DE4107028A1 - Pilzstämme der Gattungen Trichoderma, Penicillium und Aspergillus sowie Verfahren zur Steigerung der Bildung extrazellulärer Enzyme bei der aeroben Submerszüchtung dieser Pilzstämme durch Elektrostimulation - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur, Steigerung der Bildung extrazellulärer Enzyme bei der aeroben Submerszüch­ tung von Pilzen durch Elektrostimulation, insbesondere von sol­ chen Enzymen, welche während der Kultivierung der Pilze ins Me­ dium sekretiert werden. Anwendungen für die Erfindung bestehen in Produktionsanlagen, in denen Pilzenzyme hergestellt werden.

Es ist allgemein bekannt, Enzyme durch Submerskultivierung von Pilzen herzustellen. Die dafür beschriebenen Verfahren unter­ scheiden sich durch Verwendung unterschiedlicher Pilzstämme, unterschiedlicher Substrate und unterschiedlicher Fermentations­ regime. Wesentliche Kriterien für die Effektivität bei der Enzym­ gewinnung sind die

• - Produktivität der Enzymbildung, die
• - erreichte Endkonzentration oder Aktivität der Enzyme im Fermentationsmedium sowie die
• - substratbezogene Enzymausbeute.

Bei all den bekannten Verfahren zur Gewinnung pilzlicher Enzyme wird die Effektivität durch die maximal mögliche Syntheseleistung bzw. Ausscheidungsrate der zu gewinnenden Stoffwechselprodukte begrenzt. Es ist bekannt, daß das Wachstum von Zellen, wie auch die Bildung von Stoffwechselprodukten durch bioelektrochemische Maßnahmen gesteigert werden kann.

Dafür gibt es mehrere Techniken:

• A) Durch Einsetzen freier oder isolierter Elektroden in das Fermentationsmedium erfolgt eine galvanische oder kapazitive Ankopplung des elektrischen Feldes.
• B) Elektrodenlose induktive Ankopplung, beispielsweise über Helmholtzspulen, wobei ein pulsierendes Magnetfeld im Fermen­ tationsmedium elektrische Feldstärken im mV/cm-Bereich indu­ ziert.

Die Kategorie A. betreffen beispielsweise die Patentschriften WO 87/02705, OS 2841455, EP 0223110, sowie DE OS 3441085.

Gemäß Patentschrift WO 87/02705 wird bei Frequenzen von 0,1 kHz bis 10 kHz und Feldstärken von 1 V/cm bis 18 V/cm die Elektrostimulation für die Beschleunigung des Wachstums von E.coli, B.subtilis, Bohnensamen und Eiern der Fruchtfliege ge­ nutzt, wobei die Frequenz 1 kHz bei, der Feldstärke 2,5 V/cm als besonders effektiv beschrieben wird.

In der Patentschrift EP 0223110 wird ein Verfahren zur Elektro­ stimulation von Mikroorganismen beschrieben, bei dem das Fermen­ tationsmedium mit den Mikroorganismen durch eine im oder in einem Außenkreis befindliche Elektrodenanordnung strömt. Auf die Elek­ trodenanordnung werden Elektroimpulse mit einer Repitationsrate von 5 Hz bis 15 Hz gegeben. Die Feldstärke wird vorzugsweise innerhalb von 10 µs bis 100 µs auf den Maximalwert gebracht und fällt dann exponentiell, gleich einer Kondensatorentladung, ab. Das Verfahren ist vorzugsweise für die mikrobielle Erzeugung von Methan bzw. Biogase sowie die anaerobe Abwasserbehandlung geeig­ net.

Entsprechend der Patentschrift DE OS 3 441085 wird die biologische Aktivität von Mikroorganismen in flüssiger Kultur mit elek­ trischem Strom als Stimulator erhöht, wobei ein pulsartiger Strom bzw. ein pulsartiger Wechselstrom angewendet wird. Der elek­ trische Strom kommt entweder in einem Aktivierungstank oder di­ rekt im Fermentor zur Anwendung. Bevorzugt findet das Verfahren Anwendurig bei der fermentativen Herstellung von Sojasauce, bei der Bearbeitung von Abwasserschlamm sowie bei der Gewinnung von Alkohol und Milchsäure. Die Spitzenwerte der Spannung betragen 1 V bis 1000 V und die Spitzenwerte der Stromstärke 10 mA bis 20 A.

