DE4200066C2 - Verwendung eines wäßrigen zitronensäurehaltigen Desinfektionsmittels zur Inaktivierung von Hepatitis-B-Viren - Google Patents
Verwendung eines wäßrigen zitronensäurehaltigen Desinfektionsmittels zur Inaktivierung von Hepatitis-B-VirenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines wäßrigen
zitronensäurehaltigen Desinfektionsmittels bei der
Desinfektion insbesondere thermolabiler
medizinischer Instrumente und Geräte sowie Teile
derselben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, der
Desinfektion mit zitronensäurehaltigen wäßrigen
Desinfektionsmitteln neue klinische
Anwendungsbereiche zu erschließen, wobei auf dem
neuen Verwendungsgebiet eine hohe Wirksamkeit bei
möglichst geringer Einwirkungszeit und möglichst
niedrigen Einwirkungstemperaturen gewährleistet sein
soll. Insbesondere in klinischen Bereichen, in denen
die Verwendung von zitronensäurehaltigen wäßrigen
Desinfektionsmitteln bislang nicht angezeigt war,
weil das Risiko einer Infektion zu groß war, soll
die Wirksamkeit gut sein.
Bekanntlich stellt gerade im Dialysebereich die
Gefahr einer Hepatitis-Infektion ein ernstes Problem
dar.
Es ist bekannt, daß zur rein thermischen
Inaktivierung von Hepatitis-B-Viren eine Temperatur
von 100°C bei einer Erhitzungsdauer von 10 Minuten
oder aber eine Erhitzungsdauer von 10 Stunden auf
eine Temperatur von 60°C, und von Hepatitis-A-Viren
ein einminütiges Erhitzen auf 98°C erforderlich ist
(vgl. K. H. Wallhäußer, "Praxis der Sterilisation,
Desinfektion, Konservierung", 4. Aufl., 1988, Georg
Thieme Verlag Stuttgart/New York, Seiten 75 ff.
(Tabelle 31)). Infolge der erforderlichen
verhältnismäßig hohen Temperaturen bzw. langen
Einwirkungsdauer ist diese Desinfektionsmethode
insbesondere für hitzelabile Geräte aus
Kunststoffen, wie zum Beispiel Dialysegeräten,
unbrauchbar, weshalb derzeit eine Desinfektion von
Geräten und Instrumenten durch Einlegen derselben
für mindestens 6 Stunden in eine 3%ige
Formalinlösung erfolgt, wonach zwecks Vermeidung
einer völlig unerwünschten Wirkstoffadsorption an
den Kunststoffoberflächen sorgfältig gespült werden
muß (vgl. K. H. Wallhäußer, a.a.O., S. 76).
Abgesehen von der Umweltfeindlichkeit und Toxizität
des Wirkstoffs Formaldehyd, sind derartige
Verweilzeiten in der Praxis wenig akzeptabel.
Es waren bereits Desinfektionsmittel bekannt, die
Zitronensäure enthalten und gegen bestimmte Viren
wirksam sind. So wird nach der Med. Wet. 27 (8),
1971, Seiten 480-482, der Zitronensäure viruzide
Wirksamkeit gegen Aphthoviren zugesprochen.
Aus Chem. Abstr. 49/13355 a, b, ist die Inhibitor-
Wirkung von Säuren (Zitronensäure) auf Influenza-A-
Virus PRB bekannt. Die Inhibierung von Influenza-
und anderen Viren (Herpes, Vaccinia) durch ein
viruzides Gemisch (Benzalkoniumchlorid, Triton
X 100, Zitronensäure) beschreibt Applied
Microbiology, 1971, Seiten 606-610.
Es wurde nun gefunden, daß die Aktivität des
Hepatitis-B-Virus durch eine nur 1,5 (0,4)
Gew.-%ige wäßrige Zitronensäurelösung bereits bei
einer Einwirkungstemperatur von 20°C (60°C) und
einer Einwirkungszeit von nur 5 Minuten auf eine
virale Aktivität herabgesetzt werden kann, die im
DNS-Polymerasetest nicht mehr meßbar war. Dies ist
überraschend, nachdem nachgewiesen worden war, daß
das bovine Parvovirus (BPV, Stamm Haden), das
gegenüber chemischen Desinfektionsmitteln als sehr
widerstandsfähig gilt, bei einer Temperatur von 30°C
und weniger, selbst bei einer Einwirkungszeit von
6 Stunden durch Essig-, Propion-, Zitronen- oder
sogar Ameisensäure, die sich bei höheren
Temperaturen am wirksamsten erwies, in einer
Konzentration von 3% nicht bzw. nicht nennenswert
inaktiviert wird (vgl. Hyg + Med 15 (1990), S.
