DE60007074T2

DE60007074T2 - Sulfatierte phosphatidylinositole, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60007074T2
Application number: DE60007074T
Authority: DE
Inventors: J. Eric DADEY; Xiao-Hui Mei
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2020-01-13
Also published as: WO2000042050A1; EP1144420A1; US6316424B1; PT1144420E; DK1144420T3; EP1144420B1; CA2356306A1; DE60007074D1; JP2002534528A; ES2214249T3; ATE256134T1; BR0007513A; CA2356306C; AU2503900A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft sulfatierte Phosphatidylinositole und deren Verwendung in der Therapie oder als eine Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems für ein therapeutisches Mittel. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung und Charakterisierung sulfatierter Phosphatidylinositole und deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen und in Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Vielzahl von sulfatierten Polymeren zeigen antivirale Aktivität gegen das menschliche Immundefektvirus (HIV). Baba et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34(1), 134 – 138 (1990), offenbart die Verwendung von sulfatiertem Polyvinylalkohol, Dextransulfan oder einem sulfatiertem Copolymer von Acrylsäure und Vinylalkohol, um die HIV-Replikation und Riesenzellbildung zu eliminieren. In ähnlichen Studien offenbart Mohan et al., Antiviral Research, 18, 139 – 150 (1992), Sulfonsäurepolymere, wie etwa Poly(4-styrolsulfonsäure), Poly(anetholsulfonsäure), Poly(vinylsulfonsäure), Poly(2-acrylamido-2-methyl-lpropansulfonsäure) und Dextransulfat, um HIV und Syncytiumbildung zu inhibieren. Andere Forscher stellten Curdlangalactosesulfat, Curdlanarabinosesulfat und Lentinansulfat aus entsprechenden, nicht-sulfatierten Polysacchariden her. In-vitro-Studien zeigten, daß diese sulfatierten Polysaccharide HIV-Infektion inhibieren, Zellfusionsereignisse blockieren und die Aktivität von Reverser Transkriptase (RT) inhibieren (siehe Yoshida et al., Biochemical Pharmacology, 37(15), 2887 – 2891 (1988)).
Andere Forscher (siehe zum Beispiel, Gustafson et al., J. Nat. Can. Inst., 81(16), 1254 – 1258 (1989) und Ohta et al., Chem. Pharm. Bull., 46(4), 684 – 686 (1998)) fanden heraus, daß bestimmte Sulfolipide die cytopathischen Effekte des HIV-Virus inhibierten und die Syncytiumbildung inhibierten. Diese Sulfolipide sind jedoch natürliche Produkte, die aus Meeresalgen unter Verwendung eines umständlichen Verfahren isoliert werden, um geringe Mengen Sulfolipid zu liefern. Eine relativ große Menge Algen (z.B. 300 Gramm (g) Trockenmasse) wird zum Beispiel gesammelt und das Sulfolipid wird aus den Algen unter Verwendung organischer Lösungsmittel extrahiert, anschließend gereinigt. Dieses Verfahren liefert etwa 3,1 Milligramm (mg) des gereinigten Sulfolipids für eine Gesamtausbeute von 0,0010%. In noch einer weiteren Studie offenbart Barzu et al., J. Med. Chem, 36, 3546 – 3555 (1993), daß natürlich vorkommende sulfatierte Polysaccharide, wie etwa Heparin, Dermatansulfat und mehrere chemisch modifizierte Heparine, die Riesenzellbildung, die normalerweise mit HIV-Infektion assoziiert ist, inhibierten.
Demgemäß haben Polymere und Polysaccharide mit mehreren schwefelhaltigen Säuregruppen in vitro einen positiven aniviralen Effekt auf HIV gezeigt. Harrop et al., Glycobiology, 8(2), 131 – 137 (1998), erklärt dieses Verhalten, indem gezeigt wird, daß radioaktiv markiertes Heparin, das ein natürlich vorkommendes sulfatiertes Polysaccharid ist, sich an spezifische Glycoproteine auf der Virushülle bindet, wodurch der menschliche Immundefektvirus darin inhibiert wird, sich an seinen natürlichen Wirtszellrezeptor, CD4, zu binden.
Obgleich die oben diskutierten sulfatierten Polymere und Polysaccharide in vitro vielversprechend waren, waren die therapeutischen Reaktionen in vivo enttäuschend. Eine signifikante Anzahl von sulfatierten polymeren Materialien sind nicht nur unter dem Gesichtspunkt der Kosten prohibitiv, sondern zeigen auch in vivo eine geringe Wirksamkeit und eine geringe biologische Verfügbarkeit, wenn sie intravenös verabreicht werden. Die sulfatierten polymeren Materialien zeigen auch einen starken, unerwünschten gerinnungshemmenden Effekt. Demgemäß wäre es ein Fortschritt in der Technik, eine Verbindung bereitzustellen, die die therapeutischen, z.B. antiviralen, Vorteile von sulfatierten polymeren Materialien zeigt, während sie deren Nachteile, zum Beispiel das Management von AIDS, überwindet. Die vorliegende Erfindung ist auf solche Verbindungen gerichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf sulfatierte Phosphatidylinositole und deren Verwendung in der Therapie gerichtet. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf die Herstellung und Charakterisiserung sulfatierter Phosphatidylinositole mit der idealisierten Struktur (I) gerichtet, wobei R, unabhängig, H, SO₃H oder SO^– ₃ ist
Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Herstellung und Charakterisierung sulfatierter Phosphatidylinositole.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein sulfatiertes Phosphatidylinositol zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung. Die sulfatierten Phosphatidylinositole können als der Wirkstoff zur Verwendung in einer Behandlung der Erkrankung oder als eine Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein zusätzliches therapeutisches Mittel enthält, verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die einem Individuum verabreicht werden kann, um eine akute oder chronische Erkrankung zu behandeln.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines sulfatierten Phosphatidylinositols als einer Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems für eine wirksamere Zuführung eines therapeutischen Mittels zu einer Zielstelle in einem Individuum.
Die Erkrankung oder der Zustand kann zum Beispiel die Behandlung, Unterdrückung oder Prävention von AIDS sein.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein therapeutisches Mittel und ein Wirkstoffzuführungssystem enthält, wobei das Wirkstoffzuführungssystem ein sulfatiertes Phosphatidylinositol und eine amphiphile Verbindung umfasst, wobei die Zusammensetzung einem Individuum in einer flüssigen Form, entweder oral oder durch Injektion, verabreicht werden kann.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein therapeutisches Mittel und ein sulfatiertes Phosphatidylinositol in einer lyophilisierten Form enthält, so daß das therapeutische Mittel einem Individuum in einer festen Form verabreicht werden kann. Solch eine feste Zusammensetzung ist insbesondere nützlich für die orale Verabreichung eines therapeutischen Mittels an ein Individuum.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein therapeutisches Mittel und ein sulfatiertes Phosphatidylinositol enthält, das ortsspezifisch für verbesserte Zuführung des therapeutischen Mittels und verbesserte Behandlung der betreffenden Krankheit ist.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, eine Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitzustellen, die ein Wirkstoffzuführungssystem und ein therapeutisches Mittel enthält. Das Wirkstoffzuführungssystem umfasst ein sulfatiertes Phosphatidylinositol und eine amphiphile Verbindung. Das Wirkstoffzuführungssystem kann das therapeutische Mittel effektiver zur interessierenden Zielstelle im Individuum zuführen.
