ROS-verwandte Krankheiten oder Leiden (nämlich Arthritis) zu behandeln. Die Hauptaufgabe der Stufen des vorliegenden Verfahrens bestehen darin, die Integrität einiger wertvoller Bestandteile zu konservieren, nämlich der molekularen Bestandteile der Thylakoide, und den Zustand der Moleküle zu kontrollieren, bevorzugt in deren fundamentalem Funktionszustand bzw. Grundfunktionszustand.
  • Erhalten eines rohen Extrakts
  • Wenn man von vollständigen Organismen oder Geweben davon, wie Pflanzengeweben oder ganzen Pflanzen, ausgeht, besteht die erste Stufe des Verfahrens in einer Dispergierstufe, wie einer Homogenisierungsstufe. Die Pflanzengewebe werden z.B. mechanisch pulverisiert. Die Mesophyllgewebe (Blätter oder Nadeln) können in kleine Stücke geschnitten werden mithilfe eines Rotationsmessers, wie dem, das sich in einem Homogenisator oder einem kommerziellen Rotationsschneider befindet. Jedes Mittel, das zur Dissoziation des cellulosischen Materials führt, um die Thylakoide freizulegen, wäre geeignet.
  • Außer dem Arbeiten unter einer Lichtquelle, die den Lichtflux optimalerweise minimiert (grünes Licht, λ = 500 bis 600 nm) beinhalten die Arbeitsbedingungen idealerweise eine Arbeitstemperatur von etwa 2 bis 20°C, bevorzugt weniger als 4°C, um die Zelldichte zu erhöhen und jeglichen Abbau durch Enzyme zu verhindern. Die Arbeitsbedingungen schließen auch hypertonische Bedingungen ein unter Verwendung von hypertonischen Mitteln, wie Zuckern. Diese Bedingungen erzielen eine optimale Viskosität und Fluidität. Ein spezifisches Beispiel eines Homogenisierungspuffers ist wie folgt:
  • Homogenisierungsmedium
    Figure 00200001
  • Der pH-Wert der Lösung kann von etwa 2 bis unter 10, bevorzugt 5 bis 8 variieren und wird bevorzugter nahe dem Neutralwert von 7 bis 7,5 gehalten (1).
  • Wenn man Spinat als Referenzpflanze nimmt, ist das Verhältnis von Nassgewicht des Pflanzenblättergewebes (g)/Volumen Puffer (ml) etwa 1:3. Somit ist die obigen Rezeptur geeignet, um Thylakoide aus 100 g Spinat zu extrahieren. Die Pflanze wird mit dem Puffer vermischt und z.B. in einem Haushaltsmischer etwa 30 Sekunden lang homogenisiert. Die Pflanzenquelle kann variieren ebenso wie das Volumen des Mediums. Der Puffer selbst kann irgendeiner sein, der geeignet ist, um einen nahezu neutralen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Z.B. kann der obige Tris-Puffer durch einen Acetat- oder Ascorbatpuffer ersetzt werden. Beide Ersatzpuffer sind annehmbar für den menschlichen Verbrauch und Ascorbatpuffer hat zusätzlich den Vorteil, dass er dem Verbraucher Vitamin C liefert. Sorbit wurde zugegeben, um die Integrität der Membran (2 und 3) zu konservieren, und um eine Viskosität sicherzustellen, die von etwa 1 bis 1,3 variiert und er kann durch jeden geeigneten Zucker, wie handelsübliche Saccharose, Fructose oder Turbinado in einer Konzentration ersetzt werden, die den gleichen Effekt erreicht, wie 0,2 bis 1,5 M (bevorzugt 0,2 bis 0,4 M) Sorbit. Saccharose mit 0,2 bis 0,4 M wäre eine annehmbare weniger teure Komponente (4). Pufferkomponenten, wie MgCl2, NaCl, Ascorbinsalz/säure werden für das vorliegende Verfahren als nicht notwendig angesehen, können aber dazu dienen, mehr Aktivität zu gewinnen oder die Aktivität über einen längeren Zeitraum zu konservieren. (5).
  • Ein nahezu neutraler pH-Wert wurde bevorzugt ausgewählt, um eine optimale Konzentration an H+-Ionen aufrechtzuerhalten. Zucker und pH sind wichtige Parameter, um die Dissoziation photosynthetischer Pigmente zu verhindern. Die Dichte der Zellflüssigkeiten wird maximiert, wenn in einer kühlen oder kalten Umgebung gearbeitet wird, nämlich unter 4°C (siehe 6, worin FRTS/1 für den vorliegenden Extrakt steht). Niedrige Temperaturen können auch Komponenten vor einem enzymatischen Abbau schützen. All diese Homogenisierungsbedingungen befreien die Membranstruktur von ihrer Organisation in Chloroplasten, ohne die molekulare strukturelle Organisation der Thylakoide wesentlich zu beeinflussen. Die Chloroplasten werden daher desorganisiert, ohne die Thylakoide zu zerstören oder zu desintegrieren. Die Oberfläche der Zellkomponenten ohne cellulosischen Schutz wird daher erhöht.
  • Es war geeignet für das vorliegende Verfahren, Pflanzengewebe direkt in einem Extraktionsmedium zu verwenden. Wenn es jedoch vorteilhaft ist, reine Chloroplasten oder ein Präparat, das mit Chloroplasten angereichert ist, oder sogar ein Präparat anderer fotosynthetischer Organismen mit oder ohne Chloroplasten zu verwenden, ist es möglich, dies zu tun. Kultivierte Zellen oder Gewebe können auch durch ganze Pflanzen ersetzt werden.
  • Ausgehend von Spinatblättern ist die Ausbeute an Thylakoiden ziemlich gut, wenn man der folgenden Gleichung folgt: α/β > 10
  • α = Verhältnis von Nassgewicht/Trockengewicht und β = Verhältnis von Nassgewicht/(Volumen des Mediums + Wassergehalt der Pflanzenbestandteile). Somit
    Figure 00210001
    und genauer (bevorzugt)
  • Figure 00210002
  • Es ist bemerkenswert, dass die Ausbeute variieren kann abhängig vom Volumen des Puffers, der ausgewählt wurde, und dem Wassergehalt der ausgewählten Pflanze. Kiefernadeln haben z.B. einen endogenen Wassergehalt, der viel weniger wichtig ist als im Fall von Spinatblättern. Für ein gleiches Nassgewicht des Pflanzen materials sollte das Volumen des Puffers erhöht werden, um Thylakoide aus Kiefernadeln zu isolieren, im Vergleich zu Spinatblättern, wobei alle Parameter der obigen Gleichung in Betracht gezogen werden.
  • Der rohe Extrakt, der erhalten wird, bildet eine erste Fraktion, die per se in dehydratisierter Form verwendet werden kann oder weiter fraktioniert werden kann.
  • Trennung der Pflanzenfraktionen
  • An die Homogenisierungsstufe schließt sich eine Trennungsstufe an. Thylakoide werden von Zellbruchstücken und von löslichen Komponenten getrennt auf Basis der unterschiedlichen Sedimentationskoeffizienten. Der Sedimentationskoeffizient von Thylakoiden ist höher als der von Zellorganellen. Die Thylakoide wurden 10 Minuten mit 10.000 × g in mobilen Eimern zentrifugiert. Eine Zentrifugenkraft von weniger als 10.000 × g aber mehr als 3.000 g kann verwendet werden, wobei die Zentrifugationszeit entsprechend eingestellt wird (7). Die optimale Handhabbarkeit für die Thylakoidpellets wurde bei 10 Minuten mit 10.000 bis 12.000 × g erhalten. Jede andere Geschwindigkeit und jeder andere Zeitraum, die ein äquivalentes Ergebnis liefern, können genommen werden. Unterschiedliche Geschwindigkeit und unterschiedlicher Zeitraum sind bei einer Vergrößerung des Maßstabs zu beachten. Während der Sedimentation passieren die Thylakoide ein Filter entsprechend der Gleichung 0,002 ≤ X ≤ 0,2wobei X berechnet wird, indem die Öffnung pro Drahtdurchmesser (alles in Millimeter) multipliziert wird. Die Zellbruchstücke und Membranen werden durch diesen Filter in einem oberen Teil eines Zentrifugationsröhrchens gestoppt. Somit können die Bodenpellets, die die Thylakoide enthalten, leicht gewonnen werden und ein Pellet kann sofort verwendet werden oder kann für die spätere Verwendung weiter fraktioniert oder stabilisiert werden. Jede andere Methode der Trennung, die den gleichen Zweck der Isolierung von Thylakoiden erreicht, kann natürlich verwendet werden. Z.B. könnte ein Dichtegradient, wie ein Saccharosegradient verwendet werden. Jedes chromatographische oder Affinitätsmedium und auch jede chromatographische oder Affinitätsmethode könnte verwendet werden. Bezug nehmend auf die obige spezifische Methode ist es ersichtlich, dass die Grob- und Feintrennung nicht in einer Stufe in einem Verfahren in großem Maßstab erreicht würde. Daher könnte eine Grobreinigung zuerst auf einer Presse oder einem Filter durchgeführt werden und die Feintrennung der Thylakoide und der flüssigen Phase würde in einer späteren Stufe erreicht.
  • Stabilisierung
  • An die Trennstufe schließt sich normalerweise eine Stabilisierungsstufe an. Diese Stufe lässt es zu, Elektronendonatoren, wie Wassermoleküle, zu entziehen, die an Membranen gebunden oder nicht gebunden sind und dies erfolgt, um den Aktivator des PSII-Systems zu eliminieren. Die Fraktionen werden gewonnen und in reine Gläschen gegeben. Spezifisch werden die erste, zweite und dritte Fraktion, die den Vollextrakt, das Pellet (Thylakoidfraktion) bzw. die Zellbruchstücke/Membranfraktionen darstellen, lyophilisiert. Die Gläschen werden dann mindestens 4 Stunden lang einem Vakuum und einer geringen Temperatur (etwa –20 bis –50°C) ausgesetzt. Die so lyophilisierten Fraktionen bleiben über lange Zeit stabil, bis wieder Wasser zugegeben wird. Andere Stabilisierungsmittel könnten verwendet werden. Z.B. wurde eine Vielzahl von Tensiden verwendet, um die Fähigkeit zu liefern, Wasser zu entziehen, ohne die Struktur der Thylakoide zu zerstören. Diese Lösungsmittel sind die folgenden: Triton X-100, PEG, Beta-D-maltosid, Glycin, Glycerin, Glycerol, TWEENsTM, SDS, LDS, DMSO, Cholat, Stearat und Propylenglycol wurden verwendet.
  • Propylenglycol wurde bevorzugt und würde vorteilhafterweise die Lyophilisierung als Stabilisator ersetzen. Propylenglycol liefert nicht nur ein inaktives ruhendes Thylakoidpräparat (funktionell und vollständig aktivierbar bei Wasserzugabe, siehe 8), sondern stabilisiert auch die Thylakoide bei Hydratisierung, indem es die Solubilisierung derselben fördert. Bei Hydratisierung bilden Thylakoide normalerweise eine Suspension; in Gegenwart von 100% Propylenglycol bilden Thylakoide eine Lösung mit einer Löslichkeitsgrenze von 100 mg/ml Lösung. Diese Lösung kann mit Wasser zur Aktivierung verdünnt werden. Dieses Lösungsmittel ist auch nicht toxisch.
  • Fakultative Fraktionierung
  • Die Thylakoidmembranen können weiter in Unterfraktionen fraktioniert werden. Z.B. könnte in Betracht gezogen werden, Reaktionszentren oder Fotosysteme, leicht zu erntende Komplexe, Cytochromkomplexe, spezielle Pigmente (Chlorophylle, Carotinoide), Plastochinone, nicht-fotosynthetische Komponenten (Zellnuclei) oder Mitochondrien) abzutrennen.
  • Thylakoidintegrität und Aktivität
  • Der Extrakt weist im Wesentlichen reine Thylakoide (> 90%) auf; sie sind fotosynthetisch aktivierbar; sie sind stabil und der Extrakt ist kontrollierbar. Die fotosynthetische Aktivität wurde mit verschiedenen Techniken ausgewertet: Sauerstofffreisetzung (Schlodder et al. 1999), Fotoredaktion von 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP) (Behera et al. 1983) und Fluoreszenz (Maxwell et al. 2000). Außerdem wurde die Integrität der Thylakoide ausgewertet mit einer Technik, die einen kontinuierlichen elektrischen Strom misst: jede Desorganisation könnte durch eine Variation des elektrischen Stroms nachgewiesen werden. Der Strom wird gemessen von PSII zum Kupplungsfaktor, was zeigt, dass die Thylakoide die Hauptuntereinheiten, die oben aufgeführt wurden, enthält und dass sie funktionell sind.
