DE4115490A1 - Neues, antifungales antibiotikum, verfahren zu seiner herstellung und verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues antifungales Antibioti­ kum mit Steroidstruktur, das der Gruppe der Ergokonine zugeordnet ist sowie auf ein Verfahren zur Herstellung desselben und dessen Verwendung als Antibiotikum. Die Vertreter der Ergokonine sind durch die Anwesenheit einer Carboxylgruppe in C-13-Position des Sterolgerüstes und andere strukturelle Parameter als eigen­ tümliche Moleküle ausgewiesen, die aufgrund ihrer antifungalen Wirksamkeit für die Anwendung als Antiinfektivum potentiell von Interesse sind. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Pilzliche Mikroorganismenstämme bilden neben diversen Ergosterin- Derivaten als fluiditätsregelnde Bestandteile ihrer Zytoplasma­ membran auch eine Reihe von Sekundärmetaboliten mit Triterpen­ struktur wie z. B. die Antibiotika Fusidinsäure, Helveolic acid und Cephalosporin P, sowie Azasterole, die sich durch individuel­ le Strukturparameter von den üblichen Sterolen unterscheiden. Neuartige, aus Trichoderma koningkii gewonnene pilzliche Sterole sind die Ergokonine A und B (II und III in Abb. 1; Reichenbach, H. et al.; DE-OS 38 23 068, 1990), die insbesondere durch die Anwesen­ heit einer Carboxylgruppe in C-13-Position sowie weitere Struk­ turmerkmale wie z. B. eine 5,6-Epoxygruppe und eine polare C-3-O- Estergruppe gekennzeichnet sind. Ergokonine sind aufgrund ihrer starken antifungalen Wirkung gegen Hefen (z. B. der Gattung Candi­ da) für die Anwendung als Antiinfektiva von potentiellem Nutzen. (H. Reichenbach et al., DE-OS 38 23 068).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen antifunga­ len Metaboliten in effektiver Weise herzustellen, der aufgrund seiner originellen Struktur für die Gewinnung wirksamer antifun­ galer Zubereitungen sowie als Ausgangsmaterial für die Halbsyn­ these neuartiger Steroidpharmaka potentiell von Interesse ist.

Dazu war ein technologisch einfaches, mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, das die Herstellung eines neuen antifungalen Antibiotikums als pilzlicher Metabolit auf fermentativem Wege aus leicht zugänglichen und kostengünstigen Einsatzstoffen ermög­ licht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß pilzliche Cyclosporin-bildende Mikroorganismen der Arten Tolypocladium in­ flatum und Sesquicilliopsis rosariensis insbesondere die Stämme Tolypocladium inflatum Wb 6/5 oder Sesquicilliopsis rosariensis F 605 aerob bei einer Temperatur zwischen 20°C und 30°C kulti­ viert wird. Aus dem während der Kultivierung erhaltenem Myzel oder aus Rückstands- und Nebenprodukten der Cyclosporingewinnung aus Extrakten dieses Mikroorganismus wird das neue antifungale Antibiotikum, dem die Bezeichnung Ergokonin C gegeben wird, auf üblichem chromatographischen Wege abgetrennt und schließlich in reiner Form gewonnen.

A. Produktionsbedingungen

Produktionsstamm des neuen Antibiotikums Ergokonin C ist entweder ein Mikroorganismus der Gattung Tolypocladium, vorzugsweise der Stamm Tolypocladium inflatum Wb 6/5, oder aber der Gattung Sesquicilliopsis, vorzugsweise der Stamm Sesquicilliopsis rosa­ riensis F 605. Beide explizit genannten Pilzstämme sind im Zusammenhang mit früheren Patentanmeldungen für die Herstellung von Cyclosporinen, Ergosterin und Tolypocladin in der Hinterle­ gungstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, Beutenbergs­ traße 11, 6900 Jena/Thür., unter dem Registrierzeichen IMET 43 899 für den Stamm Tolypocladium inflatum Wb 6/5 und IMET 43 897 für den Stamm Sesquicilliopsis rosariensis F 605 deponiert worden.

Stammkultur

Das Fermentationsmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoff­ quellen sowie aus anorganischen Salzen. Bevorzugt wird zur Kulti­ vierung ein flüssiges Nährmedium eingesetzt, welches als einzige Stickstoffquelle Ammoniumsulfat bzw. andere Ammoniumsalze ent­ hält.