Diese und andere neuartige Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, zusammengenommen mit den Figuren, deutlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 enthält FT-IR-Spektren von Phosphatidylinositol (PI) und sulfatiertem Phosphatidylinositol (SPI);
2 ist eine Massenspektrum von SPI, das das relative Vorkommen von SPI-Spezies zeigt;
3 ist ein Diagramm der Oberflächenspannung (dyne/cm) gegen die SPI-Konzentration (Gew.-%);
4 enthält Diagramme der Trübheit (400 nm) gegen die Fraktionszahl für Gelpermeationschromatogramme von einem Liposom, SPI und einem SPI/Liposom; und
5 – 8 sind Diagramme der optischen Dichte gegen die Konzentration (μg/ml), die die Inhibition der HIV Cytopathizität von SPI, einem Liposom, PSLs, Delaviridin und PSL-Liposomen, die Delaviridin enthalten, zeigen.
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Fähigkeit verschiedener sulfatierter Polymere, antivirale Aktivität gegen HIV zu zeigen, ist oben diskutiert. Die mit solchen sulfatierten Polymeren verbundenen Nachteile sind ebenfalls diskutiert worden.
Zusätzlich können gegenwärtig verfügbare Behandlungsregimes eine tägliche Langzeitverabreichung mehrerer therapeutischer Mittel einsetzen, um eine Vielzahl von Erkrankungen, wie zum Beispiel AIDS, zu behandeln. Diese Regimes zur Behandlung von AIDS, und anderen Erkrankungen, beruhen auf der passiven Fähigkeit des Körpers, therapeutische Mittel an Zielstellen zu verteilen. Indem er dies macht, ist der gesamte Körper, einschließlich nicht-befallener Bereiche, jedoch den unerwünschten und potenziellen toxischen Wirkungen der therapeutischen Mittel ausgesetzt. Es wäre daher günstig, ein wirksames Behandlungsregime zu ermöglichen, das das therapeutische Mittel zur infizierten Zielstelle lenkt, während die Gesamtkörper-Exposition begrenzt ist. Man sollte verstehen, daß die Behandlung sich auf Prophylaxe ebenso wie auf Behandlung etablierter Zustände erstreckt.
Wie hierin gezeigt, überwindet die vorliegende Erfindung die Nachteile, die von sulfatierten Polymeren bei der Behandlung von HIV und anderen Erkrankungen gezeigt wurden. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Wirkstoffzuführungssystem bereit, das ein therapeutisches Mittel effektiver zu der Zielstelle in einem Individuum bei der Behandlung einer Erkrankung zuführt. Demgemäß hat die vorliegende Erfindung den Nutzen, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein therapeutisches Mittel und ein Wirkstoffzuführungssystem umfasst, wobei das Wirkstoffzuführungssystem das therapeutische Mittel effektiver zu einer Zielstelle im Individuum zuführt und wobei eine Komponente des Wirkstoffzuführungssystems, d.h. ein sulfatiertes Phosphatidylinositol, ebenfalls therapeutische Aktivität zeigt. Demgemäß verhalten sich das Wirkstoffzuführungssystem und ein therapeutisches Mittel in einer synergitischen An und Weise, wodurch die Gesamtdosis des therapeutischen Mittels, die zur Verwendung bei der Behandlung der Erkrankung erforderlich ist, gesenkt wird, die Wirksamkeit des therapeutischen Mittels erhöht wird und die Therapiedauer verkürzt wird.
Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung die Synthese und Charakterisierung eines neuartigen, chemisch modifizierten Phospholipids, das als ein sulfatieres Phosphatidylinositol bezeichnet wird. Ein sulfatiertes Phosphatidylinositol der vorliegenden Erfindung ist eine neuartige Verbindung, die allein verwendet werden kann, um eine pharmakologische Reaktion hervorzurufen, oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung als ein Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems für ein therapeutisches Mittel verwendet werden kann. Die sulfatiertes Phospatidylinositol enthaltende Zusammensetzung kann zur Verabreichung von therapeutischen Mitteln, einschließlich Peptiden, Proteinen, antiviralen Mitteln, antibakteriellen Mitteln, Antipilzmitteln, antineoplastischen Mitteln, antiprotozoalen Mitteln, antiarthritischen Mitteln und entzündunghemmenden Mitteln, aber nicht hierauf beschränkt, an ein Individuum verwendet werden. Das Wirkstoffzuführungssytem kann zum Beispiel in der Form eines Liposoms, einer Emulsion, einer Micelle, einer Mikroemulsion oder einer gemischten Micelle vorliegen.
Die sulfatierten Phosphatidylinositole haben eine idealisierte Struktur, die als Strukturformel (I) dargestellt wird, wobei jedes R, unabhängig, H, SO₃H oder SO^– ₃ ist. Im allgemeinen werden die sulfatierten Phosphatidylinositole
hergestellt, indem die freien Hydroxylgruppen auf der Zuckereinheit (d.h. der Inositoleinheit) von Phosphatidylinositol mit einem Schwefeltrioxid/Dimethylformamid(S₃/DMF)-Komplex umgesetzt werden. Das sulfatierte Phosphtidylinositol wird dann isoliert, gereinigt und lyophilisiert, um ein weißes amorphes Pulver zu liefern.
Ein oder mehrere Hydroxygruppen werden daher in eine Sulfatgruppe umgewandelt. Typischerweise werden eine bis etwa 5, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 4 Hydroxylgruppen in eine Sulfatgruppe umgewandelt. Um den vollständigen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erzielen, werden etwa 1 bis etwa 3 Hydroxylgruppen in Sulfatgruppen umgewandelt. Das Reaktionsprodukt liefert typischerweise eine Mischung von sulfatierten Phosphatidylinositolen. Die obigen Werte geben die durchschnittliche Anzahl von Sulfatgruppen an, die im sulfatierten Phosphatidylinositol vorliegen.
Insbesondere wird ein sulfatiertes Phosphatidylinositol wie folgt hergestellt. Phosphatidylinositol (>99% Reinheit) wurde bezogen von Avanti Polar Laboratories, Alabaster, AL, und ohne weitere Reinigung verwendet. Das Sulfatierungsmittel, Schwefeltrioxid (SO₃) in Dimethylformamid (DMF), d.h. SO₃/DMF, wurde bezogen von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI. Wasserfreies DMF wurde bezogen von Fisher Scientific, Itasca, IL. Alle anderen Reagenzien waren Chemikalien mit Reagenzqualität, erhältlich von einer Vielzahl chemischer Lieferanten.
Etwa 20 mg Phosphatidylinositol wurden in einer Mischung von 2 ml Chloroform und 0,5 ml wasserfreiem DMF gelöst. Das Phosphatidylinositol wurde durch Zugabe von 180 mg SO₃/DMF-Komplex zu Phosphatidylinositol-Lösung, anschließendes Rühren der resultierenden Lösung für 4 Stunden bei 25°C unter einer Stickstoffdecke sulfatiert. Das Chloroform wurde anschließend unter einer Stickstoffspülung verdampft und die resultierende Mischung wurde in einem Eisbad auf 4°C abgekühlt. Die Reaktion wurde mit 2,4 ml einer 4%-igen Natriumhydroxid-Lösung gelöscht. Die sulfatierten Phosphatidylinositole fielen aus und wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die sulfatierten Phosphatidylinositole wurden in 3 ml Wasser Typ II löslich gemacht und überschüssiges Natriumsulfat wurde durch Interkalation der wässrigen sulfatierten Phophatidylinositol-Lösung durch eine Entsalzungsäule Econo-Pac 10DG, erhältlich von Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, entfernt. Der Ablauf wurde gesammelt und lyophilisiert, um sulfatierte Phosphatidylinositole als ein amorphes weißes Pulver zu liefern.
