DE4324859A1

DE4324859A1 - Oral verabreichbare Zusammensetzung zur Behandlung periodontaler Erkrankungen

Info

Publication number: DE4324859A1
Application number: DE4324859A
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Harada
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 1994-01-27
Also published as: US5759544A

Description

Die Erfindung betrifft oral verabreichbare Zusammensetzungen zur Prophylaxe oder Therapie von periodontalen Erkrankungen, die die Kolonienbildung von mit periodontalen Erkrankungen verbundenen Bakterien, wie Actinobacillus actinomycetemco mitans, Porphyromonas gingivalis und dergl., an oralen Ober flächen unterdrücken können.

Eine wirksame Maßnahme zur Prophylaxe von periodontalen Er krankungen besteht darin, die Kolonienbildung von krank heitserregenden Bakterien an oralen Oberflächen zu hemmen und dadurch ihre Vermehrung zu unterdrücken. Aus dieser Überlegung heraus wurden oral verabreichbare Zusammensetzun gen oder antiperiodontal verabreichbare Zusammensetzungen vorgeschlagen, die Antikörper gegen die durch Bakterien ver ursachte periodontale Erkrankung enthalten (JP-A-60-142915 und JP-A-1-313438). Jedoch kann es sich bei diesen Antikör pern um vollständige Zellen handeln, wobei das Immunogen aus vollständigen Bakterienkörpern oder Gemischen, wie Bakte rienextrakten, besteht, so daß eine Wechselwirkung mit ande ren Typen von Stämmen nicht gegeben ist. Ferner lassen der artige Zusammensetzungen im Hinblick auf ihre tatsächliche Wirksamkeit zu wünschen übrig.

Somit besteht ein Bedarf zur Entwicklung nach wirksamen Be standteilen, die in zweckmäßiger Weise die Kolonienbildung und das Wachstum von mit periodontalen Erkrankungen verbun denen Bakterien auf oralen Oberflächen unterdrücken und da mit periodontale Erkrankungen verhindern können.

Obgleich insbesondere Actinobacillus actinomycetemcomitans als besonders gefährlicher Auslöser von juveniler Periodon titis angesehen wird, wurden derartige Bakterien kürzlich auch in periodontalen Taschen von erwachsenen Patienten mit Periodontitis nachgewiesen und daraus isoliert. Somit muß derartigen Bakterien eine größere Aufmerksamkeit geschenkt werden, da sie am Auftreten und an der Entwicklung von pe riodontalen Erkrankungen beteiligt sind.

Es ist bekannt, daß Antikörper, die durch Immunisieren von Säugetieren oder Hausgeflügel mit vollständigen Bakterien oder einer bakteriellen Komponente von Actinobacillus acti nomycetemcomitans erhalten worden sind, zu oralen Zusammen setzungen verarbeitet werden können, mit denen die Kolonien bildung der Bakterien auf oralen Oberflächen unterdrückt und dadurch die oralen Erkrankungen verhindert werden können (JP-A-60-146834 und JP-A-2-53716).

Im allgemeinen besteht jedoch bei der Verwendung von ganzen Bakterien oder einer Fraktion davon mit einer Mehrzahl an Proteinen als Antigen die Schwierigkeit im Hinblick auf die Gleichmäßigkeit und Sicherheit des gebildeten Antikörpers. Ferner ist bei Einsatz eines spezifischen Proteintyps der Bakterien als Antigen ein großer Aufwand zur Herstellung des Antigens erforderlich, was Schwierigkeiten bei der Produkti vität ergibt. Somit sind derartige Verfahren bei weitem nicht für einen Einsatz in der Praxis geeignet.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine oral verabreichbare Zu sammensetzung bereitzustellen, mit der eine Kolonienbildung von mit periodontalen Erkrankungen verbundenen Bakterien auf oralen Oberflächen unterdrückt und damit periodontale Er krankungen verhindert oder geheilt werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe wurden umfangreiche Untersuchungen über periodontale Erkrankungen auslösende Bakterien durchge führt. Als Ergebnis dieser Bemühungen wurde festgestellt, daß bei Bereitstellung von Polysacchariden, die aus der Oberflächenschicht von krankheitserregenden Bakterien stam men und bei deren Verwendung als Antigen zur Immunisierung von Tieren, wie Säugetieren oder Hausgeflügel, oder vorzugs weise bei Bereitstellung von Polysacchariden, die aus der Oberflächenschicht von periodontopathischen Bakterien abge leitet sind, und bei deren Verwendung als Antigen nach Kon jugation oder Kupplung mit Polypeptiden für die Immunisie rung des Tiers, die daraus in Blut, Milch oder Eiern erhältli chen Antikörper in erheblichem Umfang die Kolonienbildung der Bak terien auf oralen Oberflächen unterdrücken. Somit können bei Zubereitung derartiger Antikörper in Form von oral verab reichbaren Zusammensetzungen periodontale Erkrankungen in wirksamer Weise verhindert oder geheilt werden.