Die Kultivierung der verfahrensgemäß einzusetzenden Stämme erfolgt in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedener Volu­ mina, in Glasfermentoren mit Rührwerk bzw., V2A-Stahltanks. Die in der Anzuchtstufe von z. B. Tolypocladium inflatum-Stämmen erhaltene Biomasse wird in der Hauptkultur unter aeroben und sterilen Bedingungen bei 25°C bis 32°C, vorzugsweise 27°C, in einem Ammoniumsalzmedium obiger Kennzeichnung bei einer Azidität zwischen pH 4.0 und pH 7.0 für die Dauer von 3 Tagen bis 8 Tagen fermentiert.

Die aus der Anzuchtstufe erhaltene Biomasse von S. rosariensis- Stämmen wird in der Hauptkultur hingegen unter aeroben und steri­ len Bedingungen bei 25°C bis 35°C, vorzugsweise 27°C, in einem Ammoniumsalz-haltigen Nährmedium obiger Kennzeichnung gleichfalls bei einer Azidität zwischen pH 4.0 und pH 7.0 für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen fermentiert. Im übrigen wird bei allen Anzuch­ ten von biologischem Material für die Gewinnung des neuen Anti­ biotikums Ergokonin C entsprechend einem vorgeschlagenen Verfah­ ren gearbeitet, in denen die fermentative Herstellung von Cyclosporin A beschrieben wurde.

B. Isolierung des Antibiotikums Ergokonin C

Frisch aus einer Kulturlösung mit pH 4 bis 7 geerntetes Myzel wird mit Methanol extrahiert. Nach dem Einengen des Methanolex­ traktes wird der wäßrige Rückstand mit CHCl₃ extrahiert. Die rot gefärbte Begleitkomponente Tolypocladin (siehe DD-AP C12P/33 39 934) kann durch Säulenchromatographie an NaHCO₃-impräg­ niertem Kieselgel oder durch Reextraktion der CHC₃-Lösung mit NaHCO₃-Lösung abgetrennt werden. Durch Chromatographie an Kiesel­ gel und ggf. organophilen Dextrangelen unter Nachweis von Frak­ tionen mit antifungaler Aktivität gegenüber geeigneten Testkeimen wie Candida kefir wird Ergokonin C erhalten, das aus der CHCl₃- Lösung durch Zusatz von Petrolether (Siedebereich 30 bis 50°C) oder n-Heptan ausgefällt und so in reiner Form gewonnen werden kann.

Als bioaktives Nebenprodukt wird in Abhängigkeit von der ange­ wandten Aufarbeitungsmethodik, vermutlich infolge Hydrolyse von Ergokonin C das bereits bekannte Ergokonin B (siehe Reichenbach, H. et al.; deutsche Offenlegungsschrift DE 38 23 068) erhalten.

Die chemische Identität des neuen Antibiotikums Ergokonin C mit der in Abb. 1 angegebenen Struktur I wird durch die in Tab. 1 gezeigten physikochemischen Parameter, sowie durch die in den Tabellen 2, 3 und 4 sowie in Abb. 2 dargestellten Ergebnisse physikochemischer Untersuchungen bestätigt. Weitere Beweise für die in Abb. 1 angegebene Struktur ergaben sich durch chemische Hydrolyse von Ergokonin C zu Ergokonin B und alpha-Aminoisobut­ tersäure (2-Amino-2-methyl-propionsäure) (Hydrolysebedingungen: methanolische Kalilauge).

Aus dem Vergleich der 100 MHz-¹³C-NMR-Daten von Ergokonin C (I) mit den bekannten Angaben für die Ergokonine A und B (siehe Tab. 2 und 3), sowie den für das Hydrolyseprodukt des Ergokonins C, Ergokonin B, ermittelten ¹³C- und ¹H-NMR-Parameter (COSY, NOE, ROESY) ergibt sich zweifelsfrei die vollständige Identität des Steroidgerüstes mit Ergokonin C.

Die 7β-Konfiguration der 7-OH-Gruppe wird durch Ergebnisse von Untersuchungen des nuklearen Overhauser-Effektes (NOE, ROESY) bestätigt.

