DE60019117T2

DE60019117T2 - Substituierte benzamide als inhibitoren von rhinovirus 3c protease

Info

Publication number: DE60019117T2
Application number: DE60019117T
Authority: DE
Inventors: Siegfried Heinz Reich; Susan Elizabeth Kephart; Michael Brennan Wallace; Jr. Theodore Otto Johnson
Original assignee: Agouron Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Agouron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2020-06-22
Also published as: MXPA01013463A; EP1192127A1; EP1192127B1; ES2239603T3; WO2000078708A1; BR0011801A; CA2375356A1; US6369226B1; AU5628800A; DE60019117D1; JP2003509337A; ATE292109T1

Description

Die Erfindung ist auf bestimmte substituierte Benzamidverbindungen gerichtet, welche als Inhibitoren von Picorna-Viren wie etwa menschlichen Rhinoviren (HRV) brauchbar sind.
Hintergrund der Erfindung
HRV, welche die Hauptursache einer Erkältung beim Menschen sind, gehören zu der Picorna-Virenfamilie. (Couch, R.B. Rhinoviruses. In Virology, Fields; B.N., Knipe, D.M., Hrsg.; Raven Press: New York, 1990; Band 1, Kapitel 22, S. 607–629; siehe McKinlay, M.A.; Pevear, D.C.; Rossman, M.G. Treatment of the Picornavirus Common Cold by Inhibitors of Viral Uncoating and Attachment. Annu. Rev. Microbiol. 1992, 46, 635–654, und darin zitierte Literaturstellen; Phillpotts, R. J., Tyrell, D. A. J. Rhinovirus Colds. Br. Med. Bull. 1985, 41, 386–390; Gwaltney, J.M. Rhinoviruses. In Viral Infections of Humans, Evans, A.S., Hrsg.; Plunem Publishing Corp.: New York, 1982; Kapitel 20, S. 491–517; Gwaltney, J.M. The Common Cold. In Principles and Practices of Infectious Diseases, Mandell, G.L., Douglas, R.G., Bennett, J.E., Hrsg.; John Wiley & Sons: New York, 1985; Kapitel 38, S. 351–355). Picorna-Viren, wie etwa HRV, haben ein positiv-einzelsträngiges RNA-Genom (siehe Kräusslich, H.-G., Wimmer, E. Viral Proteinases. Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 701–754, und darin zitierte Literaturstellen; Callahan, P.L.; Mizutani, S.; Colonno, R.J. Molecular Cloning and Complete Sequence Determination of the RNA Genome of Human Rhinovirus Type 14. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 732–736; Stanway, G., Hughes, P.J., Mounfford, R. C.; Minor, P.D., Almond, J. W. The complete nucleotide sequence of the common cold virus: human rhinovirus 14. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 7859–7875; Lee, W.-M., Wang, W.; Rueckart, R.R. Complete sequence of the RNA genome of human rhinovirus 16, a clinically useful common cold virus belonging to the ICAM-1 receptor group. Virus Genes 1995, 9, 177–181), welches in ein Polyprotein mit mehr als 2000 Aminosäuren translatiert wird. Die 2A- und 3C-Protease (3CP) prozessieren dieses Polyprotein zu seinen funktionellen Virusproteinen in HRV. (Orr, D.C., Long, A.C., Kay, J., Dunn, B.M., Cameron, J.M. Hydrolysis of a Series of Synthetic Peptide Substrates by the Human Rhinovirus 14 3C Protease, Cloned and Express in Escherichia coli. J. Gen. Virol. 1989, 70, 2931–2942. Cordingly, M.G.; Register, R.B.; Callahan, P.L., Garsky, V.M., Colonno, R.J. Cleavage of Small Peptides In Vitro by Human Rhinovirus 14 3C Protease Expressed in Escherichia coli. J. Virol. 1989, 63, 5037–5045). Die Konsensusschnittstelle für das 3CP in dem viralen Polyprotein liegt zwischen Glutamin (P1)- und Glycin (P1')-Resten. Wenngleich das 3CP eine Cysteinprotease ist, erinnert ihre Tertiärstruktur an trypsinartige Serinproteasen. (Matthews, D.A., Smith, W.A., Ferre, R.A., Condon, B., Budahazi, G., Sisson, W., Villafranca, J. E., Janson, C. A., McElroy, H.E., Gribskov, C.L., Worland, S. Structure of Human Rhinovirus 3C Protease Reveals a Trypsin-like Polypeptide Fold, RNA-Binding Site, and Means for Cleaving Precursor Polyprotein. Cell 1994, 77, 761–771. Bazan, J.F., Fletterick, R.J. Viral Cysteine Proteases are Homologous to the Trypsin-like Family of Serine Proteases: Structural and Functional Implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 7872–7876; Gorbalenya, A. E., Blinov, V.M., Donchenko, A.P. Poliovirus-encoded Proteinase 3C: A Possible Evolutionary Link Between Cellular Serine and Cysteine Proteinase Families. FEBS Lett. 1986, 194, 253–257; Allaire, M., Chernala, M.M., Malcolm, B.A., James, M.N.G. Picornaviral 3C cysteine proteinases have a fold similar to chymotrypsinlike serine proteinases. Nature 1994, 369, 72–76). Das Erfordernis einer proteolytischen Prozessierung des viralen Polyproteins, unterstützt durch eine Mutagenese der Reste der aktiven Stelle (Ivanoff, L.A., Towatari, T., Ray. J., Korant, B.D., Petteway, S.R., Jr. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1986 83, 5392–5396; Hammerle, T., Hellen, C.U.T., Wimmer, E. J. Biol. Chem. 1991 266 5412–541; Kean, K.M., Teterina, N.L., Marc, D., Girard, M. Virology 1991 181 609–619) macht das 3CP zu einem brauchbaren Ziel für eine antirhinovirale Therapie.
Die Lösung der Kristallstruktur des HRV 3CP hat die Konstruktion einer Reihe von 3CP-Inhibitoren erleichtert, welche früher beschrieben wurden (Webber, S.E., Tikhe, J., Worland, S.T., Fuhrman, S.A., Hendrickson, T.F., Matthews, D.A., Love, R.A., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., DeLisle, D.M., Ford, C.E., Binford, S.L. Design, Synthesis, and Evaluation of Nonpeptidic Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease. J. Med. Chem. 1996, 39, 5072–5082; Webber, S.E., Okano, K., Little, T., Reich, S.H., Xin, Y., Fuhrman, S.A., Matthews, D.A., Love, R.A., Hendrickson, T.F., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Ford, C.E., Binford, S.L., Worland, S.T. Tripeptide Aldehyde Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease: Design, Synthesis, Biological Evaluation, and Cocrystal Structure Solution of P1 Glutamine Isosteric Replacements J. Med. Chem. 1998, 41, 2786–2805; Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr, J.E. V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806; Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Reich, S.H., Marakovits, J.T., Prins, T.J., Zhou, R., Tikhe, J., Littlefield, E.S., Bleckman, T.M., Wallace, M.W., Little, T.L., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 2. Peptide Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2819; Kaldor, S.W., Hammond, M., Dressman, B.A., Labus, J.M., Chadwell, F.W., Kline, A.D., Heinz, B.A. Glutamine-derived Aldehydes for the Inhibition of Human Rhinovirus 3C Protease. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 2021–2026; Shepherd, T.A., Cox, G.A., McKinney, E., Tang, J., Wakulchik, M., Zimmerman, R.E., Villarreal, E.C. Small Peptidic Aldehyde Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 2893–2896; Malcolm, B.A., Lowe, C., Shechosky, S., McKay, R.T., Yang, C.C., Shah, V.J., Simon, R.J., Vederas, J.C., Santi, D.V. Peptide Aldehyde Inhibitors of Hepatitis A Virus 3C Proteinase. Biochem. 1995, 34, 8172–8179.
Sham, H.L., Rosenbrook, W., Kati, W., Betebenner, D.A., Wideburg, N.E., Saldivar, A., Plattner, J.J., Norbeck, D.W. Potent inhibitor of the human rhinovirus (HRV) 3C protease containing a backbone modified glutamine. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1995, 1081–1082; Brill, G.M., Kati, W.M., Montgomery, D., Karwowski, J.P., Humphrey, P.E., Jackson, M., Clement J.J., Kadam, S., Chen, R.H., McAlpine, J.B. Novel Triterpene Sulfates from Fusarium compactum Using a Rhinovirus 3C Protease Inhibitor Screen. J. Antibiotics 1996, 49, 541–546; Skiles, J.W., McNeil, D. Spiro Indolinone Beta-lactams, Inhibitors of Poliovirus and Rhinovirus 3C-Proteinases. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 7277–7280; Kadam, S., Poddig, J., Humphrey, P., Karwowski, J., Jackson, M., Tennent, S., Fung, L., Hochlowski, J., Rasmussen, R., McAlpine, J. Citrinin Hydrate and Radicinin: Human Rhinovirus 3C-Protease Inhibitors Discovered in a Target-directed Microbial Screen. J. Antibiotics 1994, 47, 836–839; Singh, S.B., Cordingley, M.G., Ball, R.G., Smith, J.L., Dombrowski, A.W., Goetz, M.A. Structure and Stereochemistry of Thysanone: A Novel Human Rhinovirus 3C-Protease Inhibitor from Thysanophora penicilloides. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 5279–5282; Jungheim, L.N., Cohen, J.D., Johnson, R.B., Villarreal, E.C., Wakulchik, M., Loncharich, R.J., Wang, Q.M. Inhibition of Human Rhinovirus 3C Protease by Homophthalimides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 1589–1594; Kong. J., Venkatraman, S., Furness, K., Nimkar, S., Shephard, T., Wang, Q., Aube', J., Hanzlik, R.P. Synthesis and Evaluation of Peptidyl Michael Acceptors That Inactivate Human Rhinovirus 3C Protease and Inhibit Virus Replication J. Med. Chem. 1998 41 2579–2587). Es gibt jedoch noch immer einen Bedarf zur Auffindung eines nicht-peptidartigen Inhibitors von 3CP mit niedrigem Molekulargewicht und mit einer starken antirhinoviralen Aktivität. WO-A-98/43950 offenbart Verbindungen, die als picornavirale 3C-Proteaseinhibitoren mit einer antiviralen Aktivität wirken. Diese Verbindungen weisen eine peptidomimetrische Struktur auf.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung, kleinmolekulare nicht-peptidartige Inhibitoren von HRV 3CP (RVP) zu finden. Eine weitere Aufgabe ist, irreversible Inhibitoren von RVP zu finden, welche oral verfügbar sind.
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung, welche aus der folgenden ausführlichen Beschreibung hervorgehen, wurden durch die Auffindung von benzamidhaltigen Verbindungen, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert sind, gelöst bzw. erzielt. Diese umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel:
worin:
R₁₀, R₂₀ und R₃₀ jeweils wie in Anspruch 2 definiert sind,
R₄₀ wie in Anspruch 2 definiert ist und
R wie in Anspruch 2 definiert ist.
Solche Verbindungen sowie ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze oder Solvate sind brauchbare Mittel für pharmazeutische Indikationen, die durch eine Hemmung von RVP vermittelt werden, wie etwa für die Behandlung von Erkältungen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die RVP-hemmenden Mittel der Erfindung schließen die spezifischen benzamidhaltigen Verbindungen, die nachstehend beispielhaft angegeben sind, sowie Solvate und pharmazeutisch annehmbare Salze davon ein.
Ein "Solvat" soll eine pharmazeutisch annehmbare Solvatform von einer bestimmten Verbindung bedeuten, welche die biologische Wirksamkeit einer solchen Verbindung beibehält. Zu Beispielen für Solvate gehören Verbindungen der Erfindung in Kombination mit Wasser, Isopropanol, Ethanol, Methanol, DMSO, Ethylacetat, Essigsäure oder Ethanolamin.
Ein "pharmazeutisch annehmbares Salz" soll ein Salz bedeuten, welches die biologische Wirksamkeit der freien Säuren und Basen der angegebenen Verbindung beibehält und welches nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht ist. Zu Beispielen für pharmazeutisch annehmbare Salze gehören Sulfate, Pyrosulfate, Hydrogensulfate, Sulfite, Hydrogensulfite, Phosphate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphate, Chloride, Bromide, Iodide, Acetate, Propionate, Decanoate, Caprylate, Acrylate, Formiate, Isobutyrate, Caproate, Heptanoate, Propionate, Oxalate, Malonate, Succinate, Suberate, Sebacate, Fumarate, Maleate, Butin-1,4-dioate, Hexin-1,6-dioate, Benzoate, Chlorbenzoate, Methylbenzoate, Dinitrobenzoate, Hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, Phthalate, Sulfonate, Xylolsulfonate, Phenylacetate, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, (-Hydroxybutyrate, Glycolate, Tartrate, Me than-sulfonate, Propansulfonate, Naphthalin-1-sulfonate, Naphthalin-2-sulfonate und Mandelate.
Wenn eine erfindungsgemäße Verbindung eine Base ist, kann ein gewünschtes Salz durch ein beliebiges geeignetes im Fachgebiet bekanntes Verfahren hergestellt werden, wozu eine Behandlung der freien Base mit einer anorganischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure; Bromwasserstoffsäure; Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure; und dergleichen oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure; Maleinsäure; Bernsteinsäure; Mandelsäure; Fumarsäure; Malonsäure; Brenztraubensäure; Oxalsäure; Glycolsäure; Salicylsäure; Pyranosidylsäure, wie Glucuronsäure oder Galacturonsäure; alpha-Hydroxysäure, wie Citronensäure oder Weinsäure; Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure; aromatischen Säure, wie Benzoesäure oder Zimtsäure; Sulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure oder Ethansulfonsäure gehört.
Wenn eine erfindungsgemäße Verbindung eine Säure ist, kann ein gewünschtes Salz durch ein beliebiges geeignetes im Fachgebiet bekanntes Verfahren hergestellt werden, wozu eine Behandlung der freien Säure mit einer anorganischen oder organischen Base, wie einem Amin (primär, sekundär oder tertiär); einem Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxid gehört. Zu anschaulichen Beispielen für geeignete Salze gehören organische Salze, die von Aminosäuren wie Glycin und Arginin; Ammoniak; primären, sekundären und tertiären Aminen; und cyclischen Aminen, wie Piperidin, Morpholin und Piperazin abgeleitet sind; sowie anorganische Salze, die von Natrium, Calcium, Kalium, Magnesium, Mangan, Eisen, Kupfer, Zink, Aluminium und Lithium abgeleitet sind.
