DE4334154C2

DE4334154C2 - 2-Halogeno-1,25-dihydroxy-cholecalciferole und pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE4334154C2
Application number: DE19934334154
Authority: DE
Inventors: Bruno Dr Sc Nat Schoenecker; Manfred Dr Reichenbaecher; Sabine Dr Gliesing
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1993-10-01
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2013-10-02
Also published as: DE4334154A1

Description

Die Erfindung betrifft 2-Halogeno-1,25-dihydroxy-cholecalciferole und pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung.

Die substituierten Cholecalciferole haben innerhalb der pharmazeutischen Industrie bei der Regulierung des Calcium- und Phosphathaushalts im Organismus Bedeutung erlangt. Diese sorgen für die Calcium-Resorption im Darm und für die Mineralisation der Knochen, außerdem begünstigt Cholecalciferol die Phosphat-Rückresorption in den Nierentubuli und schränkt die Phosphat- und Citratausscheidung im Harn ein.

Innerhalb des Standes der Technik wird in der US-Patentschrift 4,307,025 2β-Fluor-1α,25-dihydroxy-Cholecalciferol beschrieben. Diesem Fluorderivat werden die typischen Eigenschaften eines Vitamin D₃-Derivats zugeschrieben. Die analogen 2β-substituierten Chlor- und Bromderivate sind unbekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Wirkstoffen aus der Vitamin D3-Familie, die noch ausgeprägtere Wirkungen auf den Calcium- und Phosphatstoffwechsel, als die bisher bekannten Derivate besitzen und die auch proliferationshemmende und zelldifferenzierende Wirkungen aufweisen. Neben bedingten Vereinfachungen bei Synthese und Reinigung von Zwischen- und Endprodukten wurden neue Verbindungen gefunden, die überraschend hohe biologische Wirksamkeiten aufweisen. Gemessen am Standard Calcitriol (1α,25-dihydrnxy-Vitamin D₃), zeigen die erfindungsgemäßen Substanzen bei erhöhter Affinität zum Calcitriolrezeptor eine verbesserte Induktion der Zelldifferenzierung (HL 60) und eignen sich daher in besonderer Weise zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Hyperproliferation und gestörte Zelldifferenzierung gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel hyperproliferative Erkrankungen der Haut (Psoriasis) und maligne Tumore (Leukämie, Colonkarzinom, Mammakarzinom).

Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch die Lehre der Patentansprüche.

Die Verbindungen 2β-Brom-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol und 2β-Chlor-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol besitzen die hervorgehobenen Eigenschaften.

Durch den beschriebenen Herstellungsweg werden insbesonders das 2β-Brom-1α,25-dihydroxy- und das 2β-Chlor-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol erhalten. Jedoch konnten als Nebenprodukte innerhalb der Synthese auch die entsprechenden Diastereomeren isoliert werden.

Die Verbindungen werden hergestellt durch Umsetzung eines Epoxids der allgemeinen Formel II, siehe Reaktionsschemata 1, (US-PS 4,254,045)

worin
R₁ = Wasserstoff oder C₁-C₉ Alkanoyl oder Benzoyl bedeuten, mit Brom- oder Chlorwasserstoffsäure, einer Photoisomerisierung, einer thermischen Isomerisierung und gegebenenfalls selektiver Veresterung der freien Hydroxylgruppen zu den entsprechenden C₁-C₉-Alkanoyl- oder Benzoylverbindungen.