Insbesondere wurde festgestellt, daß bei Bereitstellung von Polysacchariden der nachstehenden Formeln (a), (b) und (c), die sich von der Oberflächenschicht von Bakterien von Acti nobacillus actinomycetemcomitans ableiten, zur Immunisierung von Tieren, wie Säugetieren oder Hausgeflügel, mit einem der Polysaccharide allein oder in Kombination mit Polypeptiden zur Verwendung als ein Antigen, die in Blut, Milch oder Eiern erhaltenen Antikörper in erheblichem Umfang die Kolonienbil dung von Actinobacillus actinomycetemcomitans auf oralen Oberflächen unterdrücken können. Werden diese Antikörper so mit in Form von oral verabreichbaren Zusammensetzungen zube reitet, so ist eine wirksame Prophylaxe oder Therapie von periodontalen Erkrankungen möglich.

In den vorstehenden Formeln bedeutet Ac eine Acetylgruppe und n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder mehr.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird eine orale Zusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines Antikörpers enthält, der durch Immunisieren eines Tiers mit einem Antigen erhalten worden ist, das mindestens ein von der Oberflächenschicht von mit periodontalen Erkran kungen verbundenen Bakterien abgeleitetes Polysaccharid um faßt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine oral verabreichbare Zusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines Antikörpers enthält, der durch Immuni sieren eines Tiers mit einem Antigen erhalten worden ist, das mindestens ein von der Oberflächenschicht von mit pe riodontalen Erkrankungen verbundenen Bakterien abgeleitetes und mit einem Polypeptid konjugiertes Polysaccharid umfaßt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine oral verabreichbare Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Antikörper enthält, der durch Immunisieren eines Tiers mit einem Antigen erhalten worden ist, das mindestens ein Polysaccharid, das unter den Sacchariden der vorstehenden Formeln (a), (b) und (c) ausgewählt ist oder mindestens ein Polysaccharid, das mit einem Polypeptid konjugiert oder ver bunden ist, umfaßt.

Das zur Gewinnung des Antikörpers, der für die erfindungsge mäße orale Zusammensetzung verwendet wird, verwendete Anti gen besteht somit mindestens aus einem Polysaccharid, das sich von der Oberfläche von mit periodontalen Erkrankungen verbundenen Bakterien ableitet.

Bei den mit Bakterien verbundenen periodontalen Erkrankungen handelt es sich um Erkrankungen, für die im allgemeinen ein enger ätiologischer Zusammenhang mit periodontalen Er krankungen angenommen wird. Hierzu gehören beispielsweise Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingiva lis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Species von Capnocytophaga, Eikenella corrodens, Wolinella recta, Baceteroides forsythus, Spirocheten, wie Treponema denticola und dergl.

Die von der Oberflächenschicht dieser periodontopathischen Bakterien abgeleiteten Polysaccharide lassen sich nach be liebigen bekannten Verfahrensweisen herstellen. Beispiels weise kann ein Verfahren herangezogen werden, bei dem die gezüchteten Bakterien in einem Autoklaven behandelt werden, ein Verfahren, bei dem Nitrite mit den zu extrahierenden Bakterien umgesetzt werden, und ein Verfahren, bei dem die Bakterien einer Phenol/Wasser-Extraktion unterworfen werden.

Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei dem verwendeten An tigen um mindestens ein Polysaccharid der folgenden Formeln (a), (b) oder (c):

In den vorstehenden Formeln bedeutet Ac eine Acetylgruppe und n eine ganze Zahl von 1 oder mehr und vorzugsweise von 10 bis 1000.

Obgleich es sich bei dem Antigen der Verbindungen (a), (b) oder (c) um beliebige Verbindungen handeln kann, die che misch aus Monosacchariden hergestellt worden sind oder die gemäß den Techniken zur Herstellung von Kohlenhydratketten erhalten worden sind, ist es bevorzugt, ein Serotyp-spezifi sches Polysaccharid-Antigen zu verwenden, das durch Extrak tion und Reinigung aus Bakterien von Actinobacillus actino mycetemcomitans erhalten worden ist.

