DE4117970A1

DE4117970A1 - Verfahren zur entfernung von metallatomen und explosivstoffen aus waessriger loesung und verwendung von suspendierten pflanzenzellen

Info

Publication number: DE4117970A1
Application number: DE19914117970
Authority: DE
Inventors: Paul J Jackson; Agapito R Torres; Emmanuel Delhaize
Original assignee: US Department of Energy
Current assignee: US Department of Energy
Priority date: 1990-05-30
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 1991-12-05
Also published as: CA2043396A1; US5296146A; GB2244485A; US5120441A; JPH07992A; GB9109910D0; FR2662685A1

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf die Wasserreinigung und insbesondere auf die Verwendung von Pflanzenzellen in Suspension zur Entfernung von Metallatomen und Explosivstoffen aus wäßriger Lösung.

Das Bariumion (Ba²⁺) wurde ausgiebig bei der Herstellung von konventionellen Sprengstoffen verwendet, und zwar in der Explosivstofformel Baratol, einer auf 2,4,6-Trinitrotoluol-basierenden (TNT-basierenden) gießbaren Mischung, die zu 76% (w/w) aus Bariumnitrat, gemahlen auf die spezifische Teilchengröße und 24% TNT besteht. Explosivstoffe werden routinemäßig unter Wasser bearbeitet, was die Verunreinigung der wäßrigen Lösung mit Ba²⁺ und TNT zur Folge hat.

Vier Familien von bei hoher Temperatur supraleitenden Keramikoxiden werden derzeit untersucht. Drei dieser Familien enthalten signifikante Mengen an Ba²⁺. Der Einfluß der Produktion derartiger Materialien im großen Maßstab auf die Umgebung umfaßt die Herstellung von Abfall, der hohe Konzentrationen an Barium und anderen toxischen Metallionen enthält.

Barium ist für Menschen sowie andere Tierarten giftig und muß vor der Ablagerung von Abfallstoffen der Produktionsstätten in der Umgebung entfernt werden. Die Forderungen der US-Environmental Protection Agency gehen derzeit dahin, daß dieses Ion bis auf Konzentrationen unterhalb 100 ppm entfernt werden muß. Neuere Richtlinien verlangen, daß dies nicht weniger Ba²⁺ freigesetzt werden kann. Die derzeitigen Verfahren zur Bariumentfernung sehen die Umwandlung von Bariumnitrat in das weniger lösliche Bariumsulfat vor, welches von Abflußwässern vor ihrer Freisetzung ausgeschieden werden kann. Das ausgeschiedene oder ausgefällte Material wird darauffolgend vergraben. Das Gesamtverfahren ist relativ teuer und es wird noch immer etwas Barium in die Umgebung freigesetzt.

TNT, Oxidationsprodukte davon und andere lösliche Explosionsmaterialien werden ebenfalls in diesen Abflußwassern festgestellt. Die meisten dieser Verbindungen sind in gleicher Weise giftig und müssen, bevor das Wasser freigesetzt werden kann, auch für die Umgebung annehmbare Niveaus reduziert werden. Die derzeitige Technologie macht das schrittweise Entfernen von Ba²⁺ erforderlich, und zwar gefolgt von der Entfernung dieser explosiven Verbindungen mit aktivierter Holzkohle und der Verbrennung der Holzkohle. Ein einfacheres effizienteres Verfahren, und zwar eines, welches auch die anderen toxischen Materialien aus dem Abfall entfernt, wird für die Verarbeitung großer Mengen an Abfallmaterial benötigt, bevor dieses in die Umgebung freigesetzt werden kann.

Die Remediation von in Wasser mitgeführtem Plutonium und anderen aktiniden Elementen ist ein gleichfalls bekanntes Problem auf dem Gebiet der Kernenergie und der Kernwaffen. Einfache, kostengünstige und effiziente Entfernungsverfahren sind aktiv gesucht, um es diesen Industrien zu ermöglichen, den ständig strenger werdenden Umweltschutzbedingungen und den Besorgnissen der Öffentlichkeit zu genügen.

Pflanzenzellensuspensionskulturen können zum Wachstum in Konzentrationen bestimmter Metallionen, die für andere Arten giftig sind, ausgewählt werden. Das Überleben kann von der Herstellung kleiner metallbindender Polypeptide abhängen, welche sämtliche in die Zellen eintretenden toxischen Ionen festbinden. Vergleiche dazu beispielsweise die folgende Literaturstelle: P. J. Jackson, C. J. Unkefer, J. A. Warr und N. J. Robinson, "Poly(γ-glutamylcysteinyl)glycine: Its Role In Cadmium Resistnace In Plant Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6619 (1987). Alternativ kann Toleranz mit der Fähigkeit, Metallionen von den Zellen auszuschließen, assoziiert sein. Vergleiche dazu beispielsweise: C. D. Foy, R. L. Chaney, und M. C. White, "Rhe Physiology of Metall Toxicity In Plants," Annu. Rev. Plante Physiol. 29, 511 (1978). Die letztgenannte Druckschrift beschreibt die Aufnahme von Metallen durch ganze Pflanzen und schlägt eine Rolle ganzer Pflanzen für die Reinigung der Umwelt und die Stabilisierung von verunreinigten Plätzen vor, wobei aber keine parallele Wirkung für Pflanzenzellenkulturen beobachtet oder vorhergesagt wurde. Bestimmte Pflanzen werden bereits zur Stabilisierung mit toxischen Spurenmetallionen verunreinigter Plätze verwendet (vgl. beispielsweise: R. R. Gemmel, "Colonization of Industriel Wasteland" (Arnold Publishing Company, London, 1977)).