Im Fall von Verbindungen, Salzen oder Solvaten, welche Feststoffe sind, ist dem Fachmann klar, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen, Salze und Solvate in verschiedenen Kristallformen vorkommen können, welche alle innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und der angegebenen Formeln liegen sollen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als einzelne Stereoisomere, Racemate und/oder Gemische von Enantiomeren und/oder Diastereomeren vorliegen. Alle solchen einzelnen Stereoisomere, Racemate und Gemische davon sollen innerhalb des breiten Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Vorzugsweise werden jedoch die erfindungsgemäßen Verbindungen in optisch reiner Form verwendet.
Gemäß dem allgemeinen Verständnis eines Fachmanns ist eine optisch reine Verbindung eine Verbindung, welche enantiomerenrein ist. So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff "optisch rein" eine Verbindung bedeuten, die mindestens eine ausreichende Aktivität umfasst. Vorzugsweise wird eine Menge eines einzelnen Enantiomers bereitgestellt, um eine Verbindung zu ergeben, welche die gewünschte pharmakologisch reine Verbindung der Erfindung aufweist, die mindestens 90 % eines einzelnen Isomers (80 % enantiomerer Überschuss), mehr bevorzugt mindestens 95 % (90 % e.e.), noch mehr bevorzugt mindestens 97,5 % (95 % e.e.) und am meisten bevorzugt mindestens 99 % (98 % e.e.) umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Hemmen der picornaviralen 3C-Proteaseaktivität gerichtet, welches das Inkontaktbringen der Protease mit einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch aktiven Salzes oder Solvats davon umfasst. Zum Beispiel kann die picornavirale 3C-Proteaseaktivität in Säugergewebe durch Verabreichen einer in den nachstehenden Tabellen gezeigten Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Solvats davon gehemmt werden. Mehr bevorzugt ist das vorliegende Verfahren auf das Hemmen der rhinoviralen Proteaseaktivität gerichtet.
"Behandeln" oder "Behandlung" soll mindestens die Abschwächung eines Krankheitszustands bei einem Säuger, wie etwa einem Menschen, bedeuten, welcher durch die Hemmung der Aktivität von einer oder mehreren picornaviralen 3C-Proteasen, wie den von menschlichen Rhinoviren, menschlichem Poliovirus, menschlichen Coxsackieviren, Encephalomyocarditisviren, Meningitisvirus und Hepatitis A-Virus gelindert wird, und umfasst: (a) eine vorbeugende Behandlung bei einem Säuger, insbesondere wenn sich herausstellt, dass der Säuger dazu neigt, den Krankheitszustand zu haben, aber noch nicht diagnostiziert wurde, dass er ihn hat; (b) das Hemmen des Krankheitszustands; und/oder (c) das vollständige oder teilweise Lindern des Krankheitszustands.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen als Inhibitoren der picornaviralen 3C-Proteaseaktivität kann durch ein beliebiges der geeigneten Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gemessen werden, wozu in vivo- und in vitro-Assays gehören. Ein Beispiel für einen geeigneten Assay für Aktivitätsmessungen ist ein antiviraler H1-HeLa-Zellkultur-Assay.
Die Verabreichung der Verbindungen der Formel I und ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze und Solvate kann auf eine beliebige der anerkannten Verabreichungsweisen erfolgen, die dem Fachmann zur Verfügung stehen. Anschauliche Beispiele für geeignete Verabreichungsweisen schließen eine orale, nasale, parenterale, topische, transdermale und rektale Verabreichung ein. Eine intranasale Verabreichung ist besonders bevorzugt.
Eine erfindungsgemäße Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug, aktiver Metabolit oder Solvat davon kann als pharmazeutische Zusammensetzung in einer beliebigen pharmazeutischen Form verabreicht werden, von der der Fachmann erkennen kann, dass sie geeignet ist. Zu geeigneten pharmazeutischen Formen gehören feste, halbfeste, flüssige oder lyophilisierte Formulierungen, wie Tabletten, Pulver, Kapseln, Suppositorien, Suspensionen, Liposome und Aerosole. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können auch geeignete Exzipientien, Verdünnungsmittel, Vehikel und Träger sowie andere pharmazeutisch aktive Mittel je nach der beabsichtigten Verwendung enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von Suspensionen intranasal verabreicht.
Annehmbare Verfahren zum Herstellen von geeigneten pharmazeutischen Formen der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind bekannt oder können routinemäßig vom Fachmann bestimmt werden. Zum Beispiel können pharmazeutische Zubereitungen gemäß herkömmlichen Methoden des pharmazeutischen Chemikers hergestellt werden, welche Schritte wie das Vermischen, Granulieren und Verpressen, falls dies erforderlich ist, für Tablettenformen, oder das Mischen, Füllen und Auflösen der Inhaltsstoffe, soweit dies zweckmäßig ist, einschließen, um die gewünschten Produkte für eine orale, parenterale, topische, intravaginale, intranasale, intrabronchiale, intraokulare, intraaurale und/oder rektale Verabreichung zu ergeben.
Feste oder flüssige pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Vehikel oder Exzipientien können in den pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Zu anschaulichen festen Trägern gehören Stärke, Lactose, Calciumsulfat-dihydrat, Terra alba, Sucrose, Talk, Gelatine, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat und Stearinsäure. Zu anschaulichen flüssigen Trägern gehören Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Salzlösung und Wasser. Der Träger oder das Verdünnungsmittel kann ein geeignetes Material für eine verlängerte Freisetzung wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs, enthalten. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, kann die Zubereitung in Form eines Sirups, eines Elixiers, einer Emulsion, einer Weichgelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit (z. B. Lösung) oder einer nichtwässrigen oder wässrigen flüssigen Suspension vorliegen.
Eine Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung enthält mindestens eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffs (d. h. eines Mittels der Erfindung) und ist vorzugsweise aus einer oder mehreren pharmazeutischen Dosierungseinheiten gebildet. Die ausgewählte Dosis kann einem Säuger, z. B. einem menschlichen Patienten, welcher eine Behandlung benötigt, die durch eine Hemmung einer picornaviralen 3C-Proteaseaktivität vermittelt wird, durch ein beliebiges bekanntes oder geeignetes Verfahren zum Verabreichen der Dosis verabreicht werden, wozu eine topische Verabreichung, z. B. als eine Salbe oder Creme; eine orale Verabreichung; eine rektale Verabreichung, z. B. als Suppositorium; eine parenterale Verabreichung durch Injektion; oder eine kontinuierliche Verabreichung durch intravaginale, intranasale, intrabronchiale, intraaurale oder intraokulare Infusion gehören.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" soll die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung bedeuten, welche, wenn sie einem Säuger verabreicht wird, der sie benötigt, ausreicht, um eine Behandlung für Krankheitszustände zu bewirken, die durch die Hemmung der Aktivität von einer oder mehreren picornaviralen 3C-Proteasen gelindert werden, wie denjenigen von menschlichen Rhinoviren, menschlichem Poliovirus, menschlichen Coxsackieviren, Encephalomyocarditisviren, Meningovirus und Hepatitis A-Virus. Die Menge einer bestimmten Verbindung der Erfindung, welche therapeutisch wirksam ist, variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie der speziellen Verbindung, dem Krankheitszustand und seiner Schwere, der Identität des Säugers, welcher die Verbindung benötigt, wobei die Menge routinemäßig vom Fachmann bestimmt werden kann.
Zum Zweck der Veranschaulichung kann eine Formulierung für eine nasale Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von rhinoviralen Infektionen wie folgt hergestellt werden, wobei alle Prozentsätze sich auf Gewicht/Gewicht beziehen und die Suspension in gereinigtem Wasser hergestellt wird. Eine Verbindung wird bis zu einer reduzierten Teilchengröße mikrovisiert, so dass D₉₀ < 10 μm. Es wird eine Suspension hergestellt, die eine Endkonzentration von 0,01 % bis 2 % der aktiven Verbindung, vorzugsweise von 0,2 % bis 2 % enthält. Ein geeignetes Konservierungsmittel, ausgewählt aus den im Fachgebiet bekannten, kann enthalten sein, z. B. Benzalkoniumchlorid/EDTA in zweckmäßigen Endkonzentrationsbereichen, z. B. 0,02 %/0,01 %. Ein Suspendiermittel, wie ein Gemisch von mikrokristalliner Cellulose (Endkonzentration 1 %–1,5 %, vorzugsweise 1,2 %) und Natriumcarboxymethylcellulose (Endkonzentration 0,1 %–0,2 %, vorzugsweise 0,13 %) kann enthalten sein. Ein oberflächenaktiver Stoff wie Polysorbat 80 kann in einer Endkonzentration von 0,05 % bis 0,2 %, vorzugsweise 0,1 % enthalten sein. Ein Tonizitätsmittel wie etwa Dextrose kann bis zu einer Endkonzentration von 4 % bis 6 %, vorzugsweise 5 % enthalten sein. Der pH der am Ende erhaltenen Lösung wird zweckmäßig auf einen physiologischen Bereich, z. B. 4–6 eingestellt, wobei eine nicht-toxische Säure und/oder Base wie HCl und/oder NaOH verwendet wird.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung und ihre Synthesen und ihre Prüfung werden in den folgenden ausführlichen Beispielen beschrieben.
Analytische Verfahren
Schmelzpunkte (Schmp.) wurden an einem Mel-Temp-Apparat bestimmt und sind nicht korrigiert. Die Strukturen der Verbindungen wurden durch Protonenkernresonanzspektroskopie, Infrarotspektroskopie und entweder Mikroelementaranalyse oder durch Massenspektrometrie bestätigt. Protonenkernresonanzspektren wurden unter Verwendung eines General Electric QE-300-Spektrometers bestimmt, das bei einer Feldstärke von 300 MHz betrieben wurde. Die chemischen Verschiebungen sind in Teilen pro Million (ppm) und durch Einstellen der Vergleichsproben derart, dass in CDCl₃ der CHCl₃-Peak bei 7,26 ppm liegt und in DMSO-D₆ der DMSO-Peak bei 2,49 ppm liegt und in Aceton-D₆ der Aceton-Peak bei 2,04 ppm liegt, angegeben. Standard- und Peakmultiplizitäten werden wie folgt bezeichnet: s, Singulett; d, Dublett; dd, Dublett von Dubletts; t, Triplett; brs, breites Singulett; brd; breites Dublett; br, breites Signal und m, Multiplett. Massenspektren wurden im Scripps Research Institute, San Diego, CA, Mass Spectrometric Facilities, bestimmt. Infrarotabsorptionsspektren wurden an einem Perkin-Eimer 457-Spektrometer oder einem MIDAK hochauflösenden FT-IR aufgenommen, und die Werte sind in cm^–1 angegeben. Mikroelementaranalysen wurden von Atlantic Microlabs Inc., Norcross, GA. durchgeführt und ergaben Ergebnisse für die angegebenen Elemente innerhalb von ± 0,4 % der theoretischen Werte. N,N-Dimethylformamid und N,N-Dimethylacetamid wurden so verwendet, wie sie von Aldrich erhalten wurden. Tetrahydrofuran (THF) wurde über Natriumbenzophenonketyl oder CaH₂ unter Stickstoff destilliert. Eine Blitzchromatographie wurde unter Verwendung von Silicagel 60 (Merck Art 9385) durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Dünnschichtchromatographien (DSC) wurden auf vorbeschichteten Siliciumdioxid-Platten 60 F254 (Merck Art 5719) durchgeführt. Abkürzungen: NMO = 4-Methylmorpholin-N-oxid; TPAP = Tetrapropylammoniumperruthenat; TBAF = Tetrabutylammoniumfluorid; HATU = O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium; FMOC = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; DIEA = Düsopropylethylamin; HOBT = 1-Hydroxybenzotriazolhydrat; DIC = 1,3-Diisopropylcarbodiimid.
3CP-Hemmungs-Assays und antivirale Assays
Die Einzelheiten der verwendeten 3CP-Enzym-Assays und der verwendeten antiviralen Assays sind in Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Actitivity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806, dargelegt.
Proteinkristallographie
3C-Protease von menschlichem Rhinovirus Serotyp 2 wurde mit einem dreifachen molaren Überschuss von Verbindung 4 in Gegenwart von 2 % DMSO 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Der Komplex wurde auf 10 mg/ml konzentriert und dann durch einen 0,22 μm-Celluloseacetatfilter geleitet. Kristalle wurden bei 13°C gezüchtet, wobei ein Hängetrop fen-Dampfdiffusionsverfahren verwendet wurde, in welchem gleiche Volumina (3 μl) des Protein/Liganden-Komplexes und der Reservoirlösung auf Kunststoffdeckgläschen vermischt wurden und damit einzelne Näpfe abgedeckt wurden, die mit 1 ml Reservoirlösung, enthaltend 1,2 M Ammoniumsulfat, 0,325 M Natriumphosphat, 0,325 M Kaliumphosphat, 0,1 M ADA pH 6,6 und 2,5 % (Vol./Vol.) 1,4-Dioxan gefüllt waren. Ein Einkristall mit den Abmessungen 0,6 mm × 0,4 mm × 0,2 mm (Raumgruppe P2₁2₁2; a=61,22, b=77,71, c=34,35 Å) wurde für eine Tieftemperatur-Datenerfassung durch zweiminütiges Eintauchen in eine künstliche Mutterlaugenlösung, die aus 400 μl der Reservoirlösung vermischt mit 125 μl Glycerin bestand, gefolgt von einem Schnellgefrieren in einem N₂-Gasstrom bei –170°C hergestellt. Röntgenbeugungsdaten wurden unter Verwendung einer MAR-Bildplatte aufgenommen und mit DENZO verarbeitet. Beugungsdaten waren 74 % vollständig bis zu einer Auflösung von 1,85 Å mit R(sym) = 1,9 %. Proteinatomkoordinaten aus der Cokristallstrukturbestimmung (Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Actitivity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806) wurden verwendet, um eine Starre-Körper-Verfeinerung (rigid body refinement) in X-PLOR zu starten, gefolgt von simulierten Annealing- und konjugierten Gradientenminimierungs-Protokollen. Die Anordnung der Testverbindung, die Zugabe des geordneten Lösungsmittels und eine weitere Verfeinerung erfolgte wie in Kean, K.M., Teterina, N.L., Marc, D., Girard, M. Virology 1991 181 609–619 beschrieben. Der endgültige R-Faktor betrug 20,8 % (10680 Reflexionen mit F > 2_(F)). Die mittleren quadratischen Abweichungen von den idealen Bindungslängen und -winkeln betrugen 0,013 Å bzw. 2,6 Grad. Das endgültige Modell bestand aus allen Atomen für die Reste 1–180 (mit Ausnahme der Seitenkette von Rest 21) plus 104 Wassermolekülen.
