DE4431309A1 - Gel-Elektrophoreseverfahren zur präparativen Trennung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Gel-Elektrophoreseverfahren zur präparativen Trennung einer Mischung von Makromolekü­ len unterschiedlicher Molekulargewichte in Fraktionen, die Makromoleküle mit gleichen oder annähernd gleichen Molekulargewichten enthalten, mittels einer Gelsäule, de­ ren aus einem Polymer eines gelbildenden Monomers beste­ hende Trennstrecke von der Mischung von einem Eintritts­ ende zu einem Austrittsende durchlaufen wird. Ferner richtet sie sich auf eine Gelsäule eines gelbildenden Polymers zur Verwendung in einem Gel-Elektrophoresever­ fahren, ein Verfahren zur Herstellung einer Gelsäule und eine Gel-Elektrophorese-Apparatur. Sie bezieht sich ins­ besondere auf die Trennung von biologischen Makromolekü­ len wie Proteinen.

Die Elektrophorese ist eine verbreitete Technik, mittels derer elektrisch aufgeladene Moleküle bei ihrer Wanderung durch ein Medium, an das ein elektrisches Feld angelegt ist, getrennt werden. Die Trennung basiert dabei auf der unterschiedlichen Migrationsgeschwindigkeit der Moleküle in dem Medium, die u. a. von der elektrischen Feldstärke, der Ladung und der Größe der Moleküle abhängt. Aufgrund dieser Abhängigkeiten wird die Elektrophorese für viele Trennprozesse verwendet. Praktische Anwendung hat die Elektrophorese in der präparativen und analytischen Che­ mie sowie in der Medizin erlangt. Üblicherweise ist das Medium ein Gel. Das Gel wird durch das elektrische Feld nicht beeinflußt und besteht zumeist aus einem Polymer wie Polyacrylamid oder Agarose.

Die zu trennende Mischung bzw. die Probe wird auf das Eintrittsende des Gels aufgebracht und ein geeignetes elektrisches Feld wird entlang des Gels angelegt. Das Gel hat für präparative Zwecke üblicherweise die Form einer Platte oder einer Säule. Bei den Säulen sind sowohl Zy­ linder- als auch Ringzylindergele gebräuchlich. Das Gel kann außerdem die eigentliche Trennstrecke enthaltenden Trenngel weitere Schichten aufweisen, wie z. B. eine Sam­ melgelschicht. Durch das angelegte elektrische Feld wird die Migration der Makromoleküle der Probe in der Trenn­ strecke des Gels mit unterschiedlichen, von der Größe der Makromoleküle abhängenden Migrationsgeschwindigkeiten ausgelöst. Bei der Wanderung der Makromoleküle durch das Gel kommt es somit auf der Trennstrecke, das ist die Länge des Trenngels und ist die Strecke, in der aufgrund unterschiedlicher Migrationsgeschwindigkeiten die Tren­ nung erfolgt, zu einer räumlichen Separation der Mischung in Banden. Eine Bande ist die mehr oder weniger scharfe Anhäufung einer Untermenge von auf gleicher Höhe migrie­ renden Makromolekülen, also mit ähnlichen Molekularge­ wichten. Die Banden können während der Elektrophorese mittels farbig markierter Makromoleküle oder nach einem Elektrophoreselauf mittels Anfärbungen sichtbar gemacht werden.

Zu analytischen Zwecken wird diese räumliche Separation der Makromoleküle durch chemische Anfärbung sichtbar ge­ macht. Für präparative Zwecke, insbesondere im Milli­ grammbereich, bestehen zwei Möglichkeiten der Isolierung der Makromoleküle aus einem Elektrophorese-Gel. Im Falle von präparativen Plattengelen können die bei der Elektro­ phorese erhaltenen Banden durch Zerschneiden des Gels in Streifen (Gel-Slicing) mit nachfolgender Elution und im Falle von Gelsäulen durch Elution der an dem Austritts­ ende des Gels eintreffenden Makromoleküle getrennt wer­ den. Die letztgenannte Methode wird präparative Elutions- PAGE genannt, wobei PAGE für Polyacrylamid-Gel-Elektro­ phorese steht. In Fällen, in denen die Makromoleküle mit einem ionischen denaturierenden Detergens wie SDS beladen sind, wird die Bezeichnung SDS-PAGE verwendet. Da die elektrophoresische Beweglichkeit von Makromolekülen nur in erster Näherung der Molmasse proportional ist, sollte aus dem Vergleich der relativen Laufstrecke des zu analy­ sierenden Makromoleküls mit der von Markermolekülen be­ kannter Molmasse eine Überprüfung der Proportionalität erfolgen.

Die präparative Elutions-PAGE hat den Vorteil eines ein­ stufigen Prozesses, der zusätzlichen Zeitaufwand, den das Gel-Slicing mit nachfolgender Elektroelution erfordert, vermeidet. Die Homogenität der eluierten Makromoleküle ist bei den bekannten präparativen Elutions-PAGE-Verfah­ ren jedoch nicht zufriedenstellend. Eine allgemeine nach­ teilige Eigenschaft der Gel-Elektrophorese ist das Über­ lappen von Makromolekülbanden, das im analytischen Maß­ stab oft nicht sichtbar ist und das im präparativen Maß­ stab zu Fraktionierungsproblemen führen kann, insbeson­ dere bei einer großen Anzahl zu trennender Makromoleküle in der Probe. Es ist bekannt, daß die Auflösung kritisch von Parametern wie dem Gelvolumen, der Porenkonzentration des Polymers, dem Puffersystem, dem Probenvolumen und der angelegten elektrischen Feldstärke abhängig ist. Es sind daher oft große Anstrengungen erforderlich, die optimalen Bedingungen aufzufinden. Weitere Maßnahmen, die eine Trennung der migrierenden Banden in dem Gel verbessern sollen, sind die Kühlung der Gelmatrix, die sorgfältige Auswahl von Puffer und eine optimierte Elution am Aus­ trittsende der Gelsäule.

Ein Gel-Elektrophorese-System, das in vielen Anwendungs­ fällen brauchbare erste Ergebnisse liefert, ist das Laemmli-SDS-PAGE-System, das in der Veröffentlichung von U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685, beschrieben ist. Aus dem Stand der Technik sind sowohl für analytische als auch für präparative Zwecke Trenngele bekannt, die eine gleichmäßige Konzentration des Monomers aufweisen. Für analytische Zwecke sind auch sogenannte Gradientengele bekannt, bei denen die Konzentration des Monomers in der Migrationsrichtung zunimmt. Ein solches Gradientengel ist beispielsweise aus der EP 0 318 551 B1 bekannt. Aus der Veröffentlichung R. Zardoya et al., BioTechniques 16 (1994) 270, ist ferner ein Gel bekannt, das einen ersten Abschnitt mit einem solchen normalen Gradienten und einen zweiten Abschnitt mit einem inversen Gradienten, also ei­ nem Bereich, in dem die Konzentration abnimmt, aufweist. Die in dieser Druckschrift beschriebene Trennstrecke des Trenngels mit einem normalen und einem anschließenden in­ versen Gradienten wird jedoch nur für analytische Bestim­ mungen mit Hilfe von Flachgelen in Betracht gezogen. Bei Säulengelen im Zusammenhang mit präparativen Trennungen sind bisher nur konstante Konzentrationsverteilungen be­ kannt.

Die Erfindung geht von der Aufgabenstellung aus, die Gel- Elektrophorese bei präparativen Trennungen in Bezug auf die Konzentration und die Reinheit der Fraktionen sowie den benötigten Zeitaufwand zu verbessern.

Zur Lösung dieser Aufgabe bei einem Verfahren der ein­ gangs bezeichneten Art wird vorgeschlagen, daß die Trenn­ strecke der Gelsäule so ausgebildet ist, daß die Migra­ tionsgeschwindigkeiten der Makromoleküle in ihrer Migra­ tionsrichtung im wesentlichen zunimmt. Im wesentlichen bedeutet dabei zum einen, daß die Migrationsgeschwindig­ keitszunahme erheblich ist, d. h. die Migrationsgeschwin­ digkeit um mindestens 10% insgesamt zunimmt, sowie ande­ rerseits, daß die Migrationsgeschwindigkeitszunahme weit­ gehend über die Gesamtlänge der Trennstrecke des Trenn­ gels verteilt erfolgt, d. h. über mindestens 10% der Länge der Trennstrecke die Migrationsgeschwindigkeit zu­ nimmt. Die Erfindung geht von der Überlegung aus, daß es zur Erzielung eines besseren Trennungsgrades vorteilhaft ist, wenn die Makromoleküle im Bereich des Austrittsendes der Trennstrecke einen so großen Abstand haben, daß keine relevante Überlappung der in verschiedene Fraktionen zu trennenden Banden vorliegt, ohne daß dabei jedoch die je­ weilige Bande einer zu starken Diffusionsverbreiterung und damit Konzentrationsverringerung unterliegt. Dies läßt sich durch die erfindungsgemäße Maßnahme erreichen.

