DE60018591T2

DE60018591T2 - Milchsäurebakterien zur behandlung und prophylaxe von giardiasis

Info

Publication number: DE60018591T2
Application number: DE60018591T
Authority: DE
Inventors: Eduardo Schiffrin; Pablo Perez
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: AP1563A; PE20010676A1; PT1227827E; EP1227827A1; CA2388952C; US7229616B2; US20050186191A1; CN1382056A; BR0015102B1; ZA200203008B; ES2239622T3; DE60018591D1; AP2002002483A0; MXPA02004115A; EP1227827B1; OA12074A; CA2388952A1; DK1227827T3; US6905679B1; ATE290393T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Kulturüberstand von Milchsäurebakterien, der eine Kolonisierung intestinaler Zellen durch Giardia intestinalis verhindern kann, zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die mit der Kolonisierung des Darms durch Giardia intestinalis assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Stämme von Bifidobakterium, die die vorstehend erwähnten Eigenschaften aufweisen, und die Verwendung von Milchsäurebakterien zur Herstellung eines aufnehmbaren Trägers, wie beispielsweise eines Lebensmittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe eines Befalls des Darms durch Giardia intestinalis.
Giardia intestinalis ist ein begeißelter Einzeller, der nach Befall des Darms eines Individuums Erkrankungen, wie beispielsweise abdominale Schmerzen, lockeren Stuhl oder sogar schweren Durchfall bewirken kann. Sein Lebenszyklus weist zwei Stadien auf, Zysten und Trophozoiten bzw. Schizonten, deren verschiedene Formen dem Mikroorganismus gestatten in unterschiedlichen und sogar widrigen Umgebungen zu überleben.
Die Zysten sind ruhende, vierkernige und eiförmige Formen, die für die Übertragung einer Giardiasis verantwortlich sind. Nach der Aufnahme von Zysten durch ein Individuum wird der Zystenaustritt durch Kontakt mit der Magensäure und/oder den Verdauungsenzymen ausgelöst. Der somit schlüpfende Parasit, der als Trophozoit bezeichnet wird, ist zweikernig und halbbirnenförmig mit einer breiten Vorderseite und einer schmalen Hinterseite gestaltet, wobei er eine Größe von ungefähr 10 μm aufweist. Die ventrale Seite ist größtenteils durch die ventrale Scheibe bedeckt, von der angenommen wird, dass sie zumindest teilweise für ein Anheften des Trophozoiten an die Darmoberfläche verantwortlich ist.
Nach dem Zystenaustritt können die Trophozoiten in dem Dünndarm des infizierten Individuums für eine lange Zeit, die sogar Jahre betragen kann, überdauern. Wenn Trophozoiten durch den Strom der Darmflüssigkeit abwärts transportiert werden, dann fangen sie erneut an eine Zyste zu bilden, um sich an eine neue Umgebung anzupassen.
Die Zysten werden mit den Fäkalien ausgeschieden und können verschiedenen extremen Umweltbedingungen, einschließlich unterschiedlicher Temperatur, pH-Wert und Spannungszuständen widerstehen. Ein infiziertes Individuum kann ungefähr 9 × 10⁸ Zysten pro Tag ausscheiden, wobei erwiesenermaßen so geringe Dosierungen wie 10 Zysten ausreichen, um eine Infektion in einem anderen Individuum zu erzeugen. Die Übertragung von Giardia intestinalis kann auf verschiedenen unterschiedlichen Wegen erfolgen, wobei die Hauptrouten einer Übertragung über das Wasser und Lebensmittel verlaufen. Eine Ausbreitung von Person zu Person wird durch gewisse Tagesstätten- (daycare) und nosokomiale Ausbrüche unterstützt. Zusätzlich wurde festgestellt, dass wilde Tiere infektiöse Reservoirs von Giardia intestinalis darstellen und zu einer Ausbreitung des Pathogens beitragen können.
Giardiasis ist ähnlich anderen Darmerkrankungen bei Kleinkindern und Kindern schwerwiegender. Eine Infektion ist im Allgemeinen mit Durchfall und mangelhafter Absorption assoziiert, was zu einem gestörten Wachstum und einer gestörten Entwicklung des Kindes führt und schließlich ebenfalls zu dem Tod von Neugeborenen führen kann.
Ungefähr eine Hälfte der infizierten Leute zeigen jedoch keine Symptome und tragen zu der Ausbreitung des Pathogens bei, da aufgrund der Abwesenheit jeglicher wahrnehmbarer Symptome kein entsprechendes Regimen angewendet wird.
Obwohl großes wissenschaftliches Bemühen in die Untersuchung von Giardia intestinalis investiert wurde, konnte die Pathogenese der Giardiasis nicht durch eine einzigen Virulenzfaktor alleine erklärt werden und keine toxische Verbindung ist bisher isoliert worden.
Die lichtmikroskopische Erscheinungsform eines durch Giardia kolonisierten Darms zeigte sich ziemlich unterschiedlich, die von einer normalen mukosalen Struktur bis zu einer subtotalen Zottenatrophie reichte. Ergebnisse von elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergaben Feinstrukturänderungen, wie beispielsweise ein Verkürzen und Zerstören von Mikrovilli bzw. Mikrozotten (Chavez et al., Experimental Parasitol. 80 (1995), 133–138).