Berechnungen, die bei der virtuellen Bibliotheksanalyse verwendet wurden Wir wählten 3087 primäre Amine und Mercaptane aus dem ACD (Available Chemicals Directory 1997, bereitgestellt durch ISIS Database 2.0 von MDL Information System, San Leandro, CA.) aus. Die Bibliothek wurde mit PEONY (einem firmeninternen Programm, welches die virtuelle 2D-Bibliothek aus ihren Fragmenten synthetisiert) erstellt; wobei die Verbindungen in der 5-Stellung des Benzamidkerns gebunden wurden. Es wurden 3D-Koordinaten der Bibliothek mit CORINA Ver. 1.7 (CORINA 3D-Structure Generator, Version 1.7, April 1996, Jens Sadowski und Johann Gesteiger) erzeugt. Die Strukturen wurden dann in dem Batchmin-Modul von MacroModel (Mohamadi, F., Richards, N.G.J., Guida, W.C., Liskamp, R., Lipton, M., Caufield, C., Chang, G., Hendrickson, T., Still, W.C., "MacroModel – An Integrated Software System for Modeling Organic and Bioorganic Molecules Using Molecular Mechanics", J. Comput. Chem. (1990), 11, 440) Ver. 5.5 unter Verwendung des AMBER*-Kraftfelds energieminimiert (die Atomladungen waren der Standardwert von dem Kraftfeld). Verbindungen mit günstig vorhergesagten Bindungsmodi an die P2- oder P4-Tasche wurden durch eine teilweise fixierte Andockroutine (partially fixed docking routine) ausgewählt, wie sie in AGDOCK implementiert ist (Gehlhaar, D.K., Verkhivker, G., Rejto, P.A., Sherman, C.A., Fodel, D.A., Fogel, L.J., Freer, S.T., "Molecular recognition of the inhibitor AG-1343 by HIV-1 protease: conformationally flexible docking by evolutionary programming", Chemistry and Biology (1995), 5, 317; D.K. Gehlhaar, D. Bouzida, und P.A. Rejto, "Reduced Dimensionality in Ligand-Protein Structure Prediction: Covalent Inhibitors of Serine Proteases and Design of Site-Directed Combinatorial Libraries," ACD Symposium Series on Rational Drug Design, American Chemical Society (1998), zur Veröffentlichung angenommen). Jede Verbindung wurde durch das Andockverfahren (docking process) achtmal gegen die aktive Stelle des Zielproteins aus der Cokristallstruktur von Verbindung 1 laufen gelassen, wobei der Benzamidkern und Proteinatome an den Koordinaten der Cokristallstruktur fixiert waren (Jeder Andocklauf (docking run) ist ein evolutionärer Programmieralgorithmus, in welchem viele versuchsweise Protein/Ligand-Konfigurationen erzeugt und hinsichtlich der Energie bewertet werden. Am Ende jedes Laufs wird eine einzige Ligandenkonformation erzeugt. Nähere Einzelheiten siehe in Matthews, D.A., Smith, W.A., Ferre, R.A., Condon, B., Budahazi, G., Sisson, W., Villafranca, J.E., Janson, C.A., McElroy, H.E., Gribskov, C.L., Worland, S. Structure of Human Rhinovirus 3C Protease Reveals a Trypsin-like Polypeptide Fold, RNA-Binding Site, and Means for Cleaving Precursor Polyprotein. Cell 1994, 77, 761–771. Alle Torsinnen der Benzamidsubstituenten in 5-Stellung waren während des Andockens (docking) flexibel. Um angedockte Strukturen (docked structures) mit sehr ungünstigen Kontakten mit dem Ziel zu entfernen, wurden die fixierten Ligandenatombeschränkungen (fixed ligand atom constraints) beseitigt und die Ligandenstrukturen wurden im Kontext des starren Proteins energieminimiert. Nur diejenigen Strukturen, welche nach der Minimierung in dem Protein die Ko ordinaten des Benzamidkerns nahe an der Cokristallstruktur beibehielten (mittlere quadratische Abweichung (RMS. deviation) <= 1,0 für Schweratome) wurden für die weitere Analyse weiterverwendet. Die angedockten Moleküle wurden dann bewertet und eingestuft, wobei HTS (Peter W. Rose, Scoring Methods in Ligand Design, 2nd UCSF Course in Computer-Aided Molecular Design, San Francisco, CA, 1997), ein firmenintern entwickeltes Programm zum schnellen Abschätzen der freien Energie der Protein-Liganden-Assoziation, verwendet wurde. Strukturen mit schlechten HTS-Bewertungen wurden verworfen; und unter den mehrfach angedockten Konformationen der gleichen Verbindung wurde diejenige mit der besten HTS-Bewertung beibehalten. Eine abschließende Einstufung beruhte darauf, welche Verbindungen mindestens eine spezifische Wasserstoffbindungsdonor- oder -akzeptor-Wechselwirkung mit Proteinatomen aufwiesen, welche bekanntermaßen Wechselwirkungen vom β-Strang-Typ mit dem nativen Peptidsubstrat ausbilden und welche gut in die P2- oder P4-Taschen passen, bewertet anhand von Ligand-Proteinatom-Abstandskriterien zu ausgewählten Proteinatomen in der Teilstruktur (Subsite).
Beispiele
Nachstehend werden beispielhafte Verbindungen der Erfindung und ihre Synthesen beschrieben.
Beispiel 1: 3-Carbamoyl-benzaldehyd (Verbindung 1a)
Oxalylchlorid (13,3 ml, 152 mmol) und DMF (50 μl) wurden zu einer Suspension von 3-Carboxybenzaldehyd (11,4 g, 76,2 mmol) in 200 ml CH₂Cl₂ zugegeben und 18 h bei 23°C gerührt. Die resultierende klare Lösung wurde konzentriert, in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst und erneut konzentriert. Das rohe Säurechlorid wurde in 20 ml THF gelöst, in ein Gemisch von konzentriertem NH₄OH (26 ml, 381 mmol) mit 100 ml zerstoßenem Eis gegossen und unter Rühren auf 23°C aufwärmen gelassen. Das Gemisch wurde mit konz. HCl bis pH ~3 angesäuert und anschließend konzentriert, um THF zu entfernen. Die resultierende wässrige Suspension wurde filtriert und das weiße feste Produkt unter Vakuum getrocknet, wobei 7,4 g (65 %) 3-Carbamoyl-benzaldehyd Verbindung 1a erhalten wurde: ¹H-NMR (DMSO-d₆) ∂ 10,06 (1H, s), 8,40 (1H, s), 8,19 (1H, s), 8,17 (1H, d, J = 6,6 Hz), 8,04 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,69 (1H t, J = 7,7 Hz), 7,56 (1H, s); IR (KBr-Pellet) 3391, 3205, 1711, 1694, 1664, 1385, 1217. Anal. (C₈H₇NO₂·0,1 H₂O) C, H, N.
3-(3-Carbamoylphenyl)-acrylsäureethylester (Verbindung 1)
Verfahren A: Eine Lösung von 3-Carbamoyl-benzaldehyd Verbindung 1a (7,38 g, 49,5 mmol) und (Carbethoxymethylen)-triphenylphosphoran (17,23 g, 49,5 mmol) in 200 ml Toluol wurde 24 h zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zwischen 750 ml CH₂Cl₂ und einem Gemisch von 200 ml Wasser mit 200 ml Salzlösung verteilt. Die organische Schicht wurde erneut mit einem Gemisch von 100 ml Wasser mit 100 ml Salzlösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet, filtriert und zu einem rohen gelben Öl konzentriert, welches beim Stehen kristallisierte. Die kombinierten wässrigen Schichten wurden filtriert und das unlösliche Material wurde mit dem aus der organischen Schicht erhaltenen rohen Feststoff kombiniert. Das Rohprodukt wurde durch Umkristallisierung aus Methanol gereinigt. Eine Ausbeute von 5,25 g (48 %) von Verbindung 1 wurde in zwei Chargen als gelbe Nadeln isoliert: Schmelzpunkt 168–170°C; ¹H-NMR (CDCl₃) ∂ 7,99 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,71 (1H, d, J = 11,8 Hz), 7,68 (1H s), 7,49 (1H t, J = 7,7 Hz), 6,52 (1H, d, J = 16,2 Hz), 6,10 (1H, br s, NH), 5,75 (1H, br s, NH), 4,28 (2H, q, J = 7,0 Hz), 1,35 (3H, t, J = 7,0 Hz); IR (Reinsubstanzfilm) (neat film) 3414, 3177, 1695, 1682, 1639, 1400, 1313, 1215, 1192, Anal. (C₁₂H₁₃NO₃) C, H, N.
Verbindung 1 wurde auch mit 78 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei Ethylacrylat in der gleichen Arbeitsweise (Verfahren B) wie für die nachstehend beschriebene Herstellung von Verbindung 2 verwendet wurde.
Beispiel 2: 3-Iod-benzamid (Verbindung 32)
3-Iod-benzamid wurde hergestellt unter Verwendung einer Modifizierung der Arbeitsweise von Remsen. (Remsen; Reid Am. Chem. J. 1899, 21, 289). 3-Iod-benzoesäure (28,68 g, 116 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (200 ml) bei 23°C unter Argon gerührt. Oxalylchlorid (30,2 ml, 349 mmol) wurde langsam zugegeben und es wurde eine langsame Gasentwicklung beobachtet. Dann wurde DMF (0,1 ml) zugegeben, was die Gasentwicklung erheblich beschleunigte, und das Reaktionsgemisch wurde 2 h gerührt. Das Lösungs mittel wurde entfernt und der braune ölige Rückstand wurde in THF (50 ml) gelöst und zu einer Lösung von 18 % wässrigem NH₄OH (260 ml) bei 0°C zugegeben. Nach 15 min Rühren des Gemisches wurde die Flüssigkeit abdekantiert, und der zurückbleibende Schlamm wurde mit 1 N HCl angesäuert. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 25,68 g (90 %) 3-Iod-benzamid Verbindung 32 erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,21 (1H, t, J = 1,5 Hz), 8,05 (1H, s), 7,87 (2H, dd, J = 8,1, 1,5 Hz), 7,47 (1H, s), 7,25 (1H, t, J = 7,8 Hz); IR (KBr) 3343, 3164, 1661, 1628, 1561, 1424, 1389, 1125. Anal. (C₇H₆INO) C, H, N.
Beispiel 3: 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäuremethylester (Verbindung 2)
Verfahren B: 3-Iod-benzamid 32 (1,16 g, 4,7 mmol), Methylacrylat (530 μl, 5,87 mmol), Palladium(II)-acetat (16 mg, 0,071 mmol) und Triethylamin (820 μl, 5,87 mmol) wurden in 10 ml Acetonitril unter Argon in einem Einschlussrohr bei 100°C 5 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C gekühlt und der graue Niederschlag wurde gesammelt. Eine Umkristallisierung aus Methanol ergab 425 mg (44 %) Verbindung 2 als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,20 (1H, s), 8,04 (1H, s), 7,87 (2H, dd, J = 7,8, 18 Hz), 7,69 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,50 (1H, t, J = 7,8 Hz), 7,47 (1H, s), 6,73 (1H, d, J = 15,9 Hz), 3,73 (3H, s); IR (KBr) 3424, 3366, 3173, 2957, 1728, 1659, 1578, 1431, 1399, 1317. Anal. (C₁₁H₁₁NO₃)·0,2 H₂O) C, H, N.
Beispiel 4: 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäure (Verbindung 33)
Verbindung 1 (1,75 g, 7,99 mmol) wurde in 2:1 0,8 N wässriges NaOH/Methanol (48 ml) hydrolysiert, wobei 5 h bei 23°C gerührt wurde. Die Lösung wurde dann auf ein Volumen von ~20 ml konzentriert, auf 0°C gekühlt und mit 1 N HCl auf pH = 4 angesäuert. Die resultierenden Kristalle wurden gesammelt, mit 5 ml kaltem H₂O gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 1,47 g (96 %) 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäure 33 als ein weißer Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆) d 12,50 (1H, br s), 8,17 (1H, s), 8,05 (1H, s), 7,85 (2H, dd, J = 23,7, 7,8 Hz), 7,61 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,49 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,47 (1H, s), 6,62 (1H d, J = 15,6 Hz); IR (KBr) 3451, 3202, 2924, 1690, 1640, 1443, 1395, 1316, 1219. Anal. (C₁₀H₉NO₃·0,25 H₂O) C, H, N.
Beispiel 5: 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäurebenzylester (Verbindung 3)
3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäure (212 mg, 1,11 mmol) und Benzylalkohol (172 ml, 1,66 mmol) wurden in DMF (3 ml) bei 0°C gerührt. EDC (318 mg, 1,66 mmol), Triethylarnin (170 μl, 1,22 mmol) und DMAP (14 mg, 0,11 mmol) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 h rühren gelassen, wobei es sich auf 23°C erwärmte. Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (3 % EtOH/CHCl₃) gereinigt, wobei 90 mg (29 %) von Verbindung 3 als ein weißer Feststoff erhalten wurden.¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,22 (1H, s), 8,04 (1H, s), 7,94 (2H, dd, J = 12,0, 7,8 Hz), 7,61 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,34-7,50 (7H, m), 6,79 (1H, d, J = 16,2 Hz), 5,23 (2H, s); IR (KBr) 3420, 3316, 3150, 1711, 1665, 1630, 1402, 1308, 1167. Anal. (C₁₇H₁₅NO₃) C, H, N.
Beispiel 6: 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäure-2-hydroxyethylester (Verbindung 4)
Diese Verbindung wurde mit 33 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei Ethylenglycol in einer Arbeitsweise verwendet wurde, welche derjenigen für die Herstellung von Verbindung 3 wie vorstehend beschrieben analog war. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,21 (1H, s), 8,06 (1H, s), 7,88 (2H, dd, J = 16,2, 7,5 Hz), 7,70 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,46-7,53 (7H, m), 6,74 (1H, d, J = 16,2 Hz), 4,87 (1H, br s), 4,16 (2H, t, J = 4,9 Hz), 3,63 (2H, t, J = 5,1 Hz); IR (KBr) 3418, 3212, 1705, 1676, 1626, 1574, 1399, 1280. Anal. (C₁₂H₁₃NO₃) C, H, N.
Beispiel 7: 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäure-phenethylester (Verbindung 5)
Diese Verbindung wurde mit 49 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei Phenethylalkohol in der gleichen Arbeitsweise wie für die vorstehend beschriebene Herstellung von Verbindung 3 verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,98 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,68 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,66 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,48 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,23-7,36 (5H, m), 6,50 (1H, d, J = 16,2 Hz), 6,14 (1H, br s), 5,83 (1H, br s), 4,44 (2H, t, J = 6,9 Hz), 3,02 (2H, t, J = 6,9 Hz); IR (KBr) 3410, 3165, 1705, 1678, 1630, 1576, 1393, 1373, 1283, 1261. Anal. (C₁₈H₁₇NO₃) C, H, N.
Beispiel 8: 3-(3-Carbamoyl-phenyl)-acrylsäure-pyridin-3-yl-methylester (Verbindung 6)
Diese Verbindung wurde mit 68 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei 3-Pyridyl-carbinol in der gleichen Arbeitsweise wie für die vorstehend beschriebene Herstellung von Verbindung 3 verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,68 (1H s), 8,60 (1H, d, J = 4,8 Hz), 7,99 (1H s), 7,66-7,81 (4H, m), 7,48 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,26-7,35 (1H, m), 6,55 (1H, d, J = 16,2 Hz), 6,16 (1H, br s), 5,79 (1H, br s), 5,28 (2H, s); IR (KBr) 3418, 3160, 1700, 1676, 1630, 1576, 1397, 1285, 1259. Anal. (C₁₆H₁₄N₂O₃) C, H, N.