  • Wenn grünes Licht bei den Arbeitsbedingungen verwendet wurde, wurden die Pigmente in ihrem Grundzustand (F0) stabilisiert, was die Optimierung und Synchronisierung jedes gewünschten Effekts zulässt. Die Stabilisierung ist möglich wegen des Entzugs des primären Elektronendonators. Die Stabilität, gemessen durch fotosynthetische Aktivität (abwesend während des Ruhezustands und vorhanden bei Aktivierung mit einem Elektronendonator) und die Konzentration an Chlorophyllen und Carotinoiden bestehen über mehrere Monate nach Extraktion. Das Verhältnis von Chlorophyllen/Carotinoiden ist auch extrem wichtig für die Aktivität des Komplexes und um die Absorption und Ableitung von Energie zu maximieren.
  • Die Extrakte sind leicht nachweisbar, aufgrund ihrer natürlichen Fluoreszenz. Kein toxisches Produkt, Lösungsmittel, Detergenz oder Konservierungsmittel wurde den obigen Thylakoiden zugegeben, um das Produkt in seinem ursprünglichen Zustand zu konservieren. Die Extrakte sind daher essbar. Sogar wenn Propylenglycol verwendet wird, um die Thylakoide zu stabilisieren, ist dieses Lösungsmittel harmlos, da seine Oxidation Brenztraubensäure und Essigsäure liefert. Dieses Lösungsmittel wird derzeit als Nahrungsmittelemulgator ver wendet, was bedeutet, dass es oberflächenaktive Eigenschaften hat (jedoch nicht schädlich für die Integrität der Thylakoide). Es hat weiterhin eine hemmende Aktivität gegen Fermentation und Schimmelwachstum. Daher kann dieses Lösungsmittel in jeder Stufe des Verfahrens verwendet werden, gemischt mit Wasser während der Homogenisierung und nicht gemischt mit Wasser nach Stufe c) (Trennstufe).
  • Die Extrakte können in fester Form, trocken oder feucht oder in flüssiger Form präsentiert werden. Die Extrakte sind in Wasser schlecht löslich, obwohl sie leicht rehydratisieren, aber sie resuspendieren vollständig in Propylenglycol. Thylakoide werden bei Rehydratisierung reaktiviert. Es ist daher in Betracht zu ziehen, dass eine Zusammensetzung verwendet wird, die solubilisierte Thylakoide enthält; wenn sie mit einem wässrigen Medium in Kontakt gebracht wird, werden die Thylakoide aktiviert.
  • Nebenprodukte
  • Obwohl die Thylakoide die Produkte sind, auf denen das Hauptinteresse bei dem obigen Verfahren liegt, können die weiteren Pflanzenbestandteile, die von den Thylakoiden getrennt werden, auch aufgrund ihres wirtschaftlichen Werts gewonnen werden. Die Fraktion der flüssigen Phase und die Fraktion mit den Zellbruchstücken/Membran können leicht als Ausgangsmaterial genommen werden, um jegliches Pflanzenmolekül von Interesse zu isolieren. Letztere Fraktion kann erneut extrahiert werden, um die Ausbeute an Thylakoiden zu erhöhen, die pro Pflanzeneinheit gewonnen wird. Es wird davon ausgegangen, dass die Komponenten anderer Fraktionen eine bessere Qualität im Vergleich zu den entsprechenden Komponenten, die bei den Verfahren des Standes der Technik erhalten werden, haben. Da die Bildung von schädigenden ROS verhindert wird oder da bereits gebildete ROS von den Thylakoiden eingefangen werden, die gemäß dem vorliegenden Verfahren hergestellt werden, ist es anzunehmen, dass andere Pflanzenbestandteile, die für ROS empfindlich sind, auch von dem vorliegenden Verfahren profitieren würden. Tatsächlich werden die weiteren Bestandteile, die normalerweise durch Oxidation abgebaut werden könnten, konserviert, indem die schädliche Quelle des Abbaus ausgeräumt wird. Somit können jegliche Pflanzenbestandteile, wie Zucker, Proteine, Lipide, Vitamine, Mineralien und Hormone getrennt durch Fraktionierung erhalten werden, indem z.B. die flüssige Phase, die mit dem obigen Verfahren erhalten wurde, fraktioniert wird, deren Bestandteile eine größere spezifische Aktivität als gewöhnlich haben. Zusätzlich kann eine geeignete Konditionierungsstufe die Extrakte in Bezug auf die interessierenden Bestandteile anreichern.
  • Nachdem festgestellt worden ist, dass die Extrakte funktionell sind, besteht die nächste Stufe darin, ihre Fängeraktivität gegenüber ROS festzustellen.
  • Die Verwendung von Thylakoiden als Antioxidantien
  • Antioxidantien sind Verbindungen, die mit ROS (wie Singulettsauerstoff Wasserstoffperoxid, Superoxidanionen und Hydroxylreste) wechselwirken. Um unschädliche Abbauprodukte zu bilden, bauen aktive Sauerstoffformen andere Moleküle ab oder inaktivieren sie und verursachen potenziell Mutationen, Krebs oder Entzündung. Sie können außerdem an der Alterung teilnehmen. Die Antioxidansmoleküle der vorliegenden Extrakte sind die folgenden: Chlorophylle, Carotinoide und Vitamine (B, C, E, K, ...), Cytochrome und Anthocyane. Die Thylakoide sind besonders gut wirkende Antioxidantien, da ihre physikalische Organisation die Carotinoide Singulettsauerstoff in ihrer Chlorophyll schützenden Rolle abfangen lässt. Die abfangende bzw. löschende Wirkung hat sowohl eine hohe Wirksamkeit als auch eine relativ lange Dauer, da die Carotinoide ihre Energie als Wärme ableiten und wieder bereit sind, Energie, die aus Triplettchlorophyllen kommt, aufzunehmen. Die Thylakoide sind daher auf dem Gebiet der Antioxidantien herausragend; wegen ihrer Fähigkeit, ihren funktionellen Zustand zu regenerieren, lässt die Organisation der Pigmente eine längere antioxidative Aktivität zu.
  • Die erfindungsgemäßen Thylakoide werden im Folgenden als FRTS/1 bezeichnet und bilden einen biologisch aktiven Molekülkomplex, der aus der Biomasse von Pflanzen extrahiert wird. Die funktionelle antioxidative Aktivität von FRTS/1 basiert auf dem Redoxpotenzial der Molekülkomplexe von Thylakoiden, wobei die dreidimensionale Struktur und der natürliche Abstand zwischen den verschiedenen Pigmenten und Molekülen bewahrt wird. Das Antioxidans ist ein Hinweis auf eine optimale Struktur und eine optimale Zusammensetzung.
  • • Quantitative Auswertung von Proteinen mit Fluorescaminmethode
  • Die Proteinkonzentration in einem stabilisierten Extrakt ist: 0,42 bis 0,65 g/g Extrakt.
  • Antioxidative Funktion der Thylakoide
  • A Hauptreaktionsweg bei der durch Radikale induzierten Lipidoxidation
  • In der Natur werden Antioxidantien angewendet, um die Oxidation von biologischen Molekülen, wie Proteinen, DNA, Lipiden etc. zu verhüten. Die Peroxidation von Lipiden ist ein praktisch überall vorkommender und schädigender Prozess in lebenden Organismen. Peroxylreste (ROO·) sind wichtige Radikale in biologischen Systemen, da sie die Lipidperoxidation starten können und sie sind Zwischenprodukte in vielen verschiedenen Oxidationsprozessen von biologisch wichtigen Molekülen.
  • Start
    Figure 00260001
  • Weiterführung
    Figure 00260002
  • Die Peroxidation von ungesättigten Lipidresten (Reaktionen 1 bis 3) verursacht Veränderungen in deren Struktur, die schließlich die physikalischen Eigenschaften von biologischen Membranen verändern. Während der Lipidperoxidation wird eine konjugierte Diengruppe gebildet (siehe LOOH in Reaktion 3), die ein UV/Vis-Absorptionsmaximum bei λmax = 234 nm (ε = 29.500 M–1cm–1) hat und dies lässt eine quantitative Auswertung des gebildeten Oxidationsproduktes zu. Um quantitative Daten zu erhalten, muss die Lipidperoxidation in kontrollierter Weise gestartet werden (Reaktion 1). Oft werden Azo-Initiatoren, die einen wohl definierten Flux von ROO• in wässriger belüfteter Lösung erzeugen, angewendet, um die Lipidoxidation in in-vitro-Versuchen zu untersuchen. Der am häufigsten verwendete wasserlösliche Azo-Initiator ist AAPH (manchmal ABAP genannt; Reaktion 4).
  • Figure 00260003
  • Die Zersetzungsrate von AAPH bei 37°C ist k = 1,3 × 10–6 M–1s1 und die Effizienz für die ROO·-Bildung ist 50%, d.h. 1 Mol AAPH liefert 1 Mol ROO·. Diese Methode der ROO·-Erzeugung lässt die Berechnung der genauen Menge von ROO· zu, die während irgendeines Zeitraums gebildet wird.
  • Das am intensivsten untersuchte Antioxidans ist Vitamin E und die aktivste Verbindung der Vitamin-E-Familie ist α-Tocopherol (α-TocH). Es ist ein Radikalketten abbrechendes Antioxidans, das zwei Peroxylreste einfangen kann, was nur nicht radikalische Produkte liefert und dadurch die Lipidperoxidation verhütet (Reaktionen 5 und 6). ROO• + TocH → ROOH + Toc• (5) ROO• + Toc• → nicht-radikalische Produkte (6)
  • Der Tocopheroxylrest (Toc*), der in Reaktion 5 gebildet wird, ist ein relativ unreaktiver Rest, der normalerweise die Radikaloxidationskettenreaktion nicht fortführen kann. Sobald alles TocH verbraucht ist, tritt die Lipidperoxidation auf, als ob kein Antioxidans vorhanden wäre.
  • Carotinoide (Car) sind die wahrscheinlichsten "Antioxidantien" in FRTS/1, da Chloroplasten Carotinoide, wie Caroline und Xanthophylle, für ihre Erregungstransportkette verwenden. Verschiedene Stoffwechselwege für die Reaktion von Carotinoiden mit ROS sind möglich und das Gesamtverhalten liegt in einem Bereich von Antioxidansaktivität auf dem ganzen Weg bis Wirkungslosigkeit im Hinblick auf die Hemmung der Lipidperoxidation. Die experimentellen Ergebnisse, die erhalten wurden, hängen ab von den angewendeten Reaktionsbedingungen. Mögliche Reaktionen von Carotinoiden mit ROO· sind: ROO• + Car → [Car-OOR]• (7) [Car-OOR]• + ROO• → ROO-Car-OOR (8) [Car-OOR]• + O2 ⇌ •OO-Car-OOR (9) ROO• + Car → ROO– + Car•+ (10) 2 Car•+ ⇌ Car + Car2+ (11) ROO• + Car → ROOH + Car• (12) Car• + O2 ⇌ CarOO• (13) ROO• + Car• → Car-OOR (14)
  • Einige Reaktionen führen zur Bildung von nicht-radikalischen Produkten (Reaktionen 7 und 8, 10 und 11, 12 und 14), die insgesamt zu einem Antioxidansverhalten eines Carotinoids führen würden. Andere Reaktionen erzeugen Peroxylradikale (Reaktionen 9 und 13), die an der Verbreitung der Lipidperoxidation beteiligt sein können. Das gesamte Verhalten von Carotinoiden kann offensichtlich nicht vorhergesagt werden aufgrund der verschiedenen möglichen Reaktionswege.
  • Abhängig von möglichen Reaktionswegen des verwendeten Antioxidans zeigen die Konzentrationszeitprofile des nachgewiesenen LOOH verschiedene Eigenschaften. Bei Verwendung eines Azo-Initiators als Peroxylradikalquelle kann die Menge an ROO·, die erzeugt wird, berechnet werden und es ist möglich, die Menge an Lipiden, die oxidiert werden, aus der Absorption bei 234 nm des konjugierten Dienanteils zu bestimmen. Auch die Menge an eingefangenen ROO· während der Lag-Phase kann bestimmt werden.