Die vorstehenden Verbindungen (a), (b) und (c) lassen sich aus Bakterien der Serotypen a, b bzw. c von Actinobacillus actinomycetemcomitans herstellen. Im Fall des Stamms vom Serotyp a kann es sich um Actinobacillus actinomycetemco mitans ATCC 29523, SUNYaB75 oder dergl. handeln. In entspre chender Weise kann es sich beim Stamm des Serotyps b um ATCC 43718 (Y4), ATCC 29522 oder dergl. handeln. Beim Stamm vom Serotyp c kann es sich um NCTC 9710, SUNYaB67 oder dergl. handeln.

In der erfindungsgemäßen Praxis ist es besonders bevorzugt, ein Antigen zu verwenden, das aus Polysacchariden, die von der Oberflächenschicht von periodontopathischen Bakterien abgeleitet sind, oder aus Polysacchariden (a), (b) und (c), die mit Polypeptiden konjugiert sind, besteht.

Die Art der Polypeptide, die mit den von der Oberflächen schicht der Bakterien abgeleiteten Polysacchariden konju giert sind, ist nicht kritisch. Vorzugsweise handelt es sich um Polypeptide, die billig sind und in erheblicher Weise den Antikörpertiter in bezug auf Polysaccharide bei Konjugation mit einem Polysaccharid unter Bereitstellung eines Immuno gens erhöhen können. Zu den für diesen Zweck verwendeten Po lypeptiden gehören verschiedene Albumine (wie BSA, Rinderse rumalbumin), Ovalbumin und dergl., gamma-Globulin, Casein, Biotin, Choleratoxin B-Untereinheit, Ferritin, Transferrin, Cytochrom C, Myosin und dergl.

Die Konjugate zwischen dem Oberflächenschicht-Polysaccharid und dem Polypeptid können nach herkömmlichen Verfahren zur Kupplung von Polysacchariden und Polypeptiden hergestellt werden, vorausgesetzt, daß diese Verfahren eine Kupplung der Polysaccharide und Polypeptide ohne eine Veränderung der an tigenen Beschaffenheit des verwendeten Polysaccharids ermög lichen. Insbesondere können ein Adsorptionsverfahren und ein kovalentes Kupplungsverfahren angewandt werden, wobei das kovalente Kupplungsverfahren im Hinblick auf die Stärke der Bindungskraft bevorzugt wird. Eine Anzahl von Verfahrenswei sen zur kovalenten Kupplung von Polysacchariden mit Polypep tiden ist bekannt. In der erfindungsgemäßen Praxis können beliebige derartige Verfahren angewandt werden. Hierzu gehö ren beispielsweise ein Verfahren, bei dem das Polysaccharid mit Bromcyan aktiviert und anschließend mit einem Polypeptid verknüpft wird, ein Verfahren bei dem eine aromatische Ami nogruppe in das Polysaccharid eingeführt und anschließend eine Diazokupplung mit der aromatischen Gruppe eines Poly peptids durchgeführt wird, ein Verfahren, bei dem eine Ami nogruppe in das Polysaccharid eingeführt und anschließend eine Umsetzung mit der Aminogruppe eines Polypeptids unter Bildung einer Schiffschen-Base vorgenommen wird, sowie ein Verfahren, bei dem nach Umsetzung des Polysaccharids mit einem Tresylchlorid das erhaltene Polysaccharid mit der Amino- oder Thiolgruppe eines Polypeptids gekuppelt wird.

Zur Immunisierung von Tieren mit dem Antigen kann man sich einer subkutanen Injektion, intramuskulären Injektion, ora len Injektion, intravenösen Injektion, pernasalen Verabrei chung, peroralen Verabreichung, peroralen Mucosaverabrei chung und dergl. bedienen. Um den Antikörpertiter zu erhö hen, kann man sich zweckmäßigerweise des Immunisierungsver fahrens unter Verwendung von Adjuvantien, wie Freund-Inkom plett- und Komplett-Adjuvans, Chorelatoxin B-Untereinheit und dergl. bedienen. Beispiele für zu immunisierende Tiere sind Säugetiere, wie Kaninchen, Ziegen, Schafe, Rinder, Pferde und dergl., sowie Geflügel, wie Hühner, Wildenten, Strauße, Hausenten, Coturnix-Wachteln und dergl. Die zur Im munisierung verwendeten Antigene können einzeln oder in Kom bination miteinander eingesetzt werden.