Die Erfindung läßt sich folgendermaßen erklären. Auf der Grundlage theoretischer Überlegungen läßt sich herleiten, daß der Migrationsweg bei einer konstanten Gelkonzentra­ tion eine lineare Funktion der Zeit ist, wobei die Ge­ schwindigkeit von dem Molekulargewicht abhängt. Bei gege­ benem Molekulargewicht hängt die Migrationsgeschwindig­ keit, wie bereits eingangs beschrieben wurde, von der Po­ rengröße des Polymers ab. Diese ist wiederum von der Kon­ zentration des gelbildenden Monomers abhängig, und zwar in der Weise, daß bei zunehmender Konzentration die Po­ rengröße verringert ist. Die Verbesserung des Trenngra­ des, die durch eine überproportionale Zunahme der Banden­ abstände im Laufe der Elektrophorese zum Ausdruck kommt, läßt sich somit durch die molekulargewichtsabhängige Zu­ nahme der Migrationsgeschwindigkeit aufgrund zunehmender Porengrößen des Polymers, gleichzusetzen mit einer Ab­ nahme der Monomerkonzentration im resultierenden Trenn­ gel, erzielen.

Die von den Makromolekülen durchwanderte Trennstrecke der Gelsäule kann in Abstimmung mit dem gewählten Migrations­ geschwindigkeitsprofil bzw. Porengrößen- oder Monomerkon­ zentrationsprofil so bemessen werden, daß der gewünschte Trennungsgrad für die Fraktionen der zu trennenden Mi­ schung erreicht wird. Die Migrationsgeschwindigkeit von bestimmten Makromolekülen in einem gewählten Gel kann durch experimentelle Untersuchungen ermittelt werden. Dasselbe gilt auch für die Bemessung der Zunahme der Mi­ grationsgeschwindigkeit und die Länge der Gelsäule und entsprechend für die Porengröße des Polymers bzw. die zu­ gehörige Konzentration des Monomers. Ein vorteilhaftes Merkmal der Erfindung kann darin bestehen, daß die Trenn­ strecke der Gelsäule kleiner als 6 cm sein kann. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Migrationsgeschwindigkeit der Makromoleküle erfindungsgemäß zunimmt und damit eine Verkürzung der Trennstrecke im Vergleich zu üblichen PAGE-Verfahren möglich ist. Aus diesem Grund wird das er­ findungsgemäße Verfahren nachfolgend abgekürzt als SPRING-PAGE-Verfahren, das für "short preparative inverse gradiant PAGE" steht, bezeichnet. Die kürzere Gellänge hat den Vorteil, daß die Trennung in kürzerer Zeit durch­ führbar ist. Hierdurch ist auch die diffusionsbedingte Bandenverbreiterung, die von der Gellänge sowie von der Migrationszeit abhängt, geringer, wodurch eine bessere Trennung erzielt wird und die Konzentration der Makromo­ leküle in den Fraktionen höher ist. Ein weiterer Vorteil ist der verminderte Bedarf an Gel sowie an kühlendem Elektrodenpuffer, der zur Verringerung der Diffusion und zur Makromolekül-Schonung verwendet wird. Eine vorteil­ hafte Ausbildung kann darin bestehen, daß das Verhältnis aus der Länge der Trennstrecke der Gelsäule zu der Qua­ dratwurzel aus der Querschnittsfläche der Gelsäule klei­ ner als 1,1 ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorteilhafterweise derart ausgestaltet, daß der Unterschied zwischen maxima­ ler und minimaler Migrationsgeschwindigkeit in der Trenn­ strecke mehr als 10%, bevorzugt mehr als 80% der mini­ malen Migrationsgeschwindigkeit beträgt. Das Migrations­ geschwindigkeitsprofil kann optimal auf das jeweilige Trennproblem ausgerichtet sein. Die Zunahme der Migra­ tionsgeschwindigkeit auf der Trennstrecke der Gelsäule kann stetig oder unstetig erfolgen. Eine theoretisch un­ stetige Migrationsgeschwindigkeitsänderung kann bei­ spielsweise eine Abhängigkeit der Migrationsgeschwin­ digkeit von dem Migrationsweg in Form einer Treppenfunk­ tion sein, also eine stufenförmige Änderung. In der Pra­ xis ist es jedoch kaum möglich, ein Trenngel herzustel­ len, das eine unstetige Migrationsgeschwindigkeitsände­ rung aufweist, da in dem Übergangsbereich der Grenz­ schicht zwischen zwei Zonen unterschiedlicher Migrations­ geschwindigkeiten eine stetige Migrationsgeschwindig­ keitsänderung bewirkt wird. Unter unstetiger Geschwindig­ keitsänderung im Sinne der Erfindung wird daher auch eine Änderung verstanden, die aufgrund von mindestens zwei Trenngelabschnitten (sogenannten diskontinuierlichen Systemen) zu einer erheblichen Geschwindigkeitsänderung führt.

Die Migrationsgeschwindigkeitszunahme kann weitgehend gleichmäßig, d. h. über mindestens 10% der Länge der Trennstrecke verteilt zunehmen. Dabei ist nicht ausge­ schlossen, daß sie in manchen Teilbereichen konstant ist oder sogar wieder abnehmen kann. Die Migrationsgeschwin­ digkeit kann vorzugsweise monoton, beispielsweise nähe­ rungsweise gleichmäßig verteilt zunehmen. Ein solches Ge­ schwindigkeitsprofil ist in praktisch besonders einfacher Weise dadurch herstellbar, daß die Porengröße des Poly­ mers in Migrationsrichtung linear abnimmt. Da die Migra­ tionsgeschwindigkeit annähernd linear von der Porengröße abhängt, ergibt sich in diesem Fall eine exponentielle Abhängigkeit des Migrationsweges von der Zeit was gleich­ bedeutend mit einer linearen Abnahme der reziproken Migrationsgeschwindigkeit ist. Unter weitgehend gleich­ mäßiger Geschwindigkeitszunahme wird dabei eine Zunahme verstanden, bei der die Abweichung des Migrationsweges vom streng exponentiellen Verlauf maximal 10% beträgt.

Die erfindungsgemäße Gelsäule eines gelbildenden Polymers zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren weist die Besonderheit auf, daß die Porengröße des Polymers von dem Eintrittsende der Trennstrecke zum Austrittsende im wesentlichen zunimmt. Im wesentlichen bedeutet dabei, wie bereits bei der Migrationsgeschwindigkeitszunahme ausge­ führt, daß die Porengrößenzunahme einerseits erheblich ist, d. h. um mindestens 10% insgesamt zunimmt, sowie an­ dererseits, daß sie weitgehend über die Länge des Trenn­ gels verteilt erfolgt, d. h. über mindestens 10% der Länge der Trennstrecke die Porengröße zunimmt.

Die Gelsäule kann als Massivsäule oder als Ringsäule aus­ gebildet sein und vorteilhafterweise eine Trennstrecke von weniger als 6 cm Länge aufweisen. Die Gelsäule läßt sich vorteilhafterweise dadurch herstellen, daß die das Polymer bildende Monomerlösung in eine Gießform gegossen wird, um eine in der Gießform ruhende Gelflüssigkeit zu bilden, aus der durch anschließende Polymerisation die Gelsäule gebildet wird, wobei die Gelflüssigkeit derart aus einer Schichtung von Monomerlösung unterschiedlicher Monomerkonzentration gebildet wird, daß die Konzentration des Monomers in der Trennstrecke der Gelsäule vom Ein­ trittsende zum Austrittsende im wesentlichen abnimmt. Die Schichtung der Monomerlösung in der Gießform erfolgt durch das Mischen einer höher und einer niedrig konzen­ trierten Monomerlösung, beispielsweise unter Verwendung eines linearen handelsüblichen Gradientenmischers. Dabei ist das Mischungsverhältnis der in die Gießform gegosse­ nen Monomerlösungen in der Weise zu variieren, daß sich das gewünschte Konzentrationsprofil einstellt.