Es wurde festgestellt, dass derartige strukturelle Anomalitäten durch eine Verringerung von Lactase, Sucrase und Maltaseaktivitäten in der Mikrovillimembran als auch von einem gestörten Darmtransport (Buret et al., Gastroenterology 103 (1992), 506–513; Roberts-Thomson et al., Gastroenterology 71 (1976), 57–61) begleitet wird.
Zusätzlich zu den zwei vorstehend erläuterten Formen, entwickelte Giardia intestinalis eine sich extrem verändernde Oberflächenstruktur und entwickelte eine Familie schützender Proteine, die alle ausgesetzten Oberflächen (Aley et al., Infect. Agents Dis. 4 (1995), 161–166, Müller et al., Infect. Immun. 64 (1996), 1385–1390; Nash et al., J. Euk. Microbiol. 42 (1995), 604–609) bedecken. Diese variablen Oberflächenproteine (VSPs) schützen Trophozoiten sowohl vor immunologischen als auch vor Umweltfaktoren, so dass Giardia den Abwehrmaßnahmen des Wirts ausweichen und in einer stark abbauenden Umgebung, wie beispielsweise der, die in dem Darmtrakt von Säugern vorherrscht, überleben kann. Eine Modifikation in den VSPs ereignet sich ungefähr jede 6. bis 13. Generation, was es für das Immunsystem des Wirts' schwierig oder nahezu unmöglich macht eine spezifische Antwort gegen das Pathogen zu entwickeln. Immun- und Umweltbelastung können verschiedene VSP Phänotypen selektionieren. Weiterhin wurde ebenfalls ein Antigenumschalten der VSPs nach dem Zystenaustritt berichtet (Gillin et al., Anu. Rev. Microbiol. 50 (1996), 679–705).
Die beim Menschen auftretende Giardiasis ist mit einem Anstieg der Anzahl von Lamina propria und intraepithelialen Lymphozyten assoziiert, was darauf hinweist, dass eine T-Zellaktivierung für die Mikrozottenschädigung verantwortlich ist. Eine induzierte Immunsuppression in Mäusen führt jedoch zu einer tiefgreifenderen Wirkung auf die Mikrozotten assoziierten Enzyme verglichen mit nicht immunsupprimierten Tieren, was darauf deutet, dass während einer Infektion durch Giardia intestinalis die Epithelschädigung nicht alleine von der Immunfunktion abhängig zu sein scheint.
Eine gewöhnliche Giardiasistherapie besteht in der Verabreichung von Antibiotika, wie beispielsweise solcher, die zu der Klasse der Nitroimidazole gehören. Bis jetzt konnte gezeigt werden, dass in endemischen Gebieten die Antwort auf die Therapie verhältnismäßig inkonsistent ist (Katelaris et al., Aliment. Pharmacol. Ther. 8 (1994), 187–192). Außerdem ist aufgrund der zumindest teilweisen Zerstörung der natürlichen Mikroflora des Darms die Verabreichung derartiger Antibiotika immer durch ernste Nebenwirkungen, wie beispielsweise ausgedehnten Durchfall oder sogar durch einen ausgedehnten Befalls des Darms durch andere schädliche Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefen, begleitet.
Somit besteht ein Bedarf im Stand der Technik an zusätzlichen Alternativen zur Behandlung von Giardiasis oder an Mitteln, um einen Befall eines Individuums durch das Pathogen zu verhindern.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit im Bereitstellen zusätzlicher Mittel zur Behandlung oder Prophylaxe einer Infektion durch Giardia intestinalis.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellen der Verwendung eines Kulturüberstandes eines Milchsäurebakteriums oder eines Bifidobakteriums gelöst, der eine Adhäsion von Giardia intestinalis an intestinale Zellen verhindern kann, zur Herstellung eines aufnehmbaren Trägers zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die mit der Kolonisierung des Darms durch Giardia intestinalis assoziiert sind.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden neue Milchsäurebakterien beziehungsweise Bifidobakterien bereitgestellt, die eine Adhäsion von Giardia intestinalis an intestinale Zellen verhindern können, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus NCC 189 (I-2333) oder NCC 200 (I2334). Diese Mikroorganismen wurden gemäß des Budapester Vertrags beim Institut Pasteur am 30. November 1999 hinterlegt und erhielten die vorstehend aufgeführten Hinterlegungsnummern. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Lebensmittel und pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Mikroorganismen enthalten.
Die Mikroorganismen können in dem Träger in einer Menge von ungefähr 10⁶ bis ungefähr 10¹² pfu (Plaque bildende Einheiten) beinhaltet sein. Sie können als solche beinhaltet sein oder wahlweise nachdem sie im Wesentlichen von dem Kulturmedium gereinigt sind. Alternativ, kann der Kulturüberstand einer Kultur derartiger Mikroorganismen in dem Träger beinhaltet sein, der vor dessen Einschluss vorzugsweise durch im Stand der Technik gut bekannte Mittel aufkonzentriert wird.