Fletcher et al demonstrierten in "Metabolism of 2-chlorobiphenyl by Suspension Cultures of Paul's Scarlet Rose," von J. S. Fletcher, A. W. Groeger, und J. C. McFarlane, Bull, Environ. Contam. Toxicol, 39, 960 (1987), daß Suspensionskulturen von Rose PCB's aus Lösung entfernen und diese chemisch modifizieren.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Konzentration gewählter Metallionen aus wäßriger Lösung beträchtlich zu reduzieren.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, die Konzentration von TNT in wäßriger Lösung wesentlich zu reduzieren.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die substantielle Reduktion der Konzentration anderer Explosivstoffe sowie von Oxidationsprodukten von Explosivstoffen in wäßriger Lösung.

Zusammenfassung der Erfindung. Um die genannten sowie weitere Ziele zu erreichen, sieht die Erfindung ein Verfahren vor, bei dem eine wäßrige Lösung eines Targetmetallions und/oder Explosivstoffe, die daraus entfernt werden sollen, mit einer Suspension von Pflanzenzellen zu mischen und ferner die Trennung der Pflanzenzellen von der Flüssigkeit, nachdem eine hinreichende Interaktionszeit vergangen ist. Die Pflanzenzellen umfassen vorzugsweise Datura innoxia (D. innoxia). Es wird ferner bevorzugt, daß die Pflanzenzellen zum Wachstum in Konzentrationen des Targetmetallions und/oder Explosivstoffs ausgewählt wurden.

Der Nutzen und die Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in einer effizienten und wirtschaftlichen Entfernung toxischer und radioaktiver Metalle sowie schädlicher Explosionsstoffe und ihrer Oxidationsprodukte aus wäßriger Lösung zu sehen, und zwar unter Verwendung von reichlich vorhandenen, leicht zu erzeugenden verfügbaren Pflanzenzellen.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigen

Fig. 1 eine graphische Darstellung des Wachstums der D. innoxia-Zellen in wäßrigen Suspensionen, die Konzentrationen von Ba²⁺ im Bereich von 0 bis 1000 µM von Ba(NO₃)₂ enthalten. Die enge Überlappung der Kurven verhindert eine ins einzelne gehende Identifikation und Trennung der fünf untersuchten Konzentrationen;

Fig. 2 eine graphische Darstellung der Entfernung von Ba²⁺ aus wäßriger Lösung durch schnelles Wachstum von D. innoxia-Zellensuspensionskulturen, gewachsen in einem Medium, welches unterschiedliche anfängliche Konzentrationen von Ba(NO₃)₂ enthält;

Fig. 3 eine graphische Darstellung, welche die Rate oder Geschwindigkeit der Aufnahme von Ba²⁺, abhängig von der Zeit durch D. innoxia-Zellen darstellt;

Fig. 4 eine graphische Darstellung der Stabilität der Metallbindung von Extrakten aus D. innoxia-Zellen in Lösungen, die unterschiedliche H⁺-Konzentrationen enthalten;

Fig. 5 eine graphische Darstellung der Bindung von Ba²⁺ durch Extrakte von D. innoxia in Lösungen, die unterschiedliche Na⁺-Konzentrationen enthalten und

Fig. 6 eine graphische Darstellung der Entfernung von Explosionsstoffverbindungen durch D. innoxia-Zellen.

Im folgenden seien nunmehr bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung im einzelnen beschrieben. Die Erfindung sieht kurz gesagt die Verwendung von Pflanzensuspensionskulturen vor, um ionische Metallspezies und TNT-basierende Explosivstoffe und ihre Oxidationsprodukte aus wäßriger Lösung zu entfernen. Mehrere Pflanzenarten (strains) wurden untersucht, und zwar einschließlich D. innoxia, Citrus citrus und Black Mexican Sweet Corn (BMS) (schwarzer mexikanischer süßer Mais). Alle zeigten eine signifikante Fähigkeit, Metallionen zu entfernen. Zu den Ionen, die auf Sub-ppm-Niveaus entfernt wurden, gehören Barium, Eisen und Plutonium. D. innoxia-Zellen, die in einem Medium wachsen, welches bei Waffen auftretendem Abfall enthielten, und zwar verunreinigt mit Ba²⁺ entfernten auch TNT, andere Explosivstoffe und Oxidationsprodukte derselben aus der Lösung. Die Technologie des Wachstums von Pflanzenzellensuspensionskulturen in Fermentvorrichtungen befindet sich in schneller Entwicklung (vgl. beispielsweise: W. J. Treat and W. A. Aldred, "An Inexpensive Chamber for Selecting and Maintaining Phototrophic Plant Cells," Biotechn. Techniques, 4, 91 (1989)). Die Verfügbarkeit einer reichlichen und relativ billigen Zellenquelle läßt die Verwendung derselben für die Entfernung bestimmter Verbindungen aus großen Volumina komplexer Abfallösungen möglich erscheinen. Die Fähigkeit, tote, dehydratisierte Zellen zu verwenden, kann auch ein Mittel zur direkten Behandlung von Abfall vorsehen.