Für das Eingießen der Monomerlösung in die Gießform be­ stehen grundsätzlich zwei Möglichkeiten. Die eine ist darin zu sehen, daß die Gelflüssigkeit der vor der Poly­ merisation noch flüssigen Gelsäule durch Unterschichtung gebildet wird. Dabei wird die Monomerlösung im Bereich des Bodens der Gießform mit zeitlich abnehmender Monomer­ konzentration eingeleitet. So ergibt sich eine mit der Tiefe der Gelflüssigkeit abnehmende Konzentration bzw. zunehmende Porengröße. Die andere Möglichkeit besteht darin, die Gelflüssigkeit durch Aufschichtung zu bilden. Dabei wird die Monomerlösung mit zeitlich zunehmender Konzentration im oberen Bereich der Gießform eingeleitet. So ergibt sich das gleiche Konzentrationsprofil wie zu­ vor. Im allgemeinen ist eine Unterschichtung vorteil­ hafter, weil dadurch die Durchmischung der Schichtung beim Einfüllen geringer ist.

Nach einem bevorzugten Merkmal wird vorgeschlagen, daß der Monomerlösung ein Zusatz beigemischt wird, der die Stabilität des Konzentrationsprofils der Gelflüssigkeit vor der Polymerisation gewährleistet und bezüglich der Gel-Elektrophorese inert ist, wobei der Anteil des Zu­ satzes von dem Eintrittsende zu dem Austrittsende der Trennstrecke zunimmt. Dieser Zusatz dient der Stabilisie­ rung der Schichtung in der Gelflüssigkeit vor der Polyme­ risation. Durch den Zusatz wird auch bei von oben nach unten in der Gelflüssigkeit abnehmender Monomerkonzentra­ tion eine mit der Tiefe zunehmende Dichte der Gelflüssig­ keit und dadurch die Stabilitätsverbesserung erreicht. Der Zusatz kann beispielsweise Sucrose, Glyzerin oder eine andere geeignete Substanz sein. Er ist vorzugsweise spezifisch schwerer und wird vorteilhafterweise der ge­ ringer konzentrierten Monomerlösung beigemischt und be­ wirkt dadurch die Erhöhung der physikalischen Dichte ge­ genüber der höher konzentrierten Monomerlösung, so daß die Dichte der Gelflüssigkeit mit der Tiefe zunimmt.

Die Gelsäule kann weiterhin vorteilhafterweise in der Weise hergestellt werden, daß eine Gießform verwendet wird, die eine beidseitig offene Außenhülse aufweist, deren Außendurchmesser so bemessen ist, daß sie in die Gelkammer einer Gel-Elektrophorese-Apparatur einschiebbar ist, und die an ihrem dem Austrittsende der Trennstrecke zugewandten Ende der Außenhülse einen Kragenrand auf­ weist, dessen Außendurchmesser größer als der der Außen­ hülse ist und der zur Abdichtung der Außenhülse gegen eine Grundplatte gedrückt wird, wobei die Monomerlösungen in einem sich zeitlich ändernden Verhältnis zu der Mono­ merlösung zusammengemischt und die Monomerlösung mittels eines Einfüllmittels in die Gießform eingefüllt wird. Die Einfüllung in die Gießform kann sowohl durch Unterschich­ tung als auch durch Überschichtung erfolgen. Das Gießen der Gelflüssigkeit kann direkt in der Gel-Elektrophorese- Apparatur erfolgen, in der die Gelsäule verwendet werden soll. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Außen­ hülse ist es jedoch möglich, die polymerisierte Gelsäule als sogenanntes Precast, also als vorgefertigte Gelsäule herzustellen und dem Benutzer zur Verfügung zu stellen. Somit läßt sich die erfindungsgemäße Gelsäule in großem Maßstab und mit gleichbleibender Qualität als vorgefer­ tigtes Teil fabrikmäßig herstellen und an Benutzer ver­ senden, wodurch für die Benutzer Qualitäts-, Zeit- und Kostenvorteile erzielt werden.

Zur Herstellung einer als Ringsäule ausgebildeten Gel­ säule wird ferner vorgeschlagen, daß die Gießform eine Innenhülse aufweist, die an ihrem dem Eintrittsende der Trennstrecke zugewandten Ende offen ist, deren Außen­ durchmesser kleiner als der Innendurchmesser der Außen­ hülse ist, deren dem Austrittsende der Trennstrecke zuge­ wandtes Ende bündig mit dem Kragenrand und der Grund­ platte dichtend abschließt und die an ihrem dem Aus­ trittsende der Trennstrecke zugewandten Ende umfangsver­ teilt angeordnete Innenhülsen-Penetrationsöffnungen für Monomerlösung aufweist. Die Gießform hat Verbindungs­ stege, mittels derer die Innenhülse mit der Außenhülse verbunden ist, und eine Einsatzhülse, deren dem Ein­ trittsende der Trennstrecke zugewandtes Ende offen ist, die genau eingepaßt in die Innenhülse eingesetzt ist, deren dem Austrittsende der Trennstrecke zugewandtes Ende mittels einer Bodenplatte verschlossen ist und die an ihrem dem Austrittsende der Trennstrecke zugewandten Ende umfangsverteilt angeordnete Einsatzhülsen-Penetrations­ öffnungen aufweist. Diese wirken mit den Innenhülsen- Penetrationsöffnungen derart zusammen, daß in die Ein­ satzhülse eingefüllte Monomerlösung durch die Einsatz­ hülsen- und Innenhülsen-Penetrationsöffnungen in den Zwischenraum zwischen Außenhülse und Innenhülse fließt.

Nach der Polymerisation der Gelflüssigkeit wird die Ein­ satzhülse entfernt.

Eine erfindungsgemäße Gel-Elektrophorese-Apparatur kann insbesondere dadurch gekennzeichnet sein, daß die zur Aufnahme einer Gelsäule ausgebildete Gelkammer kürzer als 6 cm ist. Wegen der kurzen Bauform der Gelsäule kann es besonders vorteilhaft sein, wenn das Austrittsende der Gelsäule für die Bedienperson einsehbar ist, um die füh­ rende Makromolekülfront auch bei ihrem dortigen Eintref­ fen sehen zu können, um die Elektrophorese entweder zu diesem Zeitpunkt zu beenden oder die Elution einzuleiten.

Die Vorteile der Gel-Elektrophorese nach dieser Erfindung gegenüber dem Stand der Technik bestehen darin, daß die Verbreiterung der Makromolekülbanden und die dadurch be­ dingte Verdünnung der Fraktionen und Vermischung der Ma­ kromolekülbanden durch Makromoleküle mit ähnlichem Mole­ kulargewicht verringert wird. Insgesamt ist das erfin­ dungsgemäße SPRING-PAGE-Verfahren effektiver. Die höhere Effektivität kann je nach Auslegung mehr eine kürzere Trennzeit betreffen oder mehr eine geringere Verdünnung der Fraktionen; es können auch beide Vorteile gleichzei­ tig zur Geltung kommen. Ferner wird der Bedarf an Trenn­ gel und weiteren Zusatzstoffen reduziert.

Die Erfindung wird im folgenden anhand in den Figuren schematisch dargestellter Ausführungsbeispiele näher er­ läutert.

Es zeigen

Fig. 1 eine Gel-Elektrophorese-Apparatur nach dem Stand der Technik,

Fig. 2 ein Weg-Zeit-Diagramm der Migration in einem Trenngel nach dem Stand der Technik,

Fig. 3 ein Weg-Zeit-Diagramm der Migration in einem Trenngel nach der Erfindung,

Fig. 4 ein experimentelles Ergebnis der Überprüfung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Proteinen bekannter Molekulargewichte,

Fig. 5 eine Auswertung zu Fig. 4,

Fig. 6 experimentelle Ergebnisse einer untersuchten Substanz,

Fig. 7 einen Querschnitt einer Einsatzhülse einer Gieß­ form,

Fig. 8 eine Aufsicht zu Fig. 7,

Fig. 9 einen Querschnitt einer Innenhülse mit Außen­ hülse einer Gießform,

Fig. 10 eine Aufsicht zu Fig. 9,

Fig. 11 einen Querschnitt einer Gießform mit Außen­ hülse, Innenhülse und eingesetzter Einsatz­ hülse,

Fig. 12 eine Aufsicht zu Fig. 11,

Fig. 13 das Gießen einer Gelsäule mit einer Gießform im Querschnitt,

Fig. 14 eine erfindungsgemäße Gelgieß-Einrichtung zur Herstellung einer Gelsäule und

Fig. 15 eine Mittelsäule mit Spurrillen und kegelförmi­ gem Kopf.