Beispiel 9: 3-(2-Ethoxycarbonyl-vinyl)-benzoesäure (Verbindung 7)
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens B wurde Verbindung 7 mit 72 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 11,22 (1H, s), 8,29 (1H, s), 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,71-7,78 (2H, m), 7,52 (1H t, J = 7,5 Hz), 6,54 (1H, d, J = 16,2 Hz), 4,29 (2H, q, J = 7,2 Hz), 1,36 (3H, t, J = 7,2 Hz); IR (KBr) 2984, 2672, 2564, 1725, 1642, 1445, 1302, 1209, 1177 cm^–1. Anal. (C₁₂H₁₂O₄·0,2 H₂O) C, H.
Beispiel 10: 3-(2-Ethoxycarbonyl-vinyl)-benzoesäure-methylester (Verbindung 8)
Verbindung 7 (225 mg, 1,02 mmol) wurde in einem Gemisch von Dichlormethan (2 ml) und Methanol (2 ml) gelöst. (Trimethylsilyl)diazomethan (2 M Lösung in Hexanen, ~0,8 ml, ~1,6 mmol) wurde tropfenweise zugegeben, bis die Gasentwicklung aufhörte und eine schwachgelbe Farbe 10 Minuten lang vorhanden war. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert und durch Blitzchromatographie (1 % MeOH/CHCl₃) gereinigt, wobei 196 mg (82 %) von 8 als ein weißer Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,21 (1H, s), 8,05 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,71 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,47 (1H, t, J = 7,8 Hz), 6,50 (1H, d, J = 16,3), 4,28 (2H, q, J = 7,2 Hz), 1,35 (3H, t, J = 7,2 Hz); IR (KBr) 3399, 3094, 3065, 3034, 2980, 2907, 1717, 1638, 1447 cm^–1. Anal. (C₁₃H₁₄O₄) C, H.
Beispiel 11: (E)-3-(3-Carbamoyl-phenyl)-2-cyano-acrylsäure-ethylester (Verbindung 9)
Piperidin (150 μl, 1,52 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Formyl-benzamid (Verbindung 30) (111 mg, 0,74 mmol) und Ethylcyanoacetat (79 μl, 0,74 mmol) in Ethanol (2 ml) bei 0°C zugegeben. Nach 5 h Rühren bei 23°C wurde das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst und mit 0,1 N HCl, H₂O und anschließend Salzlösung gewaschen. Die organischen Verbindungen wurden getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert. Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (3 % MeOH/CHCl₃) ergab 86 mg (47 %) von 9 als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,37 (1H, s), 8,31 (1H, s), 8,18 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,04 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,63 (1H, t, J = 7,8 Hz), 6,09 (1H, br s), 5,71 (1H, br s), 4,41 (2H, q, J = 7,2 Hz), 1,42 (3H, t, J = 7,2 Hz). IR (KBr) 3435, 3351, 3306, 3167, 2224, 1724, 1701, 1626, 1601, 1578, 1433, 1383, 1275, 1211 cm^–1. Anal. (C₁₃H₁₂N₂O₃·0,5 H₂O) C, H, N.
Beispiel 12: 6-Methyl-3-(3-carbamoylphenyl)-acrylsäure-ethylester (Verbindung 10)
3-Iod-4-methylbenzoesäure wurde gemäß dem für Verbindung 1a vorstehend beschriebenen Verfahren in das entsprechende Benzamid umgewandelt ((COCl)₂, NH₄OH), wobei 3-Iod-4-methylbenzamid mit 93 % Ausbeute erhalten wurde. Eine weitere Umwandlung gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren B ergab Verbindung 10 mit 98 % Ausbeute. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,95 (1H d, J = 7,9 Hz), 7,29 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,46 (1H, d, J = 15,9 Hz), 6,10 (1H, br s), 5,75 (1H, br s), 4,08 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,48 (3H, s), 1,42 (3H, t, J = 7,1 Hz) Anal. (C₁₃H₁₂N₂O₃·0,2 H₂O) C, H, N.
Beispiel 13: 3-Methoxy-5-nitro-phenylamin (Verbindung 34)
Natriumhydrogencarbonat (6,07 g, 72,3 mmol) wurde zu Natriumsulfid-nonahydrat (18,2 g, 75,9 mmol) in entionisiertem Wasser (50 ml) zugegeben. Als das Natriumhydrogencarbonat vollständig gelöst war, wurde Methanol (50 ml) zugegeben und die Lösung auf 0°C gekühlt. Es bildete sich ein Niederschlag, welcher durch Filtration durch ein Celitekissen entfernt wurde; die filtrierte Lösung wurde zu 3,5-Dinitroanisol (8,02 g, 40,5 mmol) in Methanol (50 ml) zugegeben. Nach 30 min Erhitzen zum Rückfluss wurde die Lösung im Vakuum konzentriert, um Methanol zu entfernen. Der wässrige Rückstand wurde in 200 ml Eiswasser gegossen und der resultierende orangefarbene Niederschlag wurde durch Saugfiltration gesammelt. Eine Chromatographie (1:2 EtOAc/Hexane) des rohen Feststoffs ergab nicht umgesetztes 3,5-Dinitroanisol (0,98 g, 12 %) und das Anilinprodukt Verbindung 34 (4,96 g, 73 %; 83 % bezogen auf zurückgewonnenes 3,5-Dinitroanisol) als einen orangefarbenen Feststoff. Schmelzpunkt = 117–119°C; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,12 (s, 2H), 6,48 (s, 1H), 3,98 (br s, 2H), 3,83 (s, 3H); IR (KBr-Pellet) 3447, 3364, 1637, 1523, 1344 cm^–1; Anal. (C₇H₈N₂O₃) C, H, N.
Beispiel 14: 1-Iod-3-methoxy-5-nitro-benzol (Verbindung 35)
Konzentriertes HCl (15 ml) wurde zu einer Lösung der Anilinverbindung 34 (5,25 g, 31,2 mmol) in Wasser (15 ml) bei 0°C zugegeben. Dazu wurde eine gekühlte Lösung von Natriumnitrit (3,88 g, 56,2 mmol) in Wasser (20 ml) tropfenweise mit kräftigem mechanischem Rühren zugegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das Rühren 15 min bei 0°C fortgesetzt und dann wurde eine Lösung von Kaliumiodid (10,37 g, 62,4 mmol) in Wasser (20 ml) vorsichtig zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch zum Sieden erhitzt. Wenn die Erzeugung eines purpurfarbenen Dampfes aufhörte, wurde das Gemisch auf 23°C gekühlt und mit CH₂Cl₂ (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung durch Silicagelchromatographie (1:9 EtOAc/Hexane) ergab die reine Iodidverbindung 35 (7,35 g, 84 %) als einen farblosen Feststoff. Schmelzpunkt = 81–82°C; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,15 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 3,88 (s, 3H); IR (KBr-Pellet) 1527, 1342 cm^–1; Anal. (C₇H₆INO₃) C, H, N.
Beispiel 15: 3-Iod-5-methoxy-phenylamin (Verbindung 36)
Ein Gemisch von Trieisendodecacarbonyl (16,24 g, 32,2 mmol), Verbindung 35 (7,50 g, 26,9 mmol), Methanol (15 ml) und Toluol (200 ml) wurde 3,5 h zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen, einer Filtration, einer Konzentration im Vakuum und einer Silicagelchromatographie (1:4 EtOAc/Hexane) wurde die Anilinverbindung 36 (6,11 g, 91 %) als ein gelbes Öl erhalten, welches beim Stehen kristallisierte. Schmelzpunkt = 84–86°C; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,64 (s, 2H), 6,15 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,66 (br s, 2H);); IR (KBr-Pellet) 3414, 3308, 3208, 1572 cm^–1; Anal. (C₇H₈INO) C, H, N.
Beispiel 16: 3-Amino-5-methoxy-benzonitril (Verbindung 37)
Durch das gleiche Verfahren, das zum Herstellen von Verbindung 44 verwendet wurde, wurde die Iodidverbindung 36 (2,51 g, 10,1 mmol) in die Nitrilverbindung 37 (1,24 g, 83 %), einen gelben Feststoff, umgewandelt. Schmelzpunkt = 81–85°C; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,53 (m, 2H), 6,39 (t,, J = 2,0 Hz, 1H), 3,87 (br s, 2H), 3,77 (s, 3H); IR (Reinsubstanzfilm) 3408, 3333, 3221, 2228, 1597 cm^–1; Anal. (C₈H₈N₂O) C, H, N.
Beispiel 17: 3-Iod-5-methoxy-benzonitril (Verbindung 38)
Durch das gleiche Verfahren, das zum Herstellen von Verbindung 35 verwendet wurde, wurde die Nitrilverbindung 37 (1,12 g, 7,6 mmol) in die Iodidverbindung 38 (1,25 g, 64 %) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) d 7,55 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,12 (s, 1H), 3,82 (s, 3H); IR (Reinsubstanzfilm) 2231, 1587, 1284 cm^–1; Anal. (C₈H₆INO) C, H, N.
Beispiel 18: 3-Iod-5-methoxy-benzamid (Verbindung 39)
Durch das gleiche Verfahren, das zum Herstellen der Amidverbindung 45 verwendet wurde, wurde die Nitrilverbindung 38 (1,245 g, 4,81 mmol) in die Amidverbindung 39 (1,039 g, 78 %), einen weißen Feststoff, umgewandelt. Schmelzpunkt = 175–176°C; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,65 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,0-5,8 (2 br S, 2H), 3,83 (s, 3H); IR (KBr-Pellet) 3389, 3194, 1658, 1568, 1390 cm^–1; Anal. (C₈H₈INO₂) C, H, N.
Beispiel 19: 3-Hydroxy-5-iod-benzamid (Verbindung 40)
Die Amidverbindung 39 (1,032 g, 3,72 mmol), suspendiert in CH₂Cl₂ (100 ml) wurde auf –78°C gekühlt. Eine Bortribromidlösung (1,0 M in CH₂Cl₂, 7,45 ml, 7,45 mmol) wurde zugegeben. Nach 30 min Rühren bei –78°C wurde die Lösung 4 h zum Rückfluss erhitzt. Es wurde ein weiteres Äquivalent von Bortribromid (3,7 ml) zugegeben und die Lösung 16 h bei 23°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (50 ml) versetzt, um die Reaktion anzuhalten, was die Bildung eines weißen Niederschlags verursachte. Ether (50 ml) wurde zugegeben, um den Niederschlag aufzulösen, und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde verworfen und die Etherschicht mit 2 N NaOH (2 × 100 ml) gewaschen. Die vereinigten basischen Waschlösungen wurden mit 6 N HCl bis pH ~4 behandelt, dann mit Ether (2 × 150 ml) extrahiert. Diese Etherextrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei die Phenolverbindung 40 (803,3 mg, 82 %) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. Schmelzpunkt = 192–195°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,99 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,24 (s, 2H) ); IR (KBr-Pellet) 3483, 3396, 3232, 1680, 1649, 1433 cm^–1; Anal. (C₇H₆INO₂) C, H, N.
Beispiel 20: 3-(3-Carbamoyl-5-hydroxy-phenyl)-acrylsäure-ethylester (Verbindung 11)
Die Iodidverbindung 40 (24,6 mg, 0,093 mmol) wurde mit Ethylacrylat (23,4 mg, 0,234 mmol) unter den vorstehend beschriebenen Standardbedingungen gekoppelt, wobei Verbindung 11 (17,3 mg, 79 %) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. Schmelzpunkt = 200–202°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,86 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,57 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,61 (d, J = 16,2 Hz, 1H), 4,18 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 7,0 Hz, 3H)); IR (KBr-Pellet) 3402, 3209, 1680, 1593, 1296 cm^–1; Anal. (C₁₂H₁₃NO₄·0,4 H₂O) C, H, N.
Beispiel 21: 3-Benzyloxy-5-iod-benzamid (Verbindung 49)
Eine Lösung von Benzylbromid (128 mg, 0,75 mmol), Phenolverbindung 40 (131,5 mg, 0,50 mmol) und Kaliumcarbonat (138 mg, 1,00 mmol) in DMF (3,0 ml) wurde 1,5 h auf 60°C erwärmt. Nach dem Kühlen auf 23°C wurde die Lösung filtriert, im Vakuum konzentriert und durch Silicagelchromatographie (1:1 EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei die Benzyletherverbindung 49 (132,5 mg, 75 %) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. Schmelzpunkt = 124–125°C; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,67 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,40 (m, 6H), 6,0-5,8 (2 br s, 2H), 5,08 (s, 2H); IR (KBr-Pellet) 3369, 3192, 1660, 1564 cm^–1; Anal. (C₁₄H₁₂INO₂) C, H, N.
Beispiel 22: 3-(3-Benzyloxy-5-carbamoyl-phenyl)-acrylsäure-ethylester (Verbindung 12)
Die Iodidverbindung 49 (51,6 mg, 0,146 mmol) wurde mit Ethylakrylat (36,6 mg, 0,365 mmol) unter den Standardbedingungen gekoppelt, wobei Verbindung 12 (18,5 mg, 39 %) als ein gebrochen weißer Feststoff erhalten wurde. Schmelzpunkt = 193–194°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,01 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,63 (d, J = 15,8 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,45 (m, 6H), 6,75 (d, J = 15,8 Hz, 1H), 5,18 (s, 2H), 4,19 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 1,26 (t, J = 7,0 Hz, 3H)); IR (KBr-Pellet) 3418, 3173, 1705, 1670, 1589, 1288 cm^–1; Anal. (C₁₉H₁₉NO₄·0,2 H₂O) C, H, N.
Beispiel 23: 3-Carbamoyl-4-methoxy-benzaldehyd (Verbindung 41)
3-Brom-anisaldehyd (8,0 g, 37,2 mmol) und Kupfercyanid (4,0 g, 44,67 mmol) wurden in DMF (100 ml) bei 150°C 16 h gerührt. Dazu wurde eine Eisennitratlösung (20 g Eisen(III)-nitrat, 6 ml konzentrierte HCl, 40 ml H₂O) zugegeben und das Gemisch 10 min gerührt, bevor es auf 23°C abkühlen gelassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit H₂O (200 ml) verdünnt und mit CHCl₃ (3 × 80 ml) extrahiert. Organische Schichten wurden kombiniert und Lösungsmittel wurden entfernt, wobei darauf geachtet wurde, das restliche DMF abzupumpen. Der braungrüne Rückstand wurde noch einmal in CHCl₃ (100 ml) gelöst und mit 1 N HCl (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Das Material wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel wurde entfernt, wobei das rohe Nitril als ein gelbbrauner Feststoff erhalten wurde. Das Nitril wurde in konzentrierter H₂SO₄ (60 ml) 1 h bei 100°C gerührt. Die Lösung wurde gekühlt, in H₂O (250 ml) gegossen und mit CHCl₃ (8 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Verbindungen wurden getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert. Der resultierende Feststoff wurde aus Methanol umkristallisiert, wobei 2,98 g (45 %) 3-Carbamoyl-4-methoxy-benzaldehyd 41 als ein weißer Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 9,92 (1H, s), 8,28 (1H, s), 8,00 (1H d, J = 9,0 Hz), 7,74 (1H, br s), 7,69 (1H br s), 7,33 (1H d, J = 9,0 Hz), 3,98 (3H, s); IR (KBr) 3399, 3183, 1676, 1589, 1433, 1262, 1204 cm^–1. Anal. (C₉H₉NO₃) C, H, N.
Beispiel 24: 5-Formyl-2-hydroxy-benzamid (Verbindung 42)
3-Carbamoyl-4-methoxy-benzaldehyd Verbindung 41 (1,065 g, 5,95 mmol) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (120 ml) bei –78°C unter Argon gerührt. Bortribromid (10,71 ml, 1,0 M, 10,71 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 18 h gerührt, wobei es sich auf 23°C erwärmte. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,05 N HCl (80 ml) versetzt, um die Reaktion anzuhalten, und 15 min rühren gelassen. Die organische Schicht wurde gesammelt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (2 × 50 ml) weiter extrahiert. Die organischen Verbindungen wurden vereinigt, getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert. Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (60 % EtOAc/CHCl₃) ergab 540 mg (55 %) von 5-Formyl-2-hydroxy-benzamid 42 als einen weißen Feststoff.¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 14,00 (1H, s), 9,88 (1H, s), 8,73 (1H br s), 8,55 (1H d, J = 1,5 Hz), 8,21 (1H, br s), 8,00 (1H dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 7,13 (1H d, J = 8,7 Hz); IR (KBr) 3420, 3237, 1686, 1618, 1493, 1375, 1279, 1196 cm^–1. Anal. (C₈H₇NO₃) C, H, N.