Der aufnehmbare Träger kann ein Lebensmittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie beispielsweise Milch, Yoghurt, Quark, Käse, fermentierte Milch, fermentierte Produkte auf Milch-Basis, Eiscremes, auf fermentiertem Getreide basierende Produkte, auf Milch basierenden Pulvern, Formulierungen für Kinder oder irgendeine Sorte von Haustiernahrung sein. Derartige Träger können. bspw. durch Verwendung eines Mikroorganismus einfach hergestellt werden, der die entsprechenden Eigenschaften zur Fermentation des Ausgangsmaterials selbst aufweist. Alternativ können die Mikroorganismen oder wahlweise ein aufkonzentrierter Kulturüberstand davon dem jeweiligen Träger in Flüssig- oder Trockenform zugegeben werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie beispielsweise eine Tablette, eine flüssige Bakteriensuspension, ein getrocknetes oder nasses orales Ergänzungsmittel, eine trockene oder nasse Schlauchernährung, kann unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden, während die Mikroorganismen und/oder ein wahlweise aufkonzentrierter Kulturüberstand davon in dem Träger beinhaltet ist. Abhängig von der Art und Weise der Verabreichung wird der Fachmann die als geeignet angesehene Formulierung auswählen.
In den Figuren,
zeigt 1 eine Adhäsion des Portland-1 Stammes an Caco-2 Zellen, wenn 10⁵ Trophozoiten/cm² zugegeben werden;
zeigt 2 die Ergebnisse von Adhäsionstests, die mit undifferenzierten HT-29 Zellen ausgeführt wurden;
zeigt 3 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des an differenzierte Caco-2 Zellen anheftenden Stammes UNO;
zeigt 4 die durch Giardia intestinalis hervorgerufene Mikrozottenschädigung an dem Epithelzellbürstensaum;
zeigt 5A die Ergebnisse einer Koinkubation von Giardia, Milchsäurebakterien und Caco-2 Zellen;
zeigt 5B die Ergebnisse einer Vor-Inkubation von einschichtigen Caco-2 Zellrasen mit Milchsäurebakterten;
zeigt 6A die Ergebnisse eines Adhäsionsexperiments, wobei Portland-1 und WB mit einem neutralisierenden Überstand der erfindungsgemäßen Milchsäurebakterien in Kontakt gebracht wurden;
zeigt 6B die Ergebnisse eines Adhäsionsexperiments, wobei WB und CIDCA mit einem neutralisierenden Überstand der erfindungsgemäßen Milchsäurebakterten in Kontakt gebracht wurden;
zeigt 7A die Ergebnisse, die durch Inkubation des Stammes WB mit sauren Überständen (pH 4) (DMEM: Überstand = 1:1) während 1 Std. erhalten wurden;
zeigt 7B, dass Neutralisation des Überstandes (pH 7) die hemmende Wirkung aufhebt;
zeigt 8A die Ergebnisse, die durch Inkubation des Stammes WB mit den auf verschiedene pH-Werte eingestellten Überständen des Stammes La10, erhalten wurden;
zeigt die 8B die Ergebnisse eines Verdünnens der sauren Überstände mit MRS;
zeigt 9 eine durchflusszytometrische Analyse von Suspensionen des Stammes WB1, die während 1 Std. bei 37°C mit auf pH 5 angesäuertem MRS (DMEM: MRS = 1:1) inkubiert wurden;
zeigt 10 die Ergebnisse einer Inokulation von Parasiten, die bei pH 4 oder 7 in TYI-S-33 Medium mit 100 μCi ³H-Adenin vorinkubiert wurden.
Während der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, gingen die Erfinder von der Annahme aus, dass ein ökologischer Ansatz in der Behandlung und/oder Verhinderung einer Giardiasis eine Kolonisierung des Darms mit Bakterien bestehen könnte, die dem Parasiten entgegenwirken können.
Die Anheftung von Giardia intestinalis Trophozoiten an Epithelzellen wird als ein Hauptschritt für die Infektion in Menschen und Tieren betrachtet. Obwohl die Mechanismen für eine Anheftung von Giardia nicht vollständig verstanden sind, stützen Hinweise, dass die ventrale Scheibe, die kontraktilen Elemente des Trophozoiten, hydrodynamische und mechanische Kräfte und eine Lectin vermittelte Bindung beteiligt sind.
Unter Berücksichtigung, dass Milchsäure ein wichtiger Faktor im Lebenszyklus von Giardia darstellt, wurde die Wechselwirkung zwischen Giardia intestinalis und Milchsäurebakterien, unter Verwendung von Darmepithelzell bzw. Enterozyten ähnlichen Zellen in Kultur, untersucht.