  • Ein Prozess innerhalb des FRTS/1 könnte die "ursprünglichen" antioxidativen Eigenschaften "wiederherstellen". Ein möglicher Mechanismus für ein solches Verhalten könnte ein Elektronentransfer statt einem Radikal einfangenden Prozess sein (siehe Reaktionen 15 und 16), z.B.:
  • Figure 00280001
  • Die Konzentration/Zeitprofile der Lipidoxidation in Gegenwart von FRTS/1 lassen es zu, diese Hypothese zu untersuchen. Aus der Dauer einer möglichen Lag-Phase während der Lipidperoxidationsversuche (9) kann die Menge an "eingefangenen" Radikalen berechnet werden. Dies lässt es zu, Schlüsse zu ziehen, in welchem Ausmaß FRTS/1 Peroxylradikale inaktivieren kann. Man muss jedoch bedenken, dass die beschriebene mögliche Regeneration der antioxidativen Eigenschaften nur wirksam sein kann, solange FRTS/1 noch intakt ist und seine "ursprüngliche" Aktivität leisten kann. Insgesamt werden die Versuche schließlich quantitative Daten für die antioxidative Fähigkeit von FRTS/1 liefern (siehe 10 für ein Beispiel der antioxidativen Kinetik von FRTS/1 im Vergleich zu Trolox). Wenn β-Carotin mit Trolox verglichen wurde, war ersteres ein Antioxidans, aber ohne Lag-Phase, wie sie für Antioxidantien typisch ist.
  • Da Lipide die Hauptkomponenten der Zellmembran, von Lipoproteinen und anderen Membranstrukturen in lebenden Organismen sind, wurden in der vorliegenden Studie PLPC-FRTS/1-(1-Palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin)-Micellen als Substrat für den Standardoxidationstest verwendet. Die Oxidation von PLPC-FRTS/1, die durch Peroxylreste induziert wurde, die von der Initiator-Azoverbindung 2,2'-Azobis-(2-amidinopropan)dihydrochlorid (AAPH) erzeugt wurden, führt zur Oxidation der Linolsäureeinheit des entsprechenden Hydroperoxids zusammen mit der Bildung eines konjugierten Diensystems mit einem Absorptionsmaximum bei 234 nm.
  • Herstellung von PLPC-(I-Palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin)-Micellen:
  • 170 μl einer 25-mg/ml-Lösung von PLPC-FRTS/1 in CHCl3 (Avanti Polar Lipids) wurde unter einem Strom von N2 zur Trockene eingedampft. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (281 μl), die vorher mit Chelex® versetzt worden war, um Metallionen zu entfernen, wurde dem PLPC-FRTS/1 zugegeben und die Mischung wurde 2 Minuten lang verwirbelt. Wässriges mit Chelex® behandeltes Natriumcholat, 109 μl, 30 mg/ml (Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, WI, USA) wurde der Mischung zugegeben und 2 min lang verwirbelt. Die Mischung wurde 20 Mal durch eine Polycarbonatmembran (Porengröße 100 nm) geleitet, um die Größe der Micellen zu homogenisieren.
  • FRTS/1 wurde in CHCl3 (12 mg/ml) gelöst und 1 ml dieser Lösung wurde mit 6 ml PLPC-FRTS/1 (25 mg/ml) vermischt, um eine Endkonzentration von PC-FRTS/1 von 6 mg/ml zu erhalten. Die Micellen wurden hergestellt, wie oben beschrieben. Azo-Initiator (AAPH) wurde in einer Konzentration von 5 mg/ml in PBS verwendet.
  • Standardisierung:
  • Anfangsversuche wurden durchgeführt unter Verwendung von FRTS/1 in dehydratisierter Form, um die Konzentration der Micellen, Azo-Initiatoren und Wellenlängen zu standardisieren. Die optimale Extinktion trat bei 234 nm auf.
  • Zwei vorläufige Versuche wurden mit 100 μl Micellenlösung, die aus PLPC-FRTS/1 und PLPC-FRTS/1 + FRTS/1 in 3 ml PBS 10 h bei 37°C hergestellt worden war mit zwei Verdünnungen (10 μl und 20 μl) einer 5-mg/ml-Lösung von Azo-Initiator, bei einer Wellenlänge von 234 nm an einem Cary 3 UV-Visible Spektrophotometer von Varian, durchgeführt. Die Hintergrundabsorption aufgrund von PC-FRTS/1 bei 234 nm war unter diesen Reaktionsbedingungen zu hoch.
  • Versuche:
  • Basierend auf den aus den obigen Versuchen erhaltenen Ergebnissen wurde beschlossen, weiter verdünnte Lösungen von FRTS/1 zu verwenden (Endkonzentration von FRTS/1 war 6,7 μg). Als negative Kontrolle wurde FRTS/1 in Micellen aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DMPC) eingearbeitet, eine Verbindung, die der durch Peroxylreste, die aus AAPH stammen, vermittelten Oxidation widersteht. Micellen wurden hergestellt aus 15,937 mg DMPC-FRTS/1 (Vorratslösung 25 mg/ml) in 0,6375 ml PBS + 1,053 ml PBS + 0,408 ml Natriumcholat + 0,2435 ml FRTS/1-Lösung in CHCl3 (2 mg/ml), wie oben beschrieben. Die folgenden Versuche wurden daher durchgeführt:
    • • 3 ml PBS + 100 μl PLPC-FRTS/1-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • • 3 ml PBS + 100 μl PLPC-FRTS/1-Micellen + 20 μl Azo-Initiator
    • • 3 ml PBS + 100 μl DMPC + FRTS/1 + 10 μl Azo-Initiator
    • • 3 ml PBS + 100 μl DMPC + FRTS/1 + 20 μl Azo-Initiator
    • • 3 ml PBS + 10 μl Azo-Initiator
    • • 3 ml PBS + 20 μl Azo-Initiator
  • Die Reaktionen wurden an einem Spektrophotometer bei 37°C 10 h lang überwacht.
  • Schlussfolgerung
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die maximale OD (bei 234 nm Wellenlänge) für PLPC-FRTS/1-Micellen, die FRTS/1 mit 0,3 mg/ml enthalten, nach 180 min 0,25 war, während die OD von PLPC-FRTS/1-Micellen ohne FRTS/1 nach dem gleichen Zeitraum 3,2 war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass FRTS/1 unzweifelhaft antioxidative Eigenschaften zeigt.
  • Antioxidative Eigenschaften einer FRTS/1-Lösung im Vergleich zu Vitamin E
  • Geringere Konzentrationen von Antioxidantien wurden verwendet, um die antioxidativen Eigenschaften von FRTS/1 und Trolox, einem wasserlöslichen Analogon von Vitamin E (0,3 mg/ml in PBS) zu vergleichen. Die folgenden Proben wurden 10 h bei 37°C an einem Spektrophotometer laufen gelassen.
    • 1. 3.000 μl PBS + 10 μl Azo-Initiator
    • 2. 3.000 μl PBS + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 3. 2.998 μl PBS + 2 μl Antioxidans (0,5 mg/ml wässrige Lösung) + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 4. 2.995 μl PBS + 5 μl Antioxidans (0,5 mg/ml wässrige Lösung) + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 5. 2.990 μl PBS + 10 μl Antioxidans (0,5 mg/ml wässrige Lösung) + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 6. 2.980 μl PBS + 20 μl Antioxidans (0,5 mg/ml wässrige Lösung) + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 7. 2.990 μl PBS + 10 μl Trolox + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 8. 2.980 μl PBS + 20 μl Trolox + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
    • 9. 2.970 μl PBS + 30 μl Trolox + 100 μl PLPC-Micellen + 10 μl Azo-Initiator
  • 10 zeigt eine anhaltendere Aktivität für FRTS/1 als für Trolox.
  • Schutzmechanismus
  • Radikalische Sauerstoffarten (ROS) wechselwirken leicht mit zellulären Makromolekülen und Strukturen, was zu Veränderungen der Permeabilität von Membranen, Aktivierung von Proteasen und Nucleasen und veränderter Genexpression führt (Yu, 1994; Schiaffonati und Tiberio, 1997). Es ist wohl bekannt, dass diese zellulären Veränderungen, die durch ROS induziert werden, zu einem apoptotischen Zelltod führen. Es wurde versucht:
    • – die antioxidativen Eigenschaften von FRTS/1 auszuwerten und
    • – die Wirkungsart von FRTS/1 als Antioxidans zu bestimmen.
  • IMR-32-Zellen bilden ein gutes Modell, um die antioxidative Wirksamkeit unseres Extrakts auszuwerten. Diese Zellen sind Neuroblastomazellen, die für oxidativen Stress, der Apoptose hervorruft, empfindlich sind.
  • Versuch 1: Standardisierung von experimentellen Bedingungen
  • Auswahl der Zellkultur
  • Die menschliche Neuroblastoma-Zelllinie (IMR-32), von der bekannt ist, dass sie auf oxidativen Stress mit Apoptose reagiert (Kim et al., 1999) wurde als in-vitro-Zellmodell verwendet. IMR32-Zellen sind besonders empfindlich für ROS und andere Gifte, da ihr p53-Genprodukt im Cytoplasma sequestriert wird. Die Sequestration macht p53 inaktiv, obwohl das Gen nicht mutiert ist.
  • Auswahl des ROS-Induktors
  • Tert.-Butylhydroperoxid (TBHP) wurde als oxidativen Stress induzierendes Mittel verwendet. TBHP hat keine Neuronspezifität im Gegensatz zu oxidativem Stress, der durch MPTP in dopaminergen Neuronen induziert wird. Dies lässt Vergleiche zu, wenn Untersuchungen in Bezug auf allgemeinere oxidative Stressbedingungen (wie die, die bei vielen neurodegenerativen Krankheiten gefunden werden) an verschiedenen Zellphänotypen durchgeführt werden müssen.
  • A. Bestimmung der optimalen Dosierung von TBHP, um Apoptose an einer IMR32-Zellkultur zu induzieren
  • Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung von 1.000 IMR-32-Zellen pro Napf, bei 1 h Inkubation. TBHP 50, 75 und 100 μM erzeugten 78%, 87% bzw. 87% Apoptose. TBHP 50 μM wurde ausgewählt, um Apoptose in den anderen Versuchen zu induzieren.
  • B. Dosierung von FRTS/1
  • Unterschiedliche Verdünnungen wurden für IMR-32-Zellen zusammen mit TBHP verwendet. Eine Mutterlösung von 1:10 wurde erstellt ausgehend von der lyophilisierten Thylakoidfraktion in Propylenglycol. Wenn nicht anders angegeben, sind die erwähnten Verdünnungen Verdünnungen dieser Mutterlösung. Der durch FRTS/1 beigetragene Schutz war 28%, 35% bzw. 75% bei Verdünnungen von 1:10, 1:100 bzw. 1:1.000. Die letztere Verdünnung wurde für die weiteren Versuche genommen.
  • 1. Zellkultur
  • IMR-32-Zellen wurden in MEM, das mit 10% FBS ergänzt war, bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/T25 Falcon-Gewebekulturkolben ausgesät und zweimal wöchentlich subkultiviert. 48 h alte Kulturen wurden in allen Versuchen verwendet. 1.000 Zellen wurden pro Napf in den ersten Versuchen ausplattiert und die Anzahl wurde auf danach 3.000 erhöht, wie in den Tabellen angegeben.
  • 2. Protokoll zum oxidativen Stress in vitro
  • 1.000 oder 3.000 Zellen/Napf/100 μl wurden in 96-Napf-(Linbro Flat Bottom)-Platten ausgesät in allen Näpfen außer Napf Nr. 12 in allen Reihen. Nach 24 h wurden die Zellen zweimal mit 250 μl PBS (pH 7,2) gewaschen und 32 Näpfe wurden jeweils mit 100 bzw. 200 μM Lösungen von TBHP (70% wässrige Lösung von Sigma Chemical Company) 1 h lang behandelt. Nach 1 h wurden die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS gewaschen, bevor frisches Wachstumsmedium zugefügt wurde. Nach 24 h wurde das Überleben der Zellen untersucht mit einem empfindlichen fluorimetrischen Test basierend auf der DNA-Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs von Hoechst mit dem folgenden Verfahren. Der Test misst die Gesamt-DNA der Population, eine Messung, die eng mit der Zellzahl korreliert. Das Medium wurde durch vorsichtiges Saugen abgesaugt. Die Zelten wurden mit 250 μl PBS gespült. PBS wurde durch vorsichtiges Saugen abgesaugt. Die Spülstufe wurde wiederholt. 100 μl Lysepuffer (0,02% SDS in 1 × SSC) wurden jedem Napf zugegeben außer denen für DNA-Standard und Leerwert in Reihe 12. Die Platte wurde bei 37°C 1 h lang inkubiert, wobei gelegentlich geschwenkt wurde. 100 μl 40 μg/ml DNA wurden in die DNA-Näpfe gegeben und 100 μl 1 × SSC-Puffer wurden in die Näpfe gegeben, die als Leerwert behandelt wurden. 100 μl 40 μg/ml Hoechst 33258 in 1 × SSC-Puffer wurden jedem Napf zugegeben und die Platte wurde mit Aluminumfolie abgedeckt, um sie vor Licht zu schützen. Die Platte wurde vorsichtig 5 Minuten lang bewegt und die Fluoreszenz wurde bei einer Erregungswellenlänge von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm abgelesen.