Im folgenden wird nun im einzelnen auf derzeit bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung eingegangen, und zwar Beispiele, die anhand der Zeichnungen erläutert sind.

A. Die Herstellung und Aufrechterhaltung von Pflanzensuspensionskulturen

Suspensionskulturen von D. innoxia wurden im Dunklen bei 30°C als 50 oder 100 ml Chargensuspensionskulturen aufrechterhalten, wie sie zuvor beschrieben wurde in der folgenden Literaturstelle: Paul J. Jackson, E. Jill Roth, Peter McClure und Cleo M. Naranjo, "Selection, Isolation, and Characterization of Cadmium-Resistant Dature innoxia Suspension Cultures," Plant Physiol. 75, 914 (1984). Das Flaschenvolumen wurde beibehalten mit einem Flaschenvolumen zu Kulturvolumen von 5 : 1, um eine adequate Oxigenierung der Zellen durch Belüftung zu bewirken. Die Zellen wurden in einem modifizierten Gamborg's 1B5 Medium ergänzt mit Vitaminen gewachsen. Unter diesen Bedingungen verdoppelt sich die Zellenzahl annähernd alle 24 Stunden.

B. Messung des Pflanzenzellenwachstums und der Teilung

Die Pflanzenzellenzahl wurde indirekt gemessen durch Bestimmung der Änderung des gepackten Zellenvolumens der Kultur. 5 ml Zellenkultur wurden 1 Minute lang bei 200 g zentrifugiert und das Volumen der gepackten Zellen wurde bestimmt.

C. Umwandlung von Zellen in Protoplaste

Ein gleiches Volumen an Zellen wurde mit einer Protoplaste hervorrufenden Lösung (600 mM KNO · 3 mM CaCl₂, 1 mM KH₂PO₄, 4 pH eingestellt auf 5,5 mit KOH), die 0,5% (w/v) Cellulysin (CalBiochem, LaJolla, CA, USA) und 0,05% Pectlyase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Suspension wurde bei 30°C 1 Stunde lang bei leichtem Schütteln inkubiert. Protoplaste wurden durch Filtration durch ein 45-Mikron-Nylonsieb aus den verbleibenden Zellen entfernt.

D. Messungen der Bariumaufnahme

Die Bariumaufnahme wurde gemessen von dem Zellenkulturmedium und von den Abfallösungen. Ein ähnliches Verfahren wurde für Plutonium verwendet. Die Messung der Entfernung von Barium aus Medium folgte der Zugabe bekannter Konzentrationen von Ba(NO₃)₂ und radioaktiven ¹³³Ba²⁺. Die Entfernung von Ba²⁺ wurde gemessen als eine Verringerung der in dem Medium vorhandenen Radioaktivität, aus der die Zellen entfernt wurden. Dies wurde durch die Messung eines Radioaktivitätsanstiegs in den aus dem Medium entfernten Zellen bestätigt. Bei sämtlichen Experimenten lag die mit den Zellen assoziierte Radioaktivitätsmenge innerhalb 10% der aus dem Medium entfernten Radioaktivitätsmenge. Die Radioaktivitätsmessung erfolgte durch Szintillations-Spektrophotometrie, darauffolgend auf die Zugabe eines wäßrigen Szintillationscocktails (Formel 963, Dupont New England Nuclear, Boston, MA, USA) zu den Proben.

E. Fraktionierung der Zellenkomponenten

Zellen wurden aus dem Medium durch Zentrifugierung gesammelt, und zwar während 1 Minute bei 200 g, wobei eine zweifache Waschung in einem eiskalten Puffer erfolgt, der 20mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM KCl und 1,4 mM MgCl₂ enthielt. Pellets wurden in der Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens des gleichen Puffers, der 20 mM 2-Mercaptoäthanol enthielt und in einem Elvehjem Gewebemahlgerät homogenisiert. Das homogenisierte Material wurde sodann bei 12 000 g 15 Minuten lang zentrifugiert und das Obenstehende wurde gesammelt. Die Messung des radioaktiven ¹¹³Ba wurde erreicht durch die Messung der Radioaktivität im gesammelten Extrakt, sodann im oben stehenden darauffolgend auf die Zentrifugierung zur Entfernung nicht lösbarer Komponenten. Die Radioaktivität im Pellet wurde durch die Resuspension des Pellets in dem obigen Puffer bestätigt und die Wertung eines bekannten Volumens dieser Suspension auf Radioaktivität.