Zu diesem Zweck wurden die folgenden Parasitenstämme und Kulturmedien verwendet:
Mikrobielle Stämme:
Die Bakterienstämme Lal (Lactobacillus johnsonii) (I-1225) und La10 (Lactobacillus acidophilus) (I-2332) stammten aus der Nestec-Sammlung (Lausanne, Schweiz). Die Stämme CIDCA 536 (Bifidobakterium bifidum) und CIDCA 538 (Bifidobakterium infantis) stammten aus der Sammlung des Centro de Investigacion y Desarollo en Critecnologia de Alimentos (Universidad Natinal de La Plata, Argentina) und wurden gemäß des Budapester Vertrags hinterlegt, wodurch sie die Hinterlegungsnr. I-2333 beziehungsweise I-2334 erhielten.
Die Giardia intestinalis Stämme Portland-1 (ATCC 30888), UNO/04/87/1 (ATCC 50184), New Orleans-1 (ATCC 50137) und WB (ATCC 30957) wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, USA) erworben.
Die Bakterien wurden für 24 Stunden bei 37°C in MRS-Brühe, ergänzt mit 0,05% Cysteinhydrochlorid (Sigma) gezüchtet. Die Inkubationen wurden unter anaeroben Bedingungen (BBL GasPak Plus) ausgeführt.
Protozoen wurden in Keisters' modifiziertem Medium gezüchtet, welches beinhaltet (pro Liter): Caseinverdau (Difco), 20 g, Hefeextrakt (BBL), 10 g; Dextrose (Merck), 10 g; Rindergallenflüssigkeit (Difco), 0,75 g; NaCl (Merck), 2 g; L-Cystein HCl (Sigma), 2 g; Natriumsalz der Ascorbinsäure (Fluka), 0,2 g; K₂HPO₄ (Merck), 1 g; KH₂PO₄ (Merck), 0,6 g; Eisenammoiumcitrat (Sigma), 22,8 mg; adultes Rinderserum (Sigma), 100 mg; Penicillin/Streptomycin (Gibco, 1000 IE/ml, 1000 μg/ml), 15 ml. Pferdeserum wurde anstelle von Rinderserum ebenfalls getestet. Der pH-Wert wurde vor Filtersterilisation (0,22 um Porengröße) mit 1 N NaOH auf pH 6.9 eingestellt. Keisters' modifiziertes Medium, das mit 10% Pferdeserum ergänzt wurde, förderte das Wachstum des Stammes Portland-1 nicht, obwohl die Inkubation auf 11 Tage ausgedehnt wurde und trotz der Tatsache, dass Trophozoiten anfänglich an der Gefäßwand hafteten. Während der ersten 5 Tage der Inkubation konnte ein hoher Anteil beweglicher Parasiten beobachtet werden. Nach dieser Zeit konnte eine Agglutination der Trophozoiten und eine deutliche Abnahme lebender Zellen beobachtet werden. Eine Zugabe von Rinderserum (10 %) zu diesen geschädigten Zellen gestattete ein Züchten nach 24 Std. Um die für Giardia verfügbare Oberfläche zur Anheftung zu erhöhen, wurden 25 cm² Gewebekulturflächen verwendet (Kunststoffflaschen). Das Kulturmedium wurde bis zu dem Flaschehals zugegeben, um anaerobe Bedingungen beizubehalten. Dieses Vorgehen führte zu Ausbeuten von ungefähr 10⁷ Trophozoiten/Flasche innerhalb von 2–3 Inkubationstagen, wobei die Parasiten einen konfluenten einschichtigen Zellrasen auf den Flaschenwänden bildeten.
Subkulturen wurden hergestellt, in dem die Kulturen in einem Eisbad (5–10 Min.) abgekühlt wurden, um anhaftende Trophozoiten abzulösen und frisches Medium mit 0,2 ml der sich ergebenden Suspension zu beimpfen. Inkubationen wurden bei 37°C für 72 Stunden ausgeführt und unterschiedliche Empfänger (Glas oder Kunststoff) wurden verwendet.
Lagerung von Giardia intestinalis Stämmen:
Die Trophozoiten wurden wie vorstehend angegeben abgelöst und in TYI-S-33 Medium suspendiert. Zweifach konzentrierte in TYI-S-33 Medium hergestellte Frostschutzmittellösung (DMSO, Sucrose) wurde zu der Suspension in drei gleichen Aliquots in 2 Minutenintervallen zugegeben. Die Endkonzentrationen der Frostschutzmittel betrugen 12 % (V/V) DMSO, 4 % (W/V) Sucrose. Den Suspensionen (ungefähr 1 × 10⁶ Trophozoiten/ml) wurde vor dem Beginn des Kühlzyklus gestattet sich während 20 Minuten bei Raumtemperatur zu äquilibrieren.
Die Ampullen wurden mit Polystyren (4 cm Wandstärke) thermisch isoliert und bei –80°C gelagert.
Reaktivierung gefrorener Trophozoiten:
Die Ampullen wurden in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut und unmittelbar in TYI-S-33 Medium in einem Verhältnis von Parasitensuspension/frischem Medium = 0,5/7 inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37°C im Dunkeln inkubiert.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch Beispiele erläutert werden.