  • 3. Berechnungen
  • CT unbehandelt = 100%: Überlebensrate nach TBHP: 42%, tote Zellen: 100 – 42 = 58%; Populationsgröße nach PC: 88% Differenz zu CT: 100 – 88 = 12% Erwartete Populationsgröße nach TBHP + PC: 100 – 58 – 12 = 30%. Gewonnene Überlebende: 60% Zunahme der Überlebensrate in %: 60 – 30 = 30 Ausgeübter Schutz: 30:60 × 100 = 50%.
  • 4. Schätzung der Cytotoxizität mit LDH-Assay:
  • Für diesen Versuch wurden IMR-32-Zellen in MEM-Medium ohne I-Glutamin, Phenolphthalein und Natriumpyruvat gezüchtet mit 3.000 IMR-32-Zelllen/Napf die in 96-Napf-Platten gesät wurden. 24 h nach dem oxidativen Stress wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und jeweils zwei Reihen wurden mit 1:1.000 bzw. 1:10.000 PC-FRTS/1 1 h bei 37°C behandelt. Nach 1 h wurden die Zellen mit PBS zweimal gewaschen und PBS wurde durch das Wachstumsmedium ersetzt. Zwei Reihen wurden jeweils mit 1:1.000 bzw. 1:10.000 PC-FRTS/1 behandelt, während jeweils zwei Reihen mit 25 bzw. 50 μM TBHP behandelt wurden. Zwei Reihen wurden als Kontrolle unbehandelt belassen. Die LDH-Aktivität wurde mit dem Lactatdehydrogenase-Assay-Kit, der von Sigma Diagnostics geliefert wird, gemessen. Der kolorimetrische Test misst restliches Pyruvat (Substrat der enzymatischen Reaktion). Die Grundaktivität, die in dem Medium allein vorhanden ist (in Abwesenheit von Zellen) wurde als 0% angesehen und wurde systematisch von jedem Versuchswert abgezogen. Zur Kontrolle unbehandelte Zellen in zwei Reihen wurden mit Triton X-100 (0,02%) lysiert und wurden als Proben mit 100% LDH-Freisetzung behandelt.
  • Zwei Anfangsversuche wurden gemacht, um das Verfahren, die Anzahl der Zellen, die verwendet wurde, die Wellenlänge für die optimale Extinktion, das optimale Pyruvatsubstrat, das verwendet werden sollte, zu standardisieren. Es wurde festgestellt, dass 3.000 Zellen pro Napf, 0,4 ml Pyruvat und Spektrophotometerwerte bei 440 nm Standard waren.
  • FRTS/1 wurde als Vorbehandlung, Co-Behandlung und Nachbehandlung mit dem oxidativen Angriff verwendet.
  • • Vorbehandlung
  • Die Zellen wurden mit FRTS/1 2 h vorbehandelt, bevor sie den TBHP-Dosen ausgesetzt wurden.
  • Figure 00330001
  • • Gleichzeitige Behandlung
  • Die Zellen wurden 1 h lang gleichzeitig mit FRTS/1 und TBHP behandelt.
  • Figure 00330002
  • • Nachbehandlung
  • Die Zellen wurden mit 3 Dosen von FRTS/1 1 h, nachdem sie TBHP-Dosen ausgesetzt worden waren, nachbehandelt.
  • Figure 00330003
  • "Zellschädigung TBHP/CT" bedeutet die Schädigungen, die durch das Oxidationsmittel verursacht wurden, berechnet als Prozentanteil von der Überlebensrate der unbehandelten Kontrollen. "FRTS/1-Abnahme" bezieht sich auf den Unterschied in der Populationsgröße bei Kontrollen und den FRTS/1 ausgesetzten Zellen. "Gesamte erwartete Abnahme" summiert den Unterschied der Populationsgröße aufgrund von TBHP und FRTS/1- Kontakt einzeln. "Erwartete Überlebensrate" ist 100 – Gesamte erwartete Abnahme. "Überlebensrate TBHP + PC/CT" ist die tatsächliche Überlebensrate in Gegenwart von FRTS/1 verdünnt 1:1.000. "Der durch PC ausgeübte Schutz" wird berechnet, wie oben angegeben.
  • In dem Vorbehandlungsversuch wird die Wirkung von FRTS/1 verstärkt im Vergleich zu dem Schutz, der durch eine Nachbehandlung ausgeübt wird (vgl. 50% mit 23% und 77% mit 62%). Es deutet stark darauf hin, dass die schützende Wirkung von PC-FRTS/1 über seine antioxidativen Eigenschaften ausgeübt wird. Bei geringer Dosis (25 μM) verdoppelt sich der Schutz, der gegen Schäden, die durch das Oxidationsmittel verursacht werden.
  • Eindeutig wird die Wirksamkeit von PC-FRTS/1 als präventive Behandlung aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften bestätigt.
  • Die antioxidativen Eigenschaften von FRTS/1 werden in dem Co-Behandlungsversuch bestätigt. Die Wirksamkeit des Produkts entspricht der, die für die Nachbehandlung bei der höchsten Dosis von Oxidationsmittel berichtet wird und liegt zwischen denen, die nach Vor- bzw. Nachbehandlung erzielt werden.
  • FRTS/1 übt einen Schutz gegen Apoptose, die durch TBHP verursacht wird, aus im Verlauf von TBHP-Schädigungen.
  • Die stärksten antioxidativen Eigenschaften von FRTS/1 werden über seine schützende Wirkung gegen ROS, das in den IMR-32-Zellen durch das Oxidationsmittel TBHP erzeugt wird, bestätigt. Unter den standardisierten Bedingungen ist die schützende Wirkung im Durchschnitt 62%.
  • Die Antioxidanswirkung tritt bei der Vor-, Co- und Nachbehandlung auf. (11a und b).
  • Je mehr oxidative Schäden durch TBHP bei IMR-32-Zellen verursacht werden (wenn die TBHP-Dosierung ansteigt), desto mehr Schutz wird durch FRTS/1 ausgeübt. Dies ist unabhängig von der Konzentration von FRTS/1, da sie bei Verdünnungen von 1:1.000 ebenso wie bei 1:10.000 gezeigt wird (dargestellt in 12A bzw. 12B). Diese Ergebnisse zeigen die Dynamik des vorliegenden Extrakts.
  • Die Tatsache, dass der Schutz mit zunehmenden Schädigungen ansteigt, deutet darauf hin, dass der Wirkungsmechanismus von FRTS/1 sich von dem von konventionellen Antioxidantien unterscheiden mag, wie in den Untersuchungen bezogen auf die Chemie der Reaktion angedeutet wird:
    • 1) die Schutzwirkung, die von FRTS/1 ausgeübt wird, dauert länger
    • 2) Vitamin E und seine Analoga werden bei gegebenen Konzentrationen verbraucht, während sie ihre antioxidierende Wirkung ausüben. Dies scheint nicht der Fall zu sein bei FRTS/1, wie durch die oben gezeigten chemischen Reaktionen erläutert wird.
  • Die Korrelation zwischen dem Ausmaß der oxidativen Schäden und dem Schutz durch PC-FRST/1 ist eine einzigartige Eigenschaft, die dieses Antioxidans zeigt.
  • Die Erhöhung der Zelldichte von 1.000 auf 3.000 vermindert offensichtlich die Dosis des Produkts, die jede Zelle erhält. Dies ist eine wohl bekannte Wirkung in der Toxikologie und Pharmakologie. Die von FRTS/1 ausgeübte Schutzwirkung bleibt exzellent, sogar wenn die Anzahl der Zellen, die zu schützen ist, sich verdreifacht. Dieser Effekt ist reproduzierbar.
  • • Einschätzung der Apoptose in IMR-32-Zellen mit Lactatdehydrogenasetest (LDH)
  • Der klassische LDH-Test misst die Freisetzung des LDH-Enzyms durch apoptotische Zellen. Der in der vorliegenden Untersuchung verwendete Test misst den Restanteil an Enzymsubstrat (Pyruvat) unter Verwendung einer kolorimetrischen Reaktion. Je mehr Substrat im Medium ist, desto weniger Enzym wurde freigesetzt. Zellmedium wurde als 0% freigesetzte Enzymaktivität genommen und lysierte Zellen im Medium als 100% freigesetzte Enzymaktivität. Die Werte in der Tabelle werden aus diesen zwei Parametern berechnet.
  • Das Ausmaß der Apoptose, das durch Freisetzung von LDH aus den geschädigten Zellen gemessen wird:
    Figure 00350001
  • Die Gesamtfreisetzung von LDH durch TBHP plus FRTS/1 bei einzelnem Kontakt wurde verglichen mit der beobachteten LDH-Aktivität (letzte Zeile).
  • Die schützende Wirkung von FRTS/1 ist offensichtlich. Eine Nachbehandlung mit FRTS/1 schützt die IMR-32-Zellen wirksam gegen Apoptose, die durch das von TBHP erzeugte ROS induziert wird.
  • Schlussfolgerung
  • FRTS/1-Verbindung zeigt potente Antioxidanseigenschaften, wie durch chemische Tests gezeigt.
  • Diese hoch effizienten antioxidativen Schutzwirkungen werden auch in einem biologischen in-vitro-Assay gezeigt:
    • • FRTS/1-Antioxidanseigenschaften, die chemisch gezeigt wurden, werden biologisch bestätigt;
    • • FRTS/1 zeigt eine hoch wirksame schützende Wirkung gegen ROS-Schädigungen, die Apoptose in IMR-32-Zellen nach TBHP-Kontakt verursachen;
    • • FRTS/1 zeigt die einzigartige Eigenschaft, dass es dynamisch ist, so dass es eine höhere Schutzwirkung ausübt, wenn die oxidativen Schädigungen ansteigen (je höher die Schäden durch ROS, desto größer der Schutz durch FRTS/1);
    • • FRTS/1 zeigt eine lang dauernde (Stunden) antioxidative Wirkung, was einen hohen Stabilitätsgrad und/oder eine hohe Fähigkeit, sich zu regenerieren, zeigt, was nur dieses Antioxidans zeigt;
    • • FRTS/1 ist in Dosierungen wirksam, die nicht toxisch sind.
  • • Wechselwirkung zwischen Zellen
  • Um eine wirksame therapeutische Medikation zu sein, muss der vorliegende Extrakt mindestens einige Eigenschaften erfüllen. Hierzu gehören, dass der Extrakt nicht toxisch ist, nicht immunogen ist oder die normale Gewebefunktion nicht stört, insbesondere den Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport durch Erythrozyten.
  • Der Extrakt sollte nicht an Erythrozyten kleben, obwohl er sich in dem aufnehmenden Körper verteilen sollte, um ein zu behandelndes Gewebe oder Organ anzusteuern. Es wurde verifiziert, ob Makrophagen, die die erste Verteidigungslinie sind, den vorliegenden Extrakt nicht zerstören. Makrophagen zerstören normalerweise durch Erzeugung von freien Radikalen, die große Teilchen vor der Phagozytose zerstören. Bei der Phagozytose erzeugen Makrophagen Cytokine, die Moleküle sind, die die Gegenwart eines Eindringlings oder die Dysfunktion eines Gewebes oder einer Zelle signalisieren. Cytokine sind Moleküle, die zu anderen Zellen geschickt werden und die Gegenwart von Eindringlingen oder einer Dysfunktion eines Gewebes signalisieren. Die Zellen, die auf Cytokine antworten, sind Zellen wie Fibroblasten, Endothelzellen, Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophile und Eosinophile. Diese Zellen sind am Prozess der Zerstörung und/oder Rekonstruktion von Geweben und Organen beteiligt. Diese Prozesse beinhalten eine Entzündung. Wenn die Antwort desorganisiert ist oder wenn der Eindringling kontinuierlich in dem Organismus präsent ist, leidet letzterer an einer chronischen Krankheit, wie Rheumatismus, Hautirritation, Konjunktivitis, Alveolitis, Asthma und sogar Krebs. Die Wechselwirkung zwischen Zellen und FRTS/1 wurde mit der FACS-Technik untersucht. Diese Vorrichtung weist die Fluoreszenz von Zellen (Autofluoreszenz) nach und auch alle fluoreszierenden Moleküle, die daran gebunden sind. FRTS/1 ist ein autofluoreszierender Komplex, so dass Wechselwirkungen ohne irgendeine Modifikation quantitativ ausgewertet werden können.