Die oral verabreichbaren Zusammensetzungen der Erfindung enthalten einen Antikörper in Blut oder in Milch, das durch Immunisieren eines Säugetiers mit dem vorstehend definierten Antigen erhalten worden ist, oder einen Antikörper in Eiern, die durch Immunisieren von Geflügel erhalten worden sind. Zu diesem Zweck werden Antiserum, Milch oder Eier mit einem Ge halt an einem derartigen Antikörper in direkter Form bereit gestellt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, einen Anti körper aus dem Antiserum, der Milch oder den Eiern nach üb lichen Reinigungsverfahren zu reinigen und einen derartigen gereinigten Antikörper in der oralen Zusammensetzung bereit zustellen. Der erfindungsgemäß verwendete Antikörper kann nach beliebigen bekannten Verfahren aus dem Serum, der Milch oder den Eiern gereinigt werden. Zu derartigen Reinigungs verfahren gehören das Aussalzen, die Gelfiltration, die Ionenaustauschchromatographie, die Affinitätschromatographie und dergl.

Die Antikörper können in den erfindungsgemäßen Zusammenset zungen direkt oder in Kombination verwendet werden. Die An tikörperdosis liegt vorzugsweise im Bereich von 0,0001 bis 50 g/kg/Tag. Der Antikörper ist in der Zusammensetzung in einer Menge von 0,0002 bis 10 Gew.-% (nachstehend kurz als % bezeichnet) und vorzugsweise von 0,002 bis 5% vorhanden.

Die erfindungsgemäß oral verabreichbare Zusammensetzung kann in Form von Zahnbehandlungsmitteln, wie Zahnpasten, Zahnpul vern, flüssigen Zahnbehandlungsmitteln und dergl., flüssigen Erfrischungsmitteln, wie Mundwässern, Pastillen oralen Pa sten, Massagecremes für das Zahnfleisch, Gurgelmitteln, Kau gummis, Bonbons, Milchprodukten und dergl., eingesetzt wer den. Weitere Zusätze für die oralen Zusammensetzungen der Erfindung hängen von den Typen der oralen Zusammensetzungen ab.

Bei Zahnpasten können beispielsweise Scheuermittel, wie Cal ciumhydrogenphosphat, Calciumcarbonat, Calciumpyrophosphat, unlösliches Natriummetaphosphat, amorphes Siliciumdioxid, kristallines Siliciumdioxid, Aluminiosilikat, Aluminiumoxid, Aluminiumhydroxid, Harze und dgl. (im allgemeinen in einem Anteil von 10 bis 95 Gew.-%), Bindemittel, wie Carboxyme thylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Alginate, Carrageenan, Gummi arabicum, Polyvinylalkohol und dergl. (im allgemeinen in einem Anteil von 0,1 bis 10 Gew.-%), Feuchthaltemittel, wie Polyethylenglykol, Sorbit, Glycerin, Propylenglykol und dergl. (im allgemeinen in einem Anteil von 5 bis 70 Gew.-%), Schäumungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat, Natriumdodecyl benzolsulfonat, hydriertes Kokosfettsäure-monoglycerid, Natriumlaurylsulfoacetat, Natrium-N-Lau roylsarcosinat, N-Acylglutaminate, Saccharosefettsäureester und dergl. (im allgemeinen in einem Anteil von 0,1 bis 10 Gew.-%), etherische Öle, wie Pfefferminzöl, Krauseminzöl und dergl., Aromastoffe, wie 1-Mentol, Carvon, Eugenol, Anethol und dergl., Süßungsmittel, wie Natriumsaccharinat, Stivio sid, Neohesperidyldihydrochalcon, Glycyrrhizin, Perillar thin, p-Methoxyzimtaldehyd und dergl., sowie Konservierungs mittel verwendet werden. Diese Additive können in herkömmli chen Vermischungsanteilen mit Wasser zur üblichen Herstel lung von Zahnpasten eingesetzt werden. Bei anderen oralen Zusammensetzungen, wie Mundwässern, können die entsprechen den Zusätze von den erforderlichen Eigenschaften des Pro dukts abhängen.

In der erfindungsgemäßen Praxis können die oralen Zusammen setzungen mit weiteren Wirkstoffen, z. B. Dextranase, Muta nase, Sorbinsäure, Chlorhexidin, Hinokitol, Cetylpyridi niumchlorid, Alkylglycine, Alkyldiaminoethylglycinsalze, Al lantoin, ε-Amminocapronsäure, Tranexamsäure, Azulen, Vitamin E, wasserlösliche mono- oder dibasische Phosphate, quater näre Ammoniumverbindungen, Natriumchlorid, rohe Arzneistoff extrakte und dergl., vermischt werden.