Die Ausgangsstoffe, die Epoxyde der allgemeinen Formel II werden innerhalb der DE 41 05 503 A1 beschrieben. Das Reaktionsschema 1 beinhaltet den Herstellungsweg.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Präparate, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die Verbindungen können beispielsweise formuliert werden als Lösungen in pharmazeutisch verträglichen Solvenzien oder als Emulsionen, Suspensionen oder Dispersionen. Als Formulierungen sind auch Pillen, Tabletten oder Kapseln, die in an sich bekannter Weise feste Trägerstoffe enthalten, geeignet. Für eine topische Anwendung werden die Verbindungen zum Beispiel als Creme oder Salbe oder in einer ähnlichen, zur topischen Anwendung geeigneten Arzneimittelform formuliert. Jede derartige Formulierung kann auch andere pharmazeutisch verträgliche und nicht-oxische Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel Stabilisatoren, Antioxidanzien, Bindemittel, Farbstoffe oder Emulgatoren. Die Verbindungen können auch durch Injektion oder intravenöse Infusion in geeigneten sterilen Lösungen oder als orale Dosierung über den Ernährungstrakt appliziert werden, beschrieben z. B. innerhalb der EP-A1-0 387 077.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln mit anti-inflammatorischer und/oder immunmodulierender Aktivität zur Induktion der Zelldifferenzierung und Inhibierung unerwünschter Zellproliferation. Weiter zur Therapie und Behandlung und Prophylaxe von Diabetes mellitus, Hypertension, Störungen des Immunsystems, inflammatorischen Erkrankungen, wie rheumatoider Arthritis und Asthma sowie Erkrankungen, die durch abnormale Zelldifferenzierung und/oder Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie Psoriasis, Krebs und zur Prävention einer Transplantatabstoßung.

Die tägliche Dosis liegt bei 0,1 µg pro Patient/Tag bis 1000 µg (1 mg)/Patient/Tag vorzugsweise bei 1,0 µg/Patient/Tag bis 500 µg/Patient/Tag.

Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln.

Die Vitamin D-Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wird mittels des Calcitriol-Rezeptortests bestimmt. Er wird unter Verwendung eines spezifischen Rezeptorproteins aus dem Darm von jungen Schweinen durchgeführt. Rezeptorhaltiges Bindungsprotein wird mit ³H-Calcitriol (5 × 10^-10 mol/l) in einem Reaktionsvolumen von 0,270 ml in Abwesenheit der Prüfsubstanzen für zwei Stunden bei 4°C in einem Teströhrchen inkubiert. Zur Trennung von freiem und rezeptorgebundenem Calcitriol wird eine Charcoal-Dextran-Absorption durchgeführt. Dazu werden 250 µl einer Charcoal-Dextran-Suspension jedem Teströhrchen zugeführt und bei 4°C für 20 Minuten inkubiert. Anschließend werden die Proben bei 10 000 × g 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und nach 1-stündiger Äquilibrierung in Picofluor 15^Tm in einem β-Zähler gemessen.

Die mit verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanz sowie der Referenzsubstanz (unmarkiertes Calcitriol) bei konstanter Konzentration der Bezugssubstanz (³H-Calcitriol) erhaltene Kompetitionskurven werden in Beziehung zueinandergesetzt und ein Kompetitionsfaktor (KF) ermittelt.

Er ist definiert als Quotient aus den Konzentrationen der jeweiligen Prüfsubstanz und der Referenzsubstanz, die für 50%ige Kompetition erforderlich sind:

Die folgenden KF-Werte wurden gemessen:

2β-Fluor-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol
1,5
US-PS 4,307,025 @	2β-Brom-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol	0,5
2β-Chlor-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol	0,3

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung 1. Darstellung von 2β-Halogeno-1α,25-trihydroxy-cholesta-5,7-dienen (Provitamin) (III)

Alle Arbeiten sind unter Ausschluß von UV-Licht auszuführen!

1.1 2β-Chlor- und 2β-Brom-3β,1α,25-trihydroxy-cholesta-5,7-dien (IIIa und IIIb)

3 mMol (1,25 g) 1α,2α-Epoxy-3β.25-dihydroxy-cholesta-5,7-dien (α-Epoxid) (II) (DE 41 05 503 A1) werden unter Argon in 70 ml entgastem Dimethylformamid gelöst. Unter Kühlung von 4 mMol (394 µl 32%ige Chlorwasserstoffsäure für IIIa bzw. 462 µl 47%ige Bromwasserstoffsäure für IIIb) in 5 ml DMF zugegeben. Danach wird bei Raumtemperatur noch 1 h gerührt, und die schwach gelbe Lösung wird auf Eiswasser gegossen. Der flockige Niederschlag wir abfiltriert, mit wenig kaltem Methanol gewaschen und trocken gesaugt. Die Mutterlauge wird 4 mal mit Ether extrahiert, und die Extrakte werden mit der methanolischen Waschlösung vereinigt. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt, und der erhaltene feste Rückstand sowie das aus Wasser gefällte Produkt wird aus Ethylacetat/n-Hexan, (V+V = 4+6) kristallisiert. Es werden jeweils feinkristalline Nadeln erhalten.
Ausbeute:
IIIa: 1,29 g (95% d. Th.);
Fp: 108-112°C
IIIb: 1,39 g (93% d. Th.)
Fp: 171-174°C.