F. Messungen der Zellentrockengewichte und Herstellung von dehydrierten Zellen

Zellen wurden aus dem Wachstumsmedium gesammelt, und zwar durch Zentrifugieren für 1 Minute bei 200 g, einmal gewaschen in frischem Wachstumsmedium und wiederum durch Zentrifugierung gesammelt. Zellenpellets wurden in einer Lösung resuspendiert, die 70% Äthanol (v/w) und 30% destilliertes Wasser enthielt. Aufschlämmungen von Zellen wurden in zuvor gewogene Gewichtsboote gegossen und bei 42°C in einem Trockenofen angeordnet. Die Zellen wurden als vollständig dehydriert angesehen, wenn keine weitere Gewichtsänderung bei zusätzlicher Erwärmung festgestellt werden konnte.

Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde und die experimentellen Verfahren, verwendet zur Verifikation ihres Betriebs dargetan wurden, seien nunmehr spezielle Ausführungsbeispiele erläutert.

Beispiel I Bariumentfernung

Barium ist für die meisten lebenden Spezies toxisch. D. innoxia-Pflanzenzellensuspensionkulturen können jedoch in Anwesenheit von Konzentrationen dieses Metallions wachsen, welche signifikant höher liegen als diejenigen, die für Säugetiere toxisch sind. Die Toleranz gegenüber hohen Konzentrationen von Ba²⁺ legt nahe, daß die Zellen irgendeinen Mechanismus besitzen, der entweder Barium ausschließt, oder es in eine nichttoxische oder weniger toxische Form sequestriert. Annähernd 1 pMol an Ba²⁺ kann mit jeder Zelle gebunden werden. Dies legt nahe, daß die Metallbindungskomponente entweder sehr reichlich vorhanden ist oder große Mengen an Ba²⁺ binden kann. Mehr als 5% des Trockengewichts der Zellen, gewachsen in hohen Konzentrationen von Ba(NO₃)₂ ist Ba²⁺.

A. Wachstum von D. innoxia-Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen von Ba²⁺

Um zu bestimmen, welche Konzentrationen von Ba²⁺ für Zellensuspensionskulturen von D. innoxia toxisch sind, wurden exponentiell wachsende Zellen unterschiedlichen Konzentrationen dieses Ions ausgesetzt. Es sei nunmehr auf die Figuren Bezug genommen; Fig. 1 zeigt das Wachstum von D. innoxia-Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen von Ba²⁺ für unterschiedliche Zeitperioden. Schnell wachsende D. innoxia- Zellensuspensionskulturen wurden in frisches Medium transferiert, welches 0, 100, 250, 500 und 1000 µM Ba(NO₃)₂ enthielt. Messungen des Zellenwachstums wurden bestimmt durch Messung des gepackten Zellenvolumens (PCV = packed cell volume) von 5 ml der Kultur zu unterschiedlichen Zeiten nach der Zugabe von Ba²⁺. Zellen wurden in frisches Medium transferiert, welches die ursprüngliche Konzentration von Ba²⁺, und zwar alle 48 Stunden, um die schnelle Zellenteilung aufrechtzuerhalten. Es ist klar, es gibt keine signifikante Differenz in der Verdopplungszeit und dem Zellenvolumen der Zellen, die in irgendeiner Konzentration von Ba²⁺ bis zu 2 mM wachsen. Oberhalb dieser Konzentration wurde festgestellt, daß das Metallion aus der Lösung ausfällt. Wenn jedoch die Zellen in ausgefälltes Ba²⁺ enthaltendem Medium gewachsen werden, so verschwindet die Ausfällung nach 1 Tag, was darlegt, daß die Entfernung des löslichen Ions durch die Zellen das Gleichgewicht verschiebt, was die Lösungsfähigkeit des ausgefällten Bariums zur Folge hat. Das Wachstum von Zellen für ausgedehnte Perioden in 1 oder 2 mM Ba(NO₃)₂ verhindert Zellenwachstum und Teilung nicht. In diesen Konzentrationen für über 350 Generationen wachsende Kulturen zeigen, daß keine Änderung der Zellenverdopplungszeiten auftreten, wenn man einen Vergleich anstellt mit den gleichen in Abwesenheit von diesem Ba²⁺ wachsenden Zellen.

B. Die Entfernung von Ba²⁺ aus dem Zellenwachstumsmedium

Um die Aufnahme von Ba²⁺ in die Zellen zu messen, wurden Kulturen, die 2×10⁶-Zellen/ml enthielten und in einem kein zusätzliches Barium enthaltendem Medium wuchsen, in Medium transferiert, welches unterschiedliche Konzentrationen an Ba(NO₃)₂ + 0,1 µCi/ml trägerfreiem ¹³³Ba(NO₃)₂ enthielt und man ließ dies 24 Stunden lang wachsen. Während dieser Periode verdoppelt sich die Zellenzahl annähernd. Sodann wurden die Zellen aus dem Medium durch Zentrifugieren gesammelt, zweimal gewaschen und homogenisiert. Das Medium, das gesamte Homogenat und das Darüberstehende wurden nach der Entfernung des unlöslichen Materials hinsichtlich Radioaktivität ausgewertet. Fig. 2 zeigt die Verteilung von Ba²⁺ unter den unterschiedlichen Fraktionen nach Entfernung durch die wachsenden D. innoxia-Zellen. Die Werte sind aufgetragen, abhängig von der Gesamtmenge des im Medium anfänglich vorhandenen Ba(NO₃)₂.