Als Modell für Darmzellen wurden die Zelllinien Caco-2 und HT29 verwendet. Eine Adhäsion an die Darmepithelzellen ähnlichen Zellen wurde wie nachfolgend beschrieben getestet:
Beispiel 1: Radioaktives Markieren von Trophozoiten
Die Parasiten wurden in TYI-S-33 inokuliert und 2,6 bis 7,1 μCi/ml von entweder 2-³H-Adenin 21 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Life Science) oder Methyl-3H Thymidin (2 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Life Science) wurden zugegeben. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 48–72 Std. ausgeführt.
Das Züchten der Trophozoiten mit 7,1 μCi/ml von entweder ³H-Adenin oder ³H-Thymidin ergab sehr unterschiedliche DPM/Parasit Verhältnisse (Tabelle 1). Obwohl die Thymidinkonzentration verglichen zu der von Adenin 10-fach höher war, war der Einbau mit dem Ergebnis, dass 0,08 beziehungsweise 2,8 DPM/Parasit erhalten wurden, sehr gering.
Tabelle 1 Einbau von ³H durch den Giardia Stamm Portland-1 bei Zugabe von 7 μCi/ml radioaktiv markierter Basen
Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse des Adenineinbaus durch die Stämme von Giardia intestinalis. Eine geeignete radioaktive Markierung wurde unter Verwendung so geringer Adeninkonzentrationen wie 2,5 μCi/ml erhalten. Unter diesen Bedingungen reichte das DPM/Parasit Verhältnis von 0,3 für den Stamm Portland-1 bis zu 1,6 für den Stamm UNO.
Tabelle 2 Einbau von 2 3H-Adenin durch verschiedene Stämme von Giardia. Die Ergebnisse sind die Durchschnittswerte von mindestens zwei Besti
Beispiel 2: Zellkultivierung
Caco-2 Zellen wurden in DMEM, das mit nicht essentiellen Aminosäuren, Penicillin (12 IE/ml), Streptomycin (12 IE/ml), Gentamycin (47 μg/ml) und inaktiviertem fötalem Kälberserum (20 % v/v) ergänzt wurde, gezüchtet. Einschichtige Zellrasen wurden in 6-Loch Gewebekulturplatten hergestellt, in dem 2 × 10⁵ Zellen pro Loch bzw. Vertiefung ausgesät wurden. Die Inkubationen erfolgten bei 37°C in einer 10 % CO₂ Luftatmosphäre. Das Kulturmedium wurde jeden 2. Tag gewechselt. Die Adhäsionstests wurden mit Zellen zwischen Passage 49 und 51 ausgeführt und lediglich einschichtige Zellrasen in einem späten post-konfluenten Stadium wurden verwendet (mindestens zwei Wochen in Kultur).
Die undifferenzierten HT-29 Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden in DMEM gezüchtet, das 4,5 g/l Glucose (Seromed, Biochrom KG, Berlin, Germany) beinhaltete, ergänzt mit Glutamax 1 (0,01 % v/v; L-Alanyl-LGlutamin 200 mM, Gibco, Basel, Switzerland), Gentamycin (0,57 mg/ml, Gibco, Basel, Switzerland) und fötales Kälberserum (10 % v/v, Gibco, Basel, Switzerland). Die Zellen wurden bei Passage 52 verwendet.
Beispiel 3: Adhäsionstests
Wurden konfluente einschichtige Zellrasen von Trophozoiten erhalten, dann wurde das Kulturmedium abgekippt, damit alle nicht an der Oberfläche haftenden Parasiten beseitigt werden. Anhaftende Parasiten wurden wie beschrieben geerntet und mit DMEM (Gibco), enthaltend 11,4 mM Cystein HCl, 3-mal, gewaschen. Verdünnungen (1:2) von Parasiten in Paraformaldehyd 1 % wurden in einem Hämocytometer gezählt.
Radioaktiv markierte Trophozoiten, die in DMEM-CYS (DMEM + 11,4 mM Cystein HCl) suspendiert wurden, wurden zu einschichtigen Zellrasen von Caco-2 Zellen zugegeben und für 1 Std. bei 37°C in einer 5 % CO₂/95 % Luftatmosphäre inkubiert. Die einschichtigen Zellrasen wurden anschließend mit DMEM-CYS bei 37°C 3-mal gewaschen, um nicht gebundene Trophozoiten abzulösen.
Nach dem Waschen wurde 1 ml einer 1 N NaOH pro Loch zugegeben und die Platten wurden während 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Zelllysate wurden in Szintillationsröhrchen überführt und ein weiterer Waschschritt der Löcher wurde mit PBS ausgeführt. Die Radioaktivität wurde mit einem β-Zähler (RackBeta Spectral, LKB, Wallac) erfasst.
Beispiel 4: Vorinkubationstests
Die Bakterienkulturen wurden 3-mal mit PBS gewaschen. Die Suspensionen, die auf 1 × 10⁸ CFU/ml in DMEM eingestellt waren, wurden zu den einschichtigen Caco-2 Zellrasen gegeben und die Platten wurden für 1 Std. bei 37°C inkubiert. Nach der Adhäsion der Bakteriensuspensionen, wurden radioaktiv markierte Trophozoiten, die auf 1 × 10⁵ Parasiten/ml eingestellt waren, zugegeben. Die Adhäsionstests wurden wie vorstehend angegeben ausgeführt.