UV (Methanol): (schwingungsstrukturierte Absorptionsbande)

IIIa: λ_max = 282,1 nm, Σ_max = 11 300 l/mol _* cm
IIIb: λ_max = 282,4 nm, Σ_max = 11 200 l/mol _* cm.
TLC:
(HPTLC-Fertigplatte, Merck Nr. 5629; Fließmittel:
Ethylacetat/n-Hexan, V+V = 4+6; gesättigte Kammer; Sprühreagenz: methanolische Schwefelsäure)
IIIa: Rf = 0,15 (braun); IIIb: Rf = 0,16 (braun)
II: Rf = 0,21 (braun).

¹H-NMR

IIIa: LM: CDCl₃; Zusatz von Trichloracetylisocyanat (TAI) wegen der geringen Löslichkeit; Standard: TMS.
0,62 (s) (18-CH₃); 0,93 (d) (21-CH₃); 1,31(s) (19-CH₃);
1,52 (s) (26.27-(CH₃)2); 4,60 (d,d) (2α-H); 5,26 (d) (1β-H)
5,28 (d,d,d) (3α-H); 5,44 (m)/5,75 (d,d) (6-H/7-H)
8,21(s) (NH); 8,42 (s) (NH); 8,61(s) (NH).
IIIb: LM: CDCl₃; Standard: TMS.
0,63 (s) (18-CH₃); 0,96 (d) (21-CH₃); 1,23 (s) (26,27-(CH₃)₂); 4,64 (m) (2α-H); 5,38/5,72 (m) (6-H/7-H).

2. Darstellung der 2β-Halogeno-1α,25-dihydroxy-cholecalciferole Photoisomerisierung

250 mg des jeweiligen Provitamins III wird in 30 ml Methanol gelöst, mit 400 ml tertiär Butyl-methyl-ether (MTBE) verdünnt, 30 min mit Argon deoxygeniert und in einem 450-ml-Umwälzphotoreaktor bei -40 bis -45°C unter Verwendung einer 150 W Quecksilber-Tauchlampe TQ 125 Zi in Kombination mit einer Filterlösung, welche im Wellenlängenbereich 280-305 nm und größer 330 nm eine gute Transmission besitzt, unter Schutzgas photoisomerisiert. Der Reaktionsverlauf wird mittels TLC verfolgt, und die Photoreaktion wird zweckmäßigerweise bei einem Umsatzgrad von ca. 50-60% Provitamin beendet. Die Lösung wird am Vakuum-Rotationsverdampfer rasch zur Trockne eingeengt, das ölige Produkt wird mit 5 ml Gemisch Ethylacetat/n- Hexan (V+V = 3+1) versetzt und bei < -18°C zur Kristallisation des nicht umgesetzten Provitamins III aufbewahrt. Auf diese Weise können über 90% des im Photoisomerengemisch enthaltenen Provitamin III durch Kristallisation abgetrennt und unmittelbar einer erneuten Photoisomerisierung zugeführt werden.

Die Mutterlauge wird flash-chromatographisch getrennt. Chromatographische Bedingungen:
chromatographische Säule: i. D. 2 cm
stationäre Phase:
für IIIa:
Lichroprep, 40-63 µm; Ag⁺-dotiert
für IIIb:
Lichroprep, 25-40 µm
mobile Phase:
für IIIa:
Ethylacetat/n-Hexan, V + V = 3 + 1
für IIIb:
Ethylacetat/n-Hexan, V+V = 2+1
Flußrate: 10 ml/min
Fraktionen:
für IIIa:
Vorlauf 20 ml; 20 × 10 ml
für IIIb:
Vorlauf 50 ml; 15 × 10 ml
Detektion: TLC:
IIIa:
Ag⁺-dotierte KG-Platte;
Fließmittel: wie Eluent
IIIb: KG-Platte;
Fließmittel: wie Eluent

Aufarbeitung der chromatographischen Fraktionen:

IIIa

- Fraktionen 4-6: Prävitamin
- Fraktionen 7-9: Tachysterol und geringe Menge Prävitamin
- Fraktionen 10-15: Provitamin und Lumisterol.