Die chemische Identität der Seitenketten an C3-O mit alpha-Ami­ noisobuttersäure ergibt sich schließlich aus den 100 MHz-¹³C- Spektrum [Tab. 2; Signale bei ppm 23.99; 24.00; 57.5 und 172.2; Bestätigung für einen Isobutyrylrest; siehe Tetrahedron 38, 2165 (1982)] sowie den festgestellten Molmassen m/z 544 (M+H)⁺ und 542 (M-H)⁻ (FAB-MS). Die endgültige Bestätigung der Anwesenheit eines alpha-Aminoisobuttersäure-Restes als Substitutent am C-3-O von I wurde durch den chromatographischen Nachweis von alpha-Aminoiso­ buttersäure neben Ergokonin B als Produkt der Hydrolyse von Ergokonin C erbracht.

Mit den angegebenen physikochemischen Daten wird die Struktur der neuen Verbindung entsprechend Abb. 1 hinreichend festgeschrieben.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert jedoch nicht eingeschränkt.

Beispiel 1

Rasenstücke von Oberflächenkulturen des Stammes Tolypocladium inflatum Wb 6/5 werden zunächst auf Glucose-Mineralsalzagar übertragen, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):
Glucose 20; (NH₄)₂SO₄ 3, H₂PO₄ 2, MgSO₄ × 7 H₂O 0.5; CaCO₃ 3.4; Agar; pH 5.3 bis pH 5.7. Sterilisation 30 min bei 120°C.

Nach einer Bebrütungszeit der Petrischalen bei 24°C für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen werden von den entstandenen Aeralen die rot- bis schwarzbraun pigmentierten Kolonien ausge­ wählt. Die Beimpfung der ersten Submersvorkultur erfolgt durch Übertragung eines ca. 1 cm² großen Rasenstückes auf 100 ml des Anzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l):
Glucose 50; Caseinpepton 10; KH₂PO₄ 1: KCl 2,5 in 1 l H₂O dest.; pH 5.5 bis pH 5.6; Sterilisation 30 min bei 120°C.

Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 72 Stunden lang bei 24°C bis 25°C mit 180 UpM bis 220 UpM auf Rundschüttlern kultiviert. Sie zeigen als Reifekriterien eine braunschwarze Färbung. Sie dienen in einer Menge von 5% als Impfmaterial für das Hauptkulturmedium, welches zu je 100 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt wurde und die folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):
Glucose 50; (NH₄)SO₄ 5; (NH₄)₂HPO₄ 2; MgSO₄ × 7 H₂O 5, ZnSO₄ × 7 H₂O 0.008; CaCO₃ 5.1; in 1 l H₂O dest; pH 5.3 bis pH 5.9. Sterilisation 30 min bei 120°C.

Die Kultivierung erfolgt 11 Tage lang bei 24°C bis 25°C auf einem Rundschwingtisch mit 180 UpM oder in 20 l-Glas- oder 500 l- Stahlfermentoren.

10 l Kulturbrühe, die man auf diese Weise erhält, werden sepa­ riert und die erhaltene feuchte Biomasse (ca. 400 g) wird 2mal mit je 1,5 l Methanol jeweils 5 Stunden bei Raumtemperatur extra­ hiert.

Bei Verwendung des Stammes Sesquicilliopsis rosariensis F 605 wird in analoger Weise verfahren.

Beispiel 2

Der nach dem Einengen verbleibende Rückstand wird in 1 l CHCl₃ aufgenommen und 2mal mit je 1 l 0.1 m NaHCO₃-Lösung gewaschen, um saure Pigmente wie Tolypocladin zu entfernen. Anschließend wird die CHCl₃-Lösung getrocknet, auf ein Volumen von ca. 20 ml eingeengt und auf eine Säule (3 cm × 0.6 m), gefüllt mit Sephadex LH-20 (in Methanol oder Aceton) aufgetragen und mit Methanol bzw. Aceton eluiert. Bioaktive Fraktionen, kenntlich an ihrer antifun­ galen Wirkung auf empfindliche Testkeime (siehe Tab. 1), werden zusammengegeben und eingeengt. Die weitere Reinigung erfolgt durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Kieselgel 60; 0.063-0.2 mm; CHCl₃/MeOH; 6.2; v/v; Säule 1 cm × 50 cm), wobei als bioaktive Komponente reines Ergokonin C (20 mg) sowie als Minorkomponente Ergokonin B (1 mg) erhalten wird. Nach dem Lösen des Ergokonins C in einer minimalen erforderlichen Menge an CHCl₃ wird die reine Substanz mit Petrolether (Siedebereich 30 bis 50°C) ausgefällt. Ausbeute 16 mg.