In Fig. 1 ist eine gebräuchliche Gel-Elektrophorese-Appa­ ratur 1 zur präparativen Trennung von Biomolekülen wie Proteinen oder Nukleinsäuren im Bereich von 1 mg bis 250 mg Ausgangssubstanz dargestellt. Sie kann zur denaturie­ renden SDS-PAGE oder naturen PAGE benutzt werden, um Pro­ teine für die Sequenzanalyse, Antikörperproduktion, enzy­ matische Kinetikstudien, Kristallographie oder derglei­ chen Anwendungen zu trennen. Aus einer Probe mit einer Mischung von Makromolekülen kann mit einer solchen Appa­ ratur unter denaturierenden Bedingungen bei kontinuierli­ cher Elutionselektrophorese eine Auflösung, Isolierung und Sammlung von Makromolekülen erreicht werden.

Das Kernstück der Apparatur 1 ist die Gelsäule 2 in der Gelkammer 3. Die Gelsäule 2 besteht aus einem Polyacryl­ amidgel und wird von einem im Inneren angeordneten Kühl­ kern 4 gekühlt. An der Gelsäule 2 wird mittels der An­ schlußleitungen 6 von einem Netzgerät 5 eine Spannung angelegt. Die Probe mit der zu trennenden Mischung an Ma­ kromolekülen wird direkt auf die Oberseite des Gels auf­ gebracht. Wenn die Moleküle durch die Gelmatrix migrieren separieren sie in ringförmige Banden 7, da die Migrati­ onsgeschwindigkeit von dem Molekulargewicht abhängt. Auf diese Weise wird eine Trennung der Biomoleküle bei ihrer Migration von dem Eintrittsende 22 der Gelsäule 2 auf der Eintrittsseite 8 der Gelkammer 3 zu dem Austrittsende 23 der Gelsäule 2 auf der Austrittsseite 9 der Gelkammer 3 in Fraktionen erzielt. An dem Austrittsende 23 werden die Banden 7 mittels einer Elutionsfritte 16 und einer Elu­ tionskammer 10 eluiert. Die Elution erfolgt dabei derart, daß die Banden durch Elutionspuffer 11 aus dem Elutions­ pufferreservoir 12 mittels einer Elutionspumpe 13 in der Elutionskammer 10 radial zum Zentrum der Fritte 16 durch den Fluß des Elutionspuffers 11 transportiert werden. Mittels der im Zentrum angeordneten senkrecht nach oben steigenden Sammelleitung 14 werden die Moleküle mittels der peristaltischen Pumpe 13 am Elutionsauslaß 17 zum Fraktionssammler abgesaugt. Mit 18 ist das Elektroden­ pufferreservoir der Kathode und mit 19 das der Anode bezeichnet.

Um die Diffusion zu verringern und damit eine bessere Mi­ gration der Fraktionen in parallel verlaufenden Banden zu erreichen, wird mittels des Kühlkerns 4 die Temperatur eines Gelquerschnitts konstant gehalten. Die Gelkammer 3 ist vollständig in Elektrophoresepuffer 15 getaucht, der das Gel von außen kühlt. Um den Wärmetransport in dem Gel zu verbessern, wird kontinuierlich Elektrophoresepuffer 15 durch den Kühlkern 4 im Inneren der Gelkammer 3 mit­ tels einer nicht dargestellten Elektrodenpufferpumpe ge­ pumpt. Die Trennstrecke umfaßt in dem dargestellten Bei­ spiel die gesamte Länge der Gelsäule 2, die ein Ringgel enthält. Nach dem Stand der Technik besteht das Polymer der Gelsäule 2 aus einer homogenen Verteilung einer poly­ merisierten Monomerlösung, d. h. die Porengröße des Poly­ mers ist überall in der Trennstrecke gleich groß und so­ mit auch die jeweilige Migrationsgeschwindigkeit für Makromoleküle eines bestimmten Molekulargewichtes.

In Fig. 2 ist der aufgrund theoretischer Betrachtungen herleitbare Zusammenhang des Migrationsweges x, der in relativen Einheiten angegeben ist, als Funktion der Elek­ trophoresezeit t dargestellt. Den theoretischen Betrach­ tungen liegt die Überlegung zugrunde, daß Polyacrylamid­ gele aus zufällig orientierten Anhäufungen linearer Poly­ merfäden bestehen, wobei die resultierende Porengröße eine nicht gaußförmige Verteilung hat. Da die Porengröße derartiger langkettiger Gele exponentiell von der Gesamt­ acrylamidkonzentration T abhängt, kann die Migration re­ lativ kleiner Teilchen durch diese Matrix mittels des Verhältnisses der verringerten Mobilität (Geschwindigkeit der Proteine) zu der freien (unverminderten) Mobilität (Geschwindigkeit des führenden Ions, die ungefähr gleich der Bandenlaufgeschwindigkeit ist) ausgedrückt werden. Dabei geht der Retardierungskoeffizient ein, der die mo­ lekulare Oberfläche des migrierenden Makromoleküls defi­ niert. Für ein Gel mit einer konstanten totalen Monomer­ konzentration T ergibt sich der in Fig. 2 dargestellte lineare Zusammenhang. Die Gelkonzentration T beträgt 10%. Dargestellt ist die theoretische Kurve für zwei Proteine P1 und P2, wobei P1 ein höheres Molekulargewicht hat als P2. Aufgrund der unterschiedlichen Molekularge­ wichte haben die beiden Proteine P1 und P2 unterschiedli­ che Retardierungskoeffizienten, was zu einer unterschied­ lichen Migrationsgeschwindigkeit führt. Der zurückgelegte Migrationsweg x nimmt linear mit der Zeit t zu. Ebenfalls dargestellt ist die Differenz DP der Migrationswege, die eine lineare Funktion der Zeit ist. Bei x = 0 ist das Eintrittsende 22 und bei x = 1 ist das Austrittsende 23 der Gelsäule 2.

In Fig. 3 ist ein Weg-Zeit-Diagramm für die selben Pro­ teine P1 und P2 für den Fall dargestellt, daß die Konzen­ tration T des Gels von dem Eintrittsende 22 zu dem Aus­ trittsende 23 linear abnimmt, das Gel also ein Konzentra­ tionsprofil aufweist, das man als inversen Gradienten be­ zeichnen kann. Die Gelkonzentration T wurde dabei für das Eintrittsende zu 15% und für das Austrittsende zu 5% angenommen, so daß der Mittelwert dem der Fig. 2 ent­ spricht und sich nahezu die gleiche Elutionsgesamtzeit ergibt. Der Migrationsweg ist in diesem Fall exponentiell von der Zeit abhängig. Dasselbe gilt auch für die Kurve DP, die den Abstand der beiden Proteinbanden angibt.

Der Vergleich der Fig. 2 und 3 zeigt, daß der Abstand der Proteinbanden der beiden Proteine P1 und P2 zu dem Elutionszeitpunkt TE, zu dem das schneller laufende Pro­ tein P2 eluiert wird, für den Fall des inversen Gradien­ ten größer ist als bei einer homogenen Konzentration. Es wird daher eine größere Auflösung erzielt. Es könnte aber auch in dem Beispiel gemäß der Fig. 3 die Elutionsdauer reduziert, d. h. die Trennstrecke verkürzt werden, um die selbe Auflösung wie in Fig. 2 zu realisieren. Da die Dif­ fusionsverbreiterung der Banden im wesentlichen von der Elutionsdauer abhängig ist, ergibt sich dabei eine ver­ besserte Bandenschärfe und somit eine höhere Konzentra­ tion und Trennung der Fraktionen. Die jeweilige Auslegung des Konzentrationsprofils und der Länge der Trennstrecke ist eine Frage des Einzelfalls und kann durch theore­ tische Überlegungen, anhand von Erfahrungswerten oder durch experimentelle Vergleiche getroffen werden.

Zum experimentellen Nachweis der oben erläuterten Theo­ rie, daß der Migrationsweg jeder einzelnen Proteinbande exponentiell mit der Migrationszeit zunimmt, wenn ein in­ verses Gradientengel verwendet wird, dessen Konzentration linear von einem hohen auf einen niedrigen Wert abnimmt, wurde ein vorgefärbter SDS-PAGE-Proteinstandard mit einem Molekulargewichtsbereich von 18,5 kDa, 27,5 kDa, 32,5 kDa, 49,5 kDa, 80 kDa und 106 kDa in einem 2 cm langen Flachgel mit einem linearen inversen Gradienten von 15% bis 5% T (zuzüglich 0,7 cm 4% Sammelgel) für die Dauer von zwei Stunden wie weiter unten bei einer un­ tersuchten Substanz beschrieben elektrophoresiert. Zum Zeitpunkt Null bei Eintritt der Probe in das Trenngel wurde das Gel mittels einer Digitalkamera photografiert ohne die Elektrophorese zu stören. Die Aufnahme wurde alle fünf Minuten wiederholt. In Fig. 4 ist das re­ sultierende Bandenmuster als Funktion der Zeit darge­ stellt. Der Effekt der exponentiellen Zunahme des Migra­ tionsweges ist deutlich sichtbar. Der Migrationsweg für jedes Protein wurde von den digitalisierten Photografien mittels einer Graphikcomputersoftware bestimmt. In Fig. 5 sind die entsprechenden Meßpunkte und die daran angepaß­ ten exponentiellen Kurvenverläufe für jedes Markerprotein dargestellt, die zeigen, daß die elektrophoresierten Pro­ teine sich der Theorie entsprechend verhalten.