Die oralen Zusammensetzungen der Erfindung werden mit Anti körpern zubereitet, die durch Immunisieren von Tieren mit einem speziellen Antigen-Typ erhalten worden sind, so daß die mit Bakterien verbundenen periodontalen Erkrankungen in geeigneter Weise an einer Kolonienbildung an oralen Oberflä chen gehindert werden und dadurch in wirksamer Weise eine Therapie oder Prophylaxe dieser Erkrankungen erreicht wird. Der Antikörper weist eine hohe Spezifität gegen die für die periodontalen Erkrankungen verantwortlichen Bakterien auf und kann in hoher Produktivität hergestellt werden.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Versuchsbeispiel 1 (1) Herstellung von Polysacchariden aus der Oberflächen schicht von Bakterien

Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4 (ATCC 43718) wird auf eine Todd-Hewitt-Brühe, die mit 1% Hefeextrakt ergänzt ist, überimpft und 3 Tage in einem Inkubator mit einem Ge halt an 5% CO₂ bei 37°C gezüchtet. Die Bakterien werden ge wonnen, dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen, in Kochsalzlö sung suspendiert und 15 Minuten bei 121°C autoklaviert. Nach Abkühlen wird die Suspension 20 Minuten bei 10 000×g zen trifugiert. Der Überstand wird gewonnen. Der abgesetzte Rückstand wird erneut mit Kochsalzlösung versetzt, wonach die vorstehende Extraktion wiederholt wird. Die Überstände werden vereinigt, gründlich gegen destilliertes Wasser dia lysiert und lyophilisiert. Man erhält ein von der Oberflä chenschicht der Bakterien abgeleitetes Polysaccharid.

Das vorstehend dargestellte allgemeine Verfahren wird wie derholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm Porphyromonas gin givalis 381 (FERM BP-1027) in Todd-Hewitt-Brühe, die mit Hä min und Menadion ergänzt ist, 2 Tage gezüchtet wird. Aus den erhaltenen Bakterien wird ein Oberflächenschicht- Polysaccharid gewonnen.

(2) Kuppeln des Oberflächenschicht-Polysaccharids mit einem Polypeptid

Die auf diese Weise erhaltenen einzelnen Oberflächenschicht- Polysaccharide werden mit Bromcyan aktiviert und anschlie ßend mit Dihydrazid-adipat zur Einführung einer Aminogruppe umgesetzt. Sodann wird Rinderserumalbumin (BSA) nach der Carbodiimidmethode mit dem Polysaccharid gekuppelt. Dieses Oberflächenschicht-Polysaccharid-BSA erweist sich als ein Immunogen.

(3) Herstellung von Antikörpern

Das auf diese Weise hergestellte Antigen wird zur Immunisie rung von Kaninchen zur Erzeugung von Antikörpern verwendet. Die Immunisierung wird gemäß einem üblichen Verfahren durch geführt. Dabei wird eine anfängliche Immunisierung durch subkutane Injektion von 1 mg des Polysaccharid-Antigens zu sammen mit Freund-Komplett-Adjuvans vorgenommen. Anschlie ßend werden 2 mg des Polysaccharid-Antigens in die Ohrvene viermal in insgesamt jeweils 7 Tagen verabreicht. Das erhal tene Antiserum wird zweimal mit zu 50% gesättigter Ammo niumsulfatlösung ausgesalzen, wonach sich eine Dialyse gegen Kochsalzlösung anschließt. Man erhält eine Antikörperprobe.

(4) Antikörperbestimmung (i) Bakterien-agglutinierende Wirkung des durch Immunisie rung von Kaninchen mit Oberflächenschicht-Polysaccha rid erhaltenen Serumantikörpers

Die Agglutinierungsaktivität dieser Antikörperproben auf Bakterien wird bestimmt.

Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4 (ATCC 43718), Por phyromonas gingivalis 381 (FERM BP-1027) Streptococcus sanguis ATCC 15560 und Streptococcus salivarius ATCC 13419 werden jeweils bis zum späten Stadium der logarithmischen Vermehrungsphase gezüchtet. Nach Gewinnen der erhaltenen einzelnen Bakterienstämme werden die Bakterien dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen und sodann in Kochsalzlösung in einer optischen Dichte OD_550nm von 1,0 suspendiert. Anderer seits werden die entsprechenden Antikörper-Proben in Koch salzlösung mit einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml ge bracht, wodurch man Antikörper-Testproben für die Bestimmung der Bakterien agglutinierenden Aktivität erhält. Die ent sprechenden Testproben werden jeweils mit Kochsalzlösung auf das Zweifache verdünnt. Die Bakteriensuspension wird jeweils zu den einzelnen Verdünnungen in einer Menge, die der Ver dünnung entspricht, gegeben. Anschließend wird bewegt und über Nacht stehengelassen. Sodann wird die Agglutinierung der Bakterien visuell festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Die Ergebnisse von Tabelle I zeigen, daß die Antikörper, die durch Immunisierung mit bakteriellen Oberflächenschicht-Po lysaccharid als Antigen erhalten worden sind, eine geringe Reaktivität mit endogenen Bakterien in der Mundhöhle, wie Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius und dergl. aufweisen und somit eine hohe Spezifität besitzen. Es ist ersichtlich, daß im Vergleich zu dem Fall, in dem als Anti gen für die Immunisierung das Oberflächenschicht-Polysaccha rid verwendet wird, die Antikörper, die bei Verwendung der Polysaccharid-BSA-Antigene für die Immunisierung erhalten wurden, eine beträchtlich höhere Reaktivität mit den Bakte rien zeigen.