Wie von Fachleuten verstanden wird, kann der Sulfatierungsgrad, d.h. die Anzahl von Hydroxylgruppen von Phosphatidylinositol, die in Sulfatgruppen umgewandelt werden, gesteuert werden durch Einstellen der Menge von SO₃/DMF-Sulfatierungsmittel, das zur Reaktionsmischung zugegeben wird, und durch die Reaktionszeit. Der Sulfatierungsgrad kann gesenkt werden durch Senken der Menge von SO₃/DMF, die zur Reaktionsmischung zugegeben wird, oder durch Verringern der Reaktionszeit, während der Sulfatierungsgrad erhöht werden kann durch Zugabe von überschüssigem SO₃/DMF zur Reaktionsmischung oder durch Erhöhen der Reaktionszeit.
Eine Vielzahl analytischer und spektroskopischer Techniken wird verwendet, um die Struktur der sulfatierten Phosphatidylinositole (SPI), die mit dem obigen Verfahren hergestellt worden sind, aufzustellen. Die Gewichtsprozent Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Schwefel (d.h. Elementaranalyse) vom Ausgangsmaterial, Phosphatidylinositol (PI) und Reaktionsprodukt, SPI, wurden zum Beispiel bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Daten in Tabelle 1 zeigen, daß die Gewichtsprozent Stickstoff in sulfatiertem Phosphatidylinositol im wesentlichen identisch sind mit den Gewichtsprozent Stickstoff in Phosphatidylinositol-Ausgangsmaterial. Stickstoff sollte in PI oder SPI nicht vorhanden sein und der niedrige, im wesentlichen konstante Stickstoffgehalt weist sowohl auf die Abwesenheit von Verunreinigungen in PI-Ausgangsmaterial als auch auf die Abwesenheit von restlichem Dimethylformamid im SPI-Produkt hin. Zusätzlich stiegen die Gewichts-% Schwefel in den Verbindungen von einer nicht-nachweisbaren Menge in PI auf 12,91% in SPI. Der substantielle Anstieg der Gewichtsprozent Schwefel im SPI-Produkt weist auf den Einbau von Schwefelgruppen in das PI-Ausgangsmaterial hin.
Phosphatidylinositol und sulfatiertes Phosphatidylinositol wurden auch mit Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie analysiert. Festes PI und lyophilisiertes SPI wurden, getrennt, mit wasserfreiem Kaliumbromid (KBr) unter Verwendung eines Mörsers und Stößels zu einem feinen weißen Pulver homogenisiert. Die resultierende feste Mischung wurde verpresst, um ein klares Fenster zu bilden, unter Verwendung einer Infrared-Red-KBr-Presse aus rostfreiem Stahl. Ein Infrarot(IR)-Spektrum wurde dann unter Verwendung eines FT-IR-Spektrometers Mattson Galaxy 4020 aufgenommen. FT-IR-Spektren von PI und SPI sind in 1 angegeben.
Die IR-Spektren von PI, SPI und Heparin (als eine Referenzverbindung) wurden aufgenommen. Ein Vergleich zwischen den IR-Spektren von PI und SPI zeigt, daß die Extinktionen, die der Streckschwingung von Kohlenstoff-Wasserstoff-Einfachbindungen von PI zuzuschreiben sind (bei 2853 und 2925 cm^–1), im SPI beibehalten werden, was darauf hinweist, daß die Kohlenwasserstoffeinheiten von PI während der Sulfatierung nicht hydrolysiert wurden. Überdies weist das Auftreten einer starken Absorption bei 1259 cm ¹ im IR-Spektrum von SPI, das im IR-Spektrum von PI nicht vorhanden ist, auf das Vorhandensein von Sulfatgruppen (-OSO₃H) hin.
Das IR-Spektrum von Heparin, einem endogenen anionischen Polysaccharid, von dem bekannt ist, daß es Sulfatgruppen enthält, wurde mit dem IR-Spektrum von PI und SPI verglichen. Die starke Absorption bei etwa 1250 cm^–1 in Heparin-IR-Spektrum ist identifiziert worden als die Oszillationfrequenzen von Sulfatgruppen, die auch auf dem Heparinmolekül vorhanden sind. (Siehe Bychkov et al., Biochemistry and Biophysics, 91(4), 442 – 445 (1981), und Bychkov et al., Biochemistry and Biophysics, 92(12), 680 – 683 (1981).) Daher legt das Vorhandensein einer starken Absorption bei etwa 1250 cm ¹ im SPI-IR-Spektrum stark das Vorhandensein von Sulfatgruppen nahe. Demgemäß ist eine IR-Analyse von SPI konsistent mit dem Einbau von Sulfatgruppen in ein PI-Molekül ohne Beeinträchtigung der Integrität des PI-Moleküls.
Proben von PI und SPI wurden durch Negativionen-Massenspektrometrie (MS) unter Verwendung eines Massenspektrometers Finnigan LCQ analysiert. Das Spektrum ist in 2 dargestellt und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. In einem MS-Vorexperiment (Daten nicht gezeigt) wurde das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis für PI zu 833,7 Masseneinheiten, d.h. mμ, bestimmt. Das Masssenspektrum von SPI zeigt im wesentlichen keinen Hinweis auf das Vorhandensein von restlichem PI. Signifikante Mengen von Spezies mit Masse-zu-Ladungs-Verhältnissen von 913, 1015, 1117 und 1219 Masseneinheiten wurden jedoch nachgewiesen. Arithmetische Unterschiede zwischen allen diesen Spezies zeigen eine Veränderung von 102 mμ oder Mehrfachen von 102 mμ. Der Unterschied zwischen 1219 und 1117 beträgt z.B. 102 mμ, der Unterschied zwischen 913 und 1015 beträgt 102 mμ und der Unterschied zwischen 913 und 1117 beträgt 204 mμ. Der Verlust oder das Hinzufügen von 102 Masseneinheiten entspricht dem Verlust oder dem Hinzufügen einer Sulfatgruppe.
Der Unterschied von 80 Masseneinheiten zwischen PI (833 mμ) und der Spezies mit 913 mμ entspricht dem Hinzufügen einer Sulfatgruppe und dem gleichzeitigen Verlust eines Natriumatoms. Somit werden die 913, 1015, 1117 und 1219 mμ mono-, di-, tri- bzw. tetrasulfatiertem Phosphatidylinositol zugeordnet. Der Negativionen-Massenspektroskopie-Test zeigt, daß sulfatiertes Phosphatidylinositol (SPI) eine Mischung aus mono-, di-, tri- und tetrasulfatierten Phosphatidylinositolen ist.
Die Oberflächenaktivität von SPI wurde ebenfalls bestimmt. In diesem Test wurden Verdünnungen von SPI hergestellt und die Oberflächenspannung jeder Lösung unter Verwendung eines Fisher Scientific Surface Tensiometers gemessen. Die Oberflächenspannung wurde als eine Funktion der SPI-Konzentration aufgetragen und die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die kritische Micellenkonzentration (CMC) von SPI wurde geschätzt als die minimale Konzentration, bei der die Oberflächenspannung konstant bleibt. Für SPI beträgt die CMC etwa 0,10 mg/ml. Oberflächenspannungsmessungen unter Verwendung von Phosphatidylinositol zeigten keine ähnliche Oberflächenaktivität. Tatsächlich führte die Zugabe von Wasser zu PI zur Bildung von Phosphatidylinositol-Liposomen. Demgemäß verändert das Hinzufügen von Sulfatgruppen zu PI sein wässriges Verhalten, wobei die Neigung des Phospholipids von der Bildung von Vesikeln zur Bildung von Micellen verschoben wird.