313-317), und andererseits eine Inaktivierung des
Hepatitis-A- und Hepatitis-B-Virus durch
Einstellung eines sauren pH-Bereichs auszuschließen
war (vgl. K. H. Wallhäußer, a.a.O., Seiten 79/80).
Gegenstand der Erfindung ist nun die Verwendung
eines gegebenenfalls in Konzentratform vorliegenden
Desinfektionsmittels mit einem Gehalt an
Zitronensäure als viruzidem Wirkstoff zur
Inaktivierung von Hepatitis-B-Viren bei der
Desinfektion von thermolabilen medizinischen
Instrumenten und Geräten sowie Teilen derselben,
Dialysegeräten und Flächen.
Das neu verwendete Desinfektionsmittel zeichnet sich
gegenüber dem bislang verwendeten, in aller Regel
Formaldehyd enthaltenden Desinfektionsmittel durch
die Umweltfreundlichkeit seiner viruziden Wirkstoffe
aus; vor allem aber ermöglicht es wesentlich
geringere Einwirkungszeiten, und dies bei ebenfalls
relativ niedrigen Temperaturen. Es können u. a. mit
Hepatoviren, insbesondere Hepatitis-B-Viren,
kontaminierte Flächen, insbesondere von
thermolabilen medizinischen Instrumenten und Geräten
sowie Teilen derselben, desinfiziert werden, wobei
man die Flächen bei einer Temperatur von etwa 20°C
bis etwa 75°C während zumindest 1 bis 5 Minuten mit
einer wäßrigen Lösung in Berührung bringt, die
Zitronensäure in einer viruziden Konzentration
enthält.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäß
verwendeten Desinfektionsmittels enthält
Zitronensäure als viruziden Wirkstoff
in einer Konzentration von 0,05-3 Gew.-%,
vorzugsweise 0,2-2,5 Gew.-%, insbesondere etwa
0,4-0,6 Gew.-%.
Da die desinfizierende Wirkung mit der Erhöhung der
Temperatur und Einwirkzeit zunimmt, ist die obere
Grenze der Zitronensäurekonzentration speziell
kurzen Einwirkzeiten, beispielsweise 5-10 Min.,
und niedrigen Temperaturen, beispielsweise die
Raumtemperatur, zuzuordnen, während die unteren
Grenzwerte entsprechend höheren Temperaturen eher
60% und mehr sowie längeren Einwirkzeiten (15 Min.
und mehr) zuzuordnen sind.
Die Wirkung der Zitronensäure kann durch Zugabe
weiterer Säuren, insbesondere Apfelsäure, Milchsäure
und/oder Weinsäure verbessert werden. Zusätzlich
können hierdurch Resistenzentwicklungen verhindert
werden. Darüber hinaus kann die Neigung zur
Kristallisation unterdrückt werden. Diese Säuren
werden jeweils in einer Menge von 5-20 Gew.-%,
vorzugsweise etwa 10 Gew.-%, des
Zitronensäuregehalts eingesetzt.
Das erfindungsgemäß verwendete Desinfektionsmittel
wird zweckmäßigerweise in Form eines
Säurekonzentrats zur Verfügung gestellt, wobei sich
eine besondere Ausführungsform durch einen Gehalt
von 50 Gew.-% Zitronensäure auszeichnet. Das
Konzentrat wird am Ort des Einsatzes mit sterilem,
entionisiertem Wasser auf die niedrigere
Konzentration, z. B. auf 2 Gew.-%, verdünnt.
Eine weitere besondere Ausführungsform in Form eines
Konzentrats zeichnet sich durch einen Gehalt von 21
Gew.-% Zitronensäure, 2 Gew.-% Milchsäure und
2 Gew.-% Apfelsäure aus.
Wie nachgewiesen wurde (vgl. nachfolgendes Beispiel)
ermöglicht schon eine 1,5 Gew.-%ige wäßrige
Zitronensäurelösung die völlige Inaktivierung von
Hepatitis-B-Viren bei einer Einwirkungszeit von nur
5 Minuten und einer Einwirkungstemperatur von
lediglich 20°C. Demgemäß kann man bei der
Desinfektion unter erfindungsgemäßer Verwendung des
Desinfektionsmittels die kontaminierten Flächen mit
einer zumindest 1,5 Gew.-%igen, vorzugsweise 1,5
Gew.-%igen, wäßrigen Zitronensäurelösung bei einer
Einwirkungstemperatur von 20-75°C, insbesondere
20°C, und während einer Einwirkungszeit von
zumindest 5 Minuten, insbesondere 5 Minuten, in
Berührung bringen.
Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren
Erläuterung der Erfindung.
Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich
Prozentangaben auf das Gewicht.
Die hepatoviruziden Eigenschaften einer
2 Gew.-%igen Zitronensäurelösung wurden im
Suspensionsversuch bei 20°C und bei 75°C
untersucht.
Da in vitro-Vermehrungssysteme für das
Hepatitis-B-Virus (HBV) bislang noch nicht zur
Verfügung stehen, wurde die Bestimmung der
HBV-Infektiosität bei vorliegenden Versuchen mit
dem DNS-Polymerase-Test vorgenommen. Die
DNS-Polymerase stellt einen guten Marker für
die strukturelle Integrität des Virus dar und
kann deshalb als indirekter Marker für die
Infektiositäten herangezogen werden.
Zur Konzentrierung und partiellen Reinigung der
eingesetzten Dane-Partikel wurden 240 ml Serum
von einem Probanden mit chronischem
HBsAg-Trägerstatus und Nachweis von HBeAg und
der DNS-Polymerase in einer Zentrifuge vom Typ
SW 28 Rotor bei 25 000 UpM während 16 Stunden
bei 4°C zentrifugiert. Das Sediment wurde in
2 ml 0,01 M PBS mit 0,1% (Gew./Vol.)
Serumalbumin aufgenommen, und jeweils ein
Milliliter wurde mit 4 ml einer 20%igen
(Gew./Gew.) Saccharose-Lösung unterschichtet.
Eine Zentrifugation in einer Zentrifuge vom Typ
SW 60 Ti Rotor bei 50 000 UpM während 2 h schloß
sich an. Nach dem Dekantieren wurden die
Dane-Partikel in 0,01 M Tris-Puffer (pH 7,4)
aufgenomnen. Als Maß für die Konzentration der
Dane-Partikel erfolgte die Bestimmung der
DNS-Polymerase-Aktivität nach der von KAPLAN
u. a. beschriebenen Methode (vgl. J. Virol. 12
(1973), S. 995 ff.). Hierbei wird nach Zugabe
aller vier Desoxyribonukleosid-triphosphate die
neu synthetisierte DNS gemessen, indem die
Radioaktivität im
Flüssigkeitszintillationszähler bestimmt wird.
In den nachfolgenden Versuchen diente als
Desinfektionsmittel eine 2 Gew.-%ige wäßrige
Zitronensäurelösung, die durch Auflösen einer im
Handel erhältlichen Zitronensäure
(Handelsprodukt der Fa. Merck, Art 244) in
zweifach destilliertem Wasser hergestellt wurde.
Der pH-Wert der 2 Gew.-%igen Lösung war 2,2.
Die Desinfektionsmittelversuche wurden in
Polyallomer-Röhrchen angesetzt und in einem
Wasserbad bei 20°C und bei 75°C entsprechend der
Richtlinie des Bundesgesundheitsamtes und der
Deutschen Vereinigung zur Bekämpfung der
Viruskrankheiten e.V. durchgeführt. Der
Versuchsansatz bestand aus einem Volumenteil
Dane-Partikel-Suspension, einem Volumenteil 0,01
M Tris-Puffer und 8 Volumenteilen der
2 Gew.-%igen Zitronensäurelösung als
Desinfektionsmittel.
Bei den Versuchen mit Eiweißbelastung wurde der
Tris-Puffer durch eine 2%ige
Rinderserumalbumin-Lösung (bovine serum albumin,
(BSA) der Fa. Beringwerke) bzw. durch foetales
Kälberserum (FKS der Fa. Boehringer Mannheim)
ersetzt.
Ferner folgte ein Versuchsansatz ohne
Viruszugabe, um auf diese Weise ggfls. eine
Unspezifität im DNS-Polymerase-Test durch
vorhandene Desinfektionsmittel zu erkennen.