Die Kategorie B. betreffen beispielsweise die Patentschriften DE OS 3027604, FR 2460329 sowie DD WP 248140.

Gemäß, der Patentschrift DE OS 3027604 wird die Kultur von Leuko­ zyten bzw. Fibroplasten dem 100 Hz pulsierenden Magnetfeld u. a. im unterbrochenen Joch eines Elektromagneten ausgesetzt, wobei die ATP Synthese und der Sauerstoffwechsel intensiviert sind. In der Patentschrift FR 2460329 wird die Anwendung von Hochfrequenz­ feldern- bis 10 GHz beschrieben, um die Essigsäurebildung von Gram-positiven Bazillen anzuregen. Gemäß der Patentschrift DD WP 248140 dient die Elektrostimulation von Streptomyces nour­ sei zur Steigerung der Biomasseproduktion unter beschleunigter Bildung des Antibiotikums in der ersten Fermentationsphase.

Die kapazitiven Verfahren zur Erhöhung der Leistung des Sauer­ stoffwechsels von Zellen haben den Nachteil, daß sie mit einem hohen apparativen bzw. energetischen Aufwand verbunden sind. Nachteilige Effekte ergeben sich im Falle der direkten Stromein­ speisung in das Fermentationsmedium, bedingt durch partielle Elektrolyse oder Korrosion an den Elektroden.

Für die Gewinnung von Enzymen aus Pilzstämmen konnten in der Fach- und Patentliteratur keine technischen Lösungen gefunden werden, in denen mittels induktiv induzierter Elektrostimulation eine Steigerung der Enzymbildung bewirkt wird.

Es ist das Ziel der Erfindung, bei der Gewinnung von Enzymen durch Submerszüchtung von Pilzen eine Steigerung der Produktion zu erzielen, um somit eine effektivere Ausnutzung von Fermentor­ volumen und Substrat zu gewährleisten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch geeignete tech­ nische Maßnahmen die, intrazelluläre Bildungsgeschwindigkeit und/oder die Sekretionsrate von Enzymen bei der aeroben Submers­ kultivierung (Fermentation) von Pilzen zu erhöhen, um somit zu einem früheren Zeitpunkt der Kultivierung eine höhere Endkonzen­ tration der Enzyme im Fermentationsmedium oder eine höhere over­ all-Bildungsgeschwindigkeit zu erreichen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man bei der Submerskultivierung von pilzlichen Mikroorganismen in einem Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, einen Pilzstamm mit reduzierter Katabolit­ repression bezüglich des zu gewinnenden Enzyms einsetzt. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß bei der Gewinnung induzierbarer Enzyme, deren Bildung einer katabolischen Repression unterliegt, eine Steigerung der Enzymbildung durch elektrische Wechselfelder erreichbar ist, wenn mittels geeigneter Prozeßführung die katabolische Repression unterdrückt wird.

Besonders ausgeprägt ist die Erhöhung der Enzymbildung, wenn sol­ che Pilzmutanten eingesetzt werden, die keine oder eine redu­ zierte Katabolitrepression bezüglich der zu gewinnenden Enzyme aufweisen. Geeignete Mutanten gehören den Gattungen Trichoderma, Penicillium und Asperqillus an. Das Verfahren ist besonders gut geeignet für die Gewinnung solcher Enzyme, die während der Sub­ merskultivierung der Pilze ins Fermentationsmedium sekretiert werden. Es wurde gefunden, daß bei der Submerskultivierung von Pilzen die Einwirkung von pulsierenden elektromagnetischen Fel­ dern zu einer Erhöhung-der Bildung von Enzymen führt. Dazu wird der Fermentorinhalt pulsierenden elektromagnetischen Feldern ausgesetzt, welche schwache pulsierende elektrische Ströme im Fermentationsmedium induzieren. Bei der Enzymbildung beispiels­ weise mittels der Mutanten
Trichoderma reesei ZIMET 43 803,
Trichoderma reesei ZIMET 43 804,
Penicillium verruculosum IMET 43 857,
Penicillium verruculosum IMET 43 858,
Asperqillus niger ZIMET 43 746,
Asperqillus terreus ZIMET 43 802
läßt sich durch elektrische Wechselfelder die Enzymbildung, stei­ gern. Eine solche Steigerung ist in batch-Fermentationsprozessen möglich, bei denen durch Art oder Konzentration des vorgelegten Substrates eine Katabolitrepression bezüglich der zu gewinnenden Enzyme ausgeschlossen ist. Eine andere günstige Variante des Verfahrens besteht darin, daß bei der nicht-wachstumsgekoppelten Enzymbildung das Mycel in einer batch-Periode, der Fermentation angezogen wird und daß in einer sich anschließenden batch-Perio­ de, in welcher die Enzymbildung erfolgt, das elektromagnetische Feld angelegt und somit nur in der Periode der Enzymbildung das elektrische Feld erzeugt wird.