Ein sulfatiertes Phosphatidylinositol der vorliegenden Erfindung kann allein verwendet werden (d.h. in Abwesenheit eines weiteren therapeutischen Mittels), um eine Erkrankung zu behandeln. Das sulfatierte Phosphatidylinositol kann auch zusammen mit einem weiteren therapeutischen Mittel verwendet werden, um sowohl eine Erkrankung zu behandeln als auch als eine Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems für therapeutische Mittel zu dienen. Das Wirkstoffzuführungssystem, das ein SPI enthält, verbessert die Zuführung des therapeutischen Mittels zu einer Zielstelle in einem Individuum.
Wenn es allein oder als eine Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, kann ein sulfatiertes Phosphatidylinositol einem Individuum über einen herkömmlichen Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, oraler, Inhalations- (pulmonale Zuführung), nasaler, bukkaler, parenteraler, sublingualer, transdermaler, konjunktivaler, intraokularer, auraler, subkutaner, rektaler, vaginaler und topischer Verabreichung, aber nicht hierauf beschränkt. Orale Verabreichung ist bevorzugt.
Wenn es allein oder als eine Komponente einer therapeutischen Zusammensetzung, entweder als ein Feststoff oder eine Flüssigkeit, verabreicht wird, wird ein sulfatiertes Phosphatidylinositol in Vermischung mit einem Trägerstoff verabreicht, der im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und die pharmazeutische Standardpraxis ausgewählt wird. Das SPI kann z.B. oral, bukkal oder sublingual in der Form von Tabletten verabreicht werden, die Hilfsstoffe, wie etwa Stärke oder Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovuli, entweder allein oder in Vermischung, mit Hilfsstoffen, oder in der Form von Elixieren oder Suspensionen, die Geschmacks- oder Farbstoffe enthalten. Solche flüssigen Zubereitungen können mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoffen hergestellt werden, wie etwa Suspensionsmitteln (z.B. Methylcellulose, einem Glycerid oder Mischungen von Glyceriden, wie etwa einer Mischung aus Aprikosenkernöl und PEG-6-Estern oder Mischungen von PEG-8 und Capryl-/Caprinsäureglyceriden). Ein SPI kann auch parenteral injiziert werden, z.B. intravenös, intramuskulär, subkutan oder intrakoronar. Für parenterale Verabreichung wird SPI typischerweise in der Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet, die weitere Substanzen enthalten kann, z.B. Salze oder Monosaccharide, wie etwa Mannitol oder Glucose, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen.
Wenn es allein in der Therapie verwendet wird oder zusammen mit einem weiteren therapeutischen Mittel, wird ein sulfatiertes Phosphatidylinositol in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 1.000 mg täglich für einen durchschnittlichen Erwachsenen (70 kg), als eine Einzeldosis oder in mehreren Dosen, verabreicht, um die gewünschte pharmakologische Reaktion bereitzustellen, wie etwa antivirale Aktivität gegen HIV.
Ein Vorteil der Verwendung von sulfatiertem Phosphatidylinositol, um eine pharmakologische Reaktion bereitzustellen, ist, daß sulfatierte Phosphatidylinositole ein nominales Molekulargewicht im Gewichtsmittel von etwa 1250 g/mol haben. Ein sulfatiertes Phosphatidylinositol liegt daher im selben Molekulargewichtsbereich wie viele kleinmolekulare therapeutische Mittel, wie Antibiotika, Antikrebsmedikamente und Peptid-und Proteinmedikamente. Zusätzlich stellen die sulfatierten Phosphatidylinositole nicht nur einen therapeutischen Nutzen bereit, sondern überwinden auch Nachteile, die mit der Verwendung von sulfatierten Polymeren in der Therapie verbunden sind, wie etwa hohe Kosten, Schwierigkeiten bei Herstellung oder Isolierung, niedrige Wirksamkeit und biologische Verfügbarkeit und gerinnungshemmende Wirkung.
Als ein zusätzlicher Vorteil kann ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nicht nur wegen seiner therapeutischen Wirkung verwendet werden, sondern auch als eine Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein zusätzliches therapeutisches Mittel enthält. Das Wirkstoffzuführungssystem stellt eine verbesserte Zuführung des therapeutischen Mittels bereit. Solch eine pharmazeutische Zusammensetzung hat die Vorteile, daß sie ein Wirkstoffzuführungssystem aufweist, das ein sulfatiertes Phosphatidylinositol einschließt, welches das therapeutische Mittel effektiver zu einer Zielstelle in einem Individuum zuführt und auch einen therapeutischen Nutzen bereitstellt.
Sulfatierte Phosphatidylinositole sind als eine Komponente in einem Wirkstoffzuführungssystem von pharmazeutischen Zusammensetzungen nützlich, weil, obgleich die sulfatierten Phosphatidylinositole Derivate von Phosphatidylinositol sind, die sulfatierten Derivate viele der physikochemischen Eigenschaften des ursprünglichen Phosphatidylinositols beibehalten, einschließlich eines amphiphilen Charakters. Daher kann ein sulfatiertes Phosphatidylinositol in einem Wirkstoffzuführungssystem eingesetzt werden, das weiter eine amphiphile Komponente enthält. Solche Wirkstoffzuführungssysteme schließen z.B. Liposome, Micellen und gemischte Micellen, Emulsionen und Mikroemulsionen, Gele, Flüssigkristalle, Mikrokügelchen und Nanoteilchen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Ein mit dem sulfatierten Phosphatidylinositol verwendetes Amphiphil ist ein Molekül mit einem wasserlöslichen (hydrophilen) polaren Kopf und einem wasserunlöslichen (hydrophoben) organischen Schwanz. Beispiele für Amphiphile schließen ein anionisches Tensid und Mischungen davon, ein kntionisches Tensid und Mischungen davon, ein nichtionisches Tensid und Mischungen davon oder eine kompatible Mischung von Tensiden ein. Das Tensid kann auch ein ampholytisches Tensid und Mischungen davon oder amphotheres Tensid und Mischungen davon sein, die anionische oder kationische Eigenschaften in Abhängigkeit vom pH der Zusammensetzung aufweisen.
Das Amphiphil kann ein anionisches Tensid sein und insbesondere jedes anionische Tensid mit einer hydrophoben Einheit, wie etwa einer Kohlenstoffkette, die etwa 8 bis etwa 30 Kohlenstoffatome und insbesondere etwa 12 bis etwa 20 Kohlenstoffatome einschließt, und weiter eine hydrophile Einheit besitzt, wie etwa Sulfat, Sulfonat, Carbonat, Phosphat oder Carboxylat. Oft ist die hydrophobe Kohlenstoffkette verethert, wie etwa mit Ethylenoxid oder Propylenoxid, um dem anionischen Tensid eine bestimmte physikalische Eigenschaft zu verleihen, wie etwa erhöhte Wasserlöslichkeit oder verringerte Oberflächenspannung.