Die vereinigten Fraktionen werden am Vakuum-Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt.

Das aus der Prävitamin-Fraktion erhaltene ölige Produkt wird thermisch zu Vitamin isomerisiert.

Das Tachysterol-Fraktion wird in 40 ml MTBE gelöst und nach Zugabe von 15 mg Anthracen in einem 50 ml Photoreaktor aus Glas unter Verwendung einer Quecksilber-Höchstdrucklampe HBO 200 und einer 5%igen Natriumnitrit-Filterlösung 4 h unter Argon-Spülung bestrahlt. MTBE wird abdestilliert, und der ölige Rückstand (Prävitamin und geringe Menge Tachysterol) wird thermisch isomerisiert.

Die geringe Menge Provitamin/Lumisterol wird ohne weitere Reinigung dem Bestrahlungsrecycling zugeführt.
IIIb:
Fraktionen 3-6: Provitamin/Lumisterol/Tachsysterol
Fraktionen 7-13: Prävitamin

Die vereinigten Fraktionen werden zur Trockne eingeengt. Das feste weiße Gemisch Provitamin/Lumisterol/Tachsysterol wird ohne weitere Reinigung dem Bestrahlungsrecycling zugeführt. Die Prävitamin-Fraktion wird thermisch isomerisiert.

Thermische Isomerisierung

Der aus den Prävitamin-Fraktionen erhaltene ölige Rückstand wird jeweils in 15 ml Ethylacetat/n-Hexan (V+V = 2 + 1) aufgenommen und unter Argon 6 Stunden bei 60-65°C erwärmt. Danach wird die abgekühlte Lösung auf 2 ml konzentriert und flash-chromatographisch getrennt.
Chromatographische Bedingungen:
chromatographische Säule: i.D. 2 cm
stationäre Phase: Lichroprep 25-40 µm
mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan, V+V = 2+1
Flußrate: 8 ml/min
Fraktionen: 20 ml Vorlauf; 15 × 10 ml
Detektion: TLC (KG-Platte; Fließmittel wie Eluent)
Aufarbeitung der chromatographischen Fraktionen:
Fraktionen 3-7: Vitamin
Fraktionen 8-12: Prävitamin

Die Prävitamin-Fraktionen werden konzentriert, nochmals thermisch isomerisiert und - wie beschrieben - flash-chromatographisch getrennt. Die vereinigten Vitamin-Fraktionen werden zur Trockne eingeengt, und das mikrokristalline Produkt wird aus Ethylacetat/n-Hexan oder Methylformiat kristallisiert. Es werden weiße Kristalle erhalten.

Erhaltene Menge und Ausbeute:
Ia: 155 mg (62%, bezogen auf das eingesetzte Provitamin)
Ib: 112 mg (44,8%, bezogen auf das eingesetzte Provitamin)

Charakterisierung der Vitamine

UV (Methanol): (strukturlose Absorptionsbande mit ausgeprägter kurzwelliger Schulter)
Ia: λ_max = 268 nm, ε_max = 16 800 l/mol _* cm
Ib: λ_max = 270 nm, ε_max = 16 600 l/mol _* cm.
Massenspektrum:
Ia: 450,29010/452,28712 (M);
berechnet für C₂₇H₄₃O₃₂Cl: 450,29007/452,28712
Ib: 494,23961/496,23759 (M);
berechnet für C₂₇H₄₃O₃Br: 494,23956/496,23751.
TLC:
(HPTLC-Fertigplatte, Merck Nr. 5629; Fließmittel:
Ethylacetat/n-Hexan, V + V = 2 + 1)
Ia: Rf = 0,42; IIIb: Rf = 0,46;
Schmelzpunkt:
Ia: 78-80°C; Ib: 79-81°C.

Reaktionsschema 1

Claims

1. 2β-Brom-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol.

2. 2β-Chlor-1α,25-dihydroxy-cholecalciferol.

3. Diastereomer einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 1-3.