DE4217916A1

DE4217916A1 - N-Alkylamin- und N-Arylalkylaminderivate von Heparin, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung

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Publication number: DE4217916A1
Application number: DE19924217916
Authority: DE
Inventors: Job Prof Dr Med Harenberg; Reinhard Malsch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1992-05-30
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2012-05-31
Also published as: DE4217916C2

Description

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind neue N-Alkylamin- und N-Phenylalkylaminderivate von Heparin, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung als Gerinnungshemmer so wie zur Herstellung markierter Heparinderivate.

Heparin ist ein Polyschwefelsäureester eines Mucopolysaccha rids, das aus Glucosamin und Uronsäuren wie L-Iduronsäure und D-Glucuronsäure aufgebaut ist und ein durchschnittliches Molekulargewicht von ca. 15 000 Dalton hat. Glucosamin und Uronsäuren treten dabei überwiegend alternierend auf, wobei das Heparin normalerweise aus etwa 8-30 solcher Disaccharid einheiten zusammengesetzt ist, welche gegebenenfalls eine unterschiedliche Stellung der Sulfonylgruppen aufweisen. In der folgenden Formel ist ein Ausschnitt der Kette mit einer wahrscheinlichen Struktur wiedergegeben, wobei die Sulfonyl gruppen jeweils durch ein dargestellt sind.

Heparin ist eine körpereigene Substanz, die z. B. in Mastzel len, aber auch in der Leber, Lunge, Darmschleimhaut und im Herzen vorkommt, und die Blutgerinnung in vitro und in vivo zu hemmen vermag. Die Wirkung beruht dabei auf der sogenann ten Antithrombin und Antithromboplastinfunktion, durch die die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin von Fibrinogen zu Fibrin unterbunden wird. Diese Eigenschaften nutzt man therapeutisch zur Antikoagulation und zur Thromboseprophy laxe. Technisch wird Heparin aus der Darmschleimhaut von Schlachttieren gewonnen. Die antikoagulante Potenz der so hergestellten Heparine lädt sich durch verschiedene Gerin nungsteste, beispielsweise den Hep-Test, bestimmen. Chemisch lassen sich Heparine mit salpetriger Säure oder Peroxid in kleinere Fragmente spalten, die bei einer Kettenlänge von 2 bis 12 Disaccharideinheiten ebenfalls noch antikoagulante Eigenschaften aufweisen (US-P 4 303 651, EU-A2-0 014 184).

Bei der Spaltung von Heparin durch salpetrige Säure entsteht am reduzierenden Ende des Heparinfragments eine Anhydroma nose. Diese Anhydromanosegruppe ist sehr reaktiv und kann mittels einer reduktiven Aminierung mit primären Alkylaminen oder Arylalkylaminen substituiert werden. Chemisch wird da bei intermediär aus der Aldehydgruppe des endständigen Zuckers und dem Amin die entsprechende Schiff′sche Base gebildet, welche durch Reduktion, beispielsweise mit komple xen Hydriden, wie Natriumborhydrid, in den entsprechenden Aminozucker überführt wird.

Die so hergestellten Heparinamine weisen ebenfalls eine antikoagulante Aktivität auf, die mit der zugrundeliegenden Heparinkette in gewissem Umfang variiert. Sie können daher als Antikoagulantien direkt eingesetzt werden.

Wichtig ist jedoch, daß die Aminogruppe es erlaubt, Heparin amin durch Einführung einer stabilen radioaktiven Markierung oder eines fluoreszierenden weiteren Substituenten zu mar kieren, ohne daß dadurch die Antikoagulationseigenschaft wesentlich verändert wird. Die so markierten Produkte können für diagnostische Zwecke verwendet werden, um die metabo lische Verteilung und den Abbau von Heparin im Körper zu untersuchen.

Für die radioaktive Markierung ist Tyramin (4-Hydroxyphe nylethylamin) ein besonders geeigneter Vertreter, da die Phenolgruppe des entstehenden Heparinamins leicht nach bekannten Methoden mit radioaktivem Jod substituiert werden kann, so daß das Produkt dann in einem Radioimmunassay (RIA) auch in hoher Verdünnung noch nachgewiesen werden kann. Eine Markierung der Heparinamine über fluoreszierende Gruppen lädt sich beispielsweise durch entsprechende fluoreszie rende Verbindungen, die eine Isothiocyanatgruppe aufweisen, durchführen, indem man die Isocyanatgruppe mit dem sekun dären Aminstickstoff koppelt. Für diese Reaktion geeignete Aminderivate leiten sich vom Alkylamin oder Arylalkylamin ab, wobei der Alkylrest 1 bis 10 C-Atome aufweisen kann. Die Alkylgruppe kann auch verzweigt oder ringförmig sein und gegebenenfalls durch eine Amino-, Hydroxy- oder Carboxyl gruppe substituiert sein, wodurch sich eine zusätzliche Reaktivität ergibt.