Daher schließen geeignete anionische Tenside Verbindungen in den Klassen ein, die bekannt sind als Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylethersulfonate, Sulfatester eines Alkylphenoxypolyoxyethylenethanols, alpha-Olefinsulfonate, Beta-Alkoxyalkansulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylmonoglyceridsulfate, Alkylmonoglyceridsulfonate, Alkylcarbonate, Alkylethercarboxylate, Fettsäuren, Sulfosuccinate, Sarcosinate, Oxtoxynol- oder Nonoxynolphosphate, Taurate, Fetttauride, Fettsäureamidpolyoxyethylensulfate, Isethionate oder Mischungen derselben, sind aber nicht hierauf beschränkt. Zusätzliche anionische Tenside sind in McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, 1993 Annuals (im weiteren McCutcheon's), McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, NJ, S. 263-266, aufgelistet. Zahlreiche weitere anionische Tenside und Klassen von anionischen Tensiden sind offenbart in Laughlin et al., U.S.-Patent Nr. 3,929,678.
Ein bevorzugtes anionisches Tensid ist ausgewählt aus den folgenden Klassen von Tensiden: ein C₈-C₁₈-Alkylsulfat, ein C₈-C₁₈-Fettsäuresalz, ein C₈-C₁₈-Alkylethersulfat mit einem oder zwei Molen Ethoxylierung, ein C₈-C₁₈-Alkaminoxid, ein C₈-C₁₈-Alkoylsarcosinat, ein C₈-C₁₈-Sulfoacetat, ein C₈-C₁₈-Sulfosuccinat, ein C₈-C₁₈-Alkyldiphenyloxiddisulfonat, ein C₈-C₁₈-Alkylcarbonat, ein C₈-C₁₈-alpha-Olefinsulfonat, ein Methylestersulfonat und Mischungen davon. Die C₈-C₁₈-Alkylgruppe enthält 8 bis 16 Kohlenstoffatome und kann geradkettig (z.B. Lauryl) oder verzweigt (z.B. 2-Ethylhexyl) sein. Das Kation des anionischen Tensids kann ein Alkalimetall (vorzugsweise Natrium oder Kalium), Ammonium, C₈-C₁₈-Alkylammonium (mono-, di-, tri-) oder C₁-C₃-Alkanolammonium (mono-, di-, tri-) sein.
Das Amphiphil kann auch ein nicht-ionisches Tensid sein. Typischerweise besitzt ein nichtionisches Tensid eine hydrophobe Base, wie etwa eine langkettige Alkylgruppe oder eine alkylierte Arylgruppe, und eine hydrophile Kette, die eine ausreichende Anzahl (d.h. 1 bis etwa 30) Ethoxy- und/oder Propoxy-Einheiten umfasst. Beispiele für Klassen von nichtionischen Tensiden schließen ethoxylierte Alkylphenole, ethoxylierte und propoxylierte Fettalkohole, Polyethylenglykolether von Methylglucose, Polyethylenglykolether von Sorbitol, Ethylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymere, ethoxylierte Ester von Fett(C₈-C₁₈)säuren, Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen Aminen oder Amiden und Mischungen davon ein.
Beispielhafte nicht-ionische Tenside schließen Methylgluceth-10, PEG-20-Methylglucosedistearat, PEG-20-methylglucosesesquistearat, C_11–15-Pareth-20, Ceteth-8, Ceteth-12, Dodoxynol-12, Laureth-15, PEG-20-rizinusöl, Polysorbat 20, Steareth-20, Polyoxyethylen-10-cetylether, Polyoxyethylen-10-stearylether, Polyoxyethylen-20-cetylether, Polyoxyethylen-10-oleylether, Polyoxyethylen-20-oleylether, ein ethoxyliertes Nonylphenol, ethoxyliertes Octylphenol, ethoxyliertes Dodecylphenol oder ethoxylierten Fett(C₆-C₂₂) alkohol, der 3 bis 20 Ethylenoxid-Einheiten einschließt, Polyoxyethylen-20-isohexadecylether, Polyoxyethylen-23-glycerollaurat, Polyoxyethylen-20-glycerylstearat, PPG-10-Methylglucoseether, PPG-20-Methylglucoseether, Polyoxyethylen-20-sorbitanmonoester, Polyoxyethylen-80-rizinusöl, Polyoxyethylen-15-tridecylether, Polyoxyethylen-6-tridecylether, Laureth-2, Laureth-3, Laureth-4, PEG-3-rizinusöl, PEG-600-dioleat, PEG-400-dioleat und Mischungen davon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Zahlreiche weitere nicht-ionische Tenside sind offenbart in McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, 1993 Annuals, veröffentlicht von McCutheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, NJ, S. 1-246 und 266-272; im CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, 4. Ausgabe, Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Washington, D.C. (1991) (im weiteren CTFA Dictionar) auf den Seiten 1-651; im CTFA Handbook, auf den Seiten 86-94.
Zusätzlich zu anionischen und nicht-ionischen Tensiden können kationische, ampholytische und amphothere Tenside als das Amphiphil verwendet werden. Ampholythische Tenside können breit beschrieben werden als Derivate sekundärer und tertiärer Amine mit aliphatischen Resten, die geradkettig oder verzweigt sind, und wobei einer der aliphatischen Substituenten von etwa 8 bis 18 Kohlenstoffatome enthält und wenigstens einer der aliphatischen Substituenten eine anionische, wasserlöslichmachende Gruppe, z.B. Carboxy, Sulfonat oder Sulfat, enthält. Beispiele für Verbindungen, die unter diese Beschreibung fallen, sind Natrium-3-(dodecylamino)propionat, Natrium-3-(dodecylamino)-Propan-1-sulfonat, Natrium-2-(dodecylamino)ethylsulfat, Natrium-2-(dimethylamino)octadecanoat, Dinatrium-3-(N-carboxymethyldodecylamino)propan-1-sulfonat, Dinatriumoctadecyliminodiacetat, Natrium-1-carboxymethyl-2-undecylimidazol und Natrium-N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-2-sulfato-3-dodecoxypropylamin.
Insbesondere schließt eine Klasse von ampholytischen Tensiden Sarcosinate und Taurate ein, mit der allgemeinen Strukturformel
wobei R¹ C₁₁- bis C₂₁-Alkyl ist, R² Wasserstoff oder C₁-C₂-Alkyl ist, Y CO₂M oder SO₃M ist, M ein Alkalimetall ist und n eine Zahl von 1 bis 3 ist.
Eine weitere Klasse von ampholytischen Tensiden sind die Amidsulfosuccinate mit der Strukturformel
Die folgenden Klassen von ampholytischen Tensiden können ebenfalls verwendet werden:
Zusätzliche Klassen von ampholytischen Tensiden schließen die Phosphobetaine und die Phosphitaine ein.