Damit wurde gezeigt, daß das 2 cm lange Trenngel mit ei­ nem linearen inversen Gradienten von 15 bis 5% T geeig­ net ist, Molekulargewichte im Bereich von 30 bis 50 kDa zu trennen. Um dies zu bestätigen, wurde eine besonders schwierig zu untersuchende Testsubstanz untersucht, die mit bisher bekannten präparativen Verfahren nur schwer in Untereinheiten trennbar war. Eine bekannte Möglichkeit zur Trennung stellt das High-Perfomance-Liquid-Chromato­ graphie-Verfahren (HPLC) dar, das jedoch für bestimmte Proteinarten aufgrund besonderer physikalischer Eigen­ schaften gar nicht oder nur sehr eingeschränkt zur An­ wendung kommt. Klassische Vertreter dieser ausgeprägt amphiphatischen Proteine sind sogenannte integrale Mem­ branproteine, die in vielen Bereichen der Biowissenschaf­ ten Gegenstand intensiver biochemischer Forschung sind. In diesen Fällen ist die Gel-Elektrophorese die Methode der Wahl zu präparativen Trennung. Ein typisches Beispiel einer durch präparative HPLC schwer oder nur sehr ineffi­ zient zu trennenden Proteinprobe stellt der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) mit seinen vier Unterein­ heiten (alpha, beta, gamma, delta) dar. Die Erfindung er­ möglicht eine Effizienz der Fraktionierung der nAChR-Un­ tereinheiten mittels präparativer Gel-Elektrophorese, die bisher nicht erreicht werden konnte.

Bei der Testsubstanz handelt es sich um Torpedomembran­ fragmente (TMF), die aus dem elektrischen Organ des Torpedo mamorata (biologische Station von Arcachon, Frankreich) präpariert und darin enthaltene nikotonische Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) durch Sucrose Dichte-Zen­ trifugation und pH11-Behandlung angereichert wurde. Der nAChR besteht aus vier verschiedenen Glycoproteinen mit Molekulargewichten von alpha: 40 kDa, beta: 50 kDa, gamma: 59 kDa, delta: 67 kDa. Die Stöchiometrie des mem­ branintegrierten Rezeptors ist alpha (2)-beta-gamma-delta. Die Fig. 6 zeigt das typische, mit einem analytischen Plattengel bestimmbare TMF-Bandenmuster, das neben dem Rezeptorprotein drei weitere Banden, eine 95 kDa Unter­ einheit der Torpedo Na/K-ATPase und zwei nAChR Degra­ tionsprodukte von etwa 30 und 32 kDa, enthält. Zur Tren­ nung dieser Testsubstanz wurde folgende Vorgehensweise gewählt.

An Reagenzien wurden verwendet: NN′-Methylenbisacrylamid, Tetramethyläthylendiamin (TEMED), Ammoniumperoxydisulfat (APS), beta-Mercaptoäthanol (β-ME), Trihydroxymethyl­ aminomethan (Tris), alle vorgenannten Substanzen von Sigma, Deisenhofen. Ferner Natriumdodekylsulfat (SDS) und Glycin von Merck, Darmstadt, sowie Acrylamid von Serva, Heidelberg.

SDS-PAGE wurde gemäß der Literaturstelle Laemmli mit den weiter unten genannten Variationen durchgeführt. Für kleine Flachgele (15 cm × 6 cm) wurde eine proteinauflö­ sende Kleinapparatur von Phase, Mölln, benutzt. Die prä­ parative Elutions-PAGE wurde mittels einer Präparations­ zelle Modell 491 von Bio-Rad, München durchgeführt. Ein zusätzliches Dreiwegeventil war mit dem Elutionspufferre­ servoirauslaß verbunden, um kontinuierlichen Austausch des Elutionspuffers während der Elektrophorese zu ermög­ lichen.

In allen SDS-PAGE Verfahren wurde das Tris/Glycin-Puffer­ system benutzt. Der Elektrodenpuffer bestand aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS mit pH 8,4. Der Trenngel­ puffer bestand aus 375 mM Tris, 0,1% SDS mit pH 8,8, der mit HCl eingestellt war. Der Stackgelpuffer bestand aus 125 mM Tris, 0,1% SDS mit pH 6,8, eingestellt mit HCl.

Der Probenpuffer bestand aus 62,5 mM Tris, 2% SDS, 2% β-ME, 10% Sucrose, 0,01% Bromphenolblau, pH 6,8, einge­ stellt mit Salzsäure.

Die Monomerlösungen mit Totalmonomerkonzentrationen T wurden gemäß dem Standard Laemmli-Verfahren hergestellt. Eine 30% T Acrylamidstammlösung mit 2,7% quervernetzen­ dem Biacrylamid wurde in allen Experimenten verwendet. Um einen stabilen inversen Gradienten bezüglich der Acryl­ amidkonzentration zu erhalten, wurde die spezifische Dichte der niederprozentigen Monomerlösung durch 6% (Masse pro Volumenprozent) Glyzerin oder Sucrose erhöht.

Die Mischung der Monomerlösungen erfolgte mittels eines Standardgradientenmischbechers zur Herstellung eines kon­ stanten linearen Gradienten. Nach der Auslösung der Poly­ merisation durch Hinzufügung gleicher Mengen von TEMED (0,05% Volumen/Volumen) und frisch präparierter 0,1% APS-Lösung (0,5% Volumen/Volumen) wurden die distale und die proximale Kammer des Gradientenmischers mit gleichen Mengen der hochprozentigen bzw. der niederprozentigen Mo­ nomerlösung gefüllt. Ein magnetisches Rührwerk in der di­ stalen Kammer bewirkte eine sofortige Durchmischung, wäh­ rend eine Peristaltikpumpe die mit dem Gradientenmischer zusammengemischte Monomerlösung zur Gelkammer der Präpa­ rationszelle oder des Flachgels mit einer Flußrate von 2 ml/min förderte. Der so aufgebaute Konzentrationsgradient wurde vorsichtig mit Wasser überschichtet, um eine plane Oberfläche auszubilden. Nach der vollständigen Polymeri­ sation in ca. einer Stunde wurde ein 1 cm langes Sammel­ gel auf der Oberseite hinzugefügt. Das Sammelgel sorgt für eine gleiche Starthöhe für alle Proteine der Probe bei Eintritt in das Trenngel.

Zur Proteineinfärbung wurden die Gele in 50% Ethanol, 10% Essigsäure und 0,1% Coomassiebrillantblau G 250 (Merck, Darmstadt) für 20 bis 30 Minuten gefärbt und in 25% Ethanol und 7,5% Essigsäure für mindestens eine Stunde entfärbt.

Die Probe wurde in der Weise präpariert, daß gleiche Vo­ lumina (0,5 ml) von TMF mit variierender Proteinkonzen­ tration von etwa 4 bis 6 mg/ml (BCA-Proteinprobe Pierce, Rockfort) und Probenpuffer gemischt wurden und mit Ultra­ schall für die Dauer von 10 Sekunden mit einem Sonoplus­ gerät (Bandelin, Berlin) zur optimalen Homogenisierung behandelt und anschließend das Sammelgel mit einer Pasteurpipette beladen.

Die Elektrophorese wurde mit einer konstanten Spannung von 250 Volt begonnen. Nachdem der Strom auf unter 30 mA gesunken war, wurde das Experiment mit einem Konstant­ strom von 30 mA fortgesetzt.

Die Elution erfolgte in der Weise, daß beim Erreichen von Zweidrittel der Gellänge der sichtbaren Bande des Farb­ stofffrontmarkers der Elutionspuffer A (1 : 9 Verdünnung des Elektrodenpuffers) kontinuierlich durch den Elutions­ puffer B (70 mM Triäthanolamin, 0,07% SDS, 0,01% Thiodiglycol, pH 6,8) bei gleichzeitigem Abschalten des Präparationszellenelutionspufferreservoirs und Anschluß eines äußeren Pufferreservoirs mit Hilfe des zusätzlichen eingebauten Dreiwegeventils ersetzt wurde. Die Elutions­ pufferflußrate war 1 ml/min. Die Fraktionen wurden nach jeweils 3 Minuten gesammelt. Jede Fraktion wurde auf ih­ ren Proteingehalt mittels Standard SDS-PAGE durch 4% T - 10% T Flachgele untersucht.

