MXPA02004115A - Bacterias acidolacticas para el tratamiento o profilaxis de giardiasis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con el uso de un sobrenadante de bacterias acidolacticas o de bacterias bifidas capaces de evitar la colonizacion. de celulas intestinales por Giardia intestinalis, para la preparacion de un portador ingerible para el tratamiento o profilaxis de desordenes asociados con la colonizacion del intestino por Giardia intestinalis. La presente invencion tambien se relaciona con estirpes especificas de bacterias bifidas que tiene los rasgos anteriores y con un portador ingerible tal como un alimento o una composicion farmaceutica que contiene tal sobrenadante o los microorganismos.

Description

BACTERIAS ACIDOLACTICAS PARA EL TRATAMIENTO O PROFILAXIS DE GIARDIASIS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con bacterias acidolácticas capaces de evitar la colonización de células intestinales por Giardia intestinalis, o con un sobrenadante de cultivo de las mismas, respectivamente, para uso en el tratamiento o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino por Giardia intestinalis . La presente invención también se relaciona con estirpes de bacterias bífidas que tienen los rasgos anteriores y con el uso de bacterias acidolácticas para la preparación de un portador ingerible, tal como una composición alimenticia o farmacéutica, para el tratamiento o profilaxis de una infestación del intestino por Giardia intestinalis . Giardia intestinalis es un protozoario flagelado el cual, cuando infesta el intestino de un individuo puede generar desórdenes tales como dolores abdominales, heces sueltas o incluso diarrea grave. Su ciclo de vida tiene dos etapas, quistes y trofozoítos, formas diferentes las cuales permiten que el microorganismo sobreviva en ambientes diferentes e incluso adversos . ámtm..~* .~**i?r*fffi~.?m, f , - - Los quistes son formas quiescentes, cuadrinucleadas y ovoides responsables de la transmisión de giardiasis. Después de la ingestión de quistes por un individuo, se activa el desenquistamiento por exposición al ácido gástrico y enzimas digestivas. El parásito de esa manera surge, y se le denomina trofozoíto, es binucleado y tiene una forma de media pera que tiene un tamaño de aproximadamente lOµm con una parte anterior ancha y un lado posterior estrecho. El lado ventral se encuentra de esta manera cubierto en gran medida por un disco ventral el cual se considera que constituye por lo menos en parte el punto de unión del trofozoíto con la superficie intestinal . Después del desenquistamiento de los trofozoítos puede persistir en el intestino delgado del individuo infectado durante un período prolongado que puede durar incluso años. Si los trofozoítos son transportados corriente abajo por el flujo del fluido intestinal, nuevamente pueden comenzar a enquistarse para adaptarse a su nuevo ambiente. Los quistes se excretan con las heces y pueden resistir diversas condiciones ambientales extremas, que incluyen condiciones de temperatura, pH y tonicidad diferentes. Un individuo infectado puede secretar aproximadamente 9 x 108 quistes al día, en donde se ha demostrado que dosis tan bajas como 10 quistes pueden ser suficientes para producir una infección en otro individuo. La transmisión de Giardia ii¿*? ??l ?i-+ ~*»-«' . ¿¿^g^^m intestinalis se puede llevar a cabo de diferentes maneras, en donde las vías de transmisión principales son por agua y alimentos. La diseminación de una persona a otra se fundamenta por algunos ataques en organizaciones para el cuidado de personas y en hospitales. Además, se ha encontrado que los animales silvestres son reservorios infecciosos de Giardia intestinali s y pueden contribuir a diseminar el patógeno. La giardiasis, al igual que otras enfermedades intestinales, es más grave en lactantes y niños. La infección habitualmente se asocia con diarrea y mala absorción, lo que resulta en un crecimiento y desarrollo dañados en el niño lo que finalmente lleva también a la muerte de recién nacidos. Aproximadamente la mitad de las personas infectadas, sin embargo, son asintomáticos y contribuyen a diseminar el patógeno, dado que, debido a la ausencia de algún síntoma perceptible, no se aplica un tratamiento correspondiente. Aunque se ha realizado una gran cantidad de esfuerzo científico para investigar a Giardia intestinalis, la patogenia de la giardiasis no se puede explicar por medio de un solo factor de virulencia y hasta ahora no se ha aislado un compuesto no tóxico. La apariencia al microscopio óptico de un intestino colonizado por Giardia se ha encontrado que es variable y que varía desde una estructura de mucosa normal hasta una atrofia casi total de los vellos. Los resultados de las investigaciones - por microscopía electrónica muestran cambios ultraestructurales tales como acortamiento y ruptura de los microvellos (Chávez et al., Experimental Parasitol . 80(1995), 133-138). Se ha encontrado que tales anomalías estructurales están acompañadas por una reducción en las actividades de lactasa, sacarasa y maltasa en la membrana de los microvellos así como un transporte intestinal dañado (Buret et al., Gastroenterology 103 (1992), 506-513; Roberts-Thomson et al, Gastroenterology. 71 (1976) , 57-61) . Además de las dos formas ilustradas antes, Giardia intestinalis ha desarrollado una estructura superficial que cambia notablemente y ha desarrollado una familia de proteínas protectoras que cubren todas las superficies expuestas (Aley et al., Infect. Agents Dis. 4 (1995), 161-166; Müller, et al., Infect. Immun. 