Spezifische, nicht-beschränkende Beispiele für ampholytische Tenside, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Natrium-kokosnuß-N-methyltaurat, Natriumoleyl-N-methyltaurat, Natrium-tallsäure-N-methyltaurat, Natrium-palmitoyl-N-methyltaurat, Cocodimethylcarboxymethylbetain, Lauryldimethylcarboxymethylbetain, Lauryldimethylcarboxyethylbetain, Cetyldimethylcarboxymethylbetain, Lauryl-bis-(2-hydroxyethyl)carboxymethylbetain, Oleyldimethyl-gammacarboxypropylbetain, Lauryl-bis-(2-hydroxypropyl)carboxyethylbetain, Cocoamidodimethylpropylsultain, Stearylimidodimethylpropylsultain, Laurylamido-bis-(2-hydroxyethyl)propylsultain, Dinatrium-oleamid-PEG-2-sulfosuccinat, TEA-oleamido-PEG-2-sulfosuccinat, Dinatrium-oleamid-MEA-sulfosuccinat, Dinatriumoleamid-MIPA-sulfosuccinat, Dinatrium-rizinolamid-MEA-sulfosuccinat, Dinatriumundecylenamid-MEA-sulfosuccinat, Dinatrium-weizenkeimamido-MEA-sulfosuccinat, Dinatrium-weizenkeimamido-PEG-2-sulfosuccinat, Dinatrium-isostearamido-MEA-sulfo succinat, Cocoamphoglycinat, Cocoamphocarboxylglycinat, Lauroamphoglycinat, Lauroamphocarboxyglycinat, Capryloamphocarboxyglycinat, Cocoamphopropionat, Cocoamphocarboxypropionat, Lauroamphocarboxypropionat, Caprylamphocarboxypropionat, Dihydroxyethyltalgglycinat, Cocamido-dinatrium-3-hydroxypropylphosphobetain, Laurinmyristinamido-dinatrium-3-hydroxypropylphosphobetain, Laurinmyristinamidoglycerylphosphobetain, Laurinmyristinamidocarboxy-dinatrium-3-hydroxypropylphosphobetain, Cocoamidopropyl-mononatrium-phosphitain, Laurinmyristinamidopropyl-mononatrium-phosphitain und Mischungen davon.
Nachdem das sulfatierte Phosphatidylinositol in das Wirkstoffzuführungssystem integriert ist, kann das Wirkstoffzuführungssystem in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, um eine Vielzahl von Wirkstoffen, einschießlich Peptiden, Proteinen, antiviralen Mitteln, antibakteriellen Mitteln, Antipilzmitteln, antineoplastischen Mitteln, antiprotozoalen Mitteln, antiarthritischen Mitteln und entzündungshemmenden Mitteln, aber nicht hierauf beschränkt, zu einer Zielstelle in einem Individuum zuzuführen.
Therapeutische Mittel, die in die pharmazeutische Zusammensetzung einbezogen werden können, schließen entzündungshemmende Wirkstoffe, wie Tereofenamat, Proglumetacin, Tiaramid, Apazon, Benzpiperylon, Pipebuzon, Ramifenazon und Methotrexat; antiinfektiöse Wirkstoffe, wie Isoniacid, Polymyxin, Bacitracin, Tuberactionomycin und Erythromycin, Antiarthritis-Wirkstoffe, wie Penicillamin, Chloroquinphosphat, Glucosamin und Hydroxychloroquin; Diabetes-Wirkstoffe, wie Insulin und Glycogen; und Antikrebs-Wirkstoffe, wie Cyclophosphamid, Interferon α, Interferon β, Interferon γ, Vincristin und Vinblastin ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Geeignete Dosen für solche therapeutischen Mittel zur Verwendung im Zusammenhang mit dem Wirkstoffzuführungssystem können von Fachleuten leicht bestimmt werden.
Ein Wirkstoffzuführungssystem der vorliegenden Erfindung umfasst ein sulfatiertes Phosphatidylinositol und eine amphiphile Verbindung. Das Wirkstoffzuführungssystem liegt typischerweise in der Form eines Liposoms vor, kann aber auch zum Beipsiel eine Emulsion, Mikroemulsion, Micelle, gemischte Micelle, Gel, Flüssigkristall, Mikrokügelchen oder Nanoteilchen sein.
Das Wirkstoffzuführungssystem umfasst ein sulfatiertes Phosphatidylinositol und eine amphiphile Verbindung in einem Gewichtsverhältnis von SPI zu amphiphiler Verbindung von etwa 5 zu 95 bis etwa 95 zu 5 und vorzugsweise etwa 15 zu 85 bis etwa 85 bis 15. Um den vollen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erzielen, ist das Gewichtsverhältnis etwa 75 zu 25 bis etwa 25 zu 75.
Ein Liposom ist ein Membranvesikel, hergestellt aus einem sulfatierten Phosphatidylinositol und einem Phospholipid. Strukturell ist ein Liposom eine zweischichtige sphärische Membran mit polaren Enden von Phospholipiden in einer Schicht, die die Außenfläche der sphärischen Membran bildet, und den polaren Enden von Phospholipiden in einer zweiten Schicht, die die Innenfläche der sphärischen Membran bilden. Die nicht-polaren, hydrophoben Schwänze der Phospholipide in den zwei Schichten richten sich so aus, daß sie das Innere der zweischichtigen Membran bilden.
Die zweischichtige Liposome können Verbindungen mikroenkapsulieren und die Verbindungen durch Umgebungen transportieren, in denen die Verbindung normalerweise abgebaut wird. Liposome sind daher nützlich als Wirkstoffzuführungssysteme.
Ein Wirkstoffzuführungssystem wird zum Beispiel hergestellt, indem ein herkömmliches Liposom aus einem Phospholipid und einem sulfatierten Phosphatidylinositol gebildet wird. Die Phospholipide, die verwendet werden, um ein Liposom zu bilden, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, sind nicht beschränkt. Das Liposom kann daher mit herkömmlichen Techniken aus z.B. Phosphatidylethanolamin (d.h. Cephalin), Phosphatidylcholin (d.h. Lecithin), Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, 3'-O-Lysylphosphatidylglycerol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen davon hergestellt werden. Im allgemeinen kann das Phospholipid jedes Glycerid sein, das mit C₆-C₂₄-Fettsäuren an den 1,2-Positionen verestert ist und mit einem Phosphorsäureesterrest an der 3-Position. Es ist nicht erforderlich, ein gereinigtes Phospholipid zu verwenden, um das Liposom zu bilden. Kommerzielle Phospholipide, wie kommerzielles Lecithin, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und liefern daher wirtschaftliche Vorteile bei der Bereitstellung eines Wirkstoffzuführungssystems der vorliegenden Erfindung.
Um ein Wirkstoffzuführungssystem der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, wurden mehrere Liposom-Formulierungen hergestellt, bei denen ein Teil der normalen Phospholipid-Doppelschicht (d.h. etwa 5 bis etwa 50 Gew.-%) ersetzt wurde durch ein sulfatiertes Phosphatidylinositol. Zum Beispiel wurde kommerziell erhältliches Lecithin (d.h. Phospholipon 80, erhältlich von American Lecithin Company, Oxford, CT) in Ethanol oder Chloroform gelöst, anschließend wurde die resultierende Lösung in einem Rundkolben zu einem dünnen Film getrocknet. Der Film wurde anschließend mit einer wässrigen Lösung von sulfatierten Phosphatidylinositolen hydratisiert. Die resultierenden großen, multilamellaren Liposome wurden durch Beschallung für 5 Minuten in der Größe verringert, gefolgt von wiederholter Extrusion durch eine 200-nm-Membran, um kleinere uni- und multilamellare Liposome herzustellen, die sulfatierte Phosphatidylinositole enthalten, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 200 nm.
Das resultierende polysulfatierte Phospholipid (d.h. PSL) wurde mit Gelpermeationschromatographie getestet. Kolloidale Lösungen des PSLs eines herkömmlichen Liposoms und des SPIs allein wurden durch eine 1 × 20 cm-Säule, gepackt mit Cepharose 6B, interkaliert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung eluiert. Das Eluens wurde in 1,0 ml-Aliquoten gesammelt und jedes Aliquot auf das Vorhandensein von Phospholipid und SPI analysiert. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Die Daten zeigen, daß herkömmliche Liposome zwischen Fraktion 5 und Fraktion 9 (ausgefüllte Kreise) eluieren. Außerdem eluiert auch PSL zwischen Fraktion 5 und Fraktion 9 (leere Kreise). SPI allein eluiert jedoch zwischen Fraktion 9 und Fraktion 17 (ausgefüllte Quadrate). Weil Sepharose 6B Substanzen auf der Grundlage des Molekulargewichts trennt, wobei höher molekulares Material zuerst eluiert, zeigt PSL dasselbe Elutionsprofil wie herkömmliche Liposome. Diese Ergebnisse bestätigen, daß das SPI eine integrale Komponente der PSL-Phospholipid-Doppelschicht ist, im Gegensatz dazu, einfach in wässrigem Medium gelöst zu sein.