Beispiel 25: 3-(3-Carbamoyl-4-hydroxy-phenyl)-akrylsäure-ethylester (Verbindung 14)
5-Formyl-2-hydroxybenzamid Verbindung 42 (65 mg, 0,40 mmol) und (Carbethoxymethylen)triphenylphosphoran (281 mg, 0,81 mmol) wurden 2 h in DMF (3 ml) bei 23°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (2 % MeOH/CHCl₃) gereinigt, wobei 44 mg (48 %) von Verbindung 14 als ein weißer Feststoff erhalten wurden.¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,50 (1H s), 8,52 (1H br s), 8,29 (1H, s), 8,07 (1H, br s), 7,77 (1H d, J = 8,7 Hz), 7,56 (1H d, J = 15,6 Hz), 6,92 (1H, d, J = 8,7 Hz), 6,57 (1H d, J = 15,6 Hz), 4,18 (2H, q, J = 7,2 Hz), 1,26 (3H, t, J = 7,2); IR (KBr) 3387, 3198, 2988, 2359, 1688, 1620, 1491, 1441, 1372, 1279 cm^–1. Anal. (C₁₂H₁₃NO₄) C, H, N.
Beispiel 26: 2-Benzyloxy-5-formyl-benzamid (Verbindung 42a)
Verbindung 42 (105 mg, 0,64 mmol) und Benzylbromid (114 μl, 0,95 mmol) wurden in DMF (3 ml) mit K₂CO₃ (176 mg, 1,27 mmol) 1 h bei 60°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (2 % MeOH/CHCl₃) gereinigt, wobei 135 mg (83 %) von 42a als ein weißer Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,91 (1H, s), 8,24 (1H s), 7,98 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,67 (2H, br s), 7,51 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,41-7,34 (4H, m), 5,36 (2 H, s); IR (KBr) 3387, 3192, 2849, 1690, 1649, 1599, 1437, 1389, 1265, 1206 cm^–1. Anal. (C₁₅N₁₃NO₃·0,2 H₂O) C, H, N. Berechnet C = 69,59, H = 5,22, N = 5,41; gefunden C = 69,60, H = 5,21, N = 5,42.
Beispiel 27: 3-(4-Benzyloxy-3-carbamoyl-phenyl)-acrylsäure-ethylester (Verbindung 15)
2-Benzyloxy-5-formyl-benzamid Verbindung 42a (105 mg, 0,412 mmol) und (Carbethoxy-methylen)triphenylphosphoran (287 mg, 0,824 mmol) wurden 2 Stunden in DMF (3 ml) bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (1 % MeOH/CHCl₃) gereinigt, wobei 95,8 mg (72 %) von Verbindung 15 als ein weißer Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,45 (1H d, J = 1,8 Hz), 7,70-7,60 (3 H, m), 7,43 (5 H, br s), 7,08 (1H d, J = 8,7 Hz), 6,43 (1H d, J = 15,6 Hz), 5,75 (1H br s), 5,23 (2H, s), 4,25 (2H, q, J = 7,2 Hz), 1,33 (3H, t, J = 7,2 Hz); IR (KBr) 3441, 3154, 1689, 1676, 1593, 1500, 1431, 1371 cm^–1. Anal. (C₁₉H₁₉NO₄) C, H, N.
Beispiel 28: 3-[2-(Methoxy-methyl-carbamoyl)-vinyl]benzamid (Verbindung 43)
3-Iod-benzamid Verbindung 32 (3,0 g, 12,1 mmol), N-Methoxy-N-methylacrylamid (Molander, G.G.; Stengel, P.J. Tetrahedron 1997, 53, 26, 8887–8912) (1,8 g, 15 mmol), Palladium(II)-acetat (40 mg, 0,18 mmol) und Triethylamin (2,1 ml, 15 mmol) wurden 2,5 h in Acetonitril (12 ml) unter Argon in einem Einschlussrohr bei 100°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abkühlen gelassen und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst, mit 0,1 N HCl und anschließend mit Salzlösung gewaschen, getrocknet, (MgSO₄) und konzentriert. Eine zweimalige Umkristallisierung aus Methanol ergab 1,64 g (58 %) von 3-[2-(Methoxy-methyl-carbamoyl)-vinyl)benzamid 43 als einen weißen Feststoff.¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,06 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,73, (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,46 (1H, t, J = 7,8 Hz), 7,10 (1H, d, J = 16,2 Hz), 6,33 (1H, br s), 5,97 (1H, br s), 3,77 (3H, s), 3,31 (3H, s); IR (KBr) 3385, 3173, 1680, 1649, 1613, 1582, 1476, 1433, 1397, 1182, 1105 cm^–1. Anal. (C₁₂H₁₄N₂O₃·0,33 H₂O) C, H, N.
Beispiel 29: 3-(3-Oxo-but-1-enyl)-benzamid (Verbindung 16)
Verfahren C: 3-[2-(Methoxy-methyl-carbamoyl)-vinyl]benzamid Verbindung 43 (100 mg, 0,427 mmol) wurde in trockenem THF (4 ml) bei 0°C unter Argon gerührt. Methyllithium (1,6 ml, 1,5 M in Ether, 2,4 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 1,5 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über 0,1 N HCl gegossen und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organischen Verbindungen wurden getrocknet (MgSO₄) und konzentriert. Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (2 bis 5 % EtOH/CH₂Cl₂) ergab 54 mg (67 %) von 16 als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,03 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,54 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,50 (1H, t, J = 7,8 Hz), 6,80 (1H, d, J = 16,2 Hz), 6,14 (1H br s), 5,82 (1H, br s), 2,39 (3H, s); IR (KBr) 3345, 3160, 2363, 1667, 1400, 1264 cm^–1. Anal. (C₁₁H₁₁NO₂) C, H, N.
Beispiel 30: 3-(3-Oxo-3-phenyl-prop-1-enyl)-benzamid (Verbindung 17)
Verbindung 17 wurde mit 20 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei Phenyllithium gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren C verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,15 (1H, s), 8,03 (2 H, d, J = 7,2 Hz), 7,76-7,84 (3H, m), 7,48-7,64 (5H, m), 6,26 (1H br s), 5,85 (1H br s). IR (KBr) 3383, 3192, 3057, 2361, 1653, 1609, 1580, 1447 cm^–1. Anal. (C₁₆N₁₃NO₂) C, H, N.
Beispiel 31: 3-[3-(4-Dimethylamino-phenyl)-oxo-propenyl]benzamid (Verbindung 18)
4-Brom-N,N-dimethylanilin (770 mg, 3,85 mmol) wurde in trockenem THF (6 ml) bei –40°C unter Argon gerührt. n-Butyllithium (1,5 ml, 2,5 M in Hexanen, 3,75 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und die Lösung 15 min gerührt. Eine Lösung von 3-[2-(Methoxy-methyl-carbamoyl)-vinyl]benzamid Verbindung 43 (150 mg, 0,64 mmol) in THF (3 ml) wurde langsam zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 h gerührt, wobei es auf 23°C erwärmt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über gesättigtes NH₄Cl gegossen und wurde dann mit CHCl₃ extrahiert. Die organischen Verbindungen wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert. Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (1 bis 4 % MeOH/CHCl₃) ergab 140 mg von 18 (75 %) als einen hellorangefarbenen Feststoff.¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,14 (1H s), 8,02 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,83-7,75 (3H, m), 7,67 (1H d, J = 15,6 Hz), 7,50 (1H, t, J = 7,8 Hz), 6,71 (2H, d, J = 9,0 Hz), 6,13 (1H, br s), 5,66 (1H, br s), 3,10 (6H, s); IR (KBr) 3372, 3192, 1671, 1609, 1578, 1377, 1188 cm^–1. Anal. (C₁₈H₁₈N₂O₂·0,1 H₂O) C, H, N.
Beispiel 33: 3-[3-(4-Methoxy-phenyl)-oxo-propenyl]benzamid (Verbindung 19)
Verbindung 19 wurde mit 47 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei 4-Bromanisol in der gleichen Arbeitsweise wie für die vorstehend beschriebene Herstellung von 18 verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,15 (1H s), 8,06 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,84-7,75 (3H, m), 7,63 (1H d, J = 16,2 Hz), 7,51 (1H, t, J = 7,8 Hz), 6,99 (2H, d, J = 9,0 Hz), 6,18 (1H, br s), 5,73 (1H, br s), 3,90 (3H, s); IR (KBr) 3376, 3192, 1659, 1607, 1439, 1227 cm^–1. Anal. (C₁₇H₁₅NO₃·0,2 H₂O) C, H, N.
Beispiel 34: 3-(3-Oxo-3-pyridin-2-yl-propenyl)-benzamid (Verbindung 20)
Diese Verbindung wurde mit 17 % Ausbeute als ein weißer Feststoff hergestellt, wobei 2-Brompyridin in der gleichen Arbeitsweise wie für die vorstehend beschriebene Herstellung von Verbindung 18 verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,76 (1H, d, J = 4,8 Hz), 8,39 (1H, d, J = 16,2 Hz), 8,19 (2H, t, J = 1,5 Hz), 7,95 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,91-7,82 (3H, m), 7,52 (2H, t, J = 7,8 Hz), 6,26 (1H, br s), 5,91 (1H, br s); IR (KBr) 3416, 3207, 3055, 1672, 1607, 1580, 1391, 1332, 1221 cm^–1. Anal. (C₁₅H₁₂N₂O₂·0,2 H₂O) C, H, N.
Beispiel 35: 3-(3-Furan-2-yl-3-oxo-propenyl)-benzamid (Verbindung 21)
Zu einer Lösung von frisch destilliertem Furan (425 μl, 5,85 mmol) in trockenem THF (8 ml) bei –10°C unter Argon wurde n-Butyllithium (1,56 ml, 2,5 M in Hexanen, 3,9 mmol) zugegeben.¹³ Nach 2 h Rühren bei 0°C wurde die Lösung auf –50°C gekühlt und eine Lösung von 3-[2-(Methoxy-methyl-carbamoyl)-vinyl]benzamid (114 mg, 0,487 mmol) in THF (1 ml) wurde langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h gerührt, wobei es sich auf 0°C erwärmte, und wurde dann über gesättigtes NH₄Cl gegossen und mit CHCl₃ extrahiert. Die organischen Verbindungen wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert. Eine Reinigung durch Blitzchromatographie (2 bis 6 % MeOH/CHCl₃) ergab 49 mg (42 %) von Verbindung 21 als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,16 (1H, s), 7,89 (1H, d, J = 15,6 Hz), 7,83-7,76 (2H, m), 7,68 (1H, t, J = 0,9 Hz), 7,57-7,48 (2H, m), 7,37 (1H, d, J = 3,6 Hz), 6,62 (1H, dd, J = 2,1, 0,9 Hz), 6,15 (1H, br s), 5,69 (1H, br s); IR (KBr) 3474, 3354, 3191, 1668, 1605, 1466, 1393, 1325 cm^–1. Anal. (C₁₄H₁₁NO₃·0,2 H₂O) C, H, N.
Beispiel 36: 1-Oxo-indan-5-carbonitril (Verbindung 44)
Eine Lösung von 5-Brom-1-indanon (5,28 g, 25 mmol), Zinkcyanid (1,76 g, 15 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (1,15 g, 1,0 mmol) in DMF (25 ml) wurde 2 h auf 80°C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 23°C wurde die Lösung mit Toluol (50 ml) verdünnt, mit 2 N NH₄OH (2 × 50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie des Rückstands (1:1 EtOAc/Hexane) ergab 3,33 g (85 %) von Verbindung 44 als einen gelben Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,85 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,67 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,21 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 2,77 (dd, J = 6,3, 5,9 Hz, 2H); IR (KBr-Pellet) 2226, 1715 cm^–1; Anal. (C₁₀H₇NO·0,1 H₂O) C, H, N.
Beispiel 37: 1-Oxo-indan-5-carbonsäureamid (Verbindung 45)
Eine Lösung von Nitril, Verbindung 44, (3,02 g, 20,4 mmol) in 3 % wässrigem H₂O₂ (110 ml) wurde 4 h auf 50°C erhitzt. Das Gemisch wurde dann 1 h auf 0°C gekühlt und der resultierende Niederschlag durch Saugfiltration gesammelt und unter Vakuum getrocknet, wobei 2,40 g (67 %) von Verbindung 45 als ein gelber Feststoff erhalten wurden. Die wässrige Mutterlauge wurde zur Trockne eingeengt und mit heißem Methanol verrieben. Die Methanol-löslichen Substanzen wurden konzentriert und durch Silicagelchromatographie (5 % MeOH in CH₂Cl₂) gereinigt, wobei weitere 184,5 mg (5 %) Verbindung 45 als weißer Feststoff erhalten wurden. Schmelzpunkt = 207°C. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,14 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,85 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 3,13 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,68 (m, 2H); IR (KBr-Pellet) 1697, 1660, 1622 cm^–1; Anal. (C₁₀H₉NO₂) C, H, N.
Beispiel 38: 1-Oxo-indan-5-carbonsäure-tritylamid (Verbindung 46)
Essigsäureanhydrid (1,05 ml, 11,1 mmol) und konzentrierte H₂SO₄ (0,01 ml) wurden zu einer Lösung von Amidverbindung 45 (620,5 mg, 3,54 mmol) und Triphenylmethylalkohol (615 mg, 2,36 mmol) in Eisessig (12 ml) zugegeben. ¹² Die Lösung wurde 3,5 h auf 40°C erhitzt, auf 23°C gekühlt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Silicagelchromatographie (1:1 EtOAc/Hexane bis 10:1 EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei 432 mg (44 % bezogen auf Tritylalkohol) Verbindung 46 als ein gelber Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,92 (s, 1H), 7,78 (q, J = 8,5 Hz, 2H), 7,30 (m, 15H), 3,18 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 2,74 (m, 2H); Anal. (C₂₉H₂₃NO₂·0,25 H₂O) C, H, N.
Beispiel 39: 1-Oxo-1H-inden-5-carbonsäure-tritylamid (Verbindung 47)
Eine Lösung von N-Bromsuccinimid (67,3 mg, 0,38 mmol) und Amidverbindung 46 (157,8 mg, 0,38 mmol) in CCl₄ (10 ml) wurde 2 h zum Rückfluss erhitzt, wobei sie mit einer 200 W-Lampe bestrahlt wurde. Nach dem Abkühlen auf 23°C wurde der Succinimidniederschlag abfiltriert. Die klare Lösung wurde auf 0°C gekühlt und mit Triethylamin (0,055 ml, 0,40 mmol) 2 h behandelt, dann im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie des Rückstands (1:1 EtOAc/Hexane) ergab 73,6 mg (47 %) Enonverbindung 47 als einen gelben Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) d 7,66 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,47 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,28 (m, 16H), 5,98 (d, J = 5,9 Hz, 1H); IR (Reinsubstanzfilm) 1711, 1670, 1493 cm^–1.
Beispiel 40: 1-Oxo-1H-inden-5-carbonsäureamid (Verbindung 22)
Trifluoressigsäure (3 ml) wurde zu einer Lösung von Verbindung 47 (68,3 mg, 0,16 mmol) in CH₂Cl₂ (3,0 ml) zugegeben. Nach 30 min bei 23°C wurde die Lösung im Vakuum konzentriert und durch Silicagelchromatographie (5 % MeOH in CH₂Cl₂) gereinigt, wobei 16,6 mg (60 %) Verbindung 22 als ein gelber Feststoff erhalten wurden. Schmelzpunkt = 275°C (Zersetzung); ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,08 (s, 1H), 7,95 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,44 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 6,08 (d, J = 5,9 Hz, 1H); IR (KBr-Pellet) 3383, 1705, 1658 cm^–1; HRMS (M+H⁺): berechnet für C₁₀H₈NO₂; 174,0555; gefunden 174,0559; Anal. (C₁₀H₈NO₂·0,1 H₂O) C, H, N.
Beispiel 41: 5-(t-Butyl)-diphenyl-silanyloxymethyl)-isophthalsäure-diethylester (Verbindung 51)