Fig. 2 zeigt das mit den Zellen verbundene Barium, Fig. 2b das mit der nicht löslichen Komponente verbundene Barium und Fig. 2c das mit Medium verbleibende Barium. Fast 90% des Ba²⁺ions ist mit den Zellen darauffolgend auf das Wachstum in 1 mM Ba²⁺ assoziiert. Praktisch das gesamte mit den Zellen assoziierte Metallion ist mit einer Komponente des nicht löslichen Zellenhomogenats verbunden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Zellen in der Lage sind, große Mengen an Ba²⁺ zu sequestrieren. Ihre Resultate legen ferner nahe, daß entweder die Metallbindung ziemlich schwach ist oder daß die Zahl der potentiellen Bindungsplätze nahe der Sättigung ist, wenn die Zellen in 1 mM Ba²⁺ gewachsen wurden. Die Tatsache, daß diese Konzentration von Barium für die Zellen nicht toxisch zu sein scheint, liegt nahe, daß letzteres wahrscheinlich richtig ist. Ein sehr großer Teil von Ba²⁺ wird durch die Zellen im Medium enthalten bis zu 500 µM Ba²⁺ entfernt. Oberhalb dieser Konzentration bleiben signifikante Mengen an Ba²⁺ im Medium. Die Entfernung von Zellen, die Ba²⁺ enthalten, gefolgt von der Zugabe neuer Zellen, resultiert in der Annahme des Bariumions in der Lösung auf ungefähr den gleichen Entfernungsprozentsatz. Darauffolgende Behandlungen haben zur Folge, daß das Bariumion auf unter die feststellbare Grenze von 1 ppb abfällt. Dieses Verhalten legt eine Sättigung sämtlicher der Ba-Bindeplätze innerhalb des ersten Satzes von Zellen nahe. Die Ergebnisse demonstrieren eine enge Bindung von Ba²⁺ an eine nicht lösliche Fraktion der Zellen.

C. Identifizierung der Zellen-Komponentenbindung Ba²⁺

Messungen der Rate oder Geschwindigkeit der Aufnahme von Ba²⁺ sind in Fig. 3 gezeigt. D. innoxia-Zellen wurden im Medium angeordnet, welches 1 mM Ba(NO₃)₂ plus trägerfreies ¹³³Ba enthielt, und zwar für unterschiedliche Zeitperioden. Die Zellen wurden sodann aus dem Medium durch Zentrifugieren entfernt und das Medium und das Zellenhomogenat wurden hinsichtlich ¹³³Ba-Aktivität ausgewertet. Die Ergebnisse zeigen eine nahezu unmittelbare Wechselwirkung von löslichem Ba²⁺ mit einer Komponente der Zellen. Die schnelle Natur dieser Wechselwirkung legt nahe, daß das Metallion nicht durch Zellenmembranen läuft. Die Daten schlagen daher stark vor, daß das Ba²⁺ sich mit irgendeiner externen Komponente der Zellen verbindet, möglicherweise einer Komponente der Zellenwand oder Membran. In Abwesenheit von D. innoxia-Zellen wurden im Medium transferiert, welches 500 µM Ba(NO₃)₂ plus 0,2 µCi/ml ¹³³Ba²⁺ enthielt und weitere 24 Stunden gewachsen. Sodann wurden die Zellen in Protoplaste umgewandelt. Innerhalb von 2 Stunden wurden 95% der Zellenpopulation umgewandelt, während die Wände vertraut wurden. Zu unterschiedlichen Zeiten darauffolgend auf die Aussetzung gegenüber Enzymen wurden Proben genommen durch 45-Mikron-Siebe gefiltert, gewaschene Protoplaste wurden aus der Suspension durch Zentrifugieren für 3 Minuten bei 200 g gesammelt und die Gesamtmenge von Barium wurde ermittelt. Protoplaste laufen durch einen derartigen Sieb, wohingegen Zellen und Zellenklumpen dies nicht können. Die Messung der Gesamtmenge an Barium, gefunden in den Zellen und Protoplasten zeigte einen Verlust der Ba²⁺-Bindung durch Protoplaste. Es sei auf die Tabelle 1 Bezug genommen. Die angegebenen Daten ergaben sich aus vier unabhängigen Experimenten. Die verbleibenden 5% dieser Zellen wandeln über zwei Drittel des vorhandenen Ba²⁺. Diese Ergebnisse schlagen vor, daß eine Komponente der Zellenwand in die Ba²⁺-Bindung verwickelt ist. Die Zugabe von gereinigter Cellulose zum Medium enthaltend Ba²⁺, ergab jedoch nicht die schnelle Entfernung dieses Ions aus der Lösung (Daten nicht gezeigt), was nahelegt, daß irgendein anderer Faktor innerhalb der Wand für die Metallbindung verantwortlich ist.