Die Elektrostimulation wird in an sich bekannter Weise so durch­ geführt, daß pulsierende elektrische Felder durch Induktion im Fermentationsmedium wirksam werden, indem impulsartige Ströme in Helmholtzspulen, die um den Fermentor oder im Fermentor angeord­ net sind, produziert werden. Die Impulse haben beispielsweise eine Dauer von 100 µs bis 300 µs; es folgen mehrere Impulse mit jeweils 10 µs bis 25 µs Pausenabstand aufeinander, so daß eine Impulsgruppe mit 5 ms Dauer entsteht. Die Gruppen haben eine Folgefrequenz von 5 Hz bis 75 Hz. Die Feldstärke der im Fermen­ tationsmedium induzierten elektrischen Impulse beträgt 1 mV/cm bis 5 my/cm. Die hierfür erforderlichen Impulsströme durch die Helmholtzspulen sind von der Dimension des Fermentors, der Anord­ nung und den Parametern der Spulen abhängig. Die Spulen können außerhalb des Fermentors angebracht werden, sofern zwischen den Spulen und dem Fermentationsmedium kein das Magnetfeld abschir­ mender oder beeinflussender Metallmantel vorhanden ist. Bei Ver­ wendung z. B. eines rostfreien Edelstahlfermentors, werden die Spulen im Innenraum des Fermentors angeordnet. Da in diesem Fall der Spulendurchmesser kleiner als der Fermentorinnendurchmesser ist, muß dafür gesorgt werden, daß das Fermentationsmedium den Raum innerhalb der Spulen durchströmt. Dies wird durch den Rührer in Verbindung mit geeigneten, Strömungsleiteinrichtungen bewirkt. Die Abtrennung der Enzyme vom Fermentationsmedium erfolgt gemäß der bekannten Verfahren (Separtion, Filtration), Die Aufkonzen­ trierung der wäßrigen Enzymlösung -wird mittels Membrantrennpro­ zessen (Ultrafiltration, Diafiltration) vorgenommen. Die Auftren­ nung der konzentrierten wäßrigen Enzymlösungen in die Einzelkom­ ponenten kann beispielsweise mittels präpartiver, isoelektrischer Focusierung oder mittels präparativer HPLC vorgenommen werden. Auf diese Weise können aus dem entsprechenden Enzymkonzentrat Cellulase, Glucanase, Hemiceilulase, Amylase und/oder Lipase gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sol­ len, beschreiben die Erfindung im Detail.

Beispiel 1

In zwei Rührfermentoren des gleichen Typs, dessen Bruttovolumen 5 l beträgt, wird der Pilz Trichoderma reesei ZIMET 43 804 zur Gewinnung von Cellulase kultiviert. Das Gehäuse besteht aus einem Glaszylinder, an dem Boden- und Deckplatten aus Edelstahl ange­ bracht sind. An einem der Fermentoren ist außen am Glaszylinder anliegend ein Paar Helmholtzspulen zur Erzeugung eines elektro­ magnetischen Feldes angebracht, die mit einem Impulsgenerator verbunden sind. Beide Fermentoren werden mit dem gleichen Nähr­ medium sowie dem gleichen Inokulum gefüllt und unter den gleichen Bedingungen betrieben. Der Fermentor ohne Helmholtzspulen dient als Kontrollfermentor.