Die Teilchengröße und das Zeta-Potential (d.h. die Oberflächenladung) von Liposomen, die sulfatierte Phosphatidylinositole enthalten, wurden gemessen und verglichen mit herkömmlichen Liposomen, die frei von sulfatierten Phosphatidylinositolen sind. Die Testergebnisse sind unten in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Der durchschnittliche Durchmesser und das Zeta-Potential (Oberflächenladung) von herkömmlichen Liposomen und PSL wurden im Anschluß an eine Extrusion durch eine 200-nm-Polycarbonat-Membran bestimmt. Die in Tabelle 2 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß die Einbeziehung eines sulfatierten Phosphatidylinositols in die Lipid-Doppelschicht eines Liposoms den Teilchendurchmesser nicht beeinflusst, aber die Oberflächenladung des Liposoms wird signifikant negativer. Die Zunahme des negativen Charakters der Liposomoberfläche wird dem Vorhandensein mehrerer Sulfatgruppen auf der Vesikeloberfläche zugeschrieben. Gelpermeationschromatographie und Zeta-Potentialmessungen bestätigen, daß ein SPI, wenn es als ein Liposom formuliert wird, sich als ein Phospholipid verhält und an der Doppelschichtbildung teilnimmt.
Das Wirkstoffzuführungssystem, das im obigen Beispiel hergestellt ist, kann mit einem wasserlöslichen Wirkstoff, einem wasserunlöslichen Wirkstoff oder einer Mischung davon formuliert werden. Ein wasserlöslicher Wirkstoff wird von dem Wirkstoffzuführungssystem eingekapselt, wohingegen ein wasserunlöslicher Wirkstoff in der hydrophoben Doppelschicht des Systems angeordnet wird.
Solch ein Wirkstoffzuführungssystem kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verabreichung eines therapeutischen Mittels, z.B. eines Wirkstoffes, an ein Individuum verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält, zusätzlich zum Wirkstoffzuführungssystem (d.h. dem sulfatierten Phosphatidylinositol und der amphiphilen Verbindung), ein therapeutisches Mittel, einschließlich Peptiden, Proteinen, antiviralen Mitteln, wie etwa Azidothymidin, antibakteriellen Mitteln, Antipilzmitteln, antineoplastischen Mitteln, antiprotozoalen Mitteln, antiarthritischen Mitteln und entzündungshemmenden Mitteln, aber nicht hierauf beschränkt.
Insbesondere kann eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung, die ein therapeutisches Mitel und ein vorliegendes Wirkstoffzuführungssystem enthält, durch Vermischen des therapeutischen Mittels und des Wirkstoffzuführungssystems hergestellt werden. Solche wässrigen Zusammensetzungen können durch Injektion oder oral verabreicht werden. Ein weitere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine feste pharmazeutische Zusammensetzung, die ein therapeutisches Mittel und ein Wirkstoffzuführungssystem, in einer lyophilisierten Form, enthält, die verwendet werden kann, um das therapeutische Mittel oral zu verabreichen. In dieser Ausführungsform wird eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung gebildet und die flüssige Zusammensetzung anschließend mit herkömmlichen Techniken lyophilisiert.
Die spezifischen physikochemischen Eigenschaften des Wirkstoffzuführungssystems können durch kluge Auswahl der amphiphilen Verbindung, z.B. des Phospholipids, die verwendet wird, um das Wirkstoffzuführungssystem zu bilden, durch das Gewichtsverhältnis von SPI zu amphiphiler Verbindung und durch die Inkubationszeit eingestellt werden. Die richtige Auswahl eines Wirkstoffzuführungssystems erlaubt auch die Zuführung eines therapeutischen Mittels zu einer bestimmten Zielstelle. Das Wirkstoffzuführungssystem kann daher einen Wirkstoff oder ein therapeutisches Mittel effektiver zur Zielstelle zuführen, um gegen die betreffende Erkrankung zu wirken.
Um die Fähigkeit eines sulfatierten Phosphatidylinositols, eine pharmakologische Reaktion zu liefern, zu belegen, wurden die in-vitro-Anti-HIV-Aktivitäten eines sulfatierten Phosphatidylinositols (SPI), polysulfatierter Liposome (PSLs) und wirkstoffbeladener PSLs wie folgt evaluiert. Eine Reihe von Formulierungen von SPI und PSLs wurden hergestellt und ihre in-vitro-Anti-HIV-Aktivität vom National Cancer Insitute an den National Institutes of Health, Bethesda, MD, unter Verwendung des Verfahrens von Gustafson et al., J. Nat. Can. Inst., 81(16), 1254-1258 (1989), bestimmt. Variierende Konzentrationen von jeder Formulierung wurden mit kultivierten menschlichen Lymphoblastoidzellen vermischt, dann mit Wirtszellen, die chronisch infiziert waren mit HIV-1-Virus, bei 37°C cokultiviert. Nach 7 Tagen wird die Zellkultur mit einer Mischung aus Tetrazoliumsalz XTT und Phenazinmethylsulfat für 4 Stunden inkubiert. Lebensfähige, nicht-infizierte und proliferierende Lymphoblastoidzellen verstoffwechseln diese Mischung zum Chromophor Formazan, während infizierte Zellen dies nicht tun. Formazan absorbiert sichtbares Licht bei 450 nm. Daher ist die erzeugte Menge an Formazan ein direktes Maß für die Zelllebensfähigkeit und folglich eine Abschätzung für die Anti-HIV-Aktivität jeder Formulierung. Die Formazan-Produktion in normalen, nicht-infizierten Zellen wird als Kontrolle markiert.
Die Ergebnisse sind in den 5 bis 7 zusammengefaßt und zeigen, daß ein SPI und ein Liposom, das SPI enthält (d.h. ein PSL), menschliche Lymphoblastoidzellen vor HIV-1-Infektion bei relativ niedrigen Konzentrationen schützen, d.h. bei einer EC_SO (wirksame Dosis), von etwa 15 μg/ml bzw. etwa 25 μg/ml. Positive Anti-HIV-Ergebnisse werden bei etwa 10 μg/ml und etwa 20 μg/ml beobachtet.
Insbesondere wurden die folgenden Zusammensetzungen auf Anti-HIV-Aktivität getestet. Die Daten und wirksame Konzentration (EC₅₀), d.h. die minimale Konzentration, die 50 % der Zellen gegen Infektion schützt, jeder Zusammensetzung sind in den 5 bis 7 zusammengefaßt und die Ergebnisse in Tabelle 3 zusammengefaßt. Kontrollwerte wurden durch Inkubieren von Lymphoblastoidzellen mit jeder Formulierung in der Abwesenheit von HIV erhalten.