Tabelle 1

Assoziation von Ba²⁺m mit Pflanzenzellen und Pflanzenprotoplasten

D. Stabilität der Ba-Bindung

Um die Bindungskomponente(n) weiter zu charakterisieren und die Stabilität der Metallbindung unter unterschiedlichen Bedingungen zu bestimmen, wurde der Effekt von pH auf die Metallbindung bestimmt. 10 ml Proben von Zellen, gewachsen in 1 mM Ba²⁺ plus 0,1 µCl/ml trägerfreies ¹³³Ba wurden 24 Stunden lang gesammelt und extrahiert nach zweimaligem Waschen mit kein zusätzliches Ba²⁺ enthaltendem Medium, und jedes Extrakt wurde auf einen unterschiedlichen pH-Wert eingestellt. Sodann wurden Proben über Nacht bei 22°C inkubiert. Die sich ergebenden Proben wurden zentrifugiert, um die wäßrigen von den nicht löslichen Phasen zu trennen und das Obenstehende wurde auf den ¹³³Ba-Gehalt bewertet. Fig. 4 zeigt, daß die Metallbindung recht stabil ist über einen pH-Bereich von 1 bis 10. Diese Resultate schlagen vor, daß die Bindung recht komplex ist, da die Ionenbindung mit einer einzigen, einfachen Entität oder Einheit einen Affinitätsverlust des Bindungsplatzes für das Metallion zur Folge haben würde, und zwar bei Änderung im pH-Wert um pKa eines derartigen speziellen Platzes.

Es zeigte sich, daß Extraktionen, die unterschiedliche Konzentrationen von Na⁺ enthielten, eine relative Stabilität gegenüber unterschiedlichen Salzkonzentrationen zeigten. Bei höheren Konzentrationen jedoch wird die Ba-Bindung verloren. Dies demonstriert, daß die Wechselwirkung zwischen diesem Metallion und der Zellenkomponente von ionischer Natur ist. Dies wird in Fig. 5 veranschaulicht, die die Bindung von Barium durch Zellenkomponenten für unterschiedliche Na⁺-Konzentrationen zeigt. D. innoxia-Zellen wurden auf 4×10⁶ Zellen pro ml gewaschen und sodann in Lösungen transferiert, die 500 µM Ba(NO₃)₂, 0,1 µCi/ml trägerfreies ¹³³Ba und unterschiedliche Konzentrationen an NaCl enthielten. Die Suspensionen wurden 24 Stunden lang gemischt und sodann durch Zentrifugieren getrennt. Zellenpellets wurden in einem Puffer gewaschen, der die gleiche Konzentration von Na⁺ enthielt und sodann extrahiert.

E. Entfernung von Ba²⁺ aus Komplex-Abfallösungen

Wenn Pflanzenzellen eine Alternative zur derzeitigen Technologie der Entfernung von Ba²⁺-Lösungen bilden sollen, so muß die Bindung dieses Ions durch Zellen unter den Bedingungen demonstriert werden, die innerhalb derartiger Lösungen gefunden werden. Proben solchen Abfalls wurden daher erhalten und die Gehalte en Ba²⁺ und anderer Komponenten wurden bestimmt. Die durch die Zellen gebundene Menge an Ba²⁺ änderte sich entsprechend der ursprünglichen Menge, die in der getesteten Abfallprobe vorhanden war. Das "prozentuale Trockengewicht" = Gewicht des gebundenen Ba²⁺, dividiert durch das Gesamtgewicht der Zellen und Ba²⁺. Zwei Tage alte Suspensionskulturen von D. annoxia (8×10⁶ Zellen (ml)) wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Hälfte der Zellen wurde zweimal mit 70% Äthanol gewaschen und sodann durch Erwärmung bei 42°C dehydratisiert. Lebende Zellen und dehydratisierte Proben wurden sodann in 50 ml filtersterilisierter Abfallösung, die bekannte Mengen an Ba(NO₃)₂ plus 0,1 µCi/ml trägerfreies ¹³³Bs* enthielt. Die Suspensionen wurden mit Schütteln bei 22°C über Nacht inkubiert und sodann durch Zentrifugieren aus dem Abfall gesammelt. Die Menge des an den Zellen anhaftenden und im Abfall verbleibenden Bariums wurde gemessen. Die in unterschiedlichen Fraktionen eines Extrakts der lebenden Zellen gefundene Bariummenge wurde ebenfalls bestimmt. Tabelle 2 demonstriert die Entfernung radioaktiven Ba²⁺ aus Abfallösungen. Diese Information wurde durch eine unabhängige Bestimmung von Ba²⁺ innerhalb der Proben (Daten nicht gezeigt) bestätigt. Die Zugabe von toten, dehydratisierten Zellen zum Befall hatte ebenfalls die Entfernung von Ba²⁺ aus der Lösung zur Folge. Die Messung der Radioaktivität und Trockengewichte darauffolgend auf die Entfernung von Ba²⁺ aus der Lösung zeigte, daß bis zu 5,3% des Trockengewichts der Zellen Barium ist, und zwar darauffolgend auf die Aussetzung gegenüber dieses Metallion enthaltenden Abfall.