Beispiel 3

Der nach dem Einengen des Methanolextraktes verbleibende wäßrige Rückstand wird mit Wasser auf ca. 300 ml verdünnt und 3mal mit je 300 ml CHCl₃ ausgeschüttelt.

Die vereinigten CHCl₃ Reextrakte werden über Natriumsulfat ge­ trocknet, filtriert und im Vakuumrotationsverdampfer eingeengt. Der ölige Rückstand wird in wenig Chloroform aufgenommen und wiederholt (mindestens zweimal) an Kieselgel (Kieselgel 60; 0.063-0.2 mm; CHCl₃ 5 : 1 bis 5 : 2; v/v; Säule 2,5 cm × 65 cm) chromatographiert. Die Ergokonin-enthaltenden Fraktionen (Kon­ trolle durch Dünnschichtchromatographie oder Bioaktivität) werden vereinigt, im Vakuumrotationsverdampfer eingeengt, in wenig CHCl₃ aufgenommen und nochmals an NaHCO₃-gepuffertem Kieselgel (Kiesel­ gel 60; 0.063-0.2 mm; mit NaHCO₃-Lösung (0.5 m) behandelt und getrocknet; CHCl₃/MeOH 9 : 1 bis 7 : 3; v/v; Säule: 1,5 × 63 cm) chromatographiert. Die Ergokonin-enthaltenden Fraktionen werden wiederum zusammengegeben, im Vakuum-Rotationsverdampfer einge­ engt, in wenig CHCl₃ aufgenommen, das Ergokonin C mit n-Hexan ausgefällt und nach 24stündigem Stehen im Kühlschrank die reine Substanz abfiltriert.
Ausbeute 22 mg.

Beispiel 4

Ergokonin B (II) wird aus Ergokonin C (I) auf folgendem Wege erhalten: durch Stehenlassen einer methanolischen Lösung von 1 mg Ergokonin C in 20 ml Methanol für einen Zeitraum von 14 Tagen erfolgt eine weitgehende Hydrolyse zu einem Gemisch von Ergokonin B (II) und alpha-Aminoisobuttersäure.

Eine effektive Hydrolyse wird ferner durch Lösen von 1 mg Ergoko­ nin C in 3 ml Methanol/1,5 ml H₂O mit 200 mg KOH (10 min Stehen­ lassen bei Raumtemperatur) erreicht. Anschließend wird mit 1 n HCl unter Kühlung angesäuert (pH 4.0) und 2mal mit je 10 ml CHCl₃ das quantitativ (Kontrolle mittels Dünnschichtchromatographie) gebildete Ergokonin C extrahiert. Der Chloroformextrakt wird nach dem Trocknen über Na₂SO₄ (wasserfrei) im Vakuumrotationsverdamp­ fer eingeengt.

Legenden zu den Abbildungen

Abb. 1: Chemische Strukturen der Ergokonine A (III), B (II) und C (I)
Abb. 2: 400 MHz-NMR-Spektrum von Ergokonin C (in CDCl₃)

Tabelle 1 Physikochemische und biologische Eigenschaften von Ergokonin C (I)

Eigenschaften: farblose amorphe Masse
Löslichkeit: sehr gut löslich in CHCl₃/MeOH (95 : 5; v/v); löslich
in CHCl₃/MeOH (1 : 9; v/v) und Aceton; wenig löslich in n-Heptan oder Petrolether
Schmelzpunkt (unkorrigiert): 112-118°C
Chromatographische Eigenschaften (Merck Kieselgel- Aluminiumfolie)
Rf-Wert 0.3 (CHCl₃/MeOH; 5 : 1 v/v)
FAB-MS m/z 544 (M+H)⁺ und 542 (M-H)^-
EI-MS von Ergokonin B (durch Hydrolyse von Ergokonin C erhalten):

m/z 440.2900 (gef.) .2926 ber. für C28H40O4 (M+ -H2O)
m/z 422.2800 (gef.) .2821 ber. für C28H38O3 (M+ -2H2O)
m/z 407.2621 (gef.) .2586 ber. für C27H35O3 (M+-H2O;-CH3)
m/z 397.2761 (gef.) .2761 ber. für C26H37O3 (M+ -C2H5O2)
m/z 378.2902 (gef.) .2902 ber. für C27H38O2 (M+-2 H2O,-CO2);
m/z 271.1685 (gef.) .1698 ber. für C18H23O2 (M+-H2O, C8H17)

IR-Spektrum (lambda max. cm^-1): 1680; 2850; 2950.