(ii) Einfluß auf die Hemmung der Kolonienbildung von Acti nobacillus actinomycetemcomitans in der Mundhöhle des Hamsters durch Antikörper aus mit Y4 mit Bakterien- Oberflächenschicht-Polysaccharid immunisiertem Kanin chenserum

Acitonbacillus actinomycetemcomitans Y4 (ATCC 43718) wird nach dreitägiger Züchtung in 1 millimolarem Phosphatpuffer in einer optischen Dichte von OD_550nm von 1,0 suspendiert. Die Suspension wird mit den entsprechenden Antikörpern in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 verdünnt, wonach sich eine 30minütige Umsetzung bei 37°C anschließt. Zur Kontrolle wird die Suspension statt mit Antikörperlösung mit Phosphat puffer vermischt.

Mit den jeweiligen Gemischen werden Gruppen von Hamstern, die jeweils aus 8 Tieren bestehen, in einer Menge von 0,1 ml/Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen geimpft. 1 Woche nach Beendigung der Impfung wird der Randbereich des Zahn fleisches der Hamster mit einem sterilen Wattetupfer abge tupft, um eine Zählung der Actinobacillus actinomycetemco mitans-Bakterien und der übrigen Bakterien durchzuführen. Das Verhältnis der Actinobacillus actinomycetemcomitans-Bak terien zu den gesamten Bakterien wird berechnet und als An teil an Actinobacillus actinomycetemcomitans angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Wie aus Tabelle II ersichtlich ist, bewirkt der anti-Y4- Oberflächenschicht-Polysaccharid-Antikörper, bei dem es sich um einen erfindungsgemäßen Antikörper handelt, eine Hemmung der Kolonienbildung von Actinobacillus actinomycetemcomitans an oralen Oberflächen im Vergleich zur Kontrolle in signifi kanter Weise. Außerdem ergibt ein Vergleich der Hemmwirkung auf die Kolonienbildung von Actinobacillus actinomycetemco mitans des erfindungsgemäßen anti-Y4-Oberflächenschicht-Po lysaccharid-BSA-Antikörpers mit dem anti-Y4-Oberflächen schicht-Polysaccharid-Antikörper, daß beim erstgenannten An tikörper die Wirkung im Vergleich zur Kontrolle stärker aus geprägt ist.

(iii) Einfluß auf die Hemmung der Kolonienbildung von Por phyromonas gingivalis in der Mundhöhle des Hamsters durch Antikörper aus mit 381 Bakterien-Oberflächen schicht-Polysaccharid immunisiertem Kaninchenserum

Porphyromonas gingivalis 381 (FERM BP-1027) das 3 Tage ge züchtet worden ist, wird in 1 millimolarem Phosphatpuffer in einer optischen Dichte OD_550nm von 1,0 suspendiert. Die Sus pension wird mit anti-381-Oberflächenschicht-Polysaccharid- Antikörper oder mit anti-381-Oberflächenschicht-Polysaccha rid-BSA-Antikörper in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 ver mischt, wonach sich eine 30minütige Umsetzung bei 37°C an schließt. Zur Kontrolle wurde die Suspension mit Phosphat puffer anstelle der Antikörperlösung vermischt.