Die Helmholtzspulen sind zueinander mit einem Abstand von 8 cm auf dem Glaszylinder des Fermentors, dessen Durchmesser 16 cm beträgt, angeordnet, bestehen aus je 65 Windungen (gleichsinnig) 1,3 mm starken Kupferdrahtes und sind parallel geschalten. Der Abstand der ersten Spule von der Bodenplatte beträgt 6 cm. Die vom Impulsgenerator erzeugten, Impulse haben eine Dauer von 200 µs. Es folgen mehrere Impulse mit jeweils 15 µs Pausenabstand aufeinander, so daß eine Impulsgruppe mit 5 ms Dauer entsteht. Die Gruppen haben eine Folgefrequenz von 15 Hz. Die Feldstärke der im Fermentationsmedium induzierten elektrischen Impulse be­ trägt im Mittel 1,5 mV/cm. Die hierfür erforderlichen Impuls­ ströme durch die Helmholtzspulen haben einen Spitzenwert von 10 A. Die Mitte zwischen den Spulen entspricht etwa der Mitte des gerührten und begasten Fermentationsmediums. Die Fermentoren sind mit einem allgemein gebräuchlichen Sechsblatt-Scheibenruhrer versehen, dessen Gesamtdurchmesser 5,5 cm beträgt. Die Eintauch­ tiefe des Rührers in das Fermentationsmedium beträgt 6 cm. Die Begasung des Fermentationsmediums erfolgt über einen unterhalb des Rührers befindlichen Ring. Die Fermentoren sind mit der all­ gemein gebräuchlichen Meß- und Regeltechnik ausgestattet. Sie sind mit einer Temperatur- Meß- und Regeleinrichtung, einer Ge­ löstsauerstoffmessung, einer automatisch geregelten Schaumbe­ kämpfung sowie, einer pH-Meß- und Regeleinrichtung ausgerüstet. In einen sterilen Behälter werden 4,5 l sterilisierte Nährlösung und 0,5 l Inokulum unter Ausschluß von Fremdinfektionen gegeben, vermischt und zu gleichen Teilen von die 2,5 l in die beiden Fer­ mentoren gefüllt.

Die Nährlösung für die Fermentation in 4,5 l Trinkwasser hat folgende Zusammensetzung:

Cellulosepulver|75 g
Weizenkleie	15 g
(NH₄)₂SO₄	15 g
KH₂PO₄	10 g
MgSO₄·7H₂O	2,5 g
CaCl₂	2,0 g
Tween 80	5,0 g (Polyoxyethylenesorbitan)

Das Inokulum wird in Schüttelkolben hergestellt. Hierzu werden fünf Schüttelkolben mit je 100 ml Nährmedium unter Ausschluß von Fremdkeimen mit jeweils ca. 10⁷ Konidien einer Abimpfung des Stammes Trichoderma reesei ZIMET 43 804 beimpft. Die Kultivierung erfolgt 40 Stunden bis 48 Stunden auf einer für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein gebräuchlichen Schüttelmaschine bei 30 °C.

Die Nährlösung für das Inokulum in 1 l Trinkwasser hat folgende Zusammensetzung:

Cellulosepulver|10 g
Weizenkleie	5 g
(NH₄)₂SO₄	2,5 g
KH₂PO₄	15 g
MgSO₄·7H₂O	0,4 g
CaCl₂	0,4 g
Harnstoff	0,3 g