Biologische Wirksamkeit (Agarplatten-Diffusionstest)

Candida kefir (minimale wachstumshemmende Wirkung: 0.03 µg Ergokonin C/Diffusionszone)
Kluyveromyces marxianus (minimale wachstumshemmende Wirkung 0.05 µg Ergokonin C/Diffusionszone)
Zum Vergleich antibakterielle Wirkung gegen Bacillus subtilis ATCC 6633: minimale wachtumshemmende Wirkung 10 µg Ergokonin/Diffusionszone

Tabelle 2

¹³C-chemische Verschiebungsdaten (in ppm) und ¹³C-¹H- Kopplungskonstanten (in Hz) aus selektiven 2D-INEPT- Experimenten für Ergokonin B (durch Hydrolyse von Ergokonin C erhalten; in CD₃OD, 100.1 MHz, 30°C).

Tabelle 3

Kohlenstoff 13-chemische Verschiebungswerte im (ppm) Spektrum von Ergokonin C (in CD₃OD, 100.1 MHz, 30°C)

Tabelle 4

Homonukleare NOE-Korrelationen ermittelt für Ergokonin B (durch Hydrolyse von Ergokonin C erhalten) aus den 1D NOE Differenz- und 20 Phasensensitiven NOESY-Spektren (in CD₃OD, 400 MHz, 30°C)

Claims (7)

1. Neues antifungales Antibiotikum Ergokonin C, gekenn­ zeichnet durch die chemische Bezeichnung C-13-Carboxy- 3-0(2′-amino 2′methylpropionylcarboxy-)sterol und durch die nachfolgende Strukturformel

2. Verfahren zur Herstellung des neuen, antifungalen Antibioti­ kums Ergokonin C durch Fermentation unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff-, Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Tempera­ tur zwischen 20°C und 37°C, gekennzeichnet dadurch, daß als Ergokonin C-bildende Mikroorganismen solche der Arten Tolypocla­ dium inflatum und Sesquicilliopsis rosariensis insbesondere die Pilzstämme Tolypocladium inflatum Wb 6/5 oder Sesquicilliopsis rosariensis F 605 eingesetzt, während eines Zeitraumes von 5 Tagen bis 11 Tagen in einem Medium mit Ammoniumsalzen als einzi­ ger Stickstoffquelle kultiviert werden und das gebildete Antibio­ tikum aus dem Myzel auf extraktivem Wege gewonnen und nachfolgend gereinigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man bei der Kultivierung von rot- bis schwarzbraun pigmentierten Emers­ kulturen ausgeht, die auf einem Mineralsalz-Glucoseagar mit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle angezogen wurden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Kultivierung der Stämme Tolypocladium inflatum Wb 6/5 oder Sesquicilliopsis rosariensis F 605 als Ammoniumsalze Ammo­ niumsulfat oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet werden.

5.Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß das Myzel von der Kulturlösung abgetrennt, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, die Lösung anschließend eingeengt und das Antibiotikum Ergokonin C als Nebenprodukt der Cyclosporinher­ stellung durch säulenchromatographische Fraktionierung an Kiesel­ gel und organophilen Dextrangelen isoliert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß zur Reinigung des Antibiotikums säulenchromatographisch erhaltene und in ihrer inhibitorischen Aktivität gegenüber empfindlichen Hefestämmen gekennzeichnete Fraktionen eingeengt, durch Säulen­ chromatographie an organophilen Dextrangelen gegebenenfalls weiter gereinigt und Ergokonin C schließlich aus den erhaltenen Fraktionen in reiner Form durch Fällung mit Petrolether (Siedebe­ reich 30-50°C) oder n-Heptan erhalten wird.

7. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend das neue, antifungale Antibiotikum Ergokonin C als Wirksubstanz ggf. in Verbindung mit anderen Wirk- und Hilfsstoffen.