Eine Lösung von 5-Hydroxymethyl-isophthalsäure-diethylester Verbindung 50 (20,0 g, 79,4 mmol) und Imidazol (10,81 g, 158,8 mmol) in DMF (265 ml) wurde mit t-Butylchlordiphenylsilan (19,6 ml, 75,4 mmol) bei 23°C behandelt. Diese Lösung wurde über Nacht bei 23°C gehalten, dann wurden gesättigtes wässriges Ammoniumchlorid (200 ml) und EtOAc (200 ml) zugegeben. Die EtOAc-Schicht wurde mit zusätzlicher Ammoniumchloridlösung (100 ml) gewaschen, dann mit Salzlösung (100 ml) gewaschen. Das Verdampfen der organischen Substanzen ergab 39,9 g Produkt als farbloses Öl. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,57 (1H, s), 8,22 (1H, s), 7,70-7,67 (5H, m), 7,46-7,35 (6H, m), 4,84 (2H, s), 4,40 (4H, q, J = 7,1), 1,42 (6H, t, J = 7,1), 1,12 (9H, s).
Beispiel 42: 5-(t-Butyl-diphenyl-silanyloxymethyl)-isophthalsäure-monomethylester (Verbindung 52)
Eine Lösung von Verbindung 51 (39,9 g, 81,3 mmol) in MeOH (1,2 l) wurde mit 0,95 N wässrigem NaOH (83,6 ml, 79,4 mmol) bei 23°C behandelt. Die resultierende Lösung wurde 3 Tage bei 23°C gehalten, dann mit gesättigter wässriger Citronensäure angesäuert. MeOH wurde durch Verdampfen entfernt und die verbleibende wässrige Lösung wurde auf 5°C gekühlt und über Nacht gehalten, woraufhin eine Ausfällung stattfand. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Eiswasser (3 × 50 ml) gewaschen, dann getrocknet, wobei 31,0 g (87 % insgesamt) von Verbindung 52 als ein weißes Pulver erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,65 (1H s), 8,28 (1H, s), 8,25 (1H, s), 7,70-7,67 (4H, m), 7,45-7,36 (6H, m), 4,84 (2H, s), 3,96 (3H, s), 1,12 (9H, s).
Beispiel 43: 3-(t-Butyl-diphenyl-silanyloxymethyl)-5-hydroxymethyl-benzoesäure (Verbindung 53)
Eine Lösung von Verbindung 52 (27,2 g, 60,6 mmol) in THF (400 ml) wurde mit Lithiumtriethylborhydrid (212,0 ml einer 1 M Lösung in THF, 212,0 mmol) bei 23°C behandelt und die resultierende Lösung wurde über Nacht bei 23°C gehalten, dann wurde die Reaktion mit einer gesättigten wässrigen Citronensäurelösung (200 ml) beendet. Dieses Gemisch wurde zur Trockne eingedampft, dann in EtOAc (500 ml) wieder aufgelöst und mit Salzlösung (3 × 100 ml) gewaschen. Das Eindampfen der organischen Schicht ergab 26,8 g Alkohol als ein weißes Pulver. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,01 (2H, s), 7,74–7,68 (4H, m), 7,59 (1H, s), 7,44-7,36 (6H, m), 4,82 (2H, s), 4,77 (2H, s), 1,12 (9H, s). MS (FAB) 553 (MCs⁺).
Beispiel 44: 3-(t-Butyl-diphenyl-silanyloxymethyl)-5-(2-ethoxy-carbonyl-vinyl)benzoesäure (Verbindung 55)
Ein Gemisch von Verbindung 53 (24,8 g, 59,0 mmol), NMO (10,4 g, 88,5 mmol) und pulverisierten 3A Molekularsieben (5 g) in Methylenchlorid (118 ml) wurde mit TPAP (1,04 g, 2,95 mmol) behandelt, anschließend 2 h bei 23°C kräftig gerührt. Das Gemisch wurde dann mit gesättigter wässriger Citronensäure (100 ml) und EtOAc (500 ml) behandelt. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung (200 ml) gewaschen und dann eingedampft, wobei 3-(t-Butyl-diphenyl-silanyloxymethyl)-5-formyl-benzoesäure Verbindung 54 (21,0 g) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 10,08 (1H, s), 8,49 (1H, s), 8,33 (1H, s), 8,09 (1H, s), 7,73-7,66 (4H, m), 7,44-7,36 (6H, m), 4,87 (2H, s), 1,13 (9H, s).
Eine Lösung von Triethylphosphonoacetat (58,0 ml, 295,0 mmol) in DMF (300 ml) wurde auf 0°C gekühlt und mit Natriumhydrid (11,8 g von 60% in Mineralöl, 295 mmol) behandelt. Dieses Gemisch wurde 30 min bei 0°C gehalten, dann mit einer Lösung von Verbindung 54 (21,0 g, 50,2 mmol) in DMF (300 ml) bei 0°C behandelt. Dieses Gemisch wurde über einen Zeitraum von 3 h auf 23°C aufwärmen gelassen, anschließend über Nacht bei 23°C gehalten. Das Gemisch wurde dann mit gesättigter wässriger Citronensäure (500 ml) angesäuert, dann mit EtOAc (1 l) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung (3 × 150 ml) gewaschen, dann eingedampft, wobei 54,0 g eines dunklen Öls erhalten wurden. Eine Reinigung durch Silicagelchromatographie (EtOAc-Hexane-Elutionsmittel) ergab 14,8 g (51 % insgesamt) eines farblosen Öls, welches sich beim Stehen bei 23°C verfestigte. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,17 (1H, s), 8,06 (1H, s), 7,74-7,67 (6H, m), 7,45-7,39 (6H, m), 6,50 (1H, d, J = 16,2), 4,82 (2H, s), 4,29 (2H, q, J = 7,0), 1,36 (3H, t, J = 7,0), 1,12 (9H, s).
Beispiel 45: 3-Brommethyl-5-(2-ethoxycarbonyl-vinyl)-benzoesäure (Verbindung 57)
Eine Lösung von Verbindung 55 (5,0 g, 10,2 mmol) in THF (34 ml) wurde mit TRAF (15,3 ml einer 1 M Lösung in TNF, 15,3 mmol) behandelt und bei 23°C über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wurde dann mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung behandelt und mit Diethylether (2 × 20 ml) extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit einer gesättigten Citronensäurelösung (50 ml) angesäuert, dann mit EtOAc (2 × 50 ml) extrahiert. Das Verdampfen der organischen Verbindungen ergab 2,6 g eines weißen Pulvers Verbindung 56. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,18 (1H, s), 8,10 (1H, s), 7,79 (1H, s), 7,72 (1H, d, J = 16,0), 6,55 (1H, d, J = 16,0), 4,81 (2H, s), 4,28 (2H, q, J = 7,0), 1,35 (3H, t, J = 7,0).
Dieses Material (Verbindung 56) wurde in Methylenchlorid (50 ml) gelöst und mit Phosphortribromid (2,91 ml, 30,6 mmol) behandelt und über Nacht bei 23°C gehalten. Anschließend wurde die Lösung mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (50 ml) behandelt und mit Diethylether (2 × 30 ml) extrahiert. Die wässrige Schicht wur de mit gesättigter wässriger Citronensäure (50 ml) angesäuert, anschließend mit Citronensäure (3 × 30 ml) extrahiert. Das Eindampfen der organischen Schicht ergab 2,2 g (70 % insgesamt) von Verbindung 57 als ein weißes Pulver. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,20 (1H, s), 8,13 (1H, s), 7,77 (1H, s), 7,71 (1H, d, J = 16,2), 6,56 (1H, d, J = 16,2), 4,54 (2H, s), 4,29 (2H, q, J = 7,0), 1,35 (3H, t, J = 7,0).
Beispiel 46: 3-(3-Carbamoyl-5-hydroxymethyl-phenyl)-acrylsäure-ethylester (Verbindung 13)
Das FMOC-Rink-Polystyrolharz (0,50 g, 0,16 mmol) in einem Schüttelbehälter wurde mit einem 1:1-Gemisch von Piperidin und DMF (15 ml) behandelt und 30 min geschüttelt. Das Harz wurde mit DMF (3 × 15 ml) und CH₂Cl₂ (3 × 15 ml) gewaschen. Die Säureverbindung 55 (122 mg, 0,25 mmol) in DMF (10 ml) wurde zu dem Harz zugegeben, gefolgt von DIEA (0,09 ml, 0,50 mmol) und HATU (95 mg, 0,25 mmol). Das Gemisch wurde 1 h geschüttelt, dann abgelassen und mit DMF (3 × 15 ml) und CH₂Cl₂ (3 × 15 ml) gewaschen. TRAF (0,8 ml einer 1 M Lösung in THF, 0,80 mmol) und THF (10 ml) wurde zu dem Harz zugegeben und 4 h geschüttelt. Der Behälter wurde abgelassen und mit THF (3 × 15 ml), MeOH (3 × 15 ml), H₂O (3 × 15 ml), MeOH (3 × 15 ml) und CH₂Cl₂ (3 × 15 ml) gewaschen. Der Linker wurde mit 95:5 TFA-H₂O (20 ml) gespalten. Das Verdampfen des Lösungsmittels, gefolgt von einer Reinigung des Rückstands an Silicagel (EtOAc-Elutionsmittel) ergab 37 mg (90 %) von Verbindung 13. ¹H-NMR (CD₃OD) δ 8,04 (1H, s), 7,94 (1H, s), 7,80 (1H s), 7,77 (1H d, J = 16,2), 6,66 (1H, d, J = 16,1), 4,72 (2H, s), 4,29 (2H, q, J = 7,0) 1,36 (3H, t, J = 7,0). MS (FAB) 250 (MH⁺) 272 (MNa⁺).
Beispiel 47: Harz 58 (funktionalisiert mit 3-Brommethyl-5-(2-ethoxycarbonyl-vinyl)benzoesäure Verbindung 57)
FMOC-Rink-Amid-Polystyrolharz (3,00 g, 1,97 mmol) wurde mit einem 1:1-Gemisch von Piperidin und DMF (30 ml) behandelt und 30 min geschüttelt. Der Behälter wurde abgelassen und das Harz wurde mit DMF (3 × 25 ml), anschließend CH₂Cl₂ (3 × 25 ml) gewaschen. In einem anderen Kolben wurde Verbindung 57 (0,93 g, 2,96 mmol) und HOBT (0,40 g, 2,96 mmol) in CH₂Cl₂ (30 ml) mit DIC (0,93 ml, 5,91 mmol) behandelt und 45 min bei 23°C gehalten. Diese Lösung wurde dann zu dem Harz zugegeben und 6 h geschüttelt. Der Behälter wurde abgelassen und das Harz wurde mit CH₂Cl₂ (3 × 25 ml), MeOH (3 × 25 ml), anschließend CH₂Cl₂ (3 × 25 ml) gewaschen. Das Harz 58 wurde unter Vakuum getrocknet und in einem Exsikkator aufbewahrt.
Beispiel 48: 3-[3-Carbamoyl-5-(5-pyridin-2-yl-[1,3,4)oxadiazol-2-ylsulfanylmethyl-phenyl)acrylsäure-ethylester (Verbindung 25)
Harz 58 (100 mg, 0,063 mmol) in DMF (1 ml) und DIEA (0,11 ml, 0,63 mmol) in einem Schraubgläschen wurde mit 2-(2-Pyridyl)-5-thiol-1,3,4-oxadiazol (50 mg, 0,28 mmol) behandelt und über Nacht auf 70°C erhitzt. Das Harz wurde dann in einen Frittenbehälter (fritted vessel) überführt und mit DMF (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (3 × 10 ml) gewaschen. Das Harz wurde mit 95:5 TFA-CH₂Cl₂ (10 ml) behandelt, 1 h geschüttelt und filtriert und das Filtrat wurde eingedampft. Der Rückstand wurde mit 10 % Et₃N-MeOH (3 ml) behandelt und anschließend wieder eingedampft. Das resultierende Material wurde durch Silicagelchromatographie (EtOAc-Elutionsmittel) gereinigt, wobei 10 mg (38 %) von Verbindung 25 erhalten wurden.¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,75 (1H, d, J = 4,0), 8,18 (1H, d, J = 7,7), 8,04-7,88 (3H, m), 7,80 (1H, s), 7,65 (1H, d, J = 16,2), 7,51-7,47 (1H, m), 6,51 (1H, d, J = 16,2), 6,40 (1H, br s), 5,70 (1H, br s), 4,54 (2H, s), 4,25 (2H, q, J = 7,0), 1,32 (3H, t, J = 7,0). MS (FAB) 411 (MH⁺), 433 (MNa⁺).
Beispiel 49: 3-[3-Carbamoyl-5-(4-pyridin-2-yl-piperizin-1-methyl)-phenyl)-akrylsäureethylester (Verbindung 26)
Die Titelverbindung wurde mit 1-(2-Pyridyl)piperazin hergestellt, wobei die für die Synthese von Verbindung 25 beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurden, um 12 mg (48 %) von Verbindung 26 zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,09-8,07 (1H, m), 7,91 (1H, s), 7,79 (1H, s), 7,64 (1H, d, J = 16,0), 7,62, (1H, s), 7,47-7,41 (1H, m), 6,62-6,57 (2H m), 6,48 (1H, d, J = 16,0), 4,21 (2H, q, J = 7,0), 3,55 (2H, s), 3,49-3,45 (4H, m), 2,55-2,51 (4H, m), 1,32 (3H, t, J = 7,0). MS (FAB) 395 (MH⁺), 417 (MNa⁺).
Beispiel 50: 3-(3-{[Benzyl-(2-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino)-methyl}-5-carbamoyl-phenyl)acrylsäureethylester (Verbindung 23)
Diese Verbindung wurde mit N-Benzyl-3-amino-propionsäureethylester hergestellt, wobei die für die Synthese von Verbindung 25 beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurden, um 18 mg (67 %) von Verbindung 23 zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,95 (1H, s), 7,85 (1H, s), 7,70 (1H, d, J = 16,0), 7,50 (1H, s), 7,38-7,20 (5H, m), 6,95 (1H, s), 6,60 (1H, d, J = 16,0), 5,70 (1H, s), 4,25 (2H q, J = 7,0), 4,15 (2H, q, J = 7,0), 3,75 (2H, s), 3,63 (2H, s), 2,82 (2H, t, J = 5,0), 2,55 (2H, t, J = 5,0), 1,36 (3H, t, J = 7,0). MS (ES) 439 (MH⁺), 461 (MNa⁺).
Beispiel 51: 3-{3-Carbamoyl-5-[(ethyl-pyridin-4-yl-methyl-amino)-methyl]-phenyl}-acrylsäureethylester (Verbindung 27)
Diese Verbindung wurde mit 4-(Ethylamino-methyl)pyridin hergestellt, wobei die für die Synthese von Verbindung 25 beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurden, um 10 mg (43 %) von Verbindung 27 zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,75 (2H, d, J = 4,0), 8,05 (1H, s), 7,95 (1H, s), 7,75-7,55 (4H, m), 6,50 (1H, d, J = 16,0), 4,30 (2H, q, J = 7,0), 4,18 (2H, q, J = 8,0), 3,95 (2H, s), 3,90 (2H, s), 1,40-1,20 (6H, m). MS (ES) 368 (MH⁺), 390 (MNa⁺).
Beispiel 52: 4-[3-Carbamoyl-5-(2-ethoxycarbonyl-vinyl)-benzyl]-piperazin-1-carbonsäureethylester (Verbindung 28)
Diese Verbindung wurde mit Ethyl-1-piperazincarboxylat hergestellt, wobei die für die Synthese von Verbindung 25 beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurden, um 15 mg (63 %) von Verbindung 28 zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,07 (1H, s), 7,90 (1H, s), 7,66 (1H, s), 4,19 (2H, q, J = 7,4), 4,14 (2H, s), 4,07 (2H q, J = 7,4), 3,68 (4H, m), 3,55 (4H, m), 1,26 (3H, t, J = 7,4), 1,19 (3H, t, J = 7,4). MS (ES) 390 (MH⁺), 412 (MNa⁺).
Beispiel 53: 3-{3-Carbamoyl-5-(4-pyrimidin-2-yl-piperazin-1-ylmethyl)-phenyl]-acrylsäureethylester (Verbindung 29)
Diese Verbindung wurde mit 1-(2-Pyrimidyl)piperazin hergestellt, wobei die für die Synthese von Verbindung 25 beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurden, um 15 mg (60 %) von Verbindung 29 zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,30 (2H, d, J = 4,8), 7,88 (1H, s), 7,80 (1H, s), 7,71 (1H, d, J = 16,2), 7,70 (1H, s), 6,53 (1H, d, J = 16,2), 6,48 (1H, t, J = 4,8), 4,27 (2H q, J = 7,0), 3,84 (4H, t, J = 5,2), 3,59 (2H, s), 2,51 (4H, t, J = 4,8), 1,34 (3H, t, J = 7,0). MS (FAB) 396 (MH⁺), 418 (MNa⁺).
Beispiel 54: 3-{3-Carbamoyl-5-[4-(2-cyano-phenyl)-piperazin-1-ylmethyl]-phenyl}-acrylsäureethylester (Verbindung 30)
Diese Verbindung wurde mit 1-(2-Cyanophenyl)-piperazin hergestellt, wobei die für die Synthese von Verbindung 25 beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurden, um 19 mg (73 %) von Verbindung 30 zu erhalten.¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,90 (1H, s), 7,81 (1H, s), 7,70 (1H, d, J = 15,8), 7,69 (1H, s), 7,57-7,54 (1H, m), 7,51-7,45 (1H, m), 7,03-6,98 (2H, m), 6,53 (1H, d, J = 15,8), 4,27 (2H, q, J = 7,4), 3,63 (2H, s), 3,24 (4H, q, J = 4,8), 2,68 (4H, q, J = 4,8), 1,34 (3H, t, J = 7,0). MS (FAB) 419 (MH⁺), 441 (MNa⁺).
Syntheseschemata
Die ursprüngliche Synthese von Stammverbindung 1 ist in Schema 1 dargelegt, an der eine Modifizierung der funktionellen Gruppe von 3-Formylbenzoesäure gefolgt von einer Wittig-Olefinierung beteiligt ist (Verfahren A). Später wurde ein flexiblerer Weg ersonnen, welcher eine Palladium-katalysierte Heck-Reaktion (Heck, R.F. In Palladium Reagents in Organic Synthesis, Katritky, A.R., Meth-Cohn, O., Rees C.W., Nrsg.; Academic Press: London, 1985) zwischen einem Acrylatester und Iodbenzamid, Verbindung 32, einsetzt (Verfahren B). Die Herstellung der verschiedenen Zimtsäureesterderivate 3–6 verwendet ein Zimtsäurederivat, Verbindung 33, als wichtigstes Zwischenprodukt.
Schema 1^a Verfahren A
Verfahren B