Als Vorstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird unfrak tioniertes Heparin mit salpetriger Säure bei pH von ungefähr 2,5 in wäßriger Lösung gespalten (Shively, J.E., Conrad, H.C.: Formation of Anhydrosugars In The Chemicals Depoly merization Of Heparin. Biochemistry 1976, 15 : 3932; Cifonelli, J.A.: Reactions of Heparitin Sulfate With Nitrous Acid. Carbohydrate Research 1968, 8 : 233). Die so gewonnenen Heparinfragmente können isoliert und gegebenenfalls fraktio niert werden. Es ist jedoch auch möglich, die entsprechende Lösung direkt zu neutralisieren (pH 7 bis 9) und unter Zufü gen von Amin und komplexem Hydrid im Eintopfverfahren das entsprechende Heparinamin herzustellen. Die entstandenen Heparinderivate lassen sich entweder durch Ausfällen oder durch Dialyse der entstandenen Reaktionslösung gegen Wasser und anschließendes Lyophilisieren in fester Form gewinnen.

Die radioaktive Markierung bzw. die Markierung durch fluo reszierende Gruppen erfolgt in an sich bekannter Weise durch Reaktion der wasserlöslichen Salze in wäßriger Lösung mit Jod bzw. den entsprechenden Isothiocyanaten.

In den folgenden Beispielen ist die Methode näher erläutert, ohne daß dadurch das Verfahren beschränkt sein soll.

Beispiel 1 Spaltung von Heparin mit salpetriger Säure

3 g unfraktioniertes handelsübliches Heparin, welches aus Schweinedarm gewonnen ist, wird in 100 ml Wasser gelöst und mit 0,150 mg Natriumnitrit versetzt und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt. Die Lösung wird 24 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen und danach die entstandenen Heparinfrag mente durch Hinzufügen von Ethanol ausgefällt und durch Gel chromatographie gereinigt.

Ausbeute: 2,4 g Heparinfragmentgemisch (Molgewicht ca. 3600- 5000).

Die weitere Reinigung und Bestimmung des Produktes erfolgt mittels Gelpermeationschromatographie (GPC).

HPLC Pumpe 2150 von LKB Broma, Schweden; Injektor 7125 von Coatati, California; Probenschleife 20 µl; Mikroliterspritze # 802 von Hamilton; Vorsäule: Ultropac column TSK SWP 7,5_*75 mm von LKB Broma, Schweden; Säule: Ultropac column TSK-G 2000 SW 7,5_*300 mm von LKB Broma, Schweden; Detektion: Waters 991 Photodiodenarray Detektor, Waters 5200 Printer Plotter, Nec Power Mate SX Plus und Pda Software;
Chemikalien: NaCl NR. 6404 von Merck, entgastes "li-chrosolv water for chomotography" von Merck;
Bedingungen: Flußrate 1 ml/min, Detektion 206 nm, 0.5 AUFS, Schreiber 10 mm/min, Druck 25-28 bar, Eluens: 0,1 N NaCl, Injektionsvolumen 20 µl.

Beispiel 2 Darstellung von Heparintyramin

100 mg gespaltenes Heparin werden in 16,6 ml Aqua dest ge löst und mit verdünnter Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt. Danach werden 457,3 mg Tyramin und 83,3 mg Natrium-cyano borhydrid zugegeben und die Lösung 24 h bei Raumtemperatur gehalten. Der pH-Wert der Lösung wird erneut auf 7,0 einge stellt und weitere 83,3 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben.

Nach einer erneuten Reaktionsdauer von 48 h bei Raum temperatur wird die Lösung mit einem Amicon Dialyser mit einem Cut Off von 500 Dalton gegen Wasser dialysiert bis zur Salz und Tyraminfreiheit. Danach wird die Lösung am Rota tionsverdampfer bei 65°C Badtemperatur auf 10 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.