Beispiel 5: Koinkubationstests
Aliquots von 1 ml der Parasitensuspensionen, die 1 × 10⁵ radioaktiv markierte Giardia pro ml beinhalteten, wurden mit 1 ml von Bakteriensuspensionen (1 × 10⁸ CFU/ml) in 6-Lochgewebekulturplatten, die einschichtige Caco-2 Zellrasen aufwiesen, vermischt. Die Adhäsionstests wurden, wie vorstehend aufgeführt, durchgeführt.
Beispiel 6: Wirkung von Überständen von Milchsäurebakterien auf die Adhäsion von Giardia intestinalis
Kulturen von Milchsäurebakterien wurden bei 900 g für 15 Min. zentrifugiert und die Überstände wurden mit 4 N NaOH neutralisiert (pH 6.9 – 7.4). Eine Suspension von 1 ml, die 10⁵ radioaktiv markierte Trophozoiten/ml in DMEM-CYS beinhaltet, wurde mit 1 ml neutralisierten Überstandes in 6-Lochgewebekulturplatten, die einschichtige Caco-2 Zellrasen aufweisen, vermischt. Die Adhäsionstests wurden, wie vorstehend angegeben, durchgeführt. Geeignete Kontrollen mit MRS oder mit Milchsäure auf pH 4.5 angesäuertem MRS und anschließendem Neutralisieren auf pH 7 wurden in die Tests aufgenommen.
Vorinkubationstests wurden durch Inkubieren von Parasitensuspensionen (DMEM-CYS) mit einem gleichen Volumen eines Überstandes für 1 Std. bei 37°C ausgeführt. In einer anderen Reihe von Experimenten, wurden die Parasiten in reinen Überständen oder mit MRS verdünnten Überständen suspendiert. Nach Inkubation wurden die Giardia in DMEM suspendiert und Caco-2 Zellen zugegeben.
Eine Beurteilung des Wachstums wurde durch Inkubieren der Parasiten in TYI-S-33 Medium mit 100 μCi ³H-Adenin in einer 40 ml Kultur durchgeführt. Eine durchflusscytometerische Analyse wurde unter Verwendung eines Blau-Grün-Enegungslichts (FACScan^TM) durchgeführt.
Beispiel 7: Rasterelektronenmikroskopie
Caco-2 Zellen wurden auf runden Objektträgern aus Glas (Durchmesser, 10 mm) in 24-Lochgewebekulturplatten gezüchtet und eine Adhäsion von Trophozoiten wurde wie angegeben ausgeführt. Die Proben wurden durch die Zugabe von 2,5 % Glutaraldehyd in PBS für 16 Std. bei 4°C fixiert. Eine Nachfixierung wurde mit 2 % Osmiumtetroxid bei Raumtemperatur für 2 Std. ausgeführt und anschließend wurden Ausstriche in einer abgestuften Reihe von Ethanollösungen (Lösungen von Ethanol in Wasser von 30, 50, 70, 90, 100 %) dehydriert. Schließlich wurden die Proben unter Verwendung von CO₂ einer kritischen Punkttrocknung unterzogen, mit Gold beschichtet und unter Verwendung eines Philips SEM 505 bei einer Beschleunigungsspannung von 30 KV untersucht.
Beispiel 8: Adhäsion von Giardia intestinalis Trophozoiten an Caco-2 Zellen
Einer Caco-2 Kultur, die wie in Beispiel 2 ausgeführt, hergestellt wurde, wurden insgesamt 10⁵ Trophozoiten zugegeben. Die Ergebnisse des Adhäsionstests sind in 1 gezeigt. Trotz des Alters der einschichtigen Zellrasen wurden Adhäsionen von ungefähr 5 % beobachtet. Eine Anheftung an die Kunststoffoberflächen war sehr hoch (21,8 ± 2,4 %).
Die Ergebnisse, der mit den undifferenzierten HT-29 Zellen ausgeführten Adhäsionstests, sind in 2 gezeigt. Es wurden Werte von 7,0 ± 1,2 % und 5,5 ± 0,6 % für die Stämme Portland-1 beziehungsweise WB erhalten.
Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des an die differenzierten Caco-2 Zellen haftenden Stamms UNO ist in 3 gezeigt. Die meisten Giardia Trophozoiten befinden sich mit der ventralen Seite an den einschichtigen Zellrasen angeheftet. Einige Parasiten wurden ebenfalls beobachtet, dass sie mit ihren dorsalen Oberflächen den Caco-2 Zellen gegenüberliegen (Pfeil). Wie aus der 4 klar abgeleitet werden kann, erzeugt die Anheftung der Trophozoiten einen Abdruck an dem Bürstensaum der den Enterozyten ähnlichen Zellen.
Koinkubation von Giardia, Milchsäurebakterien und Caco-2 Zellen führte zu keiner Änderung der Anheftung (5A). Weiterhin störte die Vorinkubation von einschichtigen Caco-2 Zellrasen mit Milchsäurebakterien nicht die Parasitenadhäsion (5B).