Bei Gruppen von Hamstern, die aus jeweils 8 Tieren bestehen, wird am ersten Backenzahn des Unterkiefers ein Baumwollfaden angebunden. Sodann erhalten die Hamster eine Verabreichung der einzelnen Gemische in einer Menge von 0,1 ml/Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen. Eine Woche nach Beendigung der Impfung werden die angebundenen Fäden entfernt, um die An zahl der Porphyromonas gingivalis-Bakterien und die Gesamt zahl der anaeroben Bakterien im Faden zu zählen. Das Ver hältnis der Porphyromonas gingivalis-Bakterien zur Gesamt zahl an anaeroben Bakterien wird berechnet und als Porphyro monas gingivalis-Verhältnis angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Wie aus Tabelle III hervorgeht, hemmt der erfindungsgemäße anti-381-Oberflächenschicht-Polysaccharid-Antikörper im Ver gleich zur Kontrolle in signifikanter Weise die Kolonienbil dung von Porphyromonas gingivalis auf oralen Oberflächen. Außerdem weist der erfindungsgemäße anti-381-Oberflächen schicht-Polysaccharid-BSA-Antikörper eine signifikant hohe Hemmwirkung auf die Kolonienbildung von Porphyromonas gingi valis auf, die jeweils im Vergleich zur Kontrolle stärker ausgeprägt ist als die Wirkung von anti-381-Oberflächen schicht-Polysaccharid-Antikörper.

Versuchsbeispiel 2 (1) Herstellung von Polysaccharid-Antigen

Die Stämme Actinobacillus actinomycetemcomitans (ATCC 29523), Y4 (ATCC 43718 und NCTC 9710) werden jeweils auf Todd-Hewitt-Brühe, die mit 1% Hefeextrakt ergänzt ist, überimpft und 3 Tage bei 37°C in einem Inkubator mit einem Gehalt an 5% CO₂ gezüchtet. Die gebildeten Bakterien werden gewonnen, dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen, in Kochsalz lösung suspendiert und 15 Minuten bei 121°C autoklaviert. Nach Abkühlen wird die Suspension 20 Minuten bei 10 000×g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen. Der abgesetzte Rückstand wird erneut mit Kochsalzlösung versetzt. Der vor stehende Extraktionsvorgang wird wiederholt. Die Überstände werden vereinigt, gründlich gegen destilliertes Wasser dia lysiert und lyophylisiert. Die erhaltene Probe wird in einem 0,01 m Tris-hydrochlorid-Puffer (pH-Wert 8,2) in einer Kon zentration von 100 mg/ml gelöst, wonach sich eine 2tägige Dialyse gegen Puffer bei 4°C anschließt. Die erhaltene Lö sung wird der Ionenaustauschchromatographie an einer mit DEAE-Sephadex A-25 gepackten Säule, die mit dem vorstehenden Puffer äquilibriert worden ist, unterzogen. Die Zucker-Peak fraktionen, die die Säule ohne Adsorption passieren, werden gewonnen und in einem Rotationsverdampfer eingeengt, wo nach sich eine ausreichende Dialyse gegen destilliertes Was ser anschließt. Das erhaltene Dialysat wird der Gelfiltra tion an einer mit Sephacryl S-300 gepackten Säule unterwor fen. Eine einzelne Zucker-Peakfraktion wird gewonnen und lyophilisiert. Man erhält ein Polysaccharid-Antigen.

(2) Kuppeln des Polysaccharid-Antigens mit einem Polypeptid

Das auf diese Weise erhaltene Polysaccharid-Antigen wird mit Bromcyan aktiviert, wonach sich eine Umsetzung mit Dihy drazid-adipat zur Einführung von Aminogruppen anschließt. Anschließend wird Rinderserumalbumin (BSA) an das Polysac charid-Antigen gemäß dem Carbodiimid-Verfahren gekuppelt. Man erhält ein Polysaccharid-BSA-Antigen.

(3) Herstellung eines Antikörpers

Das auf diese Weise hergestellte Polysaccharid-Antigen bzw. Polysaccharid-BSA-Antigen wird zur Immunisierung von Kanin chen zur Gewinnung von Antikörpern verwendet. Diese Immuni sierung wird gemäß einem üblichen Verfahren durchgeführt. Zunächst wird eine anfängliche Immunisierung durch eine sub kutane Injektion von 1 mg Polysaccharid-Antigen zusammen mit Freund-Komplett-Adjuvans vorgenommen. Anschließend werden 2 mg des Polysaccharid-Antigens in die Ohrvene viermal in ins gesamt 7 Tagen intravenös verabreicht. Das erhaltene Antise rum wird zweimal mit zu 50% gesättigter Ammoniumsulfatlö sung ausgesalzt, wonach sich eine Dialyse gegen Kochsalzlö sung anschließt. Man erhält eine Antikörper-Probe.

(4) Einfluß auf die Hemmung der Kolonienbildung von Actino bacillus actinomycetemcomitans in der Mundhöhle des Ham sters durch Kaninchenserum-Antikörper

Stämme von Actinobacillus actinomycetemcomitans, die 3 Tage gezüchtet worden sind, werden in 1 millimolarem Phosphatpuf fer in einer optischen Dichte von OD_{550 nm} von 1,0 suspen diert. Die Suspension wird mit dem jeweiligen Antikörper in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 vermischt, wonach sich eine 30minütige Umsetzung bei 37°C anschließt. Zur Kontrolle wird die Suspension mit Phosphatpuffer anstelle der Antikör perlösung vermischt.