Ausbeute

Das lyophilisierte Produkt wird einer Gelpermeationschroma tographie an einer Ultropac column TSK mit 0,1 N NaCl Eluent unterworfen. Detektion erfolgt anhand der UV-Absorption bei 276 nm und 206 nm. Heparin absorbiert im UV-Licht nur bei 206 nm und nicht bei 276 nm, während Tyramin bei 276 nm absorbiert. Ein Peak zwischen 19 und 25 Minuten Elutionszeit und einer UV-Absorption bei 276 nm zeigen, daß Heparintyra min gekoppelt ist und ebenso wie nichtaminiertes gespaltenes Heparin, welches nur bei 206 nm UV absorbiert, von der Säule eluiert. Freies Tyramin wird nicht eluiert, da es bei der Dialyse aus der Präparation entfernt wurde. Die Ausbeute von Heparintyramin aus der Ausgangssubstanz beträgt mindestens 70%.

Beispiel 3 Radioaktive Markierung von Heparin-Tyramin

Zu Beginn werden 10 µl (1mCi) Jod¹²⁵ (IMS 30 Amersham Buch ler GmbH, Braunschweig) in ein Reagenzglas mit Gummistopfen gegeben. Danach gibt man 10 µg/10 µl Heparin-Tyramin und 15 µl Chloramin T in Na₂HPO₄-Puffer, pH 7,4, gelöst dazu. Dabei sind 17,5 mg Chloramin-T in 10 ml Na₂HPO₄-Puffer gelöst.

Das Ganze wird 30 Sekunden gemischt. Die diesem Vorgang wird Jod¹²⁵ an Heparin-Tyramin gebunden, wobei Chloramin-T als Oxidans wirkt. Danach fügt man 20 µg Na₂S₂O₅ dazu. Na₂S₂O₅ stoppt die Markierung, indem es nicht gebundenes Jod zu Jodid reduziert. Dieser Vorgang dauert 30 Sekunden.

Das Reaktionsgemisch wird nun auf einer Sephadex G 25 Säule aufgetragen und mit Tris-NaCl-Puffer pH =7,5 eluiert. Man zählt 10 Tropfen in ein Reagenzglas.

Abschließend werden von jeder Probe 10 µl in Zählröhrchen pipetiert und im Counter 1 Minute gezählt. Das so erhaltene Chromatogramm zeigt radioaktiv markiertes Heparin-Tyramin im Peak 1 und im Peak 2, der wesentlich niedriger ist; in ihm befindet sich das restliche, nicht zur Markierung verwendete Jod¹²⁵.

Die Bindung von Jod¹²⁵ an Heparin-Tyramin war in allen Ver suchen größer als 98% (Hunter, W.N., Greenwood, F.C.: Preparation of Iodine labelled Human Growth Hormone Of High Specific Acitivity. Nature 1962, 194 : 495).

Beispiel 4 Markierung von Heparintyramin mit Fluoreszeinisothiocyanat

120 mg Heparintyramin werden in 5 ml Wasser gelöst und mit 0,5 M Natriumhydrogencarbonat auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht und mit 18 mg Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) ver setzt. Die Reaktionsdauer bei Raumtemperatur beträgt 6 h.

Zur Abtrennung von überschüssigem FITC wird das Heparintyra min-FITC mit 80%igem Ethanol ausgefällt und über Sephadex G25 einer Gelfiltration unterworfen. Aufgrund der Fluores zenz bei 480 nm lädt sich das Heparinfluoreszein-5-isothio cyanat leicht erkennen. Das Chromatogramm der HPLC analog Beispiel 2 zeigt mehrere nicht vollständig getrennte Peaks zwischen 22 und 30 Minuten Elutionszeit, die den verschie denen Molgewichten der Heparinfragmente entsprechen.

Beispiel 5 Herstellung von Heparin-1,6-diaminohexan

120 mg LMW-Heparin (gemäß Beispiel 1) und 12 mg 1,6-Diamino hexan werden mit 12 mg Natriumcyanoborhydrid bei pH 8,7 in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht (24 h). Natriumcyanoborhydrid und überschüssiges 1,6-Dia minohexan werden durch erschöpfende Dialyse gegen Wasser entfernt, das Volumen eingeengt und das 1,6-Diaminohexanhe parin durch Lyophilisation isoliert.