  • Schlussfolgerung: FRTS/1 haftet an Makrophagen (kommerzielle Linien: NR-8383 von ATCC) bei 37°C im Vergleich zu Mastozyten (positive Kontrolle, RCMC bereitgestellt von ATCC). Makrophagen phagozytieren FRTS/1 (1/3) nach 2 Stunden, was zeigt, dass FRTS/1 für einen längeren Zeitraum im Blutstrom bleibt. Eine langsame Phagozytose ist an sich keine schlechte Nachricht, da irgendeine andere Art von nützlicher Wirkung nach der Cytokinaktivierung beobachtet werden könnte (Wirkung von "Phase II"). Da Makrophagen den Extrakt phagozytieren und da IMR-32-Zellen dem Extrakt Zugang in das Cytoplasma zu erlauben scheinen, wird angenommen, dass der Extrakt in die Zellen durch Endozytose eintreten kann.
  • Oxidative ex-vivo-Modelle
  • Leberperfusionsmodell und Hirnperfusionsmodell sind gute Versuchsmodelle, die auf oxidativen Stress ansprechen. Sie wurden verwendet, um die schützende Wirkung des Extrakts bei vitalen Organen zu zeigen.
  • Leberperfusionsmodell
  • Eine Vielzahl von Leberfunktionen wurde ausgewertet. Die zur Perfusion der Leber verwendete Methode wurde von Drouin et al. 2000 und von Lavoie et al. 2000 beschrieben. Glucose, Lactat, ALT und LDH wurden mit Spektrophotometrie bestimmt, während die Gallenproduktion einfach durch Volumetrie gemessen wurde. Im Vergleich zu einem Kontrollträger gab es keine schädliche Wirkung, die bei Perfusion des Extrakts beobachtet wurde. Im Gegenteil waren, wenn die Wirksamkeit des Extrakts zur Reduktion der Expression einer durch Stress erzeugten Ischämie im Anschluss an eine Reperfusion (I/R) gemessen wurde, die Ergebnisse so, dass der Extrakt eine schützende Wirkung gegenüber oxidativen Schädigungen, die in der Leber induziert wurden, hatte.
  • Bei diesem Modell wird die Leber in situ über einen kontrollierten extrakorporalen Kreislauf perfundiert, der die Leber isoliert, während das Gefäßbett intakt bleibt und die strukturelle und funktionelle Integrität erhalten bleibt. Dieses Modell ist gut dokumentiert (Ross 1972) und lässt die Untersuchung von oxidativem Stress ebenso wie von Zellschädigungen (Bailey 2000) zu.
  • Die Wirkung auf die Leberlebensfähigkeit wird untersucht, um die Wirkung von FRTS/1 auf die Leberlebensfähigkeit auszuwerten. Genauer wird die Wirkung von FRTS/1 auf die Leberfunktionen während der in-situ-Perfusion ausgewertet.
  • Lebern von Sprague-Dawley-Ratten wurden in situ mit einem Einzeldurchgangssystem mit einer Standard-Krebs-Henseleit-(K-H)-Lösung perfundiert. [pH 7,4, O2:CO2 (95%:5%)]. Die K-H-Lösung setzt sich zusammen aus: NaCl (118 mM), KCl (4,8 mM), KH2PO4 (1,2 mM), MgSO4·7H2O, CaCl2 (1,5 mM), NaHCO3 (25 mM) und Albumin (2% G/V).
  • Unter Anästhesie (Pentobarbital; 50 mg·kg–1 Körpergewicht) wird eine Laparotomie durchgeführt, um die Vena portae, die Vena cava inferior und den Gallenkanal zur Kanülierung freizulegen. Die Kanülierung der Vena portae wird verwendet als Eingang des Perfusats in die Leber und der der Vena cava wird verwendet, um das Perfusat am Ausgang der Leber zu gewinnen. Der Nervus vagus wird seziert, um die Leber von jedem vasomotorischen Einfluss zu isolieren. Das gesamte chirurgische Verfahren ist innerhalb von 15 Minuten beendet. Das Zeitintervall zwischen Einsatz einer Kanüle in die Vena portae und dem Beginn des Kreislaufs ist nicht größer als 3 Minuten. Der zwischen dem Herzstillstand, der durch die Öffnung des Brustkorbs verursacht wird, und dem Beginn der Perfusion verstrichene Zeitraum ist nicht größer als 1 Minute.
  • Die Gesamtdauer der Perfusion war 60 Minuten. Während der ersten 30 Minuten wurde ein Auswaschen durchgeführt. Während dieses Zeitraums wurde die K-H-Lösung (37°C) mit Glucose (8 mM), Lactat (0,5 mM), Alanin (0,2 mM) und Glycerol (0,02 mM) ergänzt und in einem offenen Kreislauf in der Leber zirkuliert. Danach wurde die Leber weitere 30 Minuten nur Trägern (Kontrolle) oder FRTS/Träger (behandelte FRTS/1-Gruppe) ausgesetzt. Die Träger beinhalten entweder Kochsalzlösung (1 ml/800 ml Perfusat) oder 1,3-Propandiol (24 ml/800 ml Perfusat). FRTS/1 wurde entweder Propandiol (0,06 mg FRTS/ml Propandiol: 24 ml/800 ml Perfusat) oder Kochsalzlösung (2 mg FRTS/ml Kochsalzlösung: 1 ml/800 ml Perfusat) zugegeben. Die Perfusatströmungsrate wurde konstant auf 6 ml/min/100 g Körpergewicht gehalten. Eine kleine Probe des Perfusats wurde am Eingang und Ausgang der Leber entnommen, um die Erzeugung oder Verwertung von Metaboliten zu bestimmen.
  • Die Konzentrationen von Glucose, Lactat, ALT und LDH in dem Perfusat wurde mit Photospektrometrie bestimmt unter Verwendung eines kommerziellen Verfahrens, das von Sigma-Aldrich Canada n. 17-UV, Nr. 735, Nr. 59-UV bzw. Nr. DH1240-UV offenbart wird). Die Extraktion oder Produktion eines Substrats durch die Leber wird gemessen durch Unterschiede zwischen dem Eingang und Ausgang eines Metaboliten multipliziert mit der Perfusatströmungsrate.
  • Da die Art des Trägers die gemessenen Parameter nicht beeinflusste, wurden die Ergebnisse kombiniert.
  • Die Gallenproduktion war sowohl bei der Kontrolle als auch der behandelten Gruppe gleich (0,55 ± 0,10 gegenüber 0,62 ± 0,12 mg/min/g Leber in der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe). Während der Reperfusion nahm die Gallenproduktion ab im Vergleich zu den Pegeln vor der Ischämie, sowohl bei der behandelten als auch bei der Kontrollgruppe. Die Gallenproduktion kehrte innerhalb von 10 Minuten auf den normalen Wert nach Reperfusion zurück.
  • Am Eingang war die Glucosekonzentration bei beiden Gruppen gleich (7,04 ± 0,40 gegenüber 7,24 ± 0,07 mM in der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe). In beiden Gruppen hatte die Leber eine leichte Tendenz, Glucose zu verwerten. Der Kontakt mit FRTS/1 hatte keine Wirkung auf den Glucoseeinfang (0,32 ± 0,21 gegenüber 0,39 ± 0,25 μM/min/g Leber in der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe). Die Konzentration von Lactat am Eingang war auch in beiden Gruppen gleich (0,60 ± 0,33 gegenüber 0,50 ± 0,10 mM in der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe). Bei Kontakt mit FRTS gab es eine leichte Tendenz bei den behandelten Lebern, Lactat zu erzeugen (–0,01 ± 0,1 gegenüber 0,40 ± 0,005 μM/min/g Leber in der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe)
  • Das Perfundieren der Leber selbst ruft keine Freisetzung von ALT oder LDH in den Kontrollgruppen hervor (–0,07 ± 0,14 bzw. 1,79 ± 0,47 μM/min/g). Die Behandlung mit FRTS/1 scheint keine Freisetzung von ALT oder LDH in der Leber hervorzurufen (0,57 ± 0,21 bzw. 2,36 ± 1,10 μM/min/g), obwohl es eine leichte Tendenz zum Anstieg gibt. Wenn die Leber vor der Verwendung von FRTS teilweise perfundiert wurde, gab es einen fortschreitenden Anstieg der LDH-Produktion in der Leber (35,57 ± 8,96 μM/min/g).
  • Diese vorläufigen Ergebnisse führen dazu, anzunehmen, dass FRTS/1 keine merkliche Wirkung auf die Lebensfähigkeit der perfundierten Leber hat. Genauer scheint die Behandlung mit FRTS/1 die Leberfunktionen während einer Perfusion mit einer Dauer von 30 Minuten nicht zu modifizieren, was durch die Verwertung von Glucose, die Produktion von Lactat und Galle ausgewertet wurde. Es gibt keine offensichtliche strukturelle Schädigung der Hepatozyten, da es keinen Anstieg von ALT und LDH gibt.
  • Das obige Verfahren wurde leicht modifiziert, um die Wirkung einer Ischämie und Reperfusion zu untersuchen. Die Gesamtdauer der Perfusion war 105 Minuten. Die 31. Minute bestand aus einer Auswaschperiode. Während dieses Zeitraums wurde K-H-Lösung (pH 7,4 und in Gegenwart von O2:CO2 95%:5%) zu Glucose 8 mM, Lactat 0,5 mM, Alanin 0,2 mM und Glycerol 0,2 mM zugegeben. Die Lösung wurde in einem offenen Kreislauf zirkuliert. Dann wurde die Leber dem Extrakt oder dem Träger: 1,3-Propandiol, 15 Minuten lang ausgesetzt. Die Perfusionsrate wurde konstant auf 6 ml/min/100 g Körpergewicht gehalten (Drouin et al. 2000, Lavoie et al. 2000). Die Perfusion wurde 30 Minuten lang gestoppt. Während dieser Unterbrechung entwickelte sich eine Ischämie. Dann wurde der Kreislauf wieder aufgenommen über eine Dauer von 30 Minuten. Die perfundierenden Flüssigkeiten wurden am Eingang und Ausgang der getesteten Lebern entnommen, um die Produktion oder Verwendung der ausgewerteten biologischen Marker zu messen.
  • Bei Reperfusion nimmt die Bioproduktion ab im Vergleich zu den Pegeln vor der Ischämie sowohl bei der Kontrolle als auch bei der behandelten Leber. Diese Pegel kehren innerhalb von 10 Minuten nach Beginn der Reperfusion zu den normalen Werten zurück. Kontrollleber und behandelte Leber setzen Glucose auf identische Weise frei (10,4 ± 0,7 μM·min–1g–1). Die Glucoseproduktion war jedoch etwas höher nach 80 Minuten in der behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollorganen. Lactat sammelte sich während der Ischämie in höheren Anteilen in behandelten Lebern an (5,9 ± 0,5 μM·min–1g–1) als in den Kontrollorganen (4,5 ± 0,1 μM·min–1·g–1).
  • Die Vorbehandlung mit dem Extrakt vermindert die Freisetzung von ALT (1,09 ± 0,44 mU min–1g–1 gegenüber 2,44 ± 0,79 mU·min–1g–1) während der Reperfusion. Die Vorbehandlung mit dem Extrakt scheint den Einfluss der Ischämie während der ersten 30 Minuten der Reperfusion zu verringern. Die Ischämie ohne irgend eine Vorbehandlung mit dem Extrakt ruft einen Anstieg an LDH (108,7 ± 27,3 mU·min–1g–1) während der Reperfusion hervor. Die Vorbehandlung mit dem Extrakt beeinflusst LDH nicht in seinem Anstieg (115,9 ± 60,8 mU·min–1g–1).