Die Kultivierung in den Fermentoren wird zu Beginn der Fermenta­ tion bei 31°C durchgeführt, nach 24 Stunden, Fermentationszeit auf 28 °C abgesenkt und bis zum Ende der Fermentation auf diesem Wert gehalten. Die Regelgrenzen für- den pH-Wert werden auf pH 4,0 (untere Regelgrenze) und pH 5,5 (obere Regelgrenze) eingestellt. Der pH-Wert wird bei Unterschreitung der Regelgrenze mit 12%iger Ammoniaklösung und bei Überschreitung der Regelgrenze mit 10%iger Schwefelsäure in den oben genannten Regel grenzen gehal­ ten. Die Rührerdrehzahl beträgt 600 U/min und die Begasungsinten­ sität 40 Norm-Liter Luft pro Stunde und Liter Fermentations­ medium. Beide Fermentoren werden über einen Zeitraum von insge­ samt 82 Stunden betrieben, wobei die Elektrostimulation während der Gesamtzeit in dem mit den Helmholtzspulen ausgerüsteten Fer­ mentor entsprechend den oben genannten Parametern durchgeführt wird. Die Abbildung zeigt den Verlauf der Cellulaseaktivität in Abhängigkeit von der Fermentationszeit für beide Fermentoren. Bei Beendigung der Fermentation nach 82 Stunden beträgt die Cellu­ laseaktivität im Kulturfiltrat 3,7 Einheiten je ml in dem Fermen­ tor mit Elektrostimulation; im Kontrollfermentor beträgt die Cellulaseaktivität 2,3 Einheiten je ml. Die angegebenen Einheiten betreffen die Filterpapieraktivität (FPA) entsprechend der von der IUPAC 1987 empfohlenen Methode.

Beispiel 2

In einem Rührfermentor mit einem Bruttovolumen von 30 l wird der Pilz Trichoderma reesei ZIMET 43 803 zur Gewinnung des Cellula­ se-Enzymkomplexes. kultiviert. Als Prozeßführung wird eine fed­ batch-Technik angewendet, bei welcher eine feedback-kontrollierte intermittierende Substratzugabe erfolgt. Die Elektrostimulation durch pulsierende elektromagnetisch induzierte elektrische Felder wird nur in der Sustratzuführungsphase vorgenommen. Das Grund­ nährmedium enthält als Induktor Cellulose in Kombination mit Weizenkleie. In der Substratzuführungsphase wird Lactose in Form einer 20%igen Lösung zugegeben. Die Dosierpumpe zur Lactosezu­ gabe wird über die CO₂-Konzentration des Fermentorabgases ange­ steuert.

Der Fermentor ist aus nichtrostendem Edelstahl gefertigt, dessen zylindrischer Fermentormantel einen Innendurchmesser von 26 cm hat. Im Innenraum des Fermentors ist ein Paar Helmholtzspulen mit einem Durchmesser von 20 cm und einem Abstand von 10 cm zueinan­ der konzentrisch zur Rührerachse angebracht. Die untere Spule hat einen Abstand von 7 cm zur Bodenplatte des Fermentors. Die Spulen und deren elektrischen Zuleitungen sind gegen das Fermentations­ medium isoliert. Da der Fermentor mit einem Unterantrieb ausge­ rüstet ist, befinden sich im Raum innerhalb der Spulen keine Metalleinbauten. Der Sechsblatt Scheibenruhrer mit einem Durch­ messer von 9 cm ist 5 cm oberhalb der Bodenplatte positioniert. Neben der allgemein gebräuchlichen und bereits im Ausführungsbei­ spiel 1 genannten Meß- und Regeltechnik ist der Fermentor mit einer weiteren Meßeinrichtung, nämlich für die Messung der CO₂- Konzentration im Fermentationsabgas ausgestattet, gekoppelt mit einem Steuergerät für die Ansteuerung einer Dosierpumpe.

Das Grundnährmedium hat folgende Zusammensetzung:

KH₂PO₄|36 g
(NH₄)₂SO₄	96 g
HgSO₄·7H₂O	4,8 g
CaCl₂	3,6 g
FeSO₄·7H₂O	60 mg
MnSO₄·7H₂O	20 mg
ZnSC₄·7H₂9	20 mg
CoCl₂·6H₂O	24 mg
Cellulosepulver	40 g
Glucose	160 g
Wäßriger Weizenkleie-Auszug von 360 g Weizenkleie

Zur Herstellung des Grundnährmediums werden 360 g Weizenkleie in Leitungswasser suspendiert, auf 6 l gebracht und kurzzeitig zum Sieden erhitzt. Nach Abtrennung der Feststoffe werden in dem Fugat die oben genannten Salze gelöst, das Cellulosepulver sus­ pendiert, mit Leitungswasser auf 8 l aufgefüllt und sterilisiert. Die Glucose wird in 1 l Wasser gesondert sterilisiert.

Beide Komponenten werden unter Ausschluß von Fremdkeimen in den sterilisierten Fermentorgegeben und anschließend mit 1 l einer Mycelsuspension der oben genannten Trichoderma reesei-Mutante beimpft. Das Inokulum wird analog dem Ausführungsbeispiel 1 her­ gestellt.