Verschiedene Variationen der Fraktionierung von nAChR- reichem TMF durch präparative Elutions-PAGE wurden unter­ sucht. Gleiche Mengen an Proteinproben (3 mg in 0,5 ml Phosphatpuffer) wurden mit gleichen Mengen an Probenpuf­ fer gemischt und für etwa 12 bis 13 Stunden wie oben be­ schrieben elektrophoresiert. In der nachfolgenden Tabelle werden die Ergebnisse der verschiedenen Gele und geteste­ ten Bedingungen zusammengefaßt wiedergegeben. Dabei be­ deuten GL die Länge des Trenngels, also der Trennstrecke, GT den Geltyp (SPRING für inversen Gradienten, STANDARD für konstante Acrylamidkonzentration), AC die Acrylamid­ konzentration (bei SPRING der Wert am Eintrittsende und am Austrittsende), t die Elektrophoresedauer, PFC die Proteinfraktionskonzentration und RES die Auflösung.

Die Homogenität der Fraktionen wurde durch Betrachten nach Coomassie-Einfärbung kleiner Analyseflachgele be­ stimmt. Für den Vergleich der Auflösungen wurde diejenige des 17%-7%- SPRINGGels willkürlich gleich 0 gesetzt. Das Pluszeichen steht für eine bessere und das Minuszeichen für eine schlechtere Auflösung. Die Elektrophoresezeit wurde nach der Fraktionierung des nAChR-delta gemessen. Die Proteinfraktionskonzentration ist diejenige der beta- Untereinheitfraktion. In dem Fall, in dem die Tabelle keine Zahlenangabe hierzu enthält, war die Bestimmung dieser Konzentration aufgrund zu inhomogener Fraktionen nicht möglich.

Es wurde gefunden, daß eine optimale Trennung von nAChR- Untereinheiten von TMF mittels einer gleichförmigen Gel­ konzentration von 8% mit einem 10 cm langen Trenngel er­ zielt werden kann. Das gleiche Ergebnis kann entweder mit einem 10 cm, 13% - 5%- SPRING-Gel in etwa 9 Stunden oder mit einem 3,5 cm, 14% - 7%- Gel in etwa 5,5 Stun­ den erzielt werden. Der letzte Fall hat dabei den zusätz­ lichen Vorteil höher konzentrierterer Fraktionen. Dieser Effekt kann optimiert werden, wenn extrem kurze Gele be­ nutzt werden, die etwa fünfmal so kurz sind wie die eines Standardsystems. Für das 2 cm lange SPRING-Gel kann die Trenndauer auf unter 50% der Dauer des Standardsystems verkürzt werden, mit einem nur geringfügigen Verlust in der Auflösung, die noch hinreichend gut war für anschlie­ ßende Verfahren wie Proteinspaltung und -sequenzierung. Ein weiterer positiver Effekt eines höher konzentrierten Eluats ist die Möglichkeit der UV-Detektion von Elutions­ fraktionen, was in der bisher bekannten Elutions-PAGE aufgrund der hohen Verdünnung der Fraktionen ein großes Problem darstellte.

In Fig. 6 ist ein UV-Absorptionselutionsprofil einer 2 cm, 18% - 6% SPRING-PAGE-Trennung von vier nAChR-Un­ tereinheiten dargestellt. Dabei wurden die Fraktionen für die Dauer von 3 Minuten bei einer Elutionsflußrate von 1 ml/min gesammelt und die Homogenität der Untereinheiten mit 10% Flachgelen untersucht. In der Fig. 6 ist die UV-Extinktion E als Funktion der Elektrophoresedauer t dargestellt. Die homogensten Fraktionen mit ihrer ent­ sprechenden laufenden Numerierung sind in das Diagramm mit ihren Flachgelergebnissen unter den zugehörigen UV- Maxima dargestellt. Der Verlust an Auflösung im Vergleich zu dem gut auflösenden System in der obigen Tabelle ist aus der geringen alpha-Bande der beta-Fraktion Nr. 17 er­ sichtlich.

Bei gleichmäßiger Gelkonzentration ist es nicht möglich, die Gellänge auf einen Wert unter 5 cm zu verkürzen, ohne an Auflösung zu verlieren. Aufgrund des untersuchten Gra­ dientenbereichs wurde gefunden, daß je nach den zu tren­ nenden Proteinen ein weiterer Auflösungsverlust eintritt, wenn die maximalen und minimalen Gelkonzentrationen zu klein sind, wie beispielsweise bei einem 2 cm langen, 13% - 5% Gel. Es hat sich als vorteilhaft herausge­ stellt, Gradienten zu verwenden, deren minimale Gelkon­ zentration im Bereich von 6% bis 8% und deren maximale Gelkonzentration das etwa 2- bis 2,5-fache der minimalen Konzentration ist. Die Probenmenge kann 0,5 mg Protein pro cm² Eintrittsfläche des Gels oder mehr betragen. Es wurden erfolgreich bis zu 3 mg TMF-Protein in etwa 9 ml Trenngelvolumen getrennt. Im allgemeinen wird die senk­ recht zur Wanderungsrichtung gemessene Querschnittsfläche der von den Makromolekülen durchlaufenen Gelsäule zwi­ schen 0,5 und 1,5 cm² pro 0,1 mg Mischung der zu trennen­ den Makromoleküle betragen.

Die Fig. 7 bis 13 zeigen Einzelheiten einer erfin­ dungsgemäßen Gießform für die Herstellung einer Gelsäule 2, die für den Einsatz in Apparaturen zur präparativen Gel-Ektrophorese geeignet ist. Sie besteht aus einem nichtleitenden, chemisch inerten Material wie Kunststoff oder Glas und ist für die Herstellung von Gelen konstan­ ter Polymerkonzentration wie auch von Gelen mit einem Po­ lymerkonzentrationsgradienten geeignet. Die Fig. 7 zeigt einen Querschnitt durch eine Einsatzhülse 28, die am obe­ ren Ende offen und am unteren Ende mit einer Bodenplatte 29 verschlossen ist. Im Bereich des unteren Endes befin­ den sich Penetrationsöffnungen 30, die umfangsverteilt angeordnet sind. Fig. 8 zeigt eine Aufsicht auf die Ein­ satzhülse 28. In Fig. 9 ist die zugehörige Außenhülse 20 mit Innenhülse 25 dargestellt. Die Innenhülse 25 wird mittels der Verbindungsstege 27 in der Außenhülse 20 ge­ halten. Die Außenhülse 20 weist an ihrem unteren Ende einen umlaufenden Kragenrand 21 auf, der zur Abdichtung dient. Die Innenhülse 25 ist mittels einer Endplatte 34 verschlossen und weist am unteren Ende umlaufend angeord­ nete Penetrationsöffnungen 26 auf. Die Fig. 10 zeigt eine Aufsicht zu der Fig. 9.

Die Fig. 11 zeigt einen Querschnitt durch die Gießform, wenn die Einsatzhülse 28 in die Innenhülse 25 eingesetzt ist. Die Einsatzhülse 28 ist mit ihrem Durchmesser genau in die Innenhülse 25 eingepaßt. Die Penetrationsöffnungen 26 und 30 sind in der zusammengesetzten Gießform gegen­ überliegend angeordnet. Die Fig. 12 zeigt eine Aufsicht zu Fig. 11.

In Fig. 13 ist dargestellt, wie eine ringförmige Gel­ säule mit der Gießform hergestellt werden kann. Hierzu wird die Gießform in ein äußeres Rohr, das beispielsweise die Gelkammer 3 einer Elektrophorese-Apparatur sein kann, eingesetzt. Der Außendurchmesser der Außenhülse 20 ist dabei dem Innendurchmesser des äußeren Rohres bzw. der Gelkammer 3 angepaßt. Durch Variation der Wandstärke der Außenhülse 20 kann, falls dies gewünscht wird, der Durch­ messer der Gelkammer 3 reduziert werden, ohne daß dabei ein Restraum zwischen Außenhülse 20 und Gelkammer 3 ver­ bleibt. Das untere Ende der Gelkammer 3 schließt mit dem Kragenrand 21 der Außenhülse 20 ab. Mittels einer Ring­ dichtung 35, die durch einen Flansch 36 auf eine Grund­ platte 24 von Befestigungsschrauben 37 dichtend gedrückt wird, ist das untere Ende der Gießform flüssigkeitsdicht verschlossen.