Beispiel 9: Einfluss der Überstände von Milchsäurebakterienkulturen auf die Adhäsion von Giardia intestinalis an Caco-2 Zellen
Koinkubation der Stämme Portland-1 und WB mit neutralisierten Überständen der erfindungsgemäß zu verwendenden Milchsäurebakterien, erzeugte eine Verringerung einer Adhäsion an Caco-2 Zellen, die von 19 % (Lal Stamm) bis 40 % (La10 Stamm) für den Portland-1 Stamm (6A) reichte. Für den Stamm WB reichten die Werte von 20 % für den Stamm CIDCA 536 bis 40 % für den Stamm La10 (6B). Obwohl Unterschiede zwischen den Stämmen nicht ermittelt werden konnten, zeigte La10 verglichen mit der MRS-Kontrolle sowohl für den Portland-1 (p=0,06) als auch den WB Stamm (P=0,04) signifikante Unterschiede.
Unter Berücksichtigung, dass der für die Caco-2 Zellen verträgliche pH-Bereich bei den Koinkubationsexperimenten eng bzw. gering ist, wurden Tests durchgeführt, in denen Parasiten vor den Adhäsionstests mit Überständen vorinkubiert und anschließend in DMEM-CYS resuspendiert wurden. Die Inkubation des Stamms WB mit sauren Überständen (pH-Wert 4) (DMEM: Überstand = 1:1) während 1 Std., erzeugte eine Verringerung der Adhäsion von 15 % für MRS bis ungefähr 3 % für alle untersuchten Stämme (7A). Die Neutralisation von Überständen (pH-Wert 7) beseitigte die hemmende Wirkung und ein Anstieg bei der Adhäsion wurde festgestellt (7B).
Die Ergebnisse, die durch Inkubieren des WB Stamms mit den auf verschiedene pH-Werte eingestellten Überständen des La10 Stamms erhaltenen wurden, sind in 8A gezeigt. Es wurden keine Unterschiede verglichen mit der MRS-Kontrolle bei einem pH-Wert 4 und 5 festgestellt, wobei jedoch eine bei einem pH-Wert von 6 und 7 eine erhöhte Adhäsion festgestellt wurde.
Verdünnen von saueren Überständen mit MRS erzeugte einen Anstieg im pH-Wert und die Adhäsion war bei 1/8 verdünnten Überständen (relative Konzentration 0,125, pH-Wert 4.07, 8B) verringert.
Die durchflusszytometrische Analyse von Suspensionen des Stamms WB 1, die für 1 Std. bei 37°C mit auf pH 5 angesäuertem MRS (DMEM:MRS= 1:1) inkubiert wurden, zeigte Unterschiede in der Größe (FCS) und der zytoplasmatischen Komplexität (SSC) (9). Inokulation von Parasiten, die bei einem pH-Wert von 4 oder 7 in TYI-S-33 Medium mit 100 μCi ³H-Adenin vorinkubiert wurden, zeigte Unterschiede beim Einbau (10). Ein niedriger Einbau von Adenin wurde bei pH 4 nach 28 Std. Inkubation sowohl in Proben von MRS als auch Überständen festgestellt. Obwohl einige Parasiten an den Flaschenwänden angeheftet waren, waren sie nicht beweglich. MRS-Brühe, die auf einen pH-Wert von 5 angesäuert und neutralisiert ist, zeigte DPM-Werte, die weniger als 20 % der Kontrolle darstellen. Für neutralisierte Überstände des La10 Stamms lagen die Werte ungefähr bei 80 % der Kontrolle und Unterschiede waren bei einem Grad bzw. Wert von 0,09 signifikant. Große Aggregate von Parasiten wurden bei einem pH-Wert von 7 sowohl in MRS als auch im Überständen festgestellt.
Die Ergebnisse für eine Giardia-Adhäsion an verschiedene Zelllinien (1 und 2) weisen darauf hin, dass eine nicht spezifische Anheftung ein wichtiges Merkmal dieses Systems zu sein scheint, da keine signifikanten Unterschiede zwischen differenzierten Zellen (Caco-2 mit unterschiedlichen Kulturzeiten) und undifferenzierten Zellen (HT-29) festgestellt wurden. Weiterhin war die Adhäsion an Kunststoffoberflächen sehr hoch. Die Adhäsion von Trophozoiten an einschichtige Caco-2 Zellrasen erzeugte offensichtlich eine Mikrozottenschädigung (4).
Experimente eines Ausschlusses von Parasiten durch einen Waschschritt nach der Bakterienadhäsion, führte zu einer Schädigung des einschichtigen Zellrasens, was zu Ausschlusswerten führte, die nicht authentisch schienen. Der Schädigungsgrad, der von der Waschlösung abhing, reichte von einem Auslöschen der Mikrozotten mit DMEM-CYS (Rasterelektronenmikroskopie) bis zur Zellablösung mit PBS. Unter Berücksichtigung der vorstehenden Ergebnisse, wurden Tests ausgeführt, wobei einschichtige Zellrasen mit in DMEM-CYS suspendierten Bakterien vorinkubiert wurden, jedoch ohne einen Waschschritt vor der Zugabe der Parasiten. Eine andere Serie von Experimenten wurde durch Vorinkubieren der Parasiten und Bakterien mit Caco-2 Zellen ausgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse (5) sind mit einem "aktiven" Anheften der Trophozoiten vereinbar, das durch eine Flagellenmotilität und kontraktile Elemente vermittelt wird. Milchsäurebakterien, die nicht beweglich sind, könnten nicht mit den Parasiten um eine Anheftung wetteifern bzw. konkunieren.
Hinsichtlich der Wirkung der Überstände der Milchsäurebakterienkulturen konnte gezeigt werden, dass sie die Giardia-Adhäsion hemmen. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass diese Hemmwirkung hauptsächlich bestimmten durch die Milchsäurebakterien sezernierten organischen Säuren zugeschrieben werden kann.
Eine Vorinkubation von Parasiten mit durch Milchsäure angesäuertem MRS, führte zu drastischen Änderungen in der Zellgröße und der zytoplasmatischen Komplexität und verringerte die Adhäsion an Caco-2 Zellen, sowohl bei Überständen als auch MRS-Kontrollen. Unter diesen Bedingungen war, wie in Experimenten, in denen behandelte Parasiten in frisches TYI-S-33 inokuliert werden, gezeigt, die Lebensfähigkeit der Parasiten stark beeinflusst.
Nach einem Kontakt mit Lactat bei einem pH-Wert von 4 wurde das Wachstum der Parasiten im Wesentlichen gestoppt, obwohl sich einige Parasiten an den Flaschenwänden anheften konnten. Unter diesen Bedingungen schien, dass Milchsäure für Giardia letal ist. Bei einem pH-Wert von 7 ist die Hemmwirkung von Lactat immer noch vorhanden, und Unterschiede zwischen angesäuertem MRS und einem Überstand von La10 könnten dadurch erklärt werden, dass die Unterschiede in der Lactatkonzentration aufgrund von Unterschieden in der Pufferkapazität zwischen frischem MRS und verbrauchten Überständen, angenommen werden.
Die Aggregate von Giardia wurden während der Vorinkubation der Parasiten mit Überständen gebildet und sie könnten zu den hohen Werten einer bei pH-Werten von 6 und 7 (8) festgestellten Adhäsion beitragen. Wie vorstehend ausgeführt, erfordern die hauptsächlichen Mechanismen für eine Adhäsion von Giardia eine Lebensfähigkeit des Parasiten, obwohl eine Adhäsion von toten Protozoen nach Behandlung von Trophozoiten mit Überständen bei einem pH-Wert von 4 gezeigt werden konnte. Diese Parasiten waren nicht fähig sich zu teilen und werden somit keine wirksame Parasitose hervorrufen können. Weiterhin hemmten neutralisierte Überstände von Kulturen von Milchsäurebakterien das Wachstum von Giardia und erzeugten zur Anheftung unfähige Aggregate.
In Hinblick auf die vorstehenden experimentellen Ergebnisse wird klar, dass die erfindungsgemäß zu verwendenden Milchsäurebakterien zur Behandlung oder Prophylaxe einer Giardiasis erfolgreich eingesetzt werden können.

Claims

Verwendung eines Kulturüberstandes eines Milchsäurebakteriums oder eines Bifidobakteriums, das die Fähigkeit aufweist, eine Adhäsion von Giardia intestinalis an Intestinalzellen zu verhindern, zur Herstellung eines einnehmbaren Trägers für die Behandlung und/oder Prophylaxe von mit der Kolonisierung des Darms durch Giardia intestinalis assoziierten Störungen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der einnehmbare Träger eine Lebensmittelzusammensetzung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Lebensmittelzusammensetzung unter Milch, Joghurt, Quark, Käse, fermentierter Milch, fermentieren Produkten auf Milch-Basis, Eiscremes, fermentierten Produkten auf Getreide-Basis, Pulvern auf Milch-Basis, Formulierungen für Kinder oder Tierfutter ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Tablette, einer flüssigen Bakteriensuspension, eines getrockneten oralen Ergänzungsmittels, eines nassen oralen Ergänzungsmittels, einer trockenen Schlauchernährung oder einer nassen Schlauchernährung ist.
Milchsäurebakterium oder Bifidobakterium, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NCC 189 (I-2333), NCC 200 (I-2334).
Lebensmittelzusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung, welche enthält, einen Kulturüberstand eines Milchsäurebakteriums, das die Fähigkeit aufweist, eine Adhäsion von Giardia intestinalis an Intestinalzellen zu verhindern, für die Behandlung und/oder Prophylaxe von mit der Kolonisierung des Darms durch Giardia intestinalis assoziierten Störungen.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, welche Milch, Joghurt, Quark, Käse, fermentierte Milch, fermentierte Produkte auf Milch-Basis, Eiscremes, fermentierte Produkten auf Getreide-Basis, Pulver auf Milch-Basis, Formulierungen für Kinder oder Tierfutter ist oder in Form einer Tablette, einer flüssigen Bakteriensuspension, eines getrockneten oralen Ergänzungsmittels, eines nassen oralen Ergänzungsmittels, einer trockenen Schlauchernährung oder einer nassen Schlauchernährung ist.