1. Sulfatiertes Phosphatidylinositol allein (5) EC₅₀ = 11,55 μg/ml
2. Herkömmliche Liposome (6) EC₅₀ = 180,32 μg/ml
3. Polysulfatierte Liposome (PSLs) (7).

Drei PSL-Zusammensetzungen wurden hergestellt und auf Anti-HIV-Aktivität getestet. Die Menge an Phospholipid in jeder Zusammensetzung ist wie folgt:
Obgleich die Gewichtsprozent SPI in jeder Formulierung unterschiedlich waren, wurde die invitro-Evaluierung auf die SPI-Menge in jeder Formulierung normalisiert, im Gegensatz zur Phospholipidkonzentration insgesamt. Auf der Basis des SPI-Gehalts waren die Ergebnisse für die drei PSL-Zusammensetzungen im wesentlichen identisch, mit einer durchschnittlichen EC_SO von 17,10 μg/ml.
Delaviridin-Mesylat ist ein kommerzieller Anti-HIV-Wirkstoff, erhältlich von BIOMOL Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA). Drei Delaviridin-Zusammensetzungen wurden für die Anti-HIV-Tests hergestellt: Delaviridin allein, Delaviridin, eingekapselt in einem herkömmlichen Liposom, und Delaviridin, eingekapselt in einem PSL. Die EC₅₀-Werte für jede Formulierung sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Delaviridin allein und Delaviridin, eingekapselt in einem herkömmlichen Liposom, zeigen ähnliche Anti-HIV-Aktivität. Delaviridin, eingekapselt in einem PSL, zeigt jedoch einen dreifachen Anstieg der Aktivität. Dieser Anstieg ist einer synergistischen Wirkung zwischen dem Wirkstoff und PSL zugeschrieben worden.
Die obigen Tests zeigen, daß SPI allein potente Anti-HIV-Aktivität besitzt, wohingegen herkömmliche Liposome minimale Anti-HIV-Aktivität besitzen. PSLs (d.h. herkömmliche Liposome, bei denen ein Prozentanteil der Doppelschicht ein SPI umfasst) zeigen eine zu SPI allein äquivalente Anti-HIV-Aktivität, und die Einkapselung eines kommerziell Anti-HIV-Wirkstoffs in einem PSL liefert eine Zusammensetzung mit einer synergistischen Anti-HIV-Aktivität.
Viele Modifikationen und Variationen der Erfindung, wie hierin zuvor dargelegt, können gemacht werden, ohne vom Schutzumfang derselben abzuweichen, und nur solche Beschränkungen sollten auferlegt werden, wie sie durch die beigefügten Ansprüche angegeben sind.

Claims

Sulfatiertes Phosphatidylinositol mit der Struktur
wobei R, unabhängig, H, SO₃H oder SO^– ₃ ist und wobei eine bis fünf R-Gruppen SO₃H oder SO^– ₃ sind.
Sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine bis vier R-Gruppen SO₃H oder SO^– ₃ sind.
Sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine bis drei R-Gruppen SO₃H oder SO^– ₃ sind.
Verbindung oder Mischung von Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem monosulfatierten Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, einem disulfatierten Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, einem trisulfatierten Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, einem tetrasulfatierten Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, einem pentasulfatierten Phosphatidylinositol nach Anspruch 1.
Zusammensetzung, die ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 und einen Trägerstoff umfaßt.
Zusammensetzung, die ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 und ein therapeutisches Mittel umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das therapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Protein, einem antiviralen Mittel, einem antibakteriellen Mittel, einem Antipilzmittel, einem antineoplastischen Mittel, einem antiprotozoalen Mittel, einem antiarthritischen Mittel und einem entzündungshemmenden Mittel.
Zusammensetzung, die ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 und ein Amphiphil umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Amphiphil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem anionischen Tensid, einem nichtionischen Tensid, einem kationischen Tensid, einem ampholytischen Tensid, einem amphoteren Tensid und Mischungen derselben.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Amphiphil ein Phospholipid umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylethanolamin, Lecithin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, 3'-O-Lysylphosphatidylglycerol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen derselben.
Wirkstoffzusammensetzung, die: (a) einen Wirkstoff und (b) ein Wirkstoffzuführungssystem, das ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfaßt, umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Protein, einem antiviralen Mittel, einem antibakteriellen Mittel, einem Antipilzmittel, einem antineoplastischen Mittel, einem antiprotozoalen Mittel, einem antiarthritischen Mittel und einem entzündungshemmenden Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tereofenamat, Proglumetacin, Tiaramid, Apazon, Benzpiperylon, Pipebuzon, Ramifenazon, Methotrexat, Isoniazid, Polymyxin, Bacitracin, Tuberactionomycin, Ethryomycin, Penicillamin, Chloroquinphosphat, Glucosamin, Hydroxycliloroquin, Insulin, Glycogen, Cyclophosphamid, Interferon α, Interferon β, Interferon γ, Vincristin, Delaviridin und Vinblastin.
Wirkstoffzusammensetzung, die: (a) einen Wirkstoff; und (b) ein Wirkstoffzuführungssystem umfaßt, wobei besagtes Wirkstoffzuführungssystem: (i) ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 und (ii) eine amphiphile Verbindung umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffzuführungssystem das sulfatierte Phosphatidylinositol und die amphiphile Verbindung in einem Gewichtsverhältnis von 5 zu 95 bis 95 zu 5 enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffzuführungssystem in der Form eines Liposoms, einer Micelle, einer gemischten Micelle, einer Emulsion, einer Mikroemulsion, eines Gels, eines Flüssigkristalls, eines Mikrokügelchens oder eines Nanoteilchens vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphile Verbindung ein anionisches Tensid, ein nicht-ionisches Tensid, ein kationisches Tensid, ein amphoteres Tensid, ein ampholytisches Tensid oder eine Mischung derselben umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphile Verbindung ein Phospholipid umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylethanolamin, Lecithin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, 3'-O-Lysylphosphatidylglycerol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen derselben.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung lyophilisiert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine Flüssigkeit ist.
Zusammensetzung, die: (a) einen Wirkstoff, der eine Erkrankung behandeln kann, und (b) ein Wirkstoffzuführungssystem, das ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfaßt, umfaßt, zur Verwendung bei der Behandlung der Erkrankung.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffzuführungssystem weiter eine amphiphile Verbindung umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphile Verbindung ein Phospholipid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphile Verbindung Lecithin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung eine HIV-Infektion ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Delaviridinmesylat ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden soll.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung oral verabreicht werden soll.
Therapeutisch wirksame Menge eines sulfatierten Phosphatidylinositols nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Behandlung einer HIV-Infektion.
Sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 31, das weiter eine therapeutische Menge Delaviridin umfaßt.
Sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfatierte Phosphatidylinositol als eine Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems verabreicht werden soll.
Sulaftiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffzuführungssystem weiter ein Amphiphil umfaßt.
Sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Amphiphil ein Phospholipid umfaßt.
Verwendung einer Wirkstoffzusammensetzung, wobei besagte Zusammensetzung: (a) einen Wirkstoff, der eine Erkrankung behandeln kann, und (b) ein Wirkstoffzuführungssystem, das ein sulfatiertes Phosphatidylinositol nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfaßt, umfaßt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffzuführungssystem weiter eine amphiphile Verbindung umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphile Verbindung ein Phospholipid ist.
Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphile Verbindung Lecithin ist.
Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung eine H-Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Delaviridinmesylat ist.
Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung oral verabreicht werden soll.
Verwendung eines sulfatierten Phosphatidylinositols nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer HN-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter die Verabreichung einer therapeutischen Menge Delaviridin umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfatierte Phosphatidylinositol als eine Komponente eines Wirkstoffzuführungssystems verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirkstoffzuführungssystem ein Amphiphil umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß das Amphiphil ein Phospholipid umfaßt.