Als positive Kontrolle wurde eine 1,75 Gew.-%ige
Formaldehydlösung (pH 7,0) mitgeführt. Diese
Lösung hatte in früheren Versuchen eine
HBV-Wirksamkeit im DNS-Polymerase-Test gezeigt.
Unmittelbar nach Ablauf der Einwirkungszeit
wurde mit 2,4 ml 0,01 M Tris-Puffer verdünnt, um
durch Verdünnung die Wirkung des
Desinfektionsmittels aufzuheben, wonach mit 2 ml
einer 20 Gew.-%igen Saccharoselösung
unterschichtet wurde. Anschließend erfolgte eine
Zentrifugation in einer Zentrifuge vom Typ SW 60
Ti Rotor mit 50 000 UpM bei 4°C während 2
Stunden. Die Sedimente wurden nach Dekantieren
des Überstandes und nach Trocknen im Exsikkator
in 50 µl 0,01 M Tris-Puffer resuspendiert,
und 25 µl wurden für die Bestimmung der
DNS-Polymerase-Aktivität in diesem Test
eingesetzt.
Gemäß einem weiteren Versuch wurde eine
0,4 Gew.-%ige Zitronensäurelösung bei 60°C und
ein Gemisch aus 0,6 Gew.-% Zitronensäure,
0,06 Gew.-% Milchsäure und 0,06
Gew.-% Apfelsäure ebenfalls bei 60°C zu
Desinfektionsmittelzwecken eingesetzt.
Die Ergebnisse der unter Verwendung von partiell
gereinigten Dane-Partikeln durchgeführten
Inaktivierungsversuche mit der 2 Gew.-%igen
wäßrigen Zitronensäurelösung als
Desinfektionsmittel sind in den Tabellen 1 und
2, sowie die mit einer 1,75 Gew.-%igen wäßrigen
Formaldehydlösung als Kontrolle durchgeführten
Versuche in Tabelle 3 enthalten. Die eingesetze
Dane-Partikel-Suspension war so eingestellt, daß
100 µl dieser Lösung ca. 20 000 Counts pro
Minute (cpm) ergaben. Damit war sichergestellt,
daß sich die HBV-Konzentration im Versuchsansatz
auf ≃ 108 Dane-Partikel belief.
Tabelle 1 zeigt die Versuchsergebnisse, die bei
erfindungsgemäßem Einsatz der 2 Gew.-%igen
Zitronensäurelösung als Desinfektionsmittel
erhalten wurden. Die Messungen erfolgten nach
einer Einwirkungszeit von 5, 15 und 30 Minuten,
um auch eine Aussage zur Kinetik machen zu
können. Als Ausgangsdaten für die Abnahme der
HBV-Aktivität dienten die Werte, die in
Gegenwart von Tris-Puffer erhalten worden waren.
Durch den Ansatz ohne Viruszugabe wurde ein
möglicher Einfluß der Zitronensäure auf das
Testsystem untersucht und damit auch auf diese
Weise die untere Nachweisbarkeitsschwelle
definiert. Für die 2 Gew.-%ige
Zitronensäurelösung wurden die Werte 10, 10 und
12 cpm in den drei gewählten Ansätzen gefunden.
Aus Tabelle 1 ergibt sich, daß bereits nach
fünfminütiger Einwirkungszeit Counts zu finden
waren, die im Bereich der Ansätze lagen, die mit
Tris-Puffer und ohne Viruszugabe durchgeführt
worden waren. Damit ist die untere
Nachweisbarkeitsschwelle erreicht worden, und
keine virale Aktivität im DNS-Polymerase-Test
mehr meßbar. Diese Aussage gilt auch für die
Proben, die Eiweiß im Ansatz enthielten.
Um den Einfluß des Desinfektionsmittels und die
Bedeutung der thermischen Behandlung getrennt zu
studieren, wurden überdies weitere Versuche
durchgeführt. Dabei wurde die Wirksamkeit der
2 Gew.-%igen Zitronensäurelösung bei 20°C, sowie
der Einfluß der Temperatur ohne
Desinfektionsmittelzugabe untersucht. Die
entsprechenden Ergebnisse sind in Tabelle 2
enthalten.
Aus dieser Tabelle ist zu ersehen, daß die
1,5 Gew.-%ige Zitronensäurelösung schon bei 20°C
in der Lage ist, den initialen Virustiter
entscheidend zu senken. Auch hier wurden nach 5
Minuten Countzahlen gefunden, die im Bereich der
Kontrollen lagen und damit den Background
darstellen. Demgegenüber wurde ermittelt, daß
der alleinige Einfluß der Temperatur bei 75°C
nicht ausreichend ist, die virale Aktivität im
DNS-Polymerase-Test vollständig zu eliminieren.
Auch nach 5 und 15 Minuten Einwirkungszeit
wurden Werte gefunden, die noch deutlich über
den entsprechenden Daten im Zitronensäure-Ansatz
lagen. Bemerkenswert erscheint, daß die höchsten
Countzahlen jeweils im Ansatz mit foetalem
Kälberserum zu finden waren.
Bei den Inaktivierungsversuchen wurden zur
Kontrolle eine 1,75 Gew.-%ige Formaldehydlösung
mitgeführt, nachdem sich bei früheren Versuchen
ergeben hatte, daß die 0,7 Gew.-%ige Lösung, die
nach der Richtlinie des Bundesgesundheitsamtes
und der Deutschen Vereinigung zur Bekämpfung der
Viruskrankheiten e.V. (DVV) von chemischen
Desinfektionsmitteln auf Wirksamkeit gegen Viren
vorgesehen ist, nicht in der Lage war, den
HBV-Titer innerhalb von 60 Minuten
Einwirkungszeit deutlich zu reduzieren.
Die Untersuchungsergebnisse der
Formaldehyd-Vergleichsversuche sind in Tabelle 3
enthalten. Hieraus ist ersichtlich, daß die
Einwirkungszeit 60 Minuten betragen muß, um die
HBV-Aktivität, wie sie im DNS-Polymerase-Test
gemessen wird, vollständig zu eliminieren. Nach
dieser Zeit wurde eine Countzahl von 24
gefunden; diese ist ein Wert, der auch im
Ansatz ohne Viruszugabe gemessen worden war.
In Tabelle 4 sind die Versuche bei 60°C mit
einer 0,4 Gew.-%igen Zitronensäurelösung bzw.
mit einem Gemisch einer 0,6 Gew.-%igen
Zitronensäure, 0,006 Gew.-% Äpfelsäure und
0,06 Gew.-% Milchsäure angegeben.
Dane-Partikel-Kontrollen:
- I. Dane-Partikel + Aqua bidest. + Tris-Puffer
- II. Dane-Partikel + 2% Albumin + Tris-Puffer
- III. Dane-Partikel + FKS + Tris-Puffer
Desinfektionsmittelkontrollen:
- I. Tris-Puffer + Aqua bidest. + Desinfektionsmittel*)
- II. Tris-Puffer + 2% Albumin + Desinfektionsmittel
- III. Tris-Puffer + FKS + Desinfektionsmittel
Inaktivierungsansatz:
- I. Dane-Partikel + Aqua bidest. + Desinfektionsmittel*)
- II. Dane-Partikel + 2% Albumin + Desinfektionsmittel
- III. Dane-Partikel + FKS + Desinfektionsmittel
Volumenverhältnis bei allen Ansätzen I-III:
1 Volumenteil + 1 Volumenteil + 8 Volumenteile
*) 2%ige wäßrige Zitronensäurelösung
Claims (6)
1. Verwendung eines gegebenenfalls in
Konzentratform vorliegenden wäßrigen
Desinfektionsmittels mit einem Gehalt an
Zitronensäure als viruzidem Wirkstoff zur
Inaktivierung von Hepatitis-B-Viren bei der
Desinfektion von thermolabilen medizinischen
Instrumenten und Geräten sowie Teilen derselben,
Dialysemaschinen und Flächen.
2. Verwendung von Milchsäure, Äpfelsäure und/oder
Weinsäure als zusätzlichen Wirkstoff nach
Anspruch 1.
3. Verwendung von Zitronensäure in einer
Konzentration von 0,05-3 Gew.-%, insbesondere
0,4-0,6 Gew.-%, nach Anspruch 1.
4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß der zusätzliche Wirkstoff
jeweils in einer Konzentration von 5-20
Gew.-%, vorzugsweise etwa 10 Gew.-%, bezogen
auf den Zitronensäuregehalt, vorliegt.
5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Desinfektionsmittel aus
einer 50 Gew.-%igen Zitronensäurelösung
bestehend als Konzentrat vorliegt.
6. Verwendung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
einen Gehalt an 21 Gew.-% Zitronensäure,
2 Gew.-% Äpfelsäure und 2 Gew.-% Milchsäure.
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