  • Die Kalium- und Natriumkonzentrationen im Plasma wurden auch in beiden Gruppen gemessen. Zu Beginn der Reperfusion ist die Freisetzung von Kalium in der behandelten Gruppe höher als bei der Kontrolle (0,43 ± 0,01 mU·min–1g–1 gegenüber 5,4 ± 0,1 mU·min–1g–1 in der Kontrollgruppe bzw. den Behandlungsgruppen). Beim Perfusat war am Eingang die plasmatische Konzentration von Kalium und Natrium in beiden Gruppen gleich (K+ = 5,6 ± 0,3 mM und 5,4 ± 0,1 mM bei der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe, Na+ = 142,2 ± 8,6 mM bzw. 137,2 ± 15,2 mM bei der Kontrollgruppe bzw. Behandlungsgruppe).
  • Zu Beginn der Reperfusion war die Freisetzung von Natrium auch bei den behandelten Gruppen höher als bei den Kontrollen (1,2 ± 1,1 μM·min–1g–1 bzw. 16,5 ± 3,9 μM·min–1g–1).
  • Die Ischämie gefolgt von der Reperfusion ist durch zirkulatorische und metabolische Störungen gekennzeichnet und durch eine Gewebeschädigung, die durch freie Radikale hervorgerufen wird (Lee 2000). Dieses spezielle Modell wird derzeit verwendet, um die Schädigung auszuwerten, die durch freie Radikale in Geweben oder Organen, die einer Transplantation unterzogen wurden, hervorgerufen wird (Smrekova 2000, Cohen 2000 und Hachimoto 2000). Strukturelle und funktionelle Störungen werden durch I/R verursacht und spiegeln sich wider durch einen Anstieg bei der Freisetzung von Enzymen (Bailey 2000, Vollmar 1994 und Perlata 1999), eine Abnahme der Gallenproduktion (Vollmar 1994) und eine Abreicherung der ATP-Reserve (Hwang 1999 und Amllet 1990). Die Ischämie kann zur Erzeugung von Singulettsauerstoff Peroxid und Superoxid (O2 –•, H2O2, OH•) nach der Freisetzung von Metallionen, wie Eisen und Kupfer (Halliwell 1999) führen. Dieses Modell ist daher ein gutes, um eine schützende Wirkung zu charakterisieren, falls vorhanden, die in dem vorliegenden Extrakt nach einem Angriff durch Radikale vorhanden wäre.
  • Metabolische Veränderungen, die einen Schutz von Leberzellen sicherstellen, werden durch die Vorbehandlung mit dem Extrakt beeinflusst. Ein Radikalangriff nach I/R ruft eine Verminderung des ATP-Zellgehalts hervor, wodurch der energetische Zustand der Zelle verändert wird (Peralta 2000, Mallet 1990). Tamarina et al. (1984) schlagen vor, dass Ischämie das glycolytische System einer Zelle schädigt, was die Lactatproduktion schwierig macht. Eine gesunde Zelle (oder eine Zelle unter der Einwirkung eines schützenden Mittels) würde sich selbst vor einem solchen Stress schützen durch Erhöhung der ATP-Produktion über den glycolytischen Stoffwechselweg. Sano et al. (1995) schlugen vor, dass die glycolytische Aktivierung die durch I/R induzierte Bildung von freien Radikalen reduziert. Auch Phosphoenolpyruvat verhindert eine ATP-Abnahme nach I/R (Saiki 1999). Hwang et al. (1999) schlagen vor, dass eine Senkung des Verhältnisses von NAD+/NADH wesentlich für die Resistenz gegen freie Radikale ist, um Zellschädigungen zu minimieren. Die Vorbehandlung der Zellen mit dem vorliegenden Extrakt erhöht die Lactatproduktion während des ischämischen Zeitraums, was offensichtlich die Aktivierung eines Abwehrmechanismus gegen die Abnahme von ATP, die durch Ischämie hervorgerufen wird, widerspiegelt. Kowalski 1992 und Groussard 2000 schlagen vor, dass Lactat eine schützende Rolle bei Ischämie spielen könnte. Lactat könnte Superoxid (OH•) puffern, Pyruvat erzeugen, das auch Peroxid und Superoxid puffert, während es sich zu Acetat und CO2 zersetzt (Herz 1997).
  • Der Kaliumaustritt aus einer Zelle, die mit dem vorliegenden Extrakt vorbehandelt wurde, unterstützt auch eine schützende Wirkung des Extrakts auf eine Zelle. Die Peroxidation von Membrankomponenten kann Kaliumkanäle schädigen (Halliwell 1999). Die Kaliumfreisetzung kann eine nützliche Anpassung gegen metabolischen Stress sein (Wang et al. 1996). Die Kaliumkanalöffnung würde das Einfangen von Substraten für die intrazelluläre ATP-Erzeugung zulassen (Wondergem 1980). Die Kaliumfreisetzung würde auch den HCO3 –-Transport hemmen, was zu einer Ansäuerung des Cytoplasmas beiträgt, die auch die Zelle schützt (Currin 1991). Die Kaliumfreisetzung erscheint früh bei einem Perfusat und geht der ALT-Freisetzung voran und ist proportional der ATP-Abnahme (Mets 1993).
  • Die Natriumansammlung in den Zellen spielt eine größere Rolle bei der Zellschädigung, die durch I/R induziert wird (Carini 2000, vanEchteld 1991 und Xia 1996). Dieser Anstieg kann beruhen auf: 1) einer dysfunktionalen Na+/K+-Pumpe, die auf einer Abnahme von ATP beruht und einem Anstieg von anorganischem Phosphat oder 2) einer Stimulierung des Na/H-anti-Trägers aufgrund der Ansäuerung des Cytoplasmas (Zhao-fan 1996), Jede Umkehrung einer solchen Situation könnte den Angriff durch metabolischen Stress, der durch Natriumakkumulierung induziert wird, verringern (Fiegen 1997). Die Natriumfreisetzung kann daher ein Abwehrmechanismus gegen Schäden sein. Die Senkung von Kalium und Natrium wurde bei Lebern beobachtet, die mit dem vorliegenden Extrakt perfundiert wurden, was die schützende Wirkung des Extrakts für Leberzellen unterstützt. Die Natriumfreisetzung ist 10 Minuten nach Reperfusion bei der behandelten Gruppe größer als bei der Kontrollgruppe, was auf eine späte Wiedergewinnung der ATP-Gehalte in den Kontrollen hindeutet.
  • Der vorliegende Extrakt stimuliert Zellmechanismen, die mit dem Zellschutz gegen einen radikalischen Angriff verbunden sind.
  • Die ex-vivo-Wirkung des vorliegenden Extrakts im Gehirn:
  • Zahlreiche Hirnpathologien beinhalten einen Anstieg der Produktion von freien Radikalen. Es wird angenommen, dass Letzteres zu dem neurodegenerierenden Prozess beiträgt, nämlich aufgrund von Hirndurchblutungsstörungen oder während der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit. Es wird angenommen, dass antiradikalische Komponenten nützlich sein könnten, um die Expression von neurodegenerativen Krankheiten zu verringern oder für deren Verhütung oder Behandlung.
  • Der Hippocampusbereich des Gehirns ist empfindlich für neurotoxische Wirkungen von freien Radikalen, nämlich während einer cerebralen Anoxie. Es wurde in vitro gezeigt, dass die neuronale Übertragung während der Anoxie geschwächt ist, wegen der Überexpression von Antioxidansmolekülen. Daher wurde die Wirkung des vorliegenden Extrakts auf die neuronale Übertragung im Hippocampus ausgewertet. Elektrophysiologische Reaktionen wurden in dieser Gehirnstruktur registriert. Insbesondere wurde die Wiedergewinnung der neuronalen Potenzialisierung untersucht. Hippocampusschnitte von 450 μm Dicke wurden aus Rattengehirnen erhalten und wurden in elektrophysiologische Kammern überführt. Die Schnitte wurden 60 bis 90 Minuten in einer sauerstoffhaltigen physiologischen Lösung gehalten, die verschiedene Konzentrationen oder nicht verschiedene Konzentrationen des Extrakts enthielt. Nach dieser Ruheperiode wurde eine elektrische Stimulierung alle 25 Sekunden in den Hippocampusafferenzen angewendet (Schaffer, Bereiche der CA1-Region). Diese elektrischen Stimulationen riefen synaptische Antworten hervor. Die Anfangssteigung der postexzitatorischen Potenziale wurde berechnet, um die synaptische Übertragungswirksamkeit nach der Anoxie quantitativ auszuwerten. Um die neuronale Potenzialisierung auszuwerten, wurde eine Hochfrequenzstimulationsübung auf die neuronalen Kreisläufe nach Anoxie angewendet. Als positive Kontrolle kann die Reaktion auf Glutamat mit oder ohne Ischämie gemessen werden und die Gegenwart des vorliegenden Extrakts sollte die Reaktion auf Glutamat wiederherstellen.
  • Toxizität von FRTS/1
  • Die Toxizität wurde in zwei verschiedenen Modellen ausgewertet: die in-situ-Leberperfusion und die in-situ-Hirnperfusion. Diese Organe zeigten keine Zeichen von Toxizität aufgrund der Gegenwart des Extrakts.
  • Negative Reaktionen
  • Der vorliegende Extrakt ist nicht immunogen.
  • Die von dem vorliegenden Extrakt hervorgerufene Immunanantwort wurde ausgewertet, indem 125 μg des Extrakts Mäusen dreimal in Intervallen von 7 Tagen intraperitoneal injiziert wurden. 1 Woche nach der letzten Injektion wurde Blut entnommen, um den Immunserumstatus festzustellen. Die Mäuse wurden anästhesiert und das Blut wurde durch Herzpunktur entnommen. Die Blutproben wurden sofort auf Eis gestellt. Das Blut wurde auf dem Eis gerinnen gelassen und Proben wurden 12 Stunden nach der Entnahme zentrifugiert. Die Zentrifugierungsbedingungen waren wie folgt: 10 Minuten mit 2.500 g, was etwa 500 μl Serum lieferte. Der Extrakt wurde auf einer Mikroplatte adsorbiert, was ein fixiertes Antigenpräparat lieferte. 200 μl des Extrakts (5 μg/ml) und 200 μl ELISA-Puffer wurden in die Näpfe einer 96-Napf-Platte gegossen. Der ELISA-Puffer wurde aus 100 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,6) hergestellt. Nach Inkubation des Antigens bei 4°C über Nacht wurde nicht adsorbiertes Antigen in drei Waschstufen mit einem Natriumphosphatpuffer 100 mM/NaCl, 100 mM (pH 7,4) entfernt. Die freien Adsorptionsstellen wurden durch 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit einer Lösung von Casein 3% in Natriumphosphat/NaCl-Puffer blockiert. Überschüssiges Casein wurde dann dreimal abgewaschen. Die Serumproben, die die Antikörper bereitstellten, falls vorhanden, wurden wie folgt hergestellt: Reihenverdünnungen in Natriumphosphat/NaCl-Puffer, der mit 0,05% Tween 20TM ergänzt war, wurden erstellt und 25 μl dieser Verdünnungen wurden den Näpfen zugegeben. Die Mikroplatte wurde weiterhin 1 h bei 37°C inkubiert, wobei sich an diese Stufe 5 Waschungen mit dem Natriumphosphat/NaCl/Tween-Puffer anschlossen.
  • Die Gegenwart von Antikörper wurde festgestellt durch Bildung eines anti-Ig-Peroxidasekomplexes. 25 μl der Enzymverdünnung in dem Natriumphosphat/NaCl/Tween-Puffer werden in jeden Napf gegeben und anschließend 1 h bei 37°C inkubiert. Die Enzymverdünnung variierte von 1:750 bis 1:3.000 abhängig von dem Konjugat (dies sind anti-Ig-Ziege-Antiseren, IgM, IgG, Ig1, Ig2 und Ig3, markiert mit Peroxidase). An die Markierungsstufe schlossen sich 5 Waschungen mit dem Puffer an. Substratwasserstoffperoxid 0,015% und das Chromogen ABTS (2,2-Azinodiethylbenzthiazolin-6-sulfonat) 0,05% gelöst in einem Phosphatcitratpuffer 100 mM (pH 4,0) wurden in die Näpfe gegeben. Danach wurde weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur und im Dunkeln inkubiert. Die Wirkung des Enzyms setzte eine gefärbte Substanz frei, die spektrophotometrisch bei einer Extinktionswellenlänge von 400 nm ausgewertet werden kann. Der Serumpegel von für den Extrakt spezifischem Antikörper sollte proportional der Farbintensität sein. Die Ergebnisse, die erhalten wurden, deuten darauf hin, dass der Extrakt nicht immunogen ist für den einzelnen Empfänger.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass der Extrakt für Individuen nicht toxisch ist, da er weder hepatotoxisch noch immunogen ist.