Die jeweiligen Gemische werden zur Impfung von Hamstergrup pen, die jeweils aus 8 Tieren bestehen in einer Menge von 0,1 ml/Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen verwendet. Eine Woche nach Beendigung der Impfung wird der Randbereich des Zahnfleisches der einzelnen Hamster mit einem sterilen Baumwolltupfer abgetupft, um eine Zählung der Actinobacillus actinomycetemcomitans-Bakterien sowie der gesamten Bakterien vorzunehmen. Das Verhältnis der Actinobacillus actinomy cetemcomitans-Bakterien zu den gesamten Bakterien wird be rechnet und als Verhältnis von Actinobacillus actinomycetem comitans angegeben. Das vorstehende Verfahren wird insgesamt dreimal wiederholt, wobei man unterschiedliche Stammtypen verwendet (Versuche A, B und C). Die Ergebnisse sind in den Tabellen IV bis VI zusammengestellt.

Tabelle IV

Versuch A (inoculierter Stamm: ATCC 29523)

Tabelle V

Versuch B (inoculierter Stamm: Y4)

Tabelle VI

Versuch C (inoculierter Stamm: NCTC 9710)

Aus den Tabellen IV bis VI geht hervor, daß die jeweiligen Antikörper im Vergleich zur Kontrollgruppe in signifikanter Weise die Kolonienbildung von Actinobacillus actinomycetem comitans auf oralen Oberflächen hemmen. Ferner ergibt sich bei Verwendung der mit BSA konjugierten Polysaccharide als Antigen eine stärker ausgeprägte Hemmung der Kolonienbildung als bei Verwendung der Polysaccharide allein.

In den nachstehenden Beispielen für erfindungsgemäße Zusam mensetzungen beziehen sich die Prozentangaben auf das Ge wicht. A.a. bedeutet Actinobacillus actinomycetemcomitans, P.g. bedeutet Porphyromonas gingivalis, P.i. bedeutet Prevo tella intermedia, F.n. bedeutet Fusobacterium nucleatum, W.r. bedeutet Wolinella recta, B.f. bedeutet Bacteroides forsythus und T.d. bedeutet Treponema denticola.

Beispiel 1

Beispiel 2

Beispiel 3

Beispiel 4

Beispiel 5

Beispiel 6

Beispiel 7

Beispiel 8

Beispiel 9

Beispiel 10

Beispiel 11

Beispiel 12

Beispiel 13

Beispiel 14

Beispiel 15

Beispiel 16

Beispiel 17

Beispiel 18

Claims

1. Oral verabreichbare Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge eines Antikörpers, erhältlich durch Immunisieren eines Tiers mit einem Antigen, das mindestens ein von einer Oberflächenschicht von mit pe riodontalen Erkrankungen verbundenen Bakterien abgelei tetes Polysaccharid umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus mindestens einem Po lysaccharid besteht.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in der Zusammensetzung in einer Menge von 0,0002 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Zusammenset zung, enthalten ist.

4. Orale Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge eines Antikörpers, erhältlich durch Immunisieren eines Tiers mit einem Antigen, das mindestens ein von der Oberflächenschicht mit periodontalen Erkran kungen verbundenen Bakterien abgeleitetes Polysaccharid enthält und mit einem Polypeptid konjugiert ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus mindestens einem mit einem Polypeptid konjugierten Polysaccharid besteht.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in der Zusammensetzung in einer Menge von 0,0002 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Zusammenset zung, enthalten ist.

7. Oral verabreichbare Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Antikörpers enthält, erhältlich durch Immuni sieren eines Tiers mit einem Antigen, das mindestens ein unter den Polysacchariden der nachstehen den allgemeinen Formeln (a), (b) und (c) ausgewähltes Polysaccharid umfaßt: worin Ac eine Acetylgruppe und n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder mehr bedeutet.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus dem Polysaccharid der Formel (a) besteht.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus dem Polysaccharid der Formel (b) besteht.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus dem Polysaccharid der Formel (c) besteht.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus einem Gemisch aus den Polysacchariden der Formeln (a), (b) und/oder (c) besteht.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid in einer Menge von 0,0002 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, enthalten ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen im wesentlichen aus mindestens einem Po lysaccharid, das mit einem Polypeptid konjugiert ist, besteht.