Das lyophilisierte Produkt wird einer Gelpermeationschroma tographie an einer Ultropac column TSK mit 0,1 N NaCl Eluent unterworfen. Die Detektion erfolgt anhand der UV-Absorption bei 206 nm. Es zeigt sich ein Heparin-1,6-diaminohexan-Peak zwischen 13 und 25 Minuten Retentionszeit. 1,6-Diaminohexan wird unter diesen Bedingungen nicht detektiert, da es durch Dialyse entfernt wurde. Die Ausbeute beträgt mehr als 70% Heparin-1,6-diaminohexan.

Das Spektrum einer wäßrigen 1%igen Lösung der Substanz zeigt eine Absorption bei 200 bis 260 nm an.

Beispiel 6 Markierung von 1,6-Diaminohexanheparin mit Rhodamin-B- isothiocyanat

100 mg 1,6-Diaminohexanheparin werden mit 2,1 mg Rhodamin-B- isothiocyanat in wäßriger Lösung bei pH 11,5 und einer Reaktionstemperatur von 37°C 24 h zur Reaktion gebracht. Das Produkt wird danach erschöpfend gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.

Bei der Gelchromatographie zeigt die Fluoreszenzdetektion bei 480 nm eine breite Bande zwischen 14 und 24 Minuten Retentionszeit, welche auf die verschiedenen, nicht getrenn ten Rodamin-1,6-diaminohexanheparinfragmente zurückzuführen ist, und einen weiteren Peak zwischen 24 und 26 Minuten, welche auf Rodamin-B-1,6-diaminohexan zurückgeht. Rodamin-B- isothiocyanat fluoresziert unter diesen Bedingungen nicht.

Beispiel 7 Antikoagulatorische Aktivität der Heparinderivate

Für den Nachweis der biologischen Gerinnungsaktivität von Heparinen liegen spezifische Testsysteme vor. Dieser erfaßt die Hemmung des empfindlichsten aktivierten Gerinnungspro teins im Rahmen der Gerinnungskaskade, den sogenannten Fak tor Xa. Der hier verwendete "Heo-Test" (Hemachem, St. Louis, USA) basiert auf dem Prinzip, daß plasmatische Anteile im Blut durch Zugabe von Reagentien zur Gerinnung gebracht wer den, wobei die normalen Gerinnungszeiten unter 22 Sekunden liegen. Eine Verlängerung der Gerinnungszeit zeigt eine Wir kung des Heparins bzw. der Heparinderivate, insbesondere auf den Faktor Xa an.

Anhand des I. Internationalen Standards für niedermolekulare Heparine werden die Gerinnungszeiten in sec in Internatio nale Einheiten/mg Trockensubstanz fraktioniertes Heparin bzw. Heparinderivat umgerechnet (vgl. J. Harenberg et al., Haemostasis, 1989, 19, 13-20).

In der nachstehenden Tabelle sind die so berechneten Einhei ten der gerinnungshemmenden Aktivität pro 1 mg der verschie denen Produkte zusammengefaßt.

Substanz
Internationale Einheiten/mg
Kontrolle
<0,01
Heparin	180
LMW-Heparin	120
Heparintyramin	108
Heparintyramin FITC	70
1,6-Diaminohexanheparin	52
Rhodamin-1,6-Diaminohexanheparin	110

Claims

1. Heparinamin der Formel I
Hep-NX-R (I),
worin
Hep ein Heparinfragment mit 4-16 Disaccharideinheiten und
R und X sind Wasserstoffatome oder Alkylgruppen mit 1-10 C-Atomen, welche geradkettig, verzweigt oder ring förmig sein können und durch eine Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl- oder Arylgruppe, die ihrerseits eine Hydro xyl- oder Aminogruppe tragen kann, substituiert sein können.

2. Heparinamin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe R eine Hydroxyphenylalkyl oder Aminoal kylgruppe darstellt.

3. Verfahren zur Herstellung von Heparin gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Heparin fragment mit einer endständigen Anhydromanosegruppe mit einem Amin der Formel NH₂R unter reduzierenden Bedin gungen umsetzt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel ein komplexes Hydrid ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Hydrid Natriumcyanoborhydrid oder Natrium borhydrid ist.

6. Verwendung von Heparinaminen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von radioaktiv oder durch fluoreszeie rende Gruppen markierter Heparinderivate.

7. Jodtyraminheparin.

8. Fluoreszeinylisothiocyanat-tyraminheparin.

9. Rhodamin-B-isothiocyanat-1,6-diaminohexanheparin.