^a(a) (COCl)₂, Kat. DMF; (b) NH₄OH, THF; (c) Ph₃PCH₂CO₂Et, PhCH₃, Rückfluss; (d) CH=CHCO2Me, Pd(OAc)₂, Et₃N, 100°C; (e) NaOH/MeOH; (f) EDC, DMF, ROH, Et₃N, DMAP

Schema 2 beschreibt ausführlich die direkte Herstellung der Verbindungen 7–10 unter Verwendung einer entsprechenden Chemie.
Schema 2^a

^a(a)CH=CHCO₂Et, Pd(OAc)₂, Et₃N, 100°C; (b) CH₂N₂; (c) NCCH₂CO₂Et, EtOH, Piperidin; (d) (COCl)₂, Kat. DMF; (e) NH₄OH, THF.

Die Synthese der 5-substituierten Verbindung 11 begann mit einer selektiven Reduktion von 3,5-Dinitroanisol und der Umwandlung in Iodbenzamid, Verbindung 49, gefolgt von einer üblichen Heck-Kupplung wie oben (Schema 3).
Schema 3^a

^a(a) NaSH, MeOH, °C; (b) NaNO2, HCl; Kl; (c) Fe₃(CO)₁₂, EtOH, Rückfluss; (d) Zn(CN)₂, Pd(PPh₃)₄, DMF; (e) H₂O₂, KOH, H₂O; (f) BBr₃, CH₂Cl₂; (g) CH=CHCO₂Et, Pd(OAc)₂, Et3N, 100°C; (h) BzBr, K₂CO₃, DMF.

Phenol, Verbindung 14, und Phenolether, Verbindung 15, wurden aus im Handel erhältlichem 3-Cyanoanisaldehyd hergestellt (Schema 4).
Schema 4^a

^a(a) H₂SO₄, 100°C; (b) BBr₃, CH₂Cl₂; (c) Ph₃P=CHCO₂Et, DMF; (d) BzBr, K₂CO₃, DMF.

Die Synthese von α,β-ungesättigten Ketonen, Verbindungen 16–21, begann mit der Herstellung des Weinreb-Amids, Verbindung 43, wiederum über eine Heck-Kupplung (Schema 5).
Schema 5^a

^a(a) CH=CHCON(OMe)Me, Pd(OAc)₂, Et₃N, 100°C; (b) RLi, –78°C; (c) Zn(CN)₂, Pd(PPh₃)₄, DMF; (d) H₂O₂, KOH, H₂O; (e) Ph₃COH, Ac₂O, AcOH, Kat. H₂SO₄; (f) NBS, hν; anschließend Et₃N; (g) TFA, CH₂Cl₂.

Eine Reaktion der erforderlichen Organolithiumspezies mit der Amidverbindung 43 ergab Ketone in guter Ausbeute. Die Organolithiumreagenzien waren handelsüblich oder wurden durch Metallierung des entsprechenden Bromids oder, im Falle von Furan (Sieber, P., Riniker, B. Protection of Carboxamide Functions by the Trityl Residue. Application to Peptide Synthesis Tet. Lett. 1991, 32, 6, 739–742) über eine direkte Metallierung des Heterocyclus erhalten. Schließlich wurde die Indenonverbindung 22 durch eine Palladium-katalysierte Cyanierung von 5-Bromindenon, gefolgt von einer Hydrolyse zum primären Amid erhalten. Eine versuchte Manipulierung der ungeschützten Indenoncarboxamidverbindung 45 führte nur zu Zersetzungsprodukten. Ein Schutz der Verbindung 45 als das Tritylamid (Dondoni, A., Junquera, F., Merchan, F. L., Merino, P., Tejero, T. Synthesis 1994 1450–1456) gestattete jedoch die α-Bromierung mit NBS, gefolgt von einer Eliminierung und Entfernung der Schutzgruppe mittels TFA, um die gewünschte Indenonverbindung 22 zu erhalten.
Die Konstruktion einer Bibliothek von 5-substituierten Benzamiden begann mit der Herstellung der Benzylbromid-Zwischenverbindung 57, die in Schema 6 dargelegt ist.
Schema 6^a Herstellung von Monomer 57 für eine parallele Synthese

^a(a) TBDPS-Cl, Imidazol, DMF; (b) MeOH, NaOH 1 Äquiv.; (c) LiHB(Et₃); (d) TPAP; (e) EtO₂CP(O)(OEt)₂, NaH; (f) TBAF; (g) PBr₃.

Der Schutz des im Handel erhältlichen Diethyl-5-(hydroxymethyl)isophthalats Verbindung 50 und eine selektive Hydrolyse eines Esters ergab das Benzoesäurederivat Verbindung 52. Eine selektive Reduktion des Esters mit Li-triethylborhydrid ergab die Hydroxymethylsäure Verbindung 53. Eine Oxidation zu dem Aldehyd mit TPAP gefolgt von einer Horner-Emmons-Kondensation und Entfernung der Silylschutzgruppe ergab die vorletzte Verbindung 56 in guter Ausbeute. Schließlich erzeugte die Umwandlung der Hydroxymethylgruppe in das Benzylbromid mit PBr₃ die wichtigste Zwischenverbindung 57, welche für die Bindung an einen festen Träger bereit ist. Die Monomerverbindung 57 wurde an Rink-Amid-Harz (entweder freies Harz oder Chiron Crowns) gekoppelt, wobei ein gewöhnliches DIC/HOBT-Kupplungsverfahren eingesetzt wurde (Schema 7). Eine nucleophile Verdrängung der Bromidverbindung 58 in DMF erfolgte ohne Anzeichen von Michael-Additionsprodukten. Die Entfernung der Schutzgruppen von den gekuppelten Produkten, Verbindung 59, mittels TFA ergab Endprodukte mit hoher Reinheit.
Schema 7^a Parallele Synthese von 5-substituierten Benzamiden auf festem Träger

^a(a) 57, DIC, HOBt; (b) RR1NH oder RSH, DIEA, DMF, 70°C; (c) TFA

Die Lösung der Cokristallstruktur dieser Reihe von Inhibitoren in einem Komplex mit dem 3CP bestätigt, dass sie im Wesentlichen so binden wie im Modell dargestellt. An der α,β-ungesättigten Estergruppe erfolgt eine irreversible kovalente 1,4-Addition durch das nucleophile katalytische Cystein an dem Protein, was in der Cokristallstruktur bestätigt wird. Eine strukturelle Rückkopplung erleichterte die Optimierung von Verbindungen, die versuchen, an die S2 und S3-Subsites des Enzyms heranzukommen. Leider wurde ein Zugang zu der S2-Subsite mit dieser Klasse von Inhibitoren nicht erreicht. Eine verwandte Reihe von ungesättigten Ketonen weisen eine starke reversible Hemmung auf, sie werden jedoch durch freie Thiole inaktiviert und weisen vermutlich infolgedessen keine antivirale Aktivität auf. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die Erkennung in der S2-Tasche zu signifikanten Verstärkungen der Bindung führen kann. Ein paralleler Syntheseversuch an fester Phase gestattete die Herstellung einer großen Zahl von Benzamidderivaten, die in der 5-Stellung substituiert waren, um Zugang zu den S3-S4-Subsites des Enzyms zu erlangen. Durch kristallografische Analyse wurde bestätigt, dass diese Derivate die S3-S4-Taschen besetzen; es wurde jedoch nur eine mäßige Verbesserung der Enzyminaktivierung erzielt. Trotz der sehr mäßigen Inaktivierungskonstanten (K_obs/I) wurde eine submikromolare antivirale Aktivität bei Verbindung 30 beobachtet. Aus unserer Arbeit und der von anderen geht hervor, dass die Erkennung an S1-S3-Subsites und eine selektive irreversible Bindung erforderlich ist, um eine starke 3CP-Inaktivierung zu erreichen.
Ergebnisse aus biologischen Tests der Verbindungen sind nachstehend beschrieben.
Tabelle 1. Substituierte Benzamide
Anmerkungen:

^a Die Elementaranalysen (C, H, N) von allen Verbindungen stimmten innerhalb von +/– 0,4 % mit den theoretischen Werten überein.
^b Serotyp 14; NI = keine Hemmung; ND = nicht bestimmt.

Tabelle 2. α,β-ungesättigte Ketobenzamide
Anmerkungen:

^a Die Elementaranalysen (C, H, N) von allen Verbindungen stimmten innerhalb von +/– 0,4 % mit den theoretischen Werten überein.
^b Serotyp 14;
^c zeigt den Verlust der 3CP-Hemmungsaktivität nach 2–3 min Einwirken von 5 mM DTT bei 23°C auf die Verbindung an.

Tabelle 3. 5-substituierte Benzamide
Anmerkungen:

^a HRMS, NMR und HPLC-Reinheit stimmten alle mit den angegebenen Strukturen überein.
^b Serotyp 14.