Im Inneren der Einsatzhülse 28 befindet sich im Bereich der Bodenplatte 29 ein Führungsmittel 39, beispielsweise ein Stahlnippel, der in der Grundplatte 24 befestigt sein kann. Das Führungsmittel 39 dient zur Fixierung eines Einfüllmittels 38, das im dargestellten Beispielfall eine Zuleitungskapillare ist, in der Mittelachse der Gelsäule 2. Durch die Zuleitungskapillare, die in minimalem Ab­ stand über der Bodenplatte 29 endet, wird Monomerlösung im Mittelpunkt des Gelsäulenquerschnitts auf die Boden­ platte 29 geleitet. Für den Fall einer nicht ringförmi­ gen, sondern massiven Gelsäule 2 entfallen die Einsatz­ hülse 28, die Innenhülse 25 und die Verbindungsstege 27, so daß die Monomerlösung direkt auf die Grundplatte 24 geleitet wird. Die Monomerlösung breitet sich nach dem Austritt aus der Zuleitungskapillare konzentrisch aus. Für den dargestellten Fall eines Ringgels dringt die Mo­ nomerlösung durch die Penetrationsöffnungen 30 der Ein­ satzhülse 28 und die Penetrationsöffnungen 26 der Innen­ hülse 25 in den Zwischenraum 31 zwischen Außenhülse 20 und Innenhülse 25. Wird dabei Monomerlösung mit zunehmen­ der Dichte eingeleitet, ergibt sich ein homogener Aufbau des Konzentrationsgradienten durch ein stetiges Unter­ schichten, so daß sich schließlich ein Konzentrations­ profil einstellt, das von dem oben liegenden Eintrittsende 22 der Gelsäule 2 zu dem unten liegenden Austrittsende 23 abnimmt.

Um die Stabilität der in der Gießform ruhenden Gelflüs­ sigkeit zu verbessern, kann bei der kontinuierlichen Mi­ schung der zwei Ausgangskonzentrationen an Monomerlösung mittels eines Gradientenbechers zu der Monomerlösung, die in abnehmender Konzentration durch die Zuleitungskapil­ lare zugeführt wird, der Monomerlösung mit der kleineren Konzentration ein Zusatz an Glyzerin, Sucrose oder einer ähnlichen Verbindung zugesetzt werden. Die Füllhöhe in der Gießform für die Gelflüssigkeit, also die Gelhöhe, und das Konzentrationsprofil einschließlich der Konzen­ trationen auf der Eintrittsseite und Austrittsseite wer­ den je nach präparativer Trennaufgabenstellung entspre­ chend gewählt. Es kann vorteilhaft sein, wenn die Gelhöhe so gewählt wird, daß noch das ca. Eineinhalbfache des auf das Gel aufzutragenden Probenvolumens unterhalb des obe­ ren Hülsenrandes zu liegen kommt, um ein Eindringen der Probe in den Raum zwischen der Hülse und der Gelkammer 3 auszuschließen.

Nach dem Einfüllen der Gelflüssigkeit wird das Gel auspo­ lymerisiert. Dann kann, im Fall einer ringförmigen Gel­ säule 2, die Einsatzhülse 28 mit dem darin befindlichen Gel entnommen werden. In den freiwerdenden Innenraum kann dann der Ringkern der Elektrophorese-Apparatur, bei­ spielsweise ein Kühlfinger, eingeführt werden. Es ist aber auch möglich, die auspolymerisierte Gelsäule 2 zu­ sammen mit der Gießform zu entnehmen und als vorgefer­ tigte Gelsäule 2 (Precast) zum Einsetzten in die Gelkam­ mer 3 einer Gel-Elektrophorese-Apparatur zur Verfügung zu stellen, so daß für Anwender die Notwendigkeit der eige­ nen Herstellung der Gelsäule 2 entfällt. Durch die Wand­ stärke bzw. den Durchmesser der Außenhülse 20 können da­ bei differierende Gelkammerinnendurchmesser ausgeglichen werden. Da es beim erfindungsgemäßen Verfahren insbeson­ dere auch auf die Gellänge, d. h. die Länge der Trenn­ strecke, ankommt, sind insbesondere Gießformen für ver­ schiedene, bevorzugt kurze Gellängen denkbar und beson­ ders für eine kommerzielle Verwertung geeignet.

Die Fig. 14 und 15 zeigen eine Gelgieß-Einrichtung, die speziell für die Anwendung des SPRING-PAGE-Verfahrens ausgelegt ist. In Fig. 14 ist der Aufbau einer Gel-Elek­ trophorese-Apparatur 1 für das vorbereitende Gießen der Gelsäule 2 dargestellt. Eine der Besonderheiten der Appa­ ratur 1 besteht darin, daß die Gelkammer 3 speziell für die Verwendung kurzer Gele von Längen unter 6 cm ausge­ legt ist. Eine andere Besonderheit besteht darin, daß das Verhältnis aus der Länge der Gelkammer 3 zu der Quadrat­ wurzel aus der Querschnittsfläche der die Gelsäule 2 be­ inhaltenden Gelkammer 3 kleiner als 1,1 ist. Die Gelkam­ mer 3 besteht aus einer Glas- oder Plexiglasröhre und weist eine Mittelachse 43 auf. Eine weitere Besonderheit besteht darin, daß das gesamte Gel von der Bedienperson eingesehen werden kann, insbesondere auch die Austritts­ seite 9 der Gelsäule 2. Der Innendurchmesser der Gelkam­ mer 3 ist konstant und die Anpassung an das erforderliche Gelvolumen für unterschiedliche Probenmengen erfolgt durch den Einsatz von Mittelachsen 43 verschiedener Durchmesser.

In Fig. 15 ist eine solche Mittelachse 43 dargestellt. Sie weist die Besonderheit auf, daß sie umfangsverteilt axial verlaufende Spurrillen 44 hat. Die Anzahl beträgt vorteilhafterweise mindestens 16, wobei sie in einer vor­ teilhaften Ausführung äquidistant angeordnet sind. Die Spurrillen 44 sind etwa 1 mm tief und erlauben einen gleichmäßigeren Fluß der von oben eingefüllten Gelflüs­ sigkeit entlang des Mantels der Mittelachse 43, wodurch ein Aufbau des Gradientengels ohne Durchmischung gewähr­ leistet wird, da die von oben eingefüllte Gelflüssigkeit entlang der Spurrillen 43 nach unten fließen und beim seitlichen nach außen Strömen durch Überschichten der je­ weils darunter befindlichen Gelflüssigkeit die Gelsäule 2 bilden kann. Auf diese Weise werden störende Durchmi­ schungen vermieden und ein in der jeweiligen Quer­ schnittsfläche gleicher Konzentrationswert erzielt.

Das obere Ende der Mittelachse 43 weist einen kegelförmi­ gen Kopf 45 auf, der ebenfalls mit Spurrillen 44 versehen ist, die an der Spitze zusammenlaufen. An dieser Spitze kann ein Schlauch zum Einfüllen der Monomerlösung aufge­ steckt werden, mit dem die Monomerlösung zuführbar ist.

Ein Gradientenmischer üblicher Bauart dient zur Herstel­ lung einer zeitlich variierenden Konzentration der Mono­ merlösung beim Einfüllen in die Gelkammer 3. Er ist in Form und Fassungsvermögen auf die mögliche Bandbreite an Gelvolumen abgestimmt und derart mit dem kegelförmigen Kopf 45 der Mittelachse 43 verbunden, daß sich eine für den Aufbau des Monomergradienten optimale Fließgeschwin­ digkeit der Monomerlösung ergibt. Die Fließgeschwindig­ keit kann durch die Verwendung von Verbindungsschläuchen unterschiedlicher Innendurchmesser, durch die Verwendung einer regulierbaren Schlauchklemme oder durch den Einsatz einer zwischengeschalteten Peristaltikpumpe erfolgen. Mittels eines Magnetrührers kann ein in dem Gradientenmi­ scher befindlicher Magnetrührkern angetrieben werden.