64 (1996), 1385-1390; Nash et al., J. Eu . Microbiol. 42 (1995), 604-609). Estas proteínas de superficie variable (VSP) protegen a los trofozoítos de factores inmunológicos y ambientales, de manera que Giardia puede evadir las defensas del huésped y puede sobrevivir en un ambiente altamente degradante tal como el que prevalece en el tracto intestinal de los mamíferos. Se produce una modificación en las VSP aproximadamente cada 6a a 13a generación lo que dificulta o vuelve casi imposible que el sistema inmunitario del huésped desarrolle una respuesta específica contra el patógeno. La tensión inmune y ambiental puede seleccionar diferentes - - fenotipos de VSP. Además, también se ha informado de cambio de antígenos por parte de los VSP después del desenquistamiento (Gillin et al., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996), 679-705). La giardiasis humana se asocia con un aumento en el número de lámina propia y linfocitos intraepiteliales, lo que sugiere que la activación de los linfocitos T puede ser la responsable del daño a los microvellos. Sin embargo, la inmunosupresión inducida en ratones produce un efecto más profundo sobre las enzimas asociadas a los microvellos, en comparación con los animales no inmunosuprimidos lo que indica que durante una infección por Giardia intestinalis, el daño epitelial parece que no depende solo de la función inmunitaria. Una terapia habitual de la giardiasis es la administración de antibióticos, tales como los que pertenecen a la clase de nitroimidazoles . Aún, en áreas endémicas, la respuesta a la terapia se ha demostrado que es inconsistente (Katelaris et al., Aliment. Pharmacol. Ther. 8 (1994), 187- 192) . Además, debido a que por lo menos en parte la destrucción de la microflora natural del intestino, la administración de tales antibióticos siempre va acompañada por efectos colaterales graves tales como diarrea prolongada o incluso infestación expandida del intestino por otros microorganismos dañinos, tales como levaduras.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de opciones adicionales para tratar la giardiasis o un medio para evitar la infestación de un individuo por el patógeno. El problema de la presente invención por lo tanto se encuentra en proporcionar un medio adicional para el tratamiento o profilaxis de una infección por Giardia intestinalis . Este problema se ha resuelto al proporcionar el uso de un sobrenadante de cultivo de una bacteria acidoláctica o una bacteria bífida capaz de evitar la adhesión de Giardia intestinalis a las células intestinales para la preparación de un portador ingerible para el tratamiento o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del intestino por Giardia intestinalis . De acuerdo con una modalidad preferida, la presente invención proporciona bacterias acidolácticas y bacterias bífidas novedosas, respectivamente, capaces de evitar la adhesión de Giardia intestinalis a células intestinales, las cuales se seleccionan del grupo que consiste de NCC 90 (I- 2332), NCC 189 (1-2333) o NCC 200 (1-2334). Estos microorganismos se han depositado de acuerdo con el tratado de Budapest ante el Institute Pasteur el 30 de noviembre de 1999, y recibieron los números de depósito mencionados antes. La presente invención también pertenece a composiciones alimenticias y farmacéuticas que contienen tales microorganismos . Los microorganismos se pueden incluir en el portador en una cantidad de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 ufp (unidades formadoras de placa) . Se pueden incluir como tales, u opcionalmente después de purificarlos esencialmente del medio de cultivo. De manera alternativa, el sobrenadante de un cultivo de tales microorganismos puede incluir el portador, el cual, antes de su inclusión, preferiblemente se puede concentrar por medios bien conocidos en la técnica. El portador ingerible puede ser un alimento o una composición farmacéutica tal como leche, yogurt, requesón, queso, leches fermentadas, productos fermentados basados en leche, helados, productos basados en cereal fermentado, polvos basados en leche, fórmulas para lactantes y cualquier clase de alimento para mascotas. Tales portadores se pueden fabricar, por ejemplo, con facilidad mediante la utilización de un microorganismo que tenga los rasgos correspondientes para fermentación de los mismos materiales iniciales. De manera alternativa, los microorganismos o un sobrenadante de cultivo opcionalmente concentrado del mismo se puede agregar al portador respectivo en forma líquida o seca. Se puede preparar una composición farmacéutica, tal como una tableta, una suspensión bacteriana líquida, un suplemento oral seco o húmedo, o un alimento por intubación seco o húmedo mediante la utilización de técnicas habituales mientras se incluyen a los microorganismos o un sobrenadante de cultivo concentrado opcional del mismo, en el portador. En base en el modo de administración, una persona experta en la técnica seleccionará la formulación que se considere apropiada. En las Figuras: La Figura 1 muestra la adhesión de la estirpe Portland-1 de células Caco-2 cuando se agregan 105 trofozoítos/cm2 ; la Figura 2 muestra los resultados de los ensayos de adhesión realizados con células HT-29 no diferenciadas; la Figura 3 muestra una micrografía electrónica de barrido de una estirpe UNO unida a células Caco-2 diferenciadas; la Figura 4 