  • Zusammensetzungen und Dosierungspläne
  • Aufgrund der Stabilität und der Wirksamkeit des vorliegenden Extrakts und der Tatsache, dass er für Tiere nicht toxisch ist, wird angenommen, dass Dosierungsraten von 1 ng/kg Körpergewicht bis 1 g/kg Körpergewicht pro Tag an Individuen verabreicht werden könnten, die eine solche Verabreichung benötigen (eine Dosis im unteren μg-Bereich kann bevorzugt sein). Die Dosierung hängt von der Aggressivität, die für die Behandlung einer Krankheit vorgesehen ist, ab. Die Dosierungen können auch von den Formulierungen und dem Verabreichungsweg abhängen. Z.B. enthält eine topische Zusammensetzung nicht die gleiche Dosis wie eine intravenöse Zusammensetzung oder eine enterische Zusammensetzung.
  • Topische Zusammensetzungen, um Haut- oder Schleimhautkrankheiten zu behandeln Allergie/Asthma
  • Braune Norwegische Ratten sind starke IgE-Erzeuger. Es gibt ein wohl etabliertes Modell einer allergeninduzierten Atemwegsüberempfindlichkeit bei Brown-Norway-Ratten (braunen Norwegischen Ratten1), das viele Merkmale von allergischem Asthma bei Menschen widerspiegelt, einschließlich Reaktionen der frühen und späten (70% der Tiere) Phase, dem Anstieg von antigenspezifischem IgE nach aktiver Immunisierung2, Atemwegsentzündung3 und erhöhter Bronchienempfindlichkeit auf verschiedene Stimuli nach Allergenkontakt4.
  • Messung der Lungenreaktion
  • Brown-Norway-Ratten werden sensibilisiert durch intraperitoneale Injektion von 1 ml von 1 mg Ovalbumin/100 mg Al(OH)3 in Kochsalzlösung, wie bereits beschrieben5. 21 Tage später werden die Tiere anästhesiert und wie vorher beschrieben6 mit dem Ende des Endotrachialtubus, der mit der Plexiglasbox verbunden ist, intubiert. Ein wassergefüllter Ösaphaguskatheter, der mit einem Druckwandler verbunden ist, wird verwendet, um Veränderungen im Pleuraldruck zu bestimmen. Die Luftströmung wird mit einem Pneumotachograph gemessen, der mit einem Differenzialwandler gekuppelt ist, der an der Plexiglasbox befestigt ist. Luftströmung, Volumen und transpulmonaler Druck, Atemwegswiderstand (RL) werden zu verschiedenen Zeiten bestimmt, um sowohl die Reaktionen der frühen als auch der späten Phase zu kennzeichnen. Sensibilisierte Brown-Norway-Ratten werden mit Kochsalzlösung oder Ovalbumin (2% in Kochsalzlösung) beaufschlagt unter Verwendung des "Wright"-Verneblers von Roxon Medi-Tech Lté (Montreal, PQ) unter Verwendung von komprimierter Luft, die mit einem Druck, der einen Ausstoß von 0,1 bis 0,2 ml/min ergibt, in die Plexiglasbox geleitet wird. Der Atemwegswiderstand wird alle 5 Minuten in der ersten Stunde und alle 15 Minuten für die nächsten 10 Stunden gemessen. Prä-, Co- und Nachbehandlung mit den Extrakten, die i.p. oder durch Inhalation verabreicht werden (etwa 1 bis 100 μg) werden bei diesem Modell getestet, um die Verbesserung festzustellen.
  • Schutz gegen UV-Strahlung
  • Die Fähigkeit von FRTS/1, durch UV-induzierte Hautschädigungen bei haarlosen Mäusen zu verhindern oder zu vermindern, wurde untersucht. Da bekannt ist, dass die meisten Hautkrebsarten durch Belichtung mit UV-Strahlung induziert werden, besteht ein Bedarf, neue potente natürliche Verbindungen zu finden, die die negativen Wirkungen von UV-Strahlung verhüten könnten.
  • Tiere
  • Haarlose Albino-(SKH/1)-Mäuse werden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erworben.
  • Alle Mäuse sind 6 Wochen alt zu Beginn der Bestrahlungsperiode. Die Mäuse werden unter Standardbedingungen (23 ± 1°C, 42 ± 6% relative Feuchtigkeit, 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus) in den Tierkäfigen von IBS gehalten. Das Licht wird automatisch täglich um 7.00 Uhr angeschaltet und um 19.00 Uhr abgeschaltet. Die Mäuse werden mit Purina Tierdiät (24% Protein, 4% Fett und 4,5% Faser) und Wasser ad libitum gefüttert. Für die Bestrahlung werden die Mäuse in Kunststoffkäfige gebracht und sich innerhalb der Käfige während der Bestrahlung frei bewegen gelassen.
  • Die Tiere werden 1 Woche lang vor der Behandlung akklimatisiert und statistisch in 5 Gruppen wie folgt unterteilt.
    • • Gruppe I: Kontrolle nicht bestrahlt, nicht behandelt (n = 5);
    • • Gruppe II: nicht mit UV bestrahlte Tiere, die mit einem Präparat einer topischen Salbe, die FRTS/1 enthält, behandelt werden (n = 5);
    • • Gruppe III: mit UV bestrahlte Tiere, die mit dem Präparat der topischen Salbe ohne FRTS/1 behandelt werden (n = 5);
    • • Gruppe IV: Tiere, denen topisch eine Creme, die FRTS/1 enthält, während der UV-Bestrahlung aufgetragen wird (n = 5);
    • • Gruppe V: nicht behandelte mit UV bestrahlte Tiere (n = 5).
  • Die Behandlung besteht in Folgendem:
    • 1. Wiegen aller Tiere, um ihren Gesundheitszustand am Tag der Behandlung festzustellen und einmal jeden zweiten Tag danach.
    • 2. Eine Art von Creme (von der bekannt ist, dass sie für Tiere und Menschen nicht toxisch ist) wird dorsal topisch aufgebracht. Die Creme enthält FRTS/1 oder nicht. Der Extrakt ist in einer Verdünnung von 1:10.000 vorhanden (ausgehend von der lyophilisierten Thylakoidfraktion). 1 g Creme wird direkt vorher (und bleibt während und nach der UV-Bestrahlung dort) auf den Rücken von drei Gruppen von Tieren abgegeben. Von diesen erhält eine Gruppe von 5 Tieren die Creme und keine Bestrahlung. Eine Gruppe erhält die Creme ohne FRTS/1 und wird UVB ausgesetzt und eine Gruppe erhält die FRTS/1-Creme und UVB. Die mit UVB bestrahlten Gruppen (n = 5) werden einmal 10 Minuten lang Höhensonnenlampen ausgesetzt. Eine Gruppe (n = 5) wird UV-Höhensonnenlampen ohne Cremebehandlung ausgesetzt.
    • 3. Eine einzige 10-minütige UVB-Bestrahlung mit Höhensonnenlampen, die 60 cm vom Rücken der Tiere entfernt sind, wird durchgeführt. Die zwei Gruppen mit 5 Tieren, die bezüglich des Schutzes durch die Creme getestet werden (mit und ohne FRTS/1) und eine einzelne Gruppe von 5 Tieren ohne Schutz werden der einzelnen Dosis von UVB ausgesetzt.
    • 4. Nach Behandlung werden alle Tiere in Käfigen gehalten und von oben im Käfig am Tag der UV-Behandlung und 3 bis 4 Tage später ohne Manipulation fotografiert.
    • 5. Nach einer Woche werden die Tiere getötet, bevor ein Stück von ihrer Rückenhaut für weitere Untersuchungen entnommen wird.
  • Westinghouse-FS40-Höhensonnenlampen, ein IL-1400-Radiometer und ein UVB-Photometer werden verwendet. Die Spektralstrahlung für die UV-Lampen ist 280 bis 400 nm, wovon 80% in der UVB-Region sind und 20% in der UVA-Region. Die Spitzenintensität der Lichtquelle ist 297 nm. Die Fluenz 60 cm von der Rückenoberfläche der Mäuse entfernt ist 0,48 bis 0,50 mJ/cm2/s. Die Mäuse werden in Kunststoffkäfige ohne Deckel gegeben, wie oben erwähnt.
  • Negative Kontrollmäuse (Gruppen I, II) werden auf gleiche Weise behandelt, aber die UV-Lampe wird nicht angeschaltet. Gruppe II erhält die Salbe ohne FRTS/1 topisch.
  • Die Mäuse von Gruppe III, IV und V erhalten 10 Minuten lang eine einzige Bestrahlung von insgesamt 200 mJ UV-Licht/cm2 (akute Dosierung). In Gruppe IV erhalten die Tiere einen topischen Auftrag eines FRTS/1-Präparats direkt vor, während und nach der UV-Belichtung. Dieser Ansatz wurde aufgenommen, um kleinere Unterschiede in den UV-Absorptionseigenschaften (Unterschiede in der optischen Dichte) im Bereich von 290 bis 320 nm in Betracht zu ziehen, die die UV-Lichtstrahlungsbedingungen optisch beeinflussen könnten (Gonales und Pathak 1996).
  • Die Mäuse werden gehalten und jeden zweiten Tag eine Woche lang vor und eine Woche nach der UV-Bestrahlung gewogen. Am Ende des Versuchs werden die Mäuse getötet und die folgenden Parameter werden in allen Gruppen verglichen.
    • 1. Körpergewicht
    • 2. Beobachtung der Epidermis und Fotografien
    • 3. Nach dem Töten der Mäuse wird ein Stück der Rückenhaut chirurgisch entfernt und für weitere Analysen verwendet
    • 4. Vergleich der Cytokeratinexpressionsmuster durch quantitativen Western-Blot
  • Sonnenbestrahlung ist der Hauptumweltfaktor, der die Struktur und Funktion der menschlichen Haut beeinflusst. Langzeitige Lichtschädigung der oberen Haut als Konsequenz von kumulativer Schädigung durch UV-Strahlung führt oft zu Lichtalterung und Hautkrebs bei hellhäutigen Individuen. Untersuchungen in Bezug auf fotobiologische Wirkungen von Ultraviolettstrahlung zeigen, dass die Ultraviolett-B-(UVB)-Komponente (290 bis 320 nm) besonders erythemogen und carcinogen ist und Veränderungen der Hautlichtalterung induziert, denen eine direkte Schädigung der DNA, RNA, Proteine (einschließlich Enzyme), Zellmembran und anderer Zellorganellen vorhergeht; Tedesco et al. (1997).
  • Kligman und Kligman (1993) machten eine klare Unterscheidung zwischen chronologischem Altern und Lichtaltern. Der Begriff Lichtalterung wird verwendet, um klinische und histologische Schädigungen zu beschreiben, die durch chronische Belichtung der Haut mit Sonnenlicht oder solarsimulierender UV-Strahlung erzeugt werden. Histologisch manifestieren sich diese Änderungen in Form von beträchtlichen Veränderungen der Elastizität, der Glycosaminoglycane und von ungeordnetem Kollagen zusammen mit einem Anstieg der Anzahl von Mastzellen und entzündlichen Zellen (Kligman und Gebre, 1991; Kaaresn und Poulsen, 1995; Póulsen et al., 1984). Dieses Phänomen der Lichtalterung wurde klinisch als irreversibel anerkannt, obwohl kürzlich erzielte therapeutische Ansätze halfen, die Überexpression von Veränderungen durch intrinsisches Altern und Lichtalterung zu minimieren (Gilchrest, 1996; Kang und Voorhees, 1998). Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Sonnenfiltern auf regelmäßiger Basis actinische Schädigungen für Bindegewebe verhüten hilft (Snyder und May, 1975; Kligman und Kligman, 1982; Bissett et al., 1991). Die Verwendung sowohl von Sonnenfiltern als auch Antioxidantien (z.B. Grüner Tee, Vitamin C, Vitamin E) scheint eine hemmende Wirkung auf durch UVB induzierte akute Hautschädigung zu haben, die sowohl zur Lichtalterung als auch zur Lichtcarcinogenese beiträgt (Snyder und May, 1975; Bissett et al., 1991 und Huang et al., 1997).