Mit Hilfe der Cokristallstruktur eines Peptidaldehyds (Webber. S.E., Okano, K., Little, T., Reich, S.H., Xin, Y., Fuhrman, S.A., Matthews, R.A., Love, R.A., Hendrickson, T.F., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Ford, C.E., Binford, S.L, Worland, S.T. Tripeptide Aldehyde Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease: Design, Synthesis, Biological Evaluation, and Cocrystal Structure Solution of P1 Glutamine Isosteric Replacements J. Med. Chem. 1998, 41, 2786–2805), der an das 3CP gebunden war, wurde die Planung des neuen Nichtpeptid-Inhibitors S in Angriff genommen. Die Analyse der 2,3 A-Kristallstruktur des HRV-14 3CP-Enzyms bestätigte, dass es mit der Trypsinfamilie von Proteasen strukturell verwandt ist, mit einer katalytischen Triade, die sich aus den Resten Cystein, Histidin und Glutaminsäure zusammensetzt. (Matthews, D.A., Smith, W.A., Ferre, R.A., Condon, B., Budahazi, G., Sisson, W., Villafranca, J.E., Janson, C.A., McElroy, H.E., Gribskov, C.L., Worland, S. Structure of Human Rhinovirus 3C Protease Reveals a Trypsin-like Polypeptide Fold, RNA-Binding Site, and Means for Cleaving Precursor Polyprotein. Cell 1994, 77, 761–771). Unser Ziel war, letztlich oral verfügbare 3CP-Inhibitoren zu entwickeln, deshalb konzentrierte sich die Planungsstrategie auf Nichtpeptid-Einheiten, von denen man erwarten konnte, dass sie günstigere pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen würden. Die ursprüngliche Planung war bewusst sehr einfach gehalten: die Positionierung einer Aldehydgruppe, so dass sie mit dem nucleophilen Cystein reagieren konnte, und das Platzieren einer Carboxamidgruppe in der S1-Erkennungstasche. Ein meta-substituierter Phenylring positionierte diese zwei Elemente mit der zweckmäßigen Entfernung und relativen Ausrichtung, was zu 3-Formylbenzamid als Prototyp-Inhibitorverbindung 1a führte:
Diese Verbindung wurde getestet und es wurde festgestellt, dass sie ein sehr schwacher Inhibitor dieses 3CP war (Ki = 104 μM). Wir kamen zu dem Schluss, dass neben der geringen Größe des Inhibitors seine fehlende Aktivität zum Teil auf das Benzaldehydcarbonyl zurückzuführen sein könnte, welches erheblich weniger reaktiv ist als sein α-Aminoaldehyd-Gegenstück, das in starken Aldehyd-Inhibitoren auf Peptidbasis vorgefunden wird. (Webber, S.E., Okano, K., Little, T., Reich, S.H., Xin, Y., Fuhrman, S.A., Matthews D.A., Love, R.A., Hendrickson, T.F., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Ford, C.E., Binford, S.L., Worland, S.T. Tripeptide Aldehyde Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease: Design, Synthesis, Biological Evaluation, and Cocrystal Structure Solution of P1 Glutamine Isosteric Replacements J. Med. Chem. 1998, 41, 2786–2805). Außerdem machte die den Aldehyden eigene Instabilität diese Gruppe für unsere Zwecke ungeeignet. Es wurde in unserem Labor (Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman„ S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806) und anderen festgestellt, dass Cysteinproteasen im Allgemeinen und 3CP im Besonderen stark durch Michael-Akzeptoren gehemmt werden, wenn sie in ein Peptiderkennungselement eingebaut sind. Die Ersetzung der Formylgruppe der Inhibitorverbindung 1a durch den α,β-ungesättigten Ethylester führte zu Verbindung 1, welcher sich als irreversibler Inhibitor mit einer schwachen Inaktivierungskonstante von 52 s^–1M^–1 erwies (Tabelle 1). Interessanterweise wies die Verbindung 1 auch eine schwache aber nachweisbare antivirale Aktivität (EC₅₀) auf, wenn sie in einem cytopathischen Wirkungs-Assay (Webber, S.E., Tikhe, J., Worland, S.T., Fuhrman, S.A., Hendrickson, T.F., Matthews, D.A., Love, R.A., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., DeLisle, D.M., Ford, C.E., Binford, S.L., Design, Synthesis, and Evaluation of Nonpeptidic Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease. J. Med. Chem. 1996, 39, 5072–5082; Webber S.E., Okano, K., Little, T., Reich, S.H., Xin, Y., Fuhrman, S.A., Matthews, D.A., Love, R.A., Hendrickson, T.F., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Ford, C.E., Binford, S.L., Worland, S.T. Tripeptide Aldehyde Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease: Design, Synthesis, Biological Evaluation, and Cocrystal Structure Solution of P1 Glutamine Isosteric Replacements J. Med. Chem. 1998, 41, 2786–2805; Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D. A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr,, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806; Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Reich, S.H., Marakovits, J.T., Prins, T.J., Zhou, R., Tikhe, J., Littlefield, E.S., Bleckman, T.M., Wallace, M.W., Little, T.L., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 2. Peptide Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2819) und anderen getestet wurde. (Kaldor, S.W. Hammond, M., Dressman, B.A., Labus, J.M., Chadwell, F.W., Kline, A.D., Heinz, B.A. Glutamine-derived Aldehydes for the Inhibition of Human Rhinovirus 3C Protease. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 2021–2026.
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Im Besitz dieser Information wurden weitere Ester hergestellt und getestet. Es wurde erwartet, dass durch das Ausfüllen der aktiven Stelle in der primären Richtung (S1'–S2') eine zusätzliche Affinität erhalten werden könnte. Die Methylesterverbindung 2 war überraschenderweise in dem antiviralen Assay zehnmal weniger aktiv, obwohl sie eine ähnliche schwache Hemmung des Enzyms relativ zu der Ethylesterverbindung 1 aufwies. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde festgestellt, dass die Estergruppe allgemein eine unbedeutende Auswirkung auf die Wirkungsstärke hatte, wobei die Benzylesterverbindung 3 die beste Aktivität aufwies. Um festzustellen, ob die Aktivität der Stammverbindung 1 auf die inhärente Reaktivität des ungesättigten Esters zurückzuführen war, wurden alternative Substitutionen in der 1-Stellung, die der S1-Erkennungstasche entsprechen, untersucht. Es wurde eine klare Bevorzugung des primären Carboxamids beobachtet, die mit der Erkennung von Glutamin in dem nativen Substratpeptid in Einklang steht. (Webber, S.E., Tikhe, J., Worland, S.T., Fuhrman, S.A., Hendrickson, T.F., Matthews, D.A., Love, R.A., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., DeLisle, D.M., Ford, C.E., Binford, S.L. Design, Synthesis, and Evaluation of Nonpeptidic Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease. J. Med. Chem. 1996, 39, 5072–5082). Eine erhöhte Aktivierung des Michael-Akzeptors hinsichtlich einer nucleophilen Addition, durch alpha-Cyano-Substitution, führte zu einem mäßigen, aber reversiblen Inhibitor, Verbindung 9. Verschiedene ungesättigte Imide, von denen ebenfalls erwartet wurde, dass sie reaktiver wären als ein ungesättigter Ester, waren schwache Inhibitoren. Die Untersuchung von α, β-ungesättigten Ketonen führte zu einigen interessanten Befunden. Ein einfaches Methylketon zeigte eine nur mäßige, aber wieder reversible Hemmung. Die Phenylketonverbindung 17 war jedoch erheblich wirkungsstärker gegen das 3CP. Wenn sie in dem antiviralen Assay getestet wurden, wiesen Ketone im Allgemeinen eine größere Toxizität (niedrigere CC₅₀) und keine messbare antivirale Wirkung auf. Bei einer Inkubation mit DTT wurden die α,β-ungesättigten Ketone vollständig inaktiviert, was nahe legt, dass ihre fehlende antivriale Aktivität auf eine Wechselwirkung mit endogenen Thiolen in Zellen (Glutathion) zurückzuführen sein könnte. (Dragovich, P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T., Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806). Es wurde erwartet, dass Elektronendonorsubstituenten in der 4-Stellung des Phenylketons (4-Me₂N-, 4-MeO-) die Ketone weniger reaktiv machen würden, es wurde jedoch keine Auswrikung auf ihre Inaktivierung mit DTT beobachtet. Entsprechend behielten heterocyclische Ketone (2-Pyridyl, 2-Furyl) ihre Reaktivität mit DTT bei. In einem Versuch, die Inhibitoren kompakter zu machen wurde ein Indenongerüst entworfen. Die bicyclische Indenonverbindung 22 war das wirkungsstärkste der Ketone. Sie wurde jedoch ebenfalls durch DTT inaktiviert und wies keine antivirale Aktivität auf. Wenngleich kleine nicht-peptidartige α,β-ungesättigte Ketone wie Verbindung 22 eine starke reversible Hemmung von 3CP ergaben, wurde klar, dass diese erhöhte Reaktivität mit dem komplexeren zellulären Milieu unvereinbar war, welches in dem cytopathischen Wirkungstest vorhanden ist.
Einer der stärker löslichen ungesättigten Ester-Inhibitoren, die Hydroxyethylesterverbindung 4, wurde erfolgreich mit dem 3CP cokristallisiert und eine 1,9 Å-Kristallstruktur wurde gelöst. Die gebundene Konformation war ähnlich der des ursprünglichen Modells, was den Phenyl(Ph)-Kern und 3-Carboxamid anbelangt. Interessanterweise war die in der Kristallstruktur beobachtete Orientierung des Michael-Esteraddukts entgegengesetzt zu der auf der Basis von Modellstudien vorhergesagten. Das heißt, die Carboethoxygruppe war von der 3-Carboxamidgruppe in der Kristallstruktur weggedreht, wogegen die Modellverbindung die Carboethoxygruppe zu der 3-Carboxamidfunktion hin orientiert hat. Dies steht mit der guten Wasserstoffbindung (2,98 Å) im Einklang, welche zwischen dem Estercarbonyl und Cys-147 NH beobachtet wird, welche den Ester hinsichtlich einer 1,4-Addition im Übergangszustand aktivieren kann und auch eine gute Wechselwirkung in dem am Ende erhaltenen Komplex zu sein scheint. Außerdem wurde diese Orientierung anschließend in den Michael-Akzeptoren auf Peptidbasis ebenfalls beobachtet. (Dragovich. P.S., Webber, S.E., Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L., Harr,, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806). Andere wichtige Wechselwirkungen zwischen dem Protein und dem Inhibitor wurden ebenfalls beobachtet. Es wird festgestellt, dass das 3-Carboxamid drei Wasserstoffbindungen zu His161 und Thr142 ausbildet. Die Wasserstoffbindung von dem Amid NH zu dem Thr142-Carbonyl ist etwas länger (3,12 Å) und in einer weniger optimalen Orientierung als diejenige, die bei Michael-Akzeptoren auf Peptidbasis beobachtet wird. (Dragovich, P.S., Webber, S.E, Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L, Harr,, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806). Wenngleich das Carboxamid 23 Grad aus der aromatischen Ebene herausgedreht ist, offensichtlich, um diese Wasserstoffbindungen zu gewährleisten, wäre eine weitere Drehung aus der Ebene heraus erforderlich, um die Wasserstoffbindungen besser nachzuahmen, die in dem P1-Glutamin von peptidartigen Inhibitoren beobachtet werden, mit einem damit verbundenen energetischen Nachteil. Diese molekulare Erkennung erklärt die Spezifität für das primäre Carboxamid gegenüber den anderen in dieser Stellung getesteten Gruppen und steht im Einklang mit den bindenden Wechselwirkungen, die bei anderen Inhibitoren beobachtet werden. (Webber, S.E., Tikhe, J., Worland, S.T., Fuhrman, S.A., Hendrickson, T.F., Matthews, D.A., Love, R.A., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., DeLisle, D.M., Ford, C.E., Binford, S.L. Design, Synthesis, and Evaluation of Nonpeptidic Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease. J. Med. Chem. 1996, 39, 5072–5082; Webber, S.E., Okano, K., Little, T., Reich, S.H., Xin, Y., Fuhrman, S.A., Matthews, D.A., Love, R.A., Hendrickson, T.F., Patick, A.K., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Ford, C.E., Binford, S.L., Worland, S. T. Tripeptide Aldehyde Inhibitors of Human Rhinovirus 3C Protease: Design, Synthesis, Biological Evaluation, and Cocrystal Structure Solution of P1 Glutamine Isosteric Replacements J. Med. Chem. 1998, 41, 2786–2805; Dragovich, P.S., Webber, S.E, Babine, R.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.N., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L, Harr, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806). Vor der Lösung der Cokristallstruktur des Benzamidkerns begannen wir, weitere Substituenten an dem Phenylring zu untersuchen, um die Affinität zu erhöhen. Wir gingen davon aus, dass eine Substitution der 6-Stellung einen Zugang zu der S2-Subsite, welche unbesetzt war, gestatten könnte, und auf der Basis anderer Klassen von 3CP-Verbindungen die Bindung signifikant verbessern sollte. 4-Methyl, Verbindung 10, erwies sich jedoch als weniger aktiv als die unsubstituierte Stammverbindung 1. In der Rückschau würde man erwarten, dass die ortho-Methylsubstitution in Verbindung 10 die günstige Orientierung des Michael-Akzeptors von dem Carboxamid weg, wie sie in der Cokristallstruktur von Verbindung 1 beobachtet wird, verhindert. Eine Substitution des Michael-Akzeptors in der α- oder β-Stellung durch eine Methylgruppe führte zu einem vollständigen Verlust der Aktivität (Daten nicht gezeigt). Schließlich führte eine Substitution der 6-Stellung ebenfalls zu einem Verlust der Aktivität.
Die Analyse der Cokristallstruktur von Verbindung 1 zeigte, dass eine Substitution in der 5-Stellung besonders vielversprechend war. Der Aryl-H-Vektor in der 5-Stellung wurde entlang des β-Faltblatts in Richtung der S3-S4-Taschen ausgerichtet und außerdem schien es, dass mit einer passenden Substitution die S2-Tasche zugänglich sein könnte. Die Phenolverbindung 11 wies eine vergleichbare Aktivität wie die von Verbindung 1 auf, dennoch zeigten die entsprechenden getesteten Phenolether ein allgemeines Fehlen der Aktivität, z. B. Verbindung 12. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Hydroxymethylenverbindung Verbindung 13 die gesamte Wirkungsstärke der unsubstituierten Stammverbindung 1 beibehielt.
Mit der Toleranz für eine Hydroxymethylgruppe in der 5-Stellung, die in Verbindung 13 beobachtet wurde, zusammen mit Cokristallstrukturinformation wurde ein paralleler Syntheseversuch unternommen, um eine Substitution in dieser Stellung zu erforschen. Unter Verwendung der primären Carboxamidgruppe als Henkel zum Anbringen an einem festen Träger hatte man den Eindruck, dass Derivate durch nucleophile Substitution der entsprechenden Brommethylverbindung leicht zugänglich wären. Eine Suche im Available Chemicals Directory (ACD) nach primären Aminen und Mercaptanen, die sich für eine Synthese eigneten, ergab 3087 Verbindungen. Eine strukturbasierte Computerana lyse wurde verwendet, um eine Untergruppe von Molekülen aus der Gesamtzahl, welche synthetisiert werden konnten, einzuordnen und auszuwählen. Aus den Vorläuferfragmenten wurde eine virtuelle Bibliothek von 5-substituierten Benzamiden erzeugt. Diese Bibliothek von 3D-Strukturen wurde dann durch eine teilweise fixierte Andockprozedur laufen gelassen, wobei der Benzamid-"Kern" des Moleküls in seiner in der Cokristallstruktur beobachteten Stellung fixiert gehalten wurde und die übrigen Atome angepasst wurden, um ihre optimale Stellung in der aktiven Stelle zu finden. Sobald diese Moleküle angedockt waren, wurden sie analysiert und anhand von energiearmen Wechselwirkungen mit dem Protein, der Anzahl von zusätzlich erzeugten Protein-Ligand-Wasserstoffbindungen und dem Ausmaß, in dem sie die S2, S3 und/oder die S4-Tasche ausfüllten, eingeordnet. Die besten Kandidatenverbindungen aus diesem Screening und Einordnungsverfahren wurden dann für die Synthese ausgewählt. Von den 784 hergestellten und getesteten Verbindungen wurden ungefähr 30 mit einer stärker als 80%igen Hemmung von 3CP bei 20 μ für eine erneute Synthese und volle Charakterisierung ausgewählt. Eine interne Kontrollverbindung wurde an allen Platten eingesetzt, welche ungefähr 25 % Hemmung bei 10 μM unter identischen Bedingungen (10 Minuten Vorinkubation) ergaben. (Dragovich, P.S., Webber, S.E, Babine, R.E., Fuhrman, S. A., Patick, A.K., Matthews, D.A., Lee, C.A., Reich, S.H., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Littlefield, E.S., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Wallace, M.B., Meador, III, J.W., Ferre, R., Brown, E.L., Binford, S.L, Harr, J.E.V., DeLisle, D.M. und Worland, S.T. Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors.1. Michael Acceptor Structure-Activity Studies J. Med. Chem. 1998, 41, 2806). Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurde eine eindeutige Bevorzugung von verzweigten Aminomethylengruppen beobachtet. Die Inaktivierungsraten (K_obs/I), welche mäßig sind, korrelieren nicht mit der antiviralen Wirkungsstärke. In der Tat ist für die stärkste Verbindung, Verbindung 30, die antivirale EC₅₀ von 600 nM außerordentlich in Anbetracht der mäßigen K_obs/I. Dieses Fehlen einer Korrelation zwischen der Inaktivierungsrate und der antiviralen Aktivität veranlasste uns, zu untersuchen, ob die antivirale Wirkung von diesen Verbindungen tatsächlich auf eine Hemmung des 3CP zurückzuführen war. Eine Untersuchung der proteolytischen Prozessierung durch 3CP in dem cytopathischen Wirkungstest unter Verwendung einer Polyacrylamidgelelektrophorese mit Verbindung 1 zeigte eindeutig eine dosisabhängige Reduktion der proteolytischen Fragmente, die mit einer Hemmung des 3CP im Einklang steht.
Um die Natur der bindenden Wechselwirkungen mit den stärker substituierten Derivaten zu bestimmen, wurde eine Cokristallstruktur von an 3CP gebundener Verbindung 26 gelöst. In diesem Fall wurde eine signifikante Änderung der Proteinkonformation beobachtet, welche sehr wahrscheinlich das Ergebnis von Kristallpackungskräften ist. Die Elementarzelle und Raumgruppe diese Komplexes war einzigartig und wurde niemals in mehr als 30 3CP-Cokristallstrukturen beobachtet. Der Benzamidkern von Verbindung 26 bindet jedoch im Wesentlichen in dem gleichen Raum und der gleichen Orientierung wie die unsubstituierte Verbindung 4. Der Piperizinring liegt direkt über dem Rückgrat des β-Faltblatts, wobei der Pyridinring tief in eine größere umgelagerte P4-Subsite eingebettet ist. Während der Pyridinring weitgehend in dem Protein eingebettet ist, sind die energetischen Kosten für das Annehmen dieser neuen Proteinkonformation unklar.

Claims

Verbindung der Formel

ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat davon.
Verbindung der Formel
worin: R₁₀ H oder CH₃ ist; R₂₀ H, OH oder CH₂OH ist; R₃₀ H oder OCH₂Ph ist; R₄₀ H oder CN ist; und R₅₀ CH₂CH₃, CH₃, CH₂Ph, CH₂CH₂Ph, CH₂CH₂OH oder CH₂(2-Pyridyl) ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat davon.
Verbindung nach Anspruch 2 der Formel
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat davon.
Verbindung der Formel
worin R₁₀₀ CH₃, Phenyl, Ph(4-NCH₃), Ph(4-OCH₃), 2-Pyridyl oder 2-Furyl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat davon.