muestra el daño a las microvellosidades en el borde de cepillo de células epiteliales, por Giardia intestinalis . la Figura 5A muestra los resultados de coincubación de giardias, bacterias acidolácticas y células Caco-2; la Figura 5B muestra los resultados de preincubación de monocapas de Caco-2 con bacterias acidolácticas; la Figura 6A muestra los resultados de un experimento de adhesión, en donde se ponen en contacto Portland-1 y WB con sobrenadante neutralizado de las bacterias acidolácticas de la presente invención; la Figura 6B muestra los resultados de un experimento de adhesión, en donde se ponen en contacto WB y CIDCA con sobrenadante neutralizado de bacterias acidolácticas de la presente invención; la Figura 7A muestra los resultados que se obtienen al incubar la estirpe WB con sobrenadantes ácidos (pH 4) (DMEM: sobrenadante = 1:1) durante lh. La Figura 7B muestra que la neutralización de los sobrenadantes (pH 7) abate el efecto inhibidor. La Figura 8A muestra los resultados que se obtienen al incubar la estirpe WB con sobrenadantes de la estirpe LalO ajustada a pH diferente; la Figura 8B muestra los resultados de diluir los sobrenadantes ácidos con MRS . La Figura 9 muestra un análisis citométrico bajo de suspensiones de la estirpe WB 1 incubada durante ÍH a 37° con MRS acidificada hasta pH 5 (DMEM: MRS = 1:1); la Figura 10 muestra el resultado de una inoculación de parásitos preincubados a pH 4 o 7 en medio TYI-S-33 con 100 µCi de 3H-adenina. Durante los estudios que llevan a la presente invención, los inventores han establecido la hipótesis de que un enfoque ecológico en el tratamiento o prevención de giardiasis puede ser una colonización del intestino con bacterias que pueda ser capaz de combatir al parásito. « -h ír §M *iM*éáhíátí áá¡t» La unión de trofozoítos de Giardia intestinalis a células epiteliales se considera que es la etapa clave de la infección en humanos y animales. Aunque los mecanismos para la adhesión Giardia no se comprenden del todo, la evidencia sustenta que el disco ventral, los elementos contráctiles del trofozoíto y las fuerzas hidrodinámicas y mecánicas así como la unión mediada por lectina son los que están involucrados. Considerando que el ácido láctico es un factor importante en el ciclo de vida de la Giardia, la interacción entre Giardia intestinalis y las bacterias acidolácticas se ha estudiado utilizando células similares a enterocitos, en cultivo. Para este fin, se han utilizado las siguientes estirpes de parásitos microbianos y medios de cultivo: Estirpes Microbianas La estirpe bacteriana Lal {Lactobacillus johnsonii ) (1-1225) y LalO {Lactobacillus acidophilus) (1-2332) de la colección Nestec (Lausana, Suiza) . Las estirpes CIDCA 536 (Bífi o acteriuip bifidum) y CIDCA 538 (Bifidojbacteriujp infantis) son de la colección del Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (Universidad Nacional de La Plata, Argentina) y se han depositado de acuerdo con el ítMi ^^i.g*.,..u^.*.i^*..,¡^^^ Tratado de Budapest, recibiendo lo depósitos Nos. 12333 y I-2334, respectivamente. Las estirpes de Giardia Intestinalis Portland-1 (ATCC 30888), UNO/04/87/1 (ATCC 50184), New Orleans-1 (ATCC 50137) y WB (ATCC 30957) , se adquieren de American Type Culture Collection (Rockville, E.U.A.). Se hacen crecer bacterias durante 24 horas a 37°C en caldo MRS suplementado con clorhidrato de cisteína 0.05% (Sigma) . Las incubaciones se realizan bajo condiciones anaeróbicas (BBL GasPak Plus) . Los protozoarios se hacen crecer en medio TYI-S-33 modificado por Keister que contiene (por litro) : digerido de caseína (Difco) 20 g; extracto de levadura (BBL) , 10 g; dextrosa (Merck), 10 g; bilis bovina (Difco) 0.75 g; NaCl (Merck) , 2 g; clorhidrato de L-cisteína (Sigma) , 2 g; sal de sodio de ácido ascórbico (Fluka) 0.2 g; K2HP04 (Merck) 1 g; KH2P04 (Merck), 0.6 g; citrato de amonio férrico (Sigma), 22.8 mg, suero bovino adulto (Sigma), 100 ml; penicilina/estreptomicina (Gibco, 1000 Ul/ml, 1000 µg/ml), 15ml. También se realizan ensayos con suero de caballo (Gibco) en vez de suero bovino. Se ajusta el pH a 6.9 con NaOH 1 N antes de esterilización por filtración (tamaño de poro de 0.22 µm) . El medio modificado de Keister suplementado con suero equino 10% no soporta el crecimiento de la estirpe Portland-1, aunque la incubación se extiende durante 11 días y pese al H¿. IÉ¡f ¡rt-tt? - hecho de que los trofozoítos inicialmente se unen a las paredes del tubo. Durante los primeros 5 días de incubación se observa una alta proporción de parásitos móviles. Después de este tiempo, se observa una aglutinación de trofozoítos y una disminución notable de células viables. La adición de suero bovino (10%) a éstas células dañadas permite el crecimiento después de 24 h. Para incrementar la disponibilidad de superficie para unión de Giardia, se utilizan botellas de cultivo de tejido de 25cm2 (botellas de plástico). Se agrega el medio de cultivo al cuello de la botella para mantener condiciones anaeróbicas. Este procedimiento resulta en rendimientos de aproximadamente 107 trofozoítos/botella en los siguientes 2-3 días de incubación y los parásitos forman una capa confluente sobre las paredes de la botella. Se elaboran subcultivos al enfriar cultivos en un baño con hielo (5-10 min) para separar los trofozoítos que se adhieren e inocular 0.2 ml de la suspensión resultante en medio fresco. Las incubaciones se realizan a 37 °C durante 72 horas y se utilizan recipientes diferentes (vidrio o plástico) .