Fermentationsparameter

- Rührerdrehzahl: 500 U/min
- Begasungsintensität: 40 Norm-Liter Luft pro Stunde und Liter Fermentationsmedium.
- Fermentationstemperatur:
batch-Periode 32°C
fed-batch-Periode 28°C
pH-Wert:
untere Regelgrenze pH, 3,3
(Regelung mit 12%iger Ammoniaklösung)
obere Regelgrenze pH 5,0
(Regelung mit 10%iger Schwefelsäure).

Fermentationsführung

Nach der Beimpfung wird der, Fermentor diskontinuierlich betrie­ ben. Die CO₂-Konzentration im Abgas steigt an und ist nach Ver­ brauch der Glucose in 24 Stunden Fermentationszeit abgefallen. Nachdem die CO₂-Konzentration das Maximum überschritten hat und auf etwa 60% des Maximalwertes vermindert ist, werden 50 ml der 20%igen Lactoselösung zudosiert und anschließend wird mit der automatischen Lactosezugabe begonnen. Die Fermentationstemperatur wird auf 28°C eingestellt,es werden 14 g Tween 80 (Polyoxyethy­ lenesorbitan) in das Fermentationsmedium gegeben, und es wird die Elektrostimulation mit den Parametern wie im Beispiel 1 ange­ schaltet. Für die intermittierenden Lactosezugaben in der fed­ batch-Periode wird die Lactosepumpe über ein Stellglied mit Timer in Abhängigkeit von der CO₂-Konzentration des Abgases ange­ steuert. Die Substratzugaben werden in bezug auf die Menge sowie die zeitlichen Abstände der jeweiligen Zugaben so bemessen, daß die Substratkonzentration zwischen kurzzeitiger Limitation und einer solchen Konzentration oszilliert, welche noch nicht rep­ rimierend auf die Enzymbildung wirkt. Die Regelgrenze wird auf 70% des CO₂-Maximalwertes eingestellt. Bei Unterschreitung dieser Regelgrenze werden 60 ml der 20%igen Lactoselösung dem Fermentationsmedium zugegeben. Die CO₂-Konzentration des Abgases steigt nach der Lactosezugabe relativ schnell auf den ursprüng­ lichen Maximalwert an und fällt dann etwas langsamer wieder ab. Zu Beginn der Lactosezuführung beträgt der zeitliche Abstand zwi­ schen den-einzelnen Zugaben etwa 90 Minuten. Nach einem Tag ver­ ringert sich dieser Abstand auf etwa 60 Minuten. Im Verlaufe der fed-batch-Periode wird die Regelgrenze der CO₂-Konzentration des Abgases annähernd der etwas zunehmenden Mycelkonzentration sowie dem ansteigenden Fermentationsvolumen angepaßt, was einer Erhö­ hung auf ca. 90% des ursprünglichen Maximalwertes entspricht. Die Fermentation wird nach 80 Stunden beendet. Die Cellulaseakti­ vität im Kulturfiltrat beträgt 14 Filterpapiereinheiten je ml. Der Gesamtlactoseverbrauch beläuft sich auf 4 l und der Gesamtam­ moniakverbrauch auf 0,5 l der 12%igen Ammoniaklösung.

Bei einem Kontrollversuch ohne Elektrostimulation werden unter gleichen Fermentationsbedingungen erst nach 120 Stunden Fermen­ tationszeit 14 Filterpapiereinheiten je ml er reicht, d. h. es wird eine um 50% längere Fermentationszeit benötigt.

Claims (6)

1. Pilzstämme der Klassen Deuteromycetes und Ascomycetes, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine reduzierte Katabolitrepression gegenüber den von ihnen produzierten Enzymen aufweisen.

2. Pilzstämme nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Gattungen Trichoderma Penicillium und Aspergillus angehören.

3. Verfahren zur Steigerung der Bildung extrazellulärer Enzyme bei der aeroben Submerszüchtung dieser Pilzstämme durch Elektro­ stimulation in einem Nährmedium, welches Kohlenstoff- sowie Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, sowie durch Abtren­ nung der enzymatