ES2239622T3

ES2239622T3 - Bacterias del acido lactico para el tratamiento y/o profilaxis de giardiasis.

Info

Publication number: ES2239622T3
Application number: ES00971377T
Authority: ES
Inventors: Eduardo Schiffrin; Pablo Perez
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2005-10-01
Anticipated expiration: 2020-10-13
Also published as: AR026248A1; CN1281220C; DK1227827T3; OA12074A; AP2002002483A0; DE60018591D1; AP1563A; CO5280049A1; ATE290393T1; DE60018591T2; WO2001030365A1; US6905679B1; AU1025001A; CA2388952A1; CA2388952C; BR0015102B1; CN1382056A; US20050186191A1; BR0015102A; EP1227827B1

Abstract

Uso de un cultivo de supernadante, de una bacteria del ácido láctico, o una bifidobacteria, capaces de prevenir la adhesión de la Giardia intestinalis a las células intestinales, para la preparación de un vehículo o portador ingerible, para el tratamiento y / o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino, con Giardia Intestinalis.

Description

Bacterias del ácido láctico para el tratamiento y/o profilaxis de giardiasis.

La presente invención, se refiere al cultivo de sobrenadantes de bacterias del ácido láctico, capaces de prevenir la colonización de células intestinales mediante Giardia intestinalis, para su uso en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino mediante Giardia intestinalis. La presente invención, pertenece también a cepas de Bifidobacterium que tienen los rasgos anteriormente mencionados arriba, y al uso de bacterias del ácido láctico para la preparación de un portador o vehículo ingerible, tal como una composición alimenticia o farmacéutica, para el tratamiento y/o profilaxis de una infestación del intestino mediante Giardia intestinalis.

La Giardia intestinalis, es un protozoo, el cual, después de la infestación del intestino de un individuo, puede efectuar trastornos tales como dolores, heces sueltas, o incluso diarrea grave. Su ciclo de vida, tiene dos etapas, quistes y trofozoitos, cuyas diferentes formas, permiten sobrevivir a los microorganismos en diferentes e incluso adversos entornos o ambientes.

Los quistes, son formas durmientes, cuatrinucleadas y ovoides, responsables para la transmisión de giardiasis. Después de la ingestión de los quistes, por parte de un individuo, la exquistación, se desencadena mediante la exposición, al ácido gástrico y/o enzimas digestivas. El parásito que emerge de esta forma, al cual se le denomina trofozoito, es binucleado y de una forma de media pera, el cual tiene una medida de aproximadamente 10 \mum, con un amplio lado anterior y un estrecho lado posterior. El lado ventral, se encuentra ampliamente cubierto mediante el disco ventral, el cual, se considera importante, por lo menos en parte, para una unión del trofozoito, a la superficie del intestino.

Después de la exquistación, los trofozoitos, pueden persistir en el intestino pequeño del individuo infectado, durante un largo transcurso de tiempo, que puede ser incluso de años. Si los trofozoitos son arrastrados corriente abajo, mediante el flujo del fluido intestinal, éstos empiezan a enquistarse, para adaptarse al nuevo entorno o ambiente.

Los quistes, se excretan con las heces, y pueden resistir una variedad de condiciones del entorno ambiental, incluyendo las correspondientes a diferentes temperaturas, pH y condiciones de tonicidad. Un individuo infectado, puede secretar aproximadamente 9 x 10^{9} quistes por día, siendo suficientes, unas dosis correspondientes a 10 quistes, para producir la infección de otro individuo. La trasmisión de Giardia intestinalis, puede lograrse en una variedad de diferentes vías, siendo las principales rutas de transmisión, la del agua y la de los alimentos. La propagación persona a persona, se apoya mediante algunos cuidados diarios, y brotes o erupciones nosocomiales. Adicionalmente, se encuentra que, los animales salvajes, son depósitos infecciosos de Giardia intestinalis, y pueden contribuir a una propagación del patógeno.

La giardiasis, como otras enfermedades intestinales, es más grave en los bebés y los niños. La infección, se encuentra normalmente asociada con la diarrea y malabsorciones, que tienen como resultado un crecimiento y desarrollo perjudicial del niño, y puede eventualmente también conducir a la muerte de recién nacidos.

Aproximadamente la mitad de las personas infectadas, son no obstante asintomáticas, y contribuyen a la propagación de los patógenos, puesto que, debido a la ausencia de cualesquiera síntomas perceptibles, no se aplica un régimen correspondiente.

A pesar del hecho de que se ha realizado un gran esfuerzo científico en la investigación de la Giardia intestinalis, la patogénesis de la giardiasis, no ha podido explicarse por medio de un factor de virulencia individual solo y, hasta ahora, no se ha aislado ningún compuesto tóxico.

Se ha encontrado que, la apariencia a la luz de un microscopio, de un intestino colonizado por Giardia, es más bien variable, correspondiendo a una gama comprendida dentro de unos márgenes que van desde una estructura de mucosa normal hasta una atrofia vellosa subtotal. Los resultados de las investigaciones de microscopia electrónica, revelaron cambios ultraestructurales, tales como el acortamiento y la disrupción de microvellosidades (Chávez et al. Experimental Parasitol. 80 (1995), 133 - 138).

Se ha encontrado que, tales tipos de anormalidades estructurales, van acompañadas de una reducción de las actividades en lactasa, sucrasa y maltaza, en la membrana microvellosa, así como también un transporte intestinal perjudicado (Buret et al., Gastroenterology 103 (1992), 506 - 513; Roberts - Thomson et al., Gastroenterology, 71 (1976),
57 - 61).

Adicionalmente a las dos formas ilustradas anteriormente, arriba, la Giardia intestinalis, ha desarrollado una estructura de superficie cambiante, y ha involucrado una familia de proteínas protectoras, las cuales cubren todas las superficies expuestas (Aley et al., Infect. Agents Dis. 4 (1995), 161 - 166; Müller, et al., Infect. Immun. 64 (1996), 1385 - 1390; Nash et al., J. Euk. Microbiol. 42 (1995), 604 - 609). Estas proteínas de superficie variable (VSp), protegen a los trofozoitos de ambos factores, factores inmunológicos y factores del entorno ambiental, de tal forma que, la Giardia, puede evadir las defensas del huésped y puede sobrevivir en un entorno ambiental, de tal forma que, ésta, prevalece en el tracto intestinal de los mamíferos. A aproximadamente cada 16ª a 13ª generación, acontece una modificación en los VSPs, convirtiéndose en dificultoso o casi imposible, para el sistema inmune del huésped, el desarrollar una respuesta específica contra el patógeno. El estrés inmune y del entorno ambiental, puede seleccionar diferentes fenotipos de VSP. Además, se ha reportado, también, un cambio del antígeno de los VSPs, después de la exquistación (Gillin et al., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996), 679 - 705).

La giardiasis humana, se encuentra asociada con un incremento en el número de lámina propia y linfocitos intraepiteliales, sugiriendo el hecho de que, la activación de las células T, podría ser responsable para el dañado de la microvellosidad. No obstante, la inmunodepresión inducida en ratones, dio como resultado un efecto más profundo en las enzimas asociadas con la microvellosidad, según se compara con los animales no inmunosupresivados, indicando, de esta forma, el hecho de que, durante una infección mediante Giardia intestinalis, el daño epitelial, parece no ser dependientes de la función inmune únicamente.

Una terapia común de la giardiasis, es la administración de antibióticos, tales como aquéllos que pertenecen a la clase de nitroimidazoles. No obstante, en las áreas endémicas, se ha mostrado que, la respuesta a la terapia, es más bien inconsistente (Katelaris et al., Aliment. Pharmacol. Ther. 8 (1994), 187 - 192). Además, debido a la destrucción, por lo menos en parte, de la microflora natural del intestino, la administración de tales tipos de antibióticos, viene siempre acompañada por efectos laterales graves, tales como una diarrea extendida o incluso una infestación extendida del intestino, mediante otros microorganismos perjudiciales, tales como las levaduras.

Así, de esta forma, existe una necesidad, en el arte correspondiente a la técnica especializada, en cuanto a disponer de opciones adicionales para tratar la giardiasis, o de medios para prevenir la infestación de un individuo mediante el patógeno.

El problema de la presente invención, por lo tanto, reside en proponer medios adicionales para el tratamiento o profilaxis de una infección, mediante Giardia intestinalis.

Este problema, se ha resuelto procediendo a proporcionar el uso de un cultivo de supernadante, de una bacteria del ácido láctico, o una bifidobacteria, capaces de prevenir la adhesión de la Giardia intestinalis a las células intestinales, para la preparación de un vehículo o portador ingerible, para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino, con Giardia Intestinalis.

Según una forma preferida de presentación de la presente invención, ésta proporciona nuevas bacterias del ácido láctico y bifidobacterias, respectivamente, capaces de prevenir la adhesión de Giardia intestinalis a las células intestinales, las cuales se seleccionan de entre el grupo consistente en NCC 189 (I-2333) ó NCC 200 (I-2334). Estos microorganismos, han sido depositados en concordancia con el Tratado de Budapest, con el Instituto Pasteur, en fecha 30 de Noviembre de 1999, y recibieron los números de depósito anteriormente mencionados, arriba. La presente invención, pertenece también a composiciones alimenticias y farmacéuticas, que contienen tales tipos de micro-
organismos.

Los microorganismos, pueden incluirse en el vehículo o portador, en una cantidad comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 10^{6} hasta aproximadamente 10^{12}pfu (unidades de formación en placa). Éstos pueden incluirse tal cuales, o de una forma opcional, después de purificarlos especialmente, a partir del medio de cultivo. De una forma alternativa, en el vehículo o portador, puede incluirse el sobrenadante de un cultivo de tales microorganismos, los cuales, previamente a su inclusión, pueden concentrarse, de una forma preferible, mediante medios que son bien conocidos en el arte de esta técnica especializada.

El soporte o vehículo ingerible, puede ser una composición alimenticia o una composición farmacéutica, tales como leche, yogur, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, cremas heladas (helados), productos a base de cereales fermentados, materias en forma de polvo a base de leche, fórmulas para bebés, o alimentos para animales de compañía, de cualquier tipo. Tales tipos de portadores o vehículos, pueden fabricarse de una forma sencilla, por ejemplo, utilizando microorganismos que tengan los rasgos correspondientes para la fermentación, de los materiales de partida, en sí mismos. De una forma alternativa, los microorganismos, o un cultivo de subrenadante opcionalmente concentrado de éstos, pueden añadirse al respectivo portador o vehículo en forma líquida o en forma seca.

Una composición farmacéutica, tal como una tableta, una suspensión bacteriana líquida, un suplemento oral, seco o húmedo, una alimentación por tubo, seca o húmeda, pueden prepararse utilizando técnicas standard, al mismo tiempo que se incluye el microorganismo y/o un sobrenadante de cultivo, opcionalmente concentrado, de éstos, en el portador o vehículo. En dependencia del modo de administración, la persona especializada en esta arte de la técnica, seleccionará la formulación que se crea que es la apropiada.

En las figuras;

La figura 1, muestra la adhesión de la cepa Portland-1, a las células Caco-2, cuando se añadieron 10^{5} trofozoitos/
cm^{2}.

La figura 2, muestra los resultados de los ensayos de adhesión realizados con células HT-29, no diferenciadas.

La figura 3, muestra una micrografía de exploración electrónica de la cepa UNO, unida a las células diferenciadas Caco-2.

La figura 4, muestra el daño de microvellosidades en el borde en cepillo de las células epiteliales, mediante Giardia intestinalis.

La figura 5 A, muestra los resultados de coincubación de giardias, bacterias del ácido láctico, y células de Caco-2;

La figura 5 B, muestra los resultados de princubación de monocapas de Caco-2, con bacterias de ácido láctico.

La figura 6 A, muestra los resultados de un experimento de adhesión, en donde Pórtland 1 y WB, se contactan con un sobrenadante neutralizado de las bacterias de ácido láctico de la presente invención;

La figura 6 B, muestra los resultados de un experimento de adhesión, en donde WB y CIDCA, se contactaron con un sobrenadante neutralizado de las bacterias de ácido láctico de la presente invención.

La figura 7 A, muestra el resultado obtenido mediante la incubación de la cepa WB con sobrenadantes ácidos
(pH 4)(DMEM : sobrenadante= 1 : 1), durante un transcurso de tiempo de 1 hora.

La figura 7 B, muestra el hecho de que, la neutralización de sobrenadantes (pH 7) suprime el efecto inhibitorio.

La figura 8 A, muestra el resultado obtenido procediendo a incubar la cepa VB con sobrenadantes de la cepa La 10, ajustada a diferentes pH.

La figura 8B, muestra los resultados de diluir sobrenadantes ácidos con MRS.

La figura 9, muestra un análisis citométrico reducido, de suspensiones de la cepa WB 1, incubada durante un transcurso de tiempo de 1 horas, a una temperatura de 37ºC, con MRS acidificado a un pH 5 (DMEM : MRS = 1 :1).

La figura 10, muestra los resultados de una inoculación de parásitos preincubados a un pH de 4 ó 7, en medio TYI-S-33, con 100 \muCi de ^{3}H adenina.

Durante los estudios que condujeron a la presente invención, los inventores, trabajaron con la hipótesis de que, un acercamiento ecológico en el tratamiento y/o prevención de la giardiasis, podría ser una colonización del intestino, con bacterias que podían ser aptas de antagonizar con el parásito.

La unión de los tropozoitos de Giardia intestinalis, a células epiteliales, se cree que es una etapa clave para la infección en humanos y animales. Si bien los mecanismos para la Giardia adhesión no se entienden en su totalidad, la evidencia, soporta el hecho de que se encuentran involucrados el disco ventral, elementos contráctiles tropozoitos, fuerzas hidrodinámicas y mecánicas, y la unión mediatizada por lectina.

Teniendo en cuenta el hecho de que, el ácido láctico, es un importante factor en el ciclo de vida de la Giardia, la interacción entre la Giardia intestinalis y las bacterias del ácido láctico, se han estudiado, utilizando enterocitos tales como células, en el cultivo.

Con esta finalidad, se han utilizado las siguientes cepas de parásitos microbianos y medios de cultivo:

Cepas microbianas

Las cepas bacterianas LA1 (Lactobacillus johnsonii) (I-1225) y La 10 (Lactobacillus acidophilus) I-2332), eran de la colección Nestec (Lausana, Suiza). Las cepas CIDCA 536 (Bifidobacterium bifidum) y CIDCA 538 (Bifiobacterium infantis), eran de la colección del Centro de Investigación y de Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (Universidad Nacional de La Plata, Argentina), y se han depositado en concordancia con el Tratado de Budapest, en donde recibieron los números de depósito I2333 e i2334, respectivamente.

Las cepas de Giardia intestinalis Portland-1 (ATCC 30888), UNO /04/87/1 (ATCC 50184), New Orleans-1 (ATCC 50137) y WB (ATCC 30957), se compraron de procedencia de la firma American Type Culture Collection (Rockville, USA).

Las bacterias, se hicieron crecer durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 37ºC, en caldo MRS, suplementado con un 0,5% de clorhidrato de cisteína (Sigma). Se procedió a llevar a cabo incubaciones, bajo condiciones anaeróbicas (BBL GasPak Plus).

Se hicieron crecer protozoos en medio TYI-S-33, modificado según Keister, el cual contenía (por litro): digesta de caseína (Difco), 20 g; extracto de levadura (BBL), 10 g; dextrosa (Merck), 10 g; bilis bovina (Difco), 0,75 g de NaCl (Merck), 2 g; L-cisteína. HCl (Sigma), 2 g; sal sódica del ácido ascórbico (Fluka), 0,2 g; K_{2}HPO_{4} (Merck), 1 g; KH_{2}PO_{4} (Merck), 0,6 g; citrato amónico férrico (Sigma), 22,8 mg; suero bovino adulto (Sigma) 100 ml; penicilina /
estreptomicina (Gibco, 1000 IU/ml, 1000 \mug/ml), 15 ml. Se ensayó, también, suero de caballo (Gibco), en lugar de suero bovino. El valor pH, se ajustó a un valor de 6,9, con NaOH 1N, previamente a la esterilización del filtro (0,22 \mum de tamaño de poro). El medio modificado de Keister, suplementado con un 10% de suero bovino, no soportó el crecimiento de la cepa Portland-1, y a pesar del hecho de que, la incubación, se extendió durante un transcurso de tiempo de 11 días, y a pesar de que, los trofozoitos, se encontraban inicialmente unidos a las paredes del tubo. Durante los 5 primeros días de incubación, se observó una alta proporción de parásitos motiles. Después de este transcurso de tiempo, se observó una aglutinación de los trofozoitos y un dramático descenso de las células viables. La adición de suero bovino (10%), a estas células dañadas, permitió el crecimiento, después de un transcurso de tiempo de 24 horas. Para incrementar la superficie disponible para la unión de Giardia, se utilizaron 25 cm^{3} de botellas de tejido de cultivo (botellas de plástico). El medio de cultivo, se añadió hasta el cuello de botella, para mantener las condiciones anaeróbicas. Este procedimiento, dio como resultado unos rendimientos productivos de aproximadamente 10^{7} trofozoitos / botella, en 2 - 3 días de incubación y, los parásitos, formaron una monocapa confluente sobre las paredes de la botella.

Se procedió a realizar cultivos, mediante el enfriamiento de cultivos, en un baño de hielo (5 - 10 minutos), para soltar los trofozoitos adherentes e inocular 0,2 ml de la suspensión resultante, en medio fresco. Las incubaciones, se realizaron a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 72 horas, y se utilizaron diferentes recipientes (vidrio o plástico).

Almacenaje de cepas de Giardia intestinalis

Se procedió a desprender los trofozoitos, de la forma que se ha indicado anteriormente, arriba, y se suspendieron en medio TYI-S-33. Se añadió, a la suspensión, una solución crioprotectora concentrada al doble (DMSO, sucrosa), preparada en medio TYI-S-33, en tres alícuotos iguales, a intervalos de 2 minutos. Las concentraciones finales de los crioprotectores, eran las correspondientes a un 12% (volumen / volumen) de DMSO, un 4% (peso / volumen) de sucrosa. Se dejó que, suspensiones (alrededor de 1 x 10^{6} trofozoitos / ml), se equilibraran durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, a la temperatura ambiente, antes del inicio del ciclo de enfriado.

Los viales, se aislaron térmicamente con poliestireno (4 cm de espesor de pared), y se emplazaron a una temperatura de -80ºC.

Reactivación de trofozoitos congelados

Los viales, se descongelaron en un baño de agua caliente, a una temperatura de 37ºC, y se inocularon inmediatamente en medio TYI-S-33, a un factor de relación suspensión de parásitos / medio fresco = 0,5 / 7. Los cultivos, se inocularon a una temperatura de 37ºC, en la oscuridad.

La presente invención, se ilustrará ahora por mediación de ejemplos.

Como un modelo para las células intestinales, se utilizaron las líneas de células Caco-2 y HT29. La adherencia de las citadas células semejantes a enterocitos, se sometió a test de ensayo, de la forma que sigue a continuación:

Ejemplo 1 Radiomarcación de trofozoitos

Se procedió a inocular parásitos en TYI-S-33, y se añadieron de 2,6 a 7,1 \muCi/ml de, o bien ya sea 2-^{3}H adenina (21 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Life Science) ó bien ya sea metil-^{3}H timidina (2 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Life Science). Se realizaron incubaciones, a una temperatura de 37ºC, durante un tiempo de 48 - 72 horas.

El crecimiento de los trofozoitos con 7,1 \muCi/ml de, o bien ya sea ^{3}H-adenina ó bien ya sea ^{3}H-timidina, proporcionaron unos factores de relación DPM / parásito, muy diferentes (Tabla 1). A pesar del hecho de que, la concentración, era de un valor 10 veces mayor si se compara con la de la adenina, la incorporación fue muy lenta, con el resultado de que se obtuvieron 0,08 y 2,8 DPM / parásito, respectivamente.

TABLA 1 Incorporación de ^{3}H, mediante la cepa de Giardia Pórtland - 1, añadiendo 7 \muCi/ml de bases radiomarcadas

Substancia radiomarcada	mmol / ml	DPM /parásito
2-^{3}H adenina	3 x 10^{-7}	28 \pm 0,10
Metil-^{3}H timidina	35 x 10^{-7}	0,08 \pm 0,00

La tabla 2, muestra los resultados de la incorporación de la adenina mediante cepas de Giardia intestinalis. Se obtuvo un radiomarcado apropiado, procediendo a utilizar concentraciones de adenina, tan bajas como las correspondientes a 2,5 \muCi/ml. En estas condiciones, los factores de relación para DPM / parásito, eran los correspondientes a unos márgenes comprendidos entre 0,3, para la cepa Portland - 1, y 1,6, para la cepa UNO.

TABLA 2 Incorporación de 2-^{3}H adenina, mediante diferentes cepas de Giardia

Los resultados, son la media de por lo menos dos determinaciones.

Cepa	DPM por parásito
	7 \muCi/ml	5 \muCi/ml	2,5 \muCi/ml
Porland – 1	2,8 \pm 0,1	0,9 \pm 0,1	0,3 \pm 0,0
UNO	ND	1,2 \pm 0,2	1,6 \pm 0,1
WB	ND	1,0 \pm 0,2	1,4 \pm 0,1
New Orleans – 1	ND	2,3 \pm 0,8	0,6 \pm 0,1

Ejemplo 2 Cultivo de células

Se procedió a hacer crecer células Caco-2 en DMEM, suplementado con aminoácidos no esenciales, penicilina (12 UI/ml), estreptomicina (12 \mug/ml), gentamicina (47 \mug/ml) y suero de ternero fetal, inactivado (20% volumen /
volumen). Se prepararon monocapas, en placas de cultivo de tejido, de 6 hoyos, sembrando 2 x 10^{5} células por hoyo. Las incubaciones, de realizaron a una temperatura de 37ºC, en una mezcla de un 10% de CO_{2} / 90% de aire atmosférico. El medio de cultivo, se cargó cada segundo día. Los ensayos de adhesión, se realizaron con células, entre las pasadas 49 y 51, y únicamente se utilizaron monocapas, en la última etapa de post-confluencia (por lo menos dos semanas en cultivo).

Se procedió a hacer crecer células HT-29 (American Tupe Culture Collection, Rockville, MD) en DMEM que contenía 4,5 g/l de glucosa (Seromedi, Biochrom KG, Berlín, Alemania), suplementado con Glutamax 1 (0,01% volumen / volumen), L-alanil-L glutamina 200 mM, GIBCO, Basel, Suiza), gentamicina (0,57 mg/ml, GIBCO, Basel, Suiza), y suero de ternero fetal (10% volumen / volumen, GIBCO, Basel, Suiza). Se utilizaron células, en la pasada 52.

Ejemplo 3 Ensayos de adhesión

Cuando se hubieron obtenido monocapas confluentes de trofozoitos, el medio de cultivo, se descartó, eliminando de esta forma cualesquiera parásitos no unidos a la superficie. Los parásitos unidos, se recolectaron tal y como se encuentra descrito, y se lavaron 3 veces con DMEM (Gibco), que contenía 11,4 mM cisteína HCl. Se procedió a enumerar las diluciones (1 : 2) de parásitos en paraformaldehído 1%, en un hemocitómetro.

Los trofozoitos radiomarcados suspendidos en DMEM-CYS + 11,4 mM cisteína HCl), se añadieron a monocapas de células de Caco-3, y se incubaron, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37ºC, en una mezcla de un 5% de CO_{2} / 95% de aire atmosférico. Se procedió, a continuación, a lavar las monocapas, 3 veces, con DMEM-CYS, a una temperatura de 37ºC, para desprender los trofozoitos no enlazados.

Después de proceder al lavado, se añadió 1 ml de NaOH 1N, por hoyo y, las placas, se incubaron durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente. Los lisados de células, se emplazaron en viales de centelleo, y se llevó a cabo un lavado adicional de los hoyos con PBS. La radioactividad, se midió con un contador \beta (RackBeta Spectral, LKB, Wallac).

Ejemplo 4 Ensayos de preincubación

Se procedió a lavar cultivos bacteriales, 3 veces, con PBS. La suspensiones, las cuales se habían ajustado a un valor de 1 x 10^{8} CFU / ml en DMEM, se añadieron a monocapas de Caco-2 y, las placas, se incubaron durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37ºC. Después de la adhesión de las suspensiones bacterianas, se añadieron trofozoitos radiomarcados, ajustados a un valor de 1 x 10^{5} parásitos / ml. Los ensayos de adhesión, se realizaron tal y como se ha indicado anteriormente, arriba.

Ejemplo 5 Ensayos de coincubación

Se procedió a mezclar 1 ml de alícuotos de suspensiones parasíticas que contenían 1 x 10^{5} Giardia radiomarcadas por ml, con 1 ml de suspensiones bacterianas (1 x 10^{8} CFU/ml), en placas de cultivo de tejido, de 6 hoyos, que contenían monocapas de Caco-2. Los ensayos de adhesión, se realizaron de la forma que se ha indicado anteriormente,
arriba.

Ejemplo 6 Acción de los sobrenadantes de bacterias del ácido láctico, en la adhesión de Giardia intestinalis

Se procedió a centrifugar bacterias del ácido láctico, a 900 g, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, y se neutralizaron los sobrenadantes (pH 6,9 - 7,4), con NaOH 4N. Se mezcló 1 ml de una suspensión que contenía 10^{5} trofozoitos radiomarcados / ml en DMEM-CYS, con 1 ml de sobrenadante neutralizado en placas de cultivo de tejido, de 6 hoyos, que contenían monocapas de Caco-2. Los ensayos de adhesión, se realizaron de la forma indicada anteriormente, arriba. En los ensayos, se incluyeron controles apropiados con MRS ó MRS acidificado a un valor pH de 4,5, con ácido láctico y, después, neutralizado a un valor pH de 7.

Se procedió a llevar a cabo ensayos de preincubación, incubando suspensiones parasíticas (DMEM-cis), con un volumen igual de sobrenadante, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37ºC. En otra serie de experimentos, los parásitos, se suspendieron en sobrenadantes puros o sobrenadantes diluidos con MRS. Después de la incubación, las giadias, se suspendieron en DMEM, y se añadieron a células de Caco-2.

La valoración del crecimiento, se realizó procediendo a llevar a cabo la incubación de parásitos en medio TYI-S-33, con 100 \muCi de ^{3}H adenina, en 40 ml de cultivo. Se realizó un análisis de flujo citométrico, utilizando una luz de excitación de color azul-verde (FACAScan®).

Ejemplo 7 Microscopía de exploración electrónica

Se procedió a hacer crecer células Caco-2, en platinas de vidrio redondas (diámetro, 10 mm), en placas de cultivo de tejido, de 24 hoyos, y se llevó a cabo la adhesión de trofozoitos, de la forma indicada. Los especímenes, se fijaron mediante la adición de 2,5% glutaraldehído en PBS, durante un transcurso de tiempo de 16 horas, a una temperatura de 4ºC. La post-fijación, se realizó en tetraóxido de osmio al 2,5%, a la temperatura ambiente, durante un transcurso de tiempo de 2 horas y, los frotis, se deshidrataron en una serie graduada de soluciones de etanol (soluciones de etanol en agua, del 30, 50, 70, 90, 100%). Finalmente, se secaron muestras al punto crítico, utilizando CO_{2}, se recubrieron con oro, y se examinaron, utilizando un dispositivo del tipo Philips SEM 505, a un voltaje de aceleración, de
30 KV.

Ejemplo 8 Adhesión de los trofozoitos de Giardia intestinalis a células de Caco-2

Se procedió a añadir un total de 10^{5} trofozoitos a un cultivo de Caco-2, preparado tal y como se describe en detalle en el ejemplo 2. Los resultados de los ensayos de adhesión, se muestran en la Figura 1. Se obtuvieron adhesiones de aproximadamente un 5%, a pesar de la edad de las monocapas. La unión a las superficies de plástico, era muy alta (21,8 \pm 2,4%).

Los resultados de los ensayos de adhesión realizados con células HT-29 indiferenciadas, se muestran en la Figura 2. Se obtuvieron los valores de 7,0 \pm 1,2% y 5,5 \pm 0,6%, para las cepas Porland -1 y WB, respectivamente.

La microscopía de exploración electrónica de la cepa UNO, unida a células de Caco-2 diferenciadas, se muestra en la Figura 2. Una mayoría de los trofozoitos Guardia, se encuentran situados con el lado ventral unido a la monocapa. Se vieron también algunos parásitos, con su superficie dorsal haciendo frente a las células Caco-2 (flecha). Tal y como se deriva claramente de la figura 4, la unión de los trofozoitos, produce una huella o impresión, en el borde en cepillo de las células semejantes a los enterocitos.

La coincubación de las células de giadias, bacterias del ácido láctico y Caco-2, no cambiaron la unión (Figura 5 A). Además, la preincubación de monocapas de Caco-2 con bacterias del ácido láctico, no interfería con la adhesión de los parásitos (Figura 5B).

Ejemplo 9 Influencia de los sobrenadantes de los cultivos del ácido láctico en la adhesión de Guardias intestinalis a células de Caco-2

La coincubación de las cepas de Portland - 1 y WB, con sobrenadantes neutralizados de las bacterias del ácido láctico a ser utilizadas en concordancia con la presente invención, produjo una reducción de la adhesión a células de Caco-2, correspondiente a unos porcentajes que van del 19% (cepa La1) al 40% (cepa La10) para la cepa Portland - 1
(Figura 6 A). Para la cepa WB, los valores, correspondían a unos porcentajes que van desde el 20%, para la cepa CIDCA 536, hasta un 40%, para la cepa La10 (Figura 6B). A pesar del hecho de que no pudieron establecerse diferencias entre la cepas, la cepa La10, mostraba diferencias significativas, al compararse con el control de MRS, para ambas, la cepa Portland - 1 (P = 0,06), y la cepa WB (P = 0,04).

Teniendo en cuenta el hecho de que, la gama de valores pH compatibles con los experimentos de coincubación, con Caco-2, es estrecha, se procedió a llevar a cabo ensayos, mediante la preincubación de parásitos con sobrenadantes y, a continuación, la resuspensión de éstos en DMEM-cisteína, antes de los ensayos de adhesión. La incubación de la cepa WB, con sobrenadantes ácidos (pH 4) (DMWM : sobrenadante = 1 : 1), durante un transcurso de tiempo de 1 hora, produjo una reducción de la adhesión desde un 15%, para el MRS, hasta aproximadamente un 3%, para todas las cepas bajo estudio (Figura 7 A). La neutralización de los sobrenadantes (pH 7), eliminó el efecto inhibitorio y se encontró un incremento, en la adhesión.

Los resultados obtenidos mediante la incubación de la cepa de WB con sobrenadantes de la cepa La10, ajustada a diferentes valores pH, se muestran en la Figura 8 A. No se encontraron diferencias al compararse al control con MRS a valores pH de 4 y 5, pero, se encontró que, la adhesión, era mayor a un valor pH de 6 y 7.

La dilución de sobrenadantes ácidos con MRS, produjo un incremento en valor pH, pero, la adhesión, se redujo, con sobrenadantes diluidos 1/8 (concentración relativa, 0,125, pH 4.07, Figura 8 B).

El análisis citométrico de flujo de las suspensiones de la cepa WB 1, incubadas durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37ºC, con MRS, acidificado a un valor pH de 5 (DMEM : MRS = 1,1), mostró diferencias en tamaño (FSC) y complejidad citoplásmica (SSC) (Figura 9). La incubación de parásitos preincubados a unos valores pH de 4 ó 7, en medio TYI-S-33, con 100 \muCi de ^{3}H adenina, mostró diferencias en la incorporación (Figura 10). Se detectó una reducida incorporación de adenina, a un pH de 4, después de un transcurso de tiempo de 28 horas de incubación, en ambas muestras, la muestra de MRS y la muestra de sobrenadantes. A pesar del hecho de que se unieron algunos parásitos a las paredes de la botella, éstos no eran motiles. El caldo de MRS, acidificado a un valor pH de 4,05, y neutralizado, mostró unos valores de DPM, que representaban menos de un porcentaje del 20% del control. Para los sobrenadantes neutralizados de la cepa La 10, los valores, eran de aproximadamente un 80% de los de control y, las diferencias, eran significativas, a un nivel de 0,09. Se encontraron grandes agregados de parásitos, a un valor pH de 7, en ambos, MRS y sobrenadantes.

Los resultados de adhesión de la Giardia, a diferentes líneas de células (figuras 1 y 2), sugieren el hecho de que, ninguna adhesión específica, parece ser una importante característica de este sistema, debido a que no se encontraron diferencias significativas entre células diferenciadas (Caco-2, con diferentes tiempos en el cultivo), y células indiferenciadas (HT-29). Además, la adhesión a las superficies de plástico, era muy alta. La adhesión de trofozoitos a monocapas de Caco-2, produjo obviamente un daño en las microvellosidades (Figura 4).

Los experimentos de exclusión de parásitos con una etapa de lavado, después de la adhesión bacteriana, condujeron a un dañado de la monocapa, dando como resultado valores de exclusión, los cuales parecieron no ser auténticos. El grado de dañado, depende de la solución de lavado, que puede ser de una gama que va desde el borrado de las microvellosidades con DMEM-cis (microscopía electrónica de exploración), hasta el desprendimiento de células con PBS. Teniendo en cuenta los anteriores descubrimientos, se realizaron ensayos, en donde, las monocapas, se preincubaron con bacterias suspendidas en DMEM-cis, pero sin una etapa de lavado, previamente a la adición de los parásitos. Se procedió a llevar a cabo otra serie de experimentos, coincubando parásitos y bacterias con células de Caco-2. Los resultados obtenidos (Figura 5), son compatibles con la unión "activa" de trofozoitos, mediatizada con motilidad de flagelos y elementos contráctiles. Al no ser motiles las bacterias del ácido láctico no pudieron competir con los parásitos, para la unión.

En cuanto a lo concerniente a la acción de los sobrenadantes de cultivos de bacterias del ácido láctico, se ha mostrado que éstos inhiben la adhesión de Giardia. Sin pretender vincularlo a ninguna teoría, se cree que, este efecto inhibitorio, puede atribuirse principalmente a ácidos orgánicos particulares, secretados por las bacterias del ácido láctico.

Una preincubación de parásitos con MRS acidificado con ácido láctico, mostró unos cambios dramáticos en el tamaño celular y la complejidad citoplásmica y, la adhesión a Caco-2, se redujo, para ambos, los sobrenadantes y controles de MRS. En estas condiciones, se encuentra altamente afectada la viabilidad de los parásitos, tal y como se muestra en los experimentos en donde, los parásitos tratados, se inoculan en TYI-S-33 fresco.

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Después de contactar con lactato, a un valor pH de 4, se paró esencialmente el crecimiento de los parásitos, a pesar del hecho de que, algunos parásitos, eran capaces de unirse a las paredes de la botella. Parecía que, bajo estas condiciones, el ácido láctico, es letal a para la Giardia. A un valor pH de 7, el efecto inhibitorio de la lactasa, se encuentra todavía presente, y no pudieron explicarse las diferencias entre el MRS acidificado y el sobrenadante de la cepa de La10, procediendo a asumir las diferencias en la concentración de lactato, debido a las diferencias en la aptitud (capacidad) del tampón, entre el MRS fresco y los sobrenadantes consumidos.

Los agregados de Giardia, se formaron durante la preincubación de parásitos con sobrenadantes, y éstos podrían contar para las altos valores de adhesión encontrados, a valores pH de 6 y 7 (Figura 8). Tal y como se ha indicado anteriormente, los mecanismos principales para la adhesión de Giardia, requieren la viabilidad del parásito, a pesar del hecho de que, pudo mostrarse la adhesión de los protozoos muertos, después del tratamiento de los protozoitos con sobrenadantes, a un valor pH de 4. Estos parásitos, no eran capaces de multiplicarse y, así, de este modo, no eran efectivos en la producción de parasitosis. Además, los sobrenadantes neutralizados de cultivos de las bacterias del ácido láctico, retardaban el crecimiento de Giardia, y produjeron agregados incapaces de unirse.

En vistas de los resultados experimentales anteriormente presentados, arriba, resulta claro el hecho de que, las bacterias del ácido láctico a utilizarse en concordancia con la presente invención, pueden ser exitosamente utilizadas para el tratamiento de la profilaxis de la giardiasis.

Claims

1. Uso de un cultivo de supernadante, de una bacteria del ácido láctico, o una bifidobacteria, capaces de prevenir la adhesión de la Giardia intestinalis a las células intestinales, para la preparación de un vehículo o portador ingerible, para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino, con Giardia Intestinalis.

2. El uso, según la reivindicación 1, en donde, el portador o vehículo ingerible, es una composición alimenticia o una composición farmacéutica.

3. El uso, según la reivindicación 2, en donde, la composición alimenticia, se selecciona de entre la leche, el yogur, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, cremas heladas (helados), productos a base de cereales fermentados, materias en forma de polvo a base de leche, fórmulas para bebés, o alimentos para animales de compañía.

4. El uso, según la reivindicación 2, en donde, la composición farmacéutica, es en forma de una tableta, una suspensión bacteriana líquida, un suplemento oral seco, un suplemento oral húmedo, una alimentación por tubo, seca, o una alimentación por tubo, húmeda.

5. Bacteria del ácido láctico o una bifidobacteria, seleccionada de entre el grupo consistente en NCC 189 (I-2333) ó NCC 200 (I-2334).

6. Composición alimenticia o farmacéutica que contiene un cultivo de sobrenadante, de una bacteria del ácido láctico, capaz de prevenir la adhesión de la Giardia intestinalis a las células intestinales, para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino, con Giardia Intestinalis.

7. La composición, según la reivindicación 6, la cual es leche, yogur, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, cremas heladas (helados), productos a base de cereales fermentados, materias en forma de polvo a base de leche, fórmulas para bebés, o alimentos para animales de compañía, de cualquier tipo, o ésta es en forma de una tableta, una suspensión bacteriana líquida, un suplemento oral seco, un suplemento oral húmedo, una alimentación por tubo, seca, o una alimentación por tubo, húmeda.