Almacenamiento de las Estirpes de Giardia Intestinalis : Se separan los trofozoítos como se indica en lo anterior y se suspenden en medio TYI-S-33. Se preparan soluciones crioprotectoras concentradas dobles (DMSO, sacarosa) en medio TYI-S-33, se agregan a la suspensión en tres alícuotas iguales, a intervalos de 2 minutos. Las concentraciones finales de crioprotectores son 12% (v/v) de DMSO, 4% (p/v) de sacarosa. Se permite que las suspensiones (aproximadamente 1 x 106 trofozoítos/ml) se equilibren durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de iniciar el ciclo de enfriamiento. Los frascos se aislan térmicamente con poliéstireno (espesor de pared de 4cm) y se colocan a -80 °C.

Reactivación de los Trofozoítos Congelados: Se entibian los frascos en un baño maría a 37 °C y se inoculan de inmediato en medio TYI-S-33 en una relación de suspensión de parásitos / medio fresco = 0.5/7. Se incuban los cultivos a 37°C en la oscuridad. La presente invención ahora se ilustra por medio de los ejemplos. Como un modelo para las células intestinales, se utilizan líneas de células Caco-2 y HT29. La adhesión de tales células similares a enterocitos se determina como sigue: Ejemplo 1: Radiomarcado de Trofozoítos Se inoculan parásitos en TYI-S-33 y se agregan 2.6 a 7.1 µCi/ml de 2-3H-adenina (21 Ci/mmoles, 1 mCi/ml, Amersham Life Science) o metil-3H-timidina (2 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Life Science) . Las incubaciones se realizan a 37°C durante 48-72 h. El crecimiento de trofozoítos con 7.1 µCi/ml ya sea a 3H-adenina o 3H-timidina proporciona relaciones de DPM/parásito muy diferentes (Tabla 1) . Aunque la concentración de timidina es 10 veces mayor en comparación con la de adenina, la incorporación es muy lenta con el resultado de que se obtienen 0.08 y 2.8 DPM/párasito, respectivamente.

Tabla 1 Incorporación de 3H por Giardia de la estirpe Portland- 1 al agregar 7µCi/ml de bases radiomarcadas Substancia mmoles/ml DPM/parási to rad i ornar cada 2 -3H-adenina 3 x 10" 7 2 . 8 ± 0 . 10 Metil - 3H- timidina 35 x 10" 7 0 . 08 ± 0 . 00 La Tabla 2 muestra los resultados de incorporación de adenina por las estirpes de Giardia intestinalis . Se obtiene radiomarcado adecuado mediante la utilización de concentraciones de adenina tan bajas como 2.5 µCi/ml. En estas titi?iri?8iia?í?^ tf?---te?-B^ÍÍ^':-»'»íÍ¿í condiciones, la relación de DPM/parásito varía de 0.3 para 1. estirpe Portland-1 a 1.6 para la estirpe UNO.

Tabla 2 Incorporación de 2- H-adenina por diferentes estirpes de Giardia Los resultados son promedios de por lo menos dos determinaciones .

Estirpe DPM por parási to 7 µCi/ml 5 µCi/ml 2.5 µCi/ml Portland- 1 2.8 ± 0.1 0.9 ± 0.1 0.3 ± 0.0 UNO ND 1.2 ± 0.2 1.6 ± 0.1 WB ND 1.0 ± 0.2 1.4 ± 0.1 New Orleans- 1 ND 2.3 ± 0.8 0.6 ± 0.1 Ejemplo 2 : Cultivo Celular Se hacen crecer células Caco-2 en DMEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 12 Ul/ml de penicilina, 12 µg/ml de estreptomicina, 47 µg/ml de gentamicina y suero bovino fetal inactivado (20 %, v/v) . Se preparan monocapas en placas de i it i üi a^^.,.-^^,^,,fc - cultivo de tejido de 6 pozos mediante sembrado de 2 x 10 células por pozo. Se realizan incubaciones a 37°C con C02 10%, aire atmosférico 90%. El medio de cultivo se cambia cada 2 días. Se realizan ensayos de adhesión con células entre pasajes 49 y 51 y se utilizan solo las monocapas en la etapa de postconfluencia tardía (por lo menos dos semanas en cultivo) . Se hacen crecer células HT-29 no diferenciadas (American Type Culture Collection, Rockville, MD) en DMEM que contiene 4.5 g/1 de glucosa (Seromed, Biochrom KG, Berlin, Alemania) suplementado con Glutamax 1 (0.01 % v/v; L-alanina-Lglutamina 200 mM, GIBCO, Basilea, Suiza), gentamicina (0.57 mg/ml, GIBCO, Basilea, Suiza) y suero bovino fetal (10% v/v, GIBCO, Basilea, Suiza) . Las células se utilizan en el pasaje 52.

Ejemplo 3 : Ensayos de Adhesión Cuando se obtienen monocapas confluentes de trofozoítos, se desecha el medio de cultivo, por lo que se eliminan los parásitos que no se han unido a una superficie. Los parásitos unidos se cosechan como se describe y se lavan 3 veces con DMEM (Gibco) que contiene clorhidrato de cisteína 11.4 mM. Se ennumeran en un hemocitómetro dilusiones (1:2) de parásitos en paraformaldehído 1%.

Se agregan trofozoítos radiomarcados suspendidos en DMEM-CYS (DMEM + clorhidrato de cisteína 11.4 mM) a las monocapas de células Caco-2 y se incuban durante 1 h a 37 °C con una atmósfera de C02 5% /95% de aire. Las monocapas después se lavan 3 veces con DMEM-CYS a 37 °C para eliminar los trofozoítos que no se han unido . Después del lavado, se agrega 1 ml de NaOH 1 N por pozo y las placas se incuban durante 1 h a temperatura ambiente. Los lisados celulares se colocan en frascos de centelleo y se realizan lavados adicionales de los pozos con PBS. Se mide la radioactividad con un contador ß (RackBeta Spectral, LKB, Wallac) .

Ejemplo 4 : Ensayos de Preincubación.

Los cultivos bacterianos se lavan 3 veces con PBS. Se agregan suspensiones que se han ajustado a 1 x 108 UFC/ml en DMEM, se agregan monocapas Caco-2 y las placas se incuban durante 1 h a 37 °C. Después de la adhesión de las suspensiones bacterianas, se agregan trofozoítos radiomarcados, ajustados a 1 x 105 parásitos /ml . Los ensayos de adhesión se realizan como se indica en lo anterior.

Ejemplo 5: Ensayo de Coincubación .«H fa.* i .tote. i Se mezclan alícuotas de 1 ml de suspensiones de parásitos que contienen 1 x 105 Giardias radiomarcadas por ml, con 1 ml de suspensiones bacterianas (1 x 108 UFC/ml) en placas de cultivo de tejido de 6 pozos, que contienen monocapas Caco- 2. El ensayo de adhesión se realiza como se indica en lo anterior. Ejemplo 6: Acción de Sobrenadantes de Bacterias Acidolácticas Sobre la Adhesión de Giardia intestinalis Los cultivos de bacterias acidolácticas se centrifugan a 900 g durante 15 min y los sobrenadantes se neutralizan (pH 6.9 - 7.4) con NaOH 4 N. Se mezcla 1 ml de suspensión que contiene 105 trofozoítos radiomarcados/ml en DMEM-CYS con 1 ml de sobrenadante neutralizado en placas de cultivo de tejido de 6 pozos que contienen monocapas Caco-2. Se realizan ensayos de adhesión como se indica en lo anterior. Los controles apropiados con MRS o MRS acidificado hasta pH 4.5 con ácido láctico y se después se neutralizan a pH 7, y se incluyen en los ensayos. Se ralizan ensayos de preincubación al incubar suspensiones de parásitos (DMEM-cys) con un volumen igual de sobrenadante durante 1 h a 37 °C. En otra serie de experimentos, se suspenden parásitos en sobrenadantes puros o en sobrenadantes diluidos con MRS. Después de la incubación las giardias se suspenden en DMEM y se agregan a células Caco-2.

Se realiza la determinación de crecimiento al incubar parásitos en medio TYI-S-33 con 100 µCi de 3H-adenina en 40 ml de cultivo. El análisis citométrico de flujo se realiza utilizando luz de exitación azul-verde (FACScanMR) .

Ejemplo 7: Microscopía Electrónica de Barrido Se hacen crecer células Caco-2 en placas de vidrio redondas (10 mm de diámetro) en placas de cultivo de tejido de 24 pozos y se realiza la adhesión de trofozoítos, como se ha indicado. Las muestras se fijan por la adhesión de glutaraldheido 2.5% en PBS durante 16 h a 4°C. El proceso posterior a la fijación se realiza con tetróxido de osmio 2% a temperatura ambiente durante 2 h y después los frotis se deshidratan en una serie graduada de soluciones de etanol (soluciones de etanol en agua de 30, 50, 70, 90, 100 %) . Finalmente, las muestras se secan al punto crítico utilizando C02, se recubren con oro y se examinan utilizando un equipo Philips SEM 505 a un voltaje de aceleración de 30 KV.

Ejemplo 8: Adhesión de Trofozoítos de Giardia intestinalis a Células Caco-2.

Se agregan un total de 105 trofozoítos a un cultivo Caco-2 preparado como se indica en el Ejemplo 2. Los resultados de los ensayos de adhesión se muestran en la Figura 1. Se obtienen adhesiones de aproximadamente 5 % pese a la edad de las monocapas. La unión a superficies plásticas es muy alta (21.8 ± 2.4 %) . Los resultados de los ensayos de adhesión realizados con células HT-29 no diferenciadas se muestran en la Figura 2. Se obtienen valores de 7.0 ± 1.2% y 5.5 ± 0.6 % para las estirpes Portland-1 y WB, respectivamente. La micrografía electrónica de barrido de la estirpe UNO unida a células Caco-2 diferenciadas se muestra en la Figura 3. La mayor parte de los trofozoítos de Giardia están colocados con el lado ventral unido a la monocapa. También se observan algunos parásitos con su superficie dorsal orientada hacia las células Caco-2 (flecha) . Como se puede derivar claramente de la Figura 4, la unión de trofozoítos produce una impresión sobre el borde rugoso de las células similares a enterocitos. La incubación conjuta de giardias, bacterias acidolácticas y células Caco-2 no cambia la unión (Figura 5A) . Además, la preincubación de monocapas Caco-2 con bacterias acidolácticas no interfiere con la adhesión del parásito (Figura 5B) .