Claims (27)

1. Gel-Elektrophoreseverfahren zur präparativen Trennung einer Mischung von Makromolekülen unterschiedlicher Molekulargewichte in Fraktionen, die Makromoleküle mit gleichen oder annähernd gleichen Molekulargewich­ ten enthalten, mittels einer Gelsäule (2), deren aus einem Polymer eines gelbildenden Monomers bestehende Trennstrecke von der Mischung von einem Eintrittsende (22) zu einem Austrittsende (23) durchlaufen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennstrecke der Gelsäule (2) so ausgebildet ist, daß die Migrationsgeschwindigkeit der Makromoleküle in ihrer Migrationsrichtung im wesentlichen zunimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionen aus dem Austrittsende (23) der Gelsäule (2) kontinuierlich eluiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennstrecke der Gelsäule (2) kleiner als 6 cm ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis aus der Länge der Trennstrecke der Gelsäule (2) zu der Quadratwurzel aus der Quer­ schnittsfläche der Gelsäule (2) kleiner als 1,1 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterschied zwischen maximaler und minimaler Migrationsgeschwindigkeit auf der Trennstrecke mehr als 10%, bevorzugt mehr als 80% der minimalen Mi­ grationsgeschwindigkeit beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Migrationsgeschwindigkeit der Makromoleküle auf der Trennstrecke der Gelsäule (2) im wesentlichen monoton zunimmt.

7. Gelsäule eines gelbildenden Polymers zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Porengröße des Polymers von dem Eintrittsende (22) der Trennstrecke zu dem Austritts­ ende (23) im wesentlichen zunimmt.

8. Gelsäule nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennstrecke der Gelsäule (2) kleiner als 6 cm ist.

9. Gelsäule nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis aus der Länge der Trennstrecke der Gelsäule (2) zu der Quadratwurzel aus der Quer­ schnittsfläche der Gelsäule (2) kleiner als 1,1 ist.

10. Gelsäule nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterschied zwischen maximaler und minimaler Po­ rengröße des Polymers auf der Trennstrecke mehr als 10%, bevorzugt mehr als 80% der minimalen Poren­ größe ist.

11. Gelsäule nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße des Polymers in der Trennstrecke der Gelsäule (2) im wesentlichen monoton zunimmt.

12. Verfahren zur Herstellung einer Gelsäule nach An­ spruch 7, bei welchem das Polymer bildende Monomerlö­ sung in eine Gießform gegossen wird, um eine in der Gießform ruhende Gelflüssigkeit zu bilden, aus der durch anschließende Polymerisation die Gelsäule ge­ bildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelflüs­ sigkeit derart aus einer Schichtung von Monomerlösung unterschiedlicher Monomerkonzentration gebildet wird, daß die Konzentration des Monomers in der Trenn­ strecke der Gelsäule (2) vom Eintrittsende (22) zum Austrittsende (23) im wesentlichen abnimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomerlösung durch Zusammengießen zweier Mo­ nomerlösungen unterschiedlicher Monomerkonzentratio­ nen gebildet wird, wobei das Mischungsverhältnis der hochprozentigen mit der niederprozentigen Monomerlö­ sung beim Zusammengießen derart variiert wird, daß sich das gewünschte Konzentrationsprofil der Trenn­ strecke der Gelflüssigkeit ergibt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Monomerlösung ein Zusatz beigemischt wird, der die Stabilität des Konzentrationsprofils der Gel­ flüssigkeit vor der Polymerisation gewährleistet und bezüglich der Gel-Elektrophorese inert ist, wobei der Anteil des Zusatzes von dem Eintrittsende (22) zu dem Austrittsende (23) der Trennstrecke zunimmt.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der höchste Wert der Konzentration des Monomers in der Trennstrecke der Gelflüssigkeit weniger als 45% (Massenprozent der Monomerlösung), bevorzugt we­ niger als 35%, besonders bevorzugt weniger als 25% beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der niedrigste Wert der Konzentration des Mono­ mers in der Trennstrecke der Gelflüssigkeit mehr als 3% (Massenprozent der Monomerlösung), bevorzugt mehr als 5% beträgt.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des höchsten Wertes der Konzentra­ tion des Monomers in der Trennstrecke der Gelflüssig­ keit zu dem niedrigsten Wert größer als 1,1, bevor­ zugt größer als 1,8 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des höchsten Wertes der Konzentra­ tion des Monomers in der Trennstrecke der Gelflüssig­ keit zu dem niedrigsten Wert kleiner als 15, bevor­ zugt kleiner als 6 und besonders bevorzugt kleiner als 3 ist.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Monomers in der Trenn­ strecke der Gelflüssigkeit im wesentlichen monoton abnimmt.

20. Verfahren nach Anspruch 13 mittels einer Gießform, die eine beidseitig offene Außenhülse (20) aufweist, deren Außendurchmesser so bemessen ist, daß sie in die Gelkammer (3) einer Gel-Elektrophorese-Apparatur (1) einschiebbar ist, und die an ihrem dem Austritts­ ende (23) der Trennstrecke zugewandten Ende einen Kragenrand (21) aufweist, dessen Außendurchmesser größer als der der Außenhülse (20) ist und der zur Abdichtung der Außenhülse (20) gegen eine Grundplatte (24) gedrückt wird, in welchem Verfahren die Monomer­ lösungen in einem sich zeitlich ändernden Verhältnis zu der Monomerlösung zusammengemischt und die Mono­ merlösung mittels eines Einfüllmittels (38) in die Gießform eingefüllt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20 zur Herstellung einer als Ringsäule ausgebildeten Gelsäule (2) mittels einer Gießform mit einer Innenhülse (25), die an ihrem dem Eintrittsende (22) der Trennstrecke zugewandten Ende offen ist, deren Außendurchmesser kleiner als der In­ nendurchmesser der Außenhülse (20) ist, deren dem Austrittsende (23) der Trennstrecke zugewandtes Ende bündig mit dem Kragenrand (21) und der Grundplatte (24) dichtend abschließt, die an ihrem dem Austritts­ ende (23) der Trennstrecke zugewandten Ende umfangs­ verteilt angeordnete Innenhülsen-Penetrationsöffnun­ gen (26) für Monomerlösung aufweist, wobei die Gieß­ form Verbindungsstege (27) aufweist, mittels derer die Innenhülse (25) mit der Außenhülse (20) verbunden ist, und eine Einsatzhülse (28), deren dem Eintritts­ ende (22) der Trennstrecke zugewandtes Ende offen ist, die genau eingepaßt in die Innenhülse (25) ein­ gesetzt ist, deren dem Austrittsende (23) der Trenn­ strecke zugewandtes Ende mittels einer Bodenplatte (29) verschlossen ist und die an ihrem dem Austritts­ ende (23) der Trennstrecke zugewandten Ende umfangs­ verteilt angeordnete Einsatzhülsen-Penetrationsöff­ nungen (30) aufweist, die mit den Innenhülsen-Pene­ trationsöffnungen (26) derart zusammenwirken, daß in die Einsatzhülse (28) eingefüllte Monomerlösung durch die Einsatzhülsen- und Innenhülsen-Penetrationsöff­ nungen (30, 26) in den Zwischenraum (31) zwischen Außenhülse (20) und Innenhülse (25) fließt, wobei nach der Polymerisation der Gelflüssigkeit die Ein­ satzhülse (28) entfernt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß im Inneren der Gießform ein Führungsmittel (39) für das Einfüllmittel (38) zum Einfüllen der Gelflüs­ sigkeit vorgesehen ist.

23. Gel-Elektrophorese-Apparatur, insbesondere zur Durch­ führung eines Verfahrens nach Anspruch 1, mit einer zur Aufnahme einer Gelsäule (2) ausgebildeten Gelkam­ mer (3), die eine Eintrittsseite (8) und eine Aus­ trittsseite (9) aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der Gelkammer (3) kleiner als 6 cm ist.

24. Gel-Elektrophorese-Apparatur, insbesondere zur Durch­ führung eines Verfahrens nach Anspruch 1, mit einer zur Aufnahme einer Gelsäule (2) ausgebildeten Gelkam­ mer (3), die eine Eintrittsseite (8) und eine Aus­ trittsseite (9) aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis aus der Länge der Gelkammer (3) zu der Quadratwurzel aus der Querschnittsfläche der Gelkam­ mer (3) kleiner als 1,1 ist.

25. Apparatur nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Austrittsseite (9) der Gelkammer (3) so ausgebildet ist, daß das Austrittsende (23) der Gelsäule (2) für die Bedienperson einsehbar ist.

26. Apparatur nach Anspruch 23 oder 24 mit einer Gelkam­ mer (3), die eine Mittelachse (43) aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittelachse (43) umfangsver­ teilt axial verlaufende Spurrillen (44) aufweist.

27. Apparatur nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das obere Ende der Mittelachse (43) einen kegelförmigen Kopf (45) mit Spurrillen (44) aufweist, an dessen Spitze die Spurrillen (44) zusam­ menlaufen.