  • Die fotoprotektive Fähigkeit oder antioxidative Wirkung von FRTS/1 gegenüber akuter UV-Strahlungsbelichtung wurde bei dem Modell der haarlosen Albinomaus ausgewertet.
  • Die Haut von haarlosen Albinomäusen (SKH-1) wurde als nützliches und relevantes Versuchsmodell zur Untersuchung und zum Verständnis der Wirkungen von UV-Strahlung und Fotoalterung von menschlicher Haut anerkannt (Kligman et al., 1989; Bissett et al., 1987; Chatterjee et al., 1990; Kligman und Gebre, 1991). Die sichtbar und mikroskopisch erkennbaren Reaktionen der Epidermis und der Dermis auf UVB-Strahlung und die Abwesenheit von Haar machen die Haut von haarlosen Mäusen besonders nützlich zur Untersuchung und Auswertung der schädigenden Wirkungen von UV-Strahlung. Dieses Mausmodell wurde auch verwendet, um immunologische Veränderungen und Carcinogenese zu untersuchen und zu studieren, die durch UVB-Strahlung induziert werden, sowohl lokal in der Haut als auch systemisch (Fisher et al., 1989; Ho et al., 1992; Reeve et al., 1991).
  • Ergebnisse:
  • Direkt nach der Bestrahlung zeigten alle nicht behandelten bestrahlten Mäuse Zeichen einer Hautreizung und von Jucken. Sie waren ansonsten gesund und aktiv, obwohl sie kein Gewicht zunahmen. Es wurden keine Symptome von Reizung oder Röte beobachtet bei bestrahlten Mäusen, wenn sie mit FRTS/1 vorbehandelt oder nachbehandelt waren, und die Mäuse nahmen in 80% der Fälle an Gewicht zu. Topische Zusammensetzungen, entweder Sonnenschutzlotion, Creme, Salbe, Öl, Gel oder Spray sind daher Gegenstände der Erfindung.
  • Hautcytokeratinanalyse
  • Die Cytokeratine 1 und 10 sind repräsentativ für reife Haut. Eine Abnahme dieser Keratine ist ein Hinweis auf die Epidermisregeneration nach Läsion.
  • Die Cytokeratine 5 und 8 sind repräsentativ für suprabasale und basale Schichten und es wird angenommen, dass sie in aktiv proliferierender Epidermis exprimiert werden.
  • Die Gegenwart dieser Cytokeratine wurde mit spezifischen Antikörpern ausgewertet.
  • Die Extrakte von Mäusehaut wurden einzeln extrahiert und die Haut der Mäuse wurde einzeln pro Gruppe analysiert. Die gleiche Menge von insgesamt extrahierten cytoplasmatischen Proteinen wurde pro Napf angewendet: 35 μg, um einen Vergleich zwischen Tieren und Behandlungen zu ermöglichen.
  • Schlussfolgerungen
  • Mit FRST/1 geschützte Mäuse zeigten ein Muster wie das von Kontrollen, die nicht behandelt und nicht bestrahlt wurden, während andere Behandlungen eine drastische Abnahme der Keratine mit hohem Molekulargewicht zeigten. Insbesondere wurde Cytokeratin 10 weiterhin gut in der Haut von FRTS/1-Mäusen exprimiert, was ein guter Hinweis auf eine schützende Wirkung ist. Bei sehr geringer Dosis war der Extrakt topisch aktiv. Die Dosis kann nach Wunsch erhöht werden, da die Dosis des Extrakts nicht durch Toxizität begrenzt wird.
  • Figure 00470001
    Tabelle 1: Relative Aktivität als Funktion der Art und des exogenen Fluids
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Claims (37)

  1. Verfahren, um einen Extrakt aus einem fotosynthetischen Organismus zu erhalten, wobei das Verfahren die folgenden Stufen beinhaltet: a) dass eine Suspension von Organismusbestandteilen, die Thylakoide enthalten, bereitgestellt wird; b) die Bestandteile aufgeschlossen werden, wobei Thylakoide unter solchen Lichtbedingungen gewonnen werden, die eine Aktivierung der fotosynthetischen Pigmente der Thylakoide minimieren in einem Medium mit einer Viskosität zwischen 1 und 1,3 centipoise und einem pH-Wert über 2 und unter 10; wobei das Medium in einem Volumen zugegeben wird, das auf Basis der folgenden Gleichung berechnet wird:
    Figure 00530001
    wobei ein erster Extrakt, der im Wesentlichen aus Thylakoiden, Zellbruchstücken/Membranen besteht, und eine flüssige Phase erhalten werden, wobei die Thylakoide organisierte fotosynthetische Pigmente in ihrem Grundzustand enthalten; c) die Thylakoide, Zellbruchstücke/Membranen und die flüssige Phase voneinander getrennt werden, um einen zweiten, dritten und vierten Extrakt zu bilden, die im Wesentlichen aus isolierten Thylakoiden, Zellbruchstücken/Membranen bzw. einer flüssigen Phase aufgebaut sind und d) jeder Elektronendonator aus dem ersten, zweiten und dritten Extrakt eliminiert wird, um die fotosynthetischen Pigmente in ihrem Grundzustand zu stabilisieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gleichung wie folgt ist:
    Figure 00530002
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der pH-Wert zwischen 5 und 8 liegt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der pH-Wert zwischen 6 und 7,5 liegt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Organismus eine Pflanze ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Suspension von Stufe a) erhalten wird, indem Pflanzenbestandteile oder Gewebe in dem Medium mechanisch dispergiert werden.
  7. Verfahren, wie in Anspruch 5 oder 6 definiert, wobei der Stufe a) eine Stufe vorgeschaltet ist, bei der eine Pflanze einem konditionierenden Parameter, ausgewählt aus Licht, osmotischer Belastung, Hitze, Kälte, Einfrieren, Trockenheit, Hormonen, chemischen und biologischen Induktoren, ausgesetzt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Stufe a) eine Stufe vorgeschaltet ist, bei der der Organismus in einer Lichtumgebung konditioniert wird mit einer Wellenlänge zwischen etwa 500 und 600 nm und Stufe b) unter den gleichen Lichtbedingungen durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Stufe a) eine Stufe vorgeschaltet ist, bei der die Pflanze in einer Lichtumgebung mit einer Wellenlänge zwischen etwa 500 und 600 nm konditioniert wird und Stufe b) unter den gleichen Lichtbedingungen durchgeführt wird.
  10. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, wobei die Viskosität teilweise erreicht wird, indem dem Medium Zucker zugegeben wird.
  11. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, wobei die Viskosität teilweise durch Gegenwart von Sorbit in einer Konzentration von etwa 0,2 bis 1,5 M in dem Medium erreicht wird oder von einem Zucker, der eine Viskosität erreicht, die äquivalent ist 0,2 bis 1,5 M Sorbit.
  12. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, wobei die Viskosität teilweise in Gegenwart von Sorbit in einer Konzentration von etwa 0,2 bis etwa 0,4 M in dem Medium oder von einem Zucker, der eine Viskosität erreicht, die äquivalent ist zu 0,2 bis 0,4 M Sorbit, erreicht wird.
  13. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert, wobei das Medium die folgende Zusammensetzung hat: Tris- oder Acetat- oder Ascorbatpuffer (20 mM) mit einem pH-Wert von 7,5 oder Sorbit oder Saccharose oder Fructose mit 350 mM.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Abtrennungsstufe durchgeführt wird aufgrund von Unterschieden des Sedimentationskoeffizienten jeweils zwischen Thylakoiden, Zellbruchstücken und Membranen, und der flüssigen Phase.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Stufe der Abtrennung beinhaltet, dass der erste Extrakt in einem Röhrchen zentrifugiert wird, das mit einem Filter in einem oberen Teil des Röhrchens ausgestattet ist, wobei der Filter eine Porosität hat, auf der sich Zellbruchstücke und Membranen absetzen, während Thylakoide und die flüssige Phase durch den Filter geleitet werden, wobei die Thylakoide im unteren Teil des Röhrchens ein Pellet bilden.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Elektronendonator Wasser ist.
  17. Verfahren, wie in Anspruch 16 definiert, wobei Wasser eliminiert wird durch Vakuumgefriertrocknung.
  18. Verfahren, wie in Anspruch 16 definiert, wobei Wasser eliminiert wird, indem es gegen ein amphoteres Lösungsmittel oder ein Tensid nach Stufe c) ausgetauscht wird.
  19. Verfahren, wie in Anspruch 16 definiert, wobei Wasser eliminiert wird, indem es gegen Propylenglycol ausgetauscht wird.
  20. Extrakt, der mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 erhältlich ist, der der zweite Extrakt ist, der im Wesentlichen aus reinen stabilisierten Thylakoiden besteht.
  21. Extrakt, wie in Anspruch 20 definiert, der in trockenem Zustand ist.
  22. Extrakt, wie in Anspruch 20 definiert, der teilweise oder vollständig solubilisiert ist.
  23. Extrakt, wie in Anspruch 20 definiert, der eine Suspension ist.
  24. Extrakt, wie in einem der Ansprüche 20 bis 23 definiert, der in Gegenwart eines Elektronendonators aktiviert wird.
  25. Extrakt, wie in Anspruch 24 definiert, wobei der Elektronendonator Wasser ist.
  26. Verwendung des Extrakts nach einem der Ansprüche 20 bis 25 zur Herstellung eines Arzneimittels, um reaktive Sauerstoffarten abzufangen.
  27. Verwendung, wie in Anspruch 26 definiert, wobei das Abfangen zur Reduktion des Ausbruchs einer Krankheit oder Störung führt, die mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffarten verbunden ist.
  28. Verwendung, wie in Anspruch 27 definiert, wobei die Krankheit oder Störung eine Etiologie hat, die mit einer Entzündung, mit Krebs oder Kontakt mit Strahlung in Beziehung steht.
  29. Verwendung, wie in Anspruch 27 definiert, wobei die Krankheit oder Störung die Haut betrifft und ausgewählt ist aus Verbrennung, Sonnenbestrahlung, Psoriasis und Dermatitis; das Gehirn betrifft und ausgewählt ist aus Trauma, Schlaganfall, Parkinson, Neurotoxinen, Demenz und Alzheimer; Gelenke betrifft und ausgewählt ist aus Polyarthritis und Arthrose; den Gastrointestinaltrakt betrifft und ausgewählt ist aus Diabetes, Pankreatitis, Endotoxinleberschädigung und ischämischem Darm; das Auge betrifft und ausgewählt ist aus Karaktogenese, Retinopathie und degenerativer Netzhautschädigung; Gefäße betrifft und ausgewählt ist aus Atherosklerose und Vaskulitis; Erythrozyten betrifft und ausgewählt ist aus Fanconi anemia und Malaria; das Herz betrifft und ausgewählt ist aus koronarer Thrombose und Ischämie; die Lungen betrifft und ausgewählt ist aus Asthma und COPD; die Niere betrifft und ausgewählt ist aus Trans plantation und Glomerulonephritis; Multiorgane betrifft und ausgewählt ist aus Entzündung, Krebs, Ischämie-Rückflusszuständen, Arzneimitteltoxizität, Eisenüberladung, Ernährungsmängeln, Alkoholtoxizität, Strahlung, Alterung, Amyloidkrankheiten und toxischem Schock.
  30. Verwendung, wie in Anspruch 27 definiert, wobei die Krankheit oder Störung die Haut oder Schleimhaut betrifft und die Verwendung topisch ist.
  31. Verwendung, wie in Anspruch 28 definiert, wobei die Strahlung im Ultraviolettspektrum liegt.
  32. Verwendung des Extrakts, wie in einem der Ansprüche 20 bis 25 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Vorrichtung, um Photonen abzufangen.
  33. Zusammensetzung, die einen Extrakt enthält, wie in einem der Ansprüche 20 bis 25 definiert.
  34. Zusammensetzung nach Anspruch 33, die eine topische Zusammensetzung ist.
  35. Zusammensetzung nach Anspruch 34, die eine Sonnenschutzlotion, -creme, -salbe, ein Sonnenschutzöl, -gel oder -spray ist.
  36. Gerät oder Vorrichtung, das/die einen Extrakt enthält, wie in einem der Ansprüche 20 bis 25 definiert.
  37. Gerät oder Vorrichtung, wie in Anspruch 36 definiert, das/die ein Bioreaktor, Biofilter oder Biosensor ist.
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