Ejemplo 9: Influencia de los Sobrenadantes de Cultivos de Bacterias Acidolácticas sobre la Adhesión de Giardia intestinalis a Células Caco-2 héláf.¡Élli *-aH^ La incubación conjunta de las estirpes Portland-1 y WB con sobrenadantes neutralizados de las bacterias acidolácticas para ser utilizado de acuerdo con la presente invención, produce una reducción de adhesión a células Caco-2 que varía de 19% (estirpe Lal) a 40% (estirpe LalO) para la estirpe Portland-1 (Figura 6A) . Para la estirpe WB, los valores varian de 20% para la estirpe CIDCA 536, hasta 40% para la estirpe LalO (Figura 6B) . Aunque las diferencias entre las estirpes no se puede establecer, la estirpe LalO muestra diferencias importantes en comparación con el control MRS para ambas estirpes, Portland-1 (P = 0,06) y WB (P = 0.04). Al considerar que el intervalo de pH compatible con los experimientos de coincubación con células Caco-2 es estrecho, se realizaron ensayos al preincubar parásitos con sobrenadantes y después al resuspenderlos en DMEM-cisteína antes de los ensayos de adhesión. La incubación de la estirpe WB con sobrenadantes ácidos (pH 4) (DMEM: sobrenadante = 1:1) durante 1 h produce una reducción de la adhesión de 15% para MRS a aproximadamente 3 % para la totalidad de las estirpes bajo estudio (Figura 7A) . La neutralización de los sobrenadantes (pH 7) elimina el efecto inhibidor y se encuentra un aumento en la adhesión (Figura 7B) . Los resultados obtenidos al incubar la estirpe WB con sobrenadantes de estirpe LalO ajustados a diferentes pH se muestran en la Figura 8A. No se encontraron diferencias en comparación con el control MRS a pH 4 y 5, pero se encontró que la adhesión es mayor a un pH de 6 y 7. La dilusión de los sobrenadantes ácidos MRS produce un aumento en el pH y la adhesión se reduce con sobrenadantes diluidos 1/8 (concentración relativa 0.125, pH 4.07, Figura 8B) . En el análisis citométrico de flujo de las suspensiones de la estirpe WB 1 incubadas durante 1 h a 37° con MRS acidificado a pH 5 (DMEM: MRS = 1:1) muestra diferencias en el tamaño (FSC) y la complejidad citoplasmática (SSC) (Figura 9) . La inoculación de parásitos preincubados a pH 4 ó 7 en medio TYI-S-33 con 100 µCi de 3H-adenina muestra diferencias en la incorporación (Figura 10) . Se detecta una incorporación baja de adenina a pH 4 después de 28 h de incubación tanto en MRS como en muestras de sobrenadantes. Aunque algunos parásitos se unen a las paredes de la botella, estos no son móviles. El caldo MRS, acidificado a pH 4.05 y neutralizado, muestra valores de DPM que representan menos de 20 % del control. Para sobrenadantes neutralizados de la estirpe LalO los valores son aproximadamente 80% del control y las diferencias son significativas a nivel 0.09. Se encuentran agregados grandes de parásitos a pH 7 tanto en MRS como en sobrenadantes. Los resultados para la adhesión de Giardia a diferentes líneas de células (Figura 1 y 2) sugiere que la unión no específica parece ser una característica importante de este sistema, dado que no se encontraron diferencias significativas entre células diferenciadas (Caco-2 con diferentes tiempos de cultivo) y células no diferenciadas (HT-29) . Además, la adhesión a superficies plásticas es muy elevada. La adhesión de trofozoítos a monocapas Caco-2 evidentemente produce daño a las microvellosidades (Figura 4) . Los experimientos de exclusión de parásitos con una etapa de lavado después de la adhesión bacteriana llevan a daño de la monocapa lo que resulta en valores de exclusión que no parecen ser auténticos. El grado de daño depende de la solución de lavado que varía desde destrucción de las microvellosidades con DMEM-cys (microscopía electrónica de barrido) a separación de células con PBS. Al considerar los hallazgos anteriores, se realizaron ensayos en donde las monocapas se preincubaron con bacterias suspendidas en DMEM-cys pero sin una etapa de lavado antes de la adhesión de los parásitos. Se realizaron otra serie de experimentos al incubar de manera conjunta parásitos y bacterias con células Caco-2. Los resultados que se obtienen (Figura 5) son comparables con la unión "activa" de trofozoítos mediada por motilidad de flagelos y elementos contráctiles. Las bacterias acidolácticas, que no son móviles, no pueden competir con los parásitos por la unión. Respecto a la acción de los sobrenadantes de cultivos de bacterias acidolácticas, se ha demostrado que inhiben la tft-iilHlrt.M.*---*-'1-''-•*-^--fc--*--.^----».-«to¿i.,t adhesión de Giardia . Sin desear unirse a teoría alguna, se considera que éste efecto inhibidor se puede atribuir principalmente a ácidos orgánicos particulares secretados por las bacterias acidolácticas . La preincubación de parásitos con MRS acidificado con ácido láctico muestra cambios notables en el tamaño celular y complejidad citoplasmática e igualmente se reduce la adhesión a células Caco-2 para sobrenadantes y controles de MRS. En estas condiciones, la viabilidad de los parásitos se altera notablemente, como se muestra en experimientos en donde los parásitos tratados se inoculan en medio TYI-S-33 fresco. Después del contacto con lactato a pH 4 el crecimiento de los parásitos se detiene esencialmente, aunque algunos parásitos son capaces de unirse a las paredes de la botella. Parece que bajo estas condiciones, el ácido láctico es mortal para Giardia . A pH 7, el efecto inhibidor del lactato aún está presente y se pueden explicar diferencias entre el MRS acidificado y el sobrenadante de la estirpe LalO al suponer diferencias en la concentración de lactato debido a diferencias en la capacidad amortiguadora entre MRS fresco y los sobrenadantes agotados. Se forman agregados de Giardia durante la preincubación de parásitos con sobrenadantes y pueden constituir los altos valores de adhesión encontrados a pH 6 y 7 (Figura 8) . Como se ha establecido antes, los mecanismos y^A-- »^^. ..fc.. &i^^||rpl.rt||^?tt-f¡.t , j ...a^^^,,..^.^^^^ principales para adhesión de Giardia requieren viabilidad del parásito, aunque se puede demostrar adhesión de protozoarios muertos después del tratamiento de trofozoítos con sobrenadantes a pH 4. Estos parásitos no son capaces de multiplicarse y por lo tanto no serán efectivos para producir parasitosis. Además, los sobrenadantes neutralizados de cultivos de bacterias acidolácticas retardan el crecimiento de Giardia y producen agregados incapaces de unirse. En vista de los resultados experimentales anteriores, se vuelve evidente que las bacterias acidolácticas para ser utilizadas de acuerdo con la presente invención se pueden aplicar con éxito para el tratamiento o profilaxis de giardiasis .