Tabelle 2

Entfernung von Ba²⁺ aus Abfallösungen durch lebende und dehydratisierte Pflanzensuspensionskulturzellen

Beispiel II Entfernung von Plutonium

Das Experiment für die Bindung von Pu ist dem für die Bindung von Ba sehr ähnlich. Der Hauptunterschied besteht darin, daß Pu(IV) ohne weiteres hydrolysiert und Polymermaterial bei Säurekonzentrationen unterhalb 0,1 N ergibt und daher Komplexbildungsagenzien in der wäßrigen Lösung notwendig macht, um das Pu(IV) in löslicher Form im pH-Bereich von 1 bis 10 zu halten. Ein weiterer Bereich von pH-Werten repräsentativ für Umgebungsbedingungen und einige Prozent Abfallströme wie auch die kompetitive Bindung des Pu(IV) durch sehr starke Chelatorcitrate und EDTA wurden überprüft. Die Testlösungen wurden mit einer kleinen Menge an Pu(IV) in HCl "gespickt", um die in Tabelle 3 gezeigten Lösungen zu ergeben. Ein Volumen gepackter Zellen (2-3 ml) wurde in jeder Lösung suspendiert und die Plutoniumkonzentration in dem Obenstehenden oder durch Szintillations-Spektrometrie nach Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren überwacht. Kontrollösungen ohne zugegebene Zellen wurden dazu verwendet, um zu verifizieren, daß das Pu(IV) keine Polymerspezies bildete, die aus der Lösung durch den Zentrifugierschritt entfernt werden könnte.

Tabelle 3

Die D. innoxia-Zellen (in diesen Lösungen nicht lebensfähig) entfernten 80 bis 90% der Pu-Aktivität aus der Lösung über einen weiten Bereich (1-8) von pH-Werten. Das Ausmaß der Pu-Entfernung könnte höher sein, da ein Teil der Aktivität zurückzuführen ist auf Americium, enthalten in dem Orignalplutoniumoxid. Citrate und EDTA, die sehr starke Komplexe mit Pu(IV) bilden, reduzierten in signifikanter Weise die Pu-Aufnahme durch das Pflanzenzellenmaterial gemäß den Feststellungen. Ein großer Überschuß an Ba störte die Pu-Aufnahme nicht signifikant. Messungen der Pu-Konzentration 1 Stunde nach Kontakt zeigten, daß die Lösungen nahe pH 1 in dieser Zeitperiode im wesentlichen im Gleichgewicht sind, während Lösungen mit einem höheren pH mehrere Stunden benötigen, um Gleichgewicht zu erreichen. Die längeren Gleichgewichtszeiten bei höherem pH sind vermutlich das Ergebnis langsamer Ligand-Austausch-Kinetikvorgängen, hervorgerufen durch die stärker komplexbildenden Liganden, erforderlich um das Pu(IV) in Lösung zu halten.

Die Lösungen 1 bis 6 (10 ml) wurden mit 50 µl einer Lösung aus 10^-4 M Pu(IV) in 1N HCl gespickt und die "schließlichen" Pu-Zählungen wurden nach 75 Stunden Schüttelns mit dem Zellenmaterial erhalten. Lösungen 7 bis 10 (10 ml) wurden mit 100 µl von 10^-4 M Pu(IV) in 12 N HCl gespickt und die "schließlich" Pu-Zählungen wurden nach 24stündigem Schütteln mit Zellenmaterial erhalten. Die anfängliche Pu(IV)-Konzentration war daher 5×10^-7 = 500 nm für die erstgenannten Lösungen und 1 µM für die letztgenannten Lösungen.

Beispiel III Eisenentfernung

Zellen wurden in 0,19 µM⁵⁹ Fe (15 µCi) 24 Stunden inkubiert, worauf sie dann durch Zentrifugieren aus dem Wachstumsmedium geerntet wurden, zweimal in einer 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 1,5 mM KCl und 50 mM 2-Mercaptoäthanol enthaltenden Lösung gewaschen wurden, resuspendiert wurden in der gleichen Lösung und homogenisiert wurden. Es wurde festgestellt, daß 77,8% des gesamten Fe²⁺ aus dem das Eisen enthaltenen Medium durch die Zellen sequestriert wurden, wobei sich 14,1% in der löslichen Fraktion des Zellenhomogenats fanden und 85,6% in den nicht löslichen Komponenten, am wahrscheinlichsten in der Zellenwand.

Beispiel IV Explosivstoffentfernung

Fig. 6 zeigt drei Hochdruckflüssigkeits-Chromatographiespuren (Retentionszeit (Minuten), abhängig von der optischen Dichte bei 254 nm) von wäßrigen Lösungen, die Explosivverbindungen und einige Nebenprodukte derselben enthielten. Fig. 6a ist die Spur einer typischen Abfallösung, die mehrere Explosivstoffe und assoziierte Zusammensetzungen enthält. Vorhanden sind Mengen an DNB (Dinitrobenzol) oder TNB (Trinitrobenzon), TNT, RDX und HMX. Fig. 6b ist eine chromatographische Spur oder Aufzeichnung der in Fig. 6a gezeigten Lösung nach Behandlung mit D. innoxia für 4 Stunden. Fig. 6c ist eine chromatographische Aufzeichnung des löslichen Teils eines Extrakts aus D. innoxia-Zellen, verwendet zur Behandlung der in Fig. 6a gekennzeichneten Lösung. Das Zellenextrakt wurde (1:1) gemischt mit einem Puffer, der Acetonitril enthielt, in dem die Explosivmoleküle stark löslich sind. Die große Spitze mit der kurzen Retentionszeit in Fig. 6b ist das Resultat von Sucrose in dem Pflanzenzellenmedium. Die große Spitze mit im wesentlichen der gleichen Retentionszeit in Fig. 6c ist das Resultat von Sucrose und anderen nicht-identifiziertem Material, freigegeben von den Zellen während des Extraktionsprozesses. HMX besitzt die gleiche Retentionzeit wie Sucorse. Unabhängige Experimente zeigten jedoch, daß mindestens ein Teil des HMX aus der Lösung entfernt wird.

Die vorstehende Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele soll nicht einschränkend verstanden werden.

Zusammenfassend siehe die Erfindung folgendes vor:

Die Verwendung von Pflanzensuspensionskulturen dient zur Entfernung von ionischen Metallspezies und TNT-basierenden Explosivstoffen und ihren Oxidationsprodukten aus wäßrigen Lösungen. Es wurden mehrere Pflanzenarten untersucht einschließlich D. innoxia, Citrus citrus und Black Mexican Sweet Corn. Alle zeigten eine signifikante Fähigkeit, Metallionen zu entfernen. Barium, Eisen und Plutoniumionen gehören zu den Ionen, die auf Sub-ppm-Niveaus entfernt wurden. In einem Waffenabfallstoffe enthaltenden mit Ba²⁺ verunreinigtem Medium wachsende D. innoxia-Zellen entfernen auch TNT, andere Explosivstoffe und Oxidationsprodukte dereben aus der Lösung. Es stellte sich ferner heraus, daß die Verwendung von toten, dehydratisierten Zellen bei der direkten Abfallbehandlung möglich ist.

Claims

1. Verfahren zum Reduzieren der Konzentration von Metallionen in wäßriger Lösung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind: Zugabe einer Suspension von Pflanzenzellen zu der wäßrigen Lösung, und Trennung der Pflanzenzellen von der Lösung nach einer hinreichenden Interaktionszeit für die Metallionen zur Wechselwirkung mit den Pflanzenzellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzellen aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Citrus citrus, Black Mexican sweet corn und D. innoxia.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Dehydratisierung der Pflanzenzellen vor dem Schritt der Zugabe zur wäßrigen Lösung erfolgt.

4. Verfahren zur Reduzierung der Konzentration von mit TNT verwandten Explosivstoffen und Nebenprodukten in wäßriger Lösung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind: Zugabe eine Suspension von Pflanzenzellen zur wäßrigen Lösung, und Trennung der Pflanzenzellen aus der Lösung, nach dem eine hinreichende Wechselwirkungszeit für die Explosivstoffe vorgesehen war, um mit den Pflanzenzellen in Wechselwirkung zu treten.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzellen ausgewählt sind aus der aus Citrus citrus, Black Mexican sweet corn und D. innoxia bestehenden Gruppe.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Dehydratisierung der Pflanzenzellen vor dem Schritt der Zugabe der wäßrigen Lösung vorgesehen ist.

7. Verfahren zur Reduzierung der Konzentration von Ba²⁺ in wäßriger Lösung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind: Zugabe einer Suspension von Pflanzenzellen zu der wäßrigen Lösung und Trennung der Pflanzenzellen aus der Lösung, nachdem eine hinreichende Wechselwirkungszeit vorgesehen war, damit das Ba²⁺ mit den Pflanzenzellen in Wechselwirkung treten kann.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzellen aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Citrus citrus, Black Mexican sweet corn und D. innoxia.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Dehydratisierung der Pflanzenzellen vor dem Schritt der Zugabe zur wäßrigen Lösung vorgesehen ist.

10. Verfahren zur Reduzierung der Konzentration von Plutoniumionen in wäßriger Lösung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind: Zugabe einer Suspension der Pflanzenzellen zu der wäßrigen Lösung, und Trennung der Pflanzenzellen von der Lösung, nachdem eine hinreichende Wechselwirkungszeit vorgesehen war, damit die Plutoniumionen mit den Pflanzenzellen in Wechselwirkung treten können.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzellen aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Citrus citrus, Schwarzer Mexikanischer süßer Mais und D. annoxia.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydratisierung der Pflanzenzellen vor dem Schritt der Zugabe zur wäßrigen Lösung erfolgt.

13. Verfahren zur Reduzierung der Konzentration von Fe²⁺ in wäßriger Lösung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind: Zugabe einer Suspension von Pflanzenzellen zu der wäßrigen Lösung und Trennung der Pflanzenzellen von der Lösung, nachdem eine hinreichende Wechselwirkungszeit für das Fe²⁺ vorgesehen wurde zur Wechselwirkung mit den Pflanzenzellen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzellen aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Citrus citrus, Schwarzer Mexikanischer süßer Mais und D. innoxia.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Dehydratisierung der Pflanzenzellen vor dem Schritt der Zugabe zur wäßrigen Lösung vorgesehen ist.