Claims (10)

- REIVINDICACIONES

1. Uso de un sobrenadante de cultivo de bacterias acidolácticas o bacterias bífidas, capaces de evitar la adhesión de Giardia intestinalis a células intestinales, para la preparación de un portador ingerible para el tratamiento o profilaxis, o ambas cosas, de trastornos asociados con la colonización del intestino por Giardia intestinalis .

2. El uso de bacterias acidolácticas o bacterias bífidas, que se seleccionan del grupo que consiste de NCC533 (1-1225), NCC90 (1-2332), NCC 189 (1-2333), NCC 200 (1-2334), para la preparación de un portador ingerible para el tratamiento o profilaxis, o ambas cosas, de desórdenes asociados con la colonización del intestino por Giardia intestinalis .

3. El uso, como se describe en la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el microorganismo está contenido en un portador en una cantidad de 106 a 1012 ufc/g.

4. El uso, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el portador ingerible es una composición de alimento o una composición farmacéutica.

5. El uso, como se describe en la reivindicación 4, en donde la composición de alimento se selecciona de leche, yogurt, requesón, queso, leches fermentadas, productos fermentados basados en leche, helados, productos basados en cereal fermentado, polvos basados en leche, fórmulas para lactantes o alimento para mascotas.

6. El uso, como se describe en la reivindicación 4, en donde la composición farmacéutica está en forma de una tableta, una suspensión bacteriana líquida, un suplemento oral seco, un suplemento oral húmedo, alimentación por tubo en seco o alimentación por tubo en húmedo.

7. Bacterias acidolácticas que se seleccionan del grupo que consiste de NCC 189 (1-2333) y NCC, 200 (1-2334) .

8. Alimento o composición farmacéutica, que contiene un microorganismo que se selecciona del grupo que consiste de NCC90 (1-2332), NCC 189 (1-2333), NCC 200 (1-2334) o bacterias bífidas NCC 189 (1-2333) o NCC 200 (1-2334) para el tratamiento o profilaxis, o ambas cosas, de trastornos relacionados con la colonización del intestino por Giardia intestinalis .

9. Alimento o composición farmacéutica, que contiene un sobrenadante de bacterias acidolácticas capaces de evitar la - adhesión de Giardia intestinalis a células intestinales, para el tratamiento o profilaxis, o ambas cosas, de trastornos relacionados con la colonización del intestino por Giardia intestinalis .

10. La composición, como se describe en la reivindicación 8 ó 9, la cual es leche, yogurt, requesón, queso, leches fermentadas, productos fermentados basados en leche, helados, productos basados en cereal fermentado, polvos basados en leche, fórmulas para lactantes o alimento para mascotas, o que está en forma de una tableta, una suspensión bacteriana líquida, un suplemento oral seco, un suplemento oral húmedo, alimentación por tubo en seco o alimentación por tubo en húmedo. ^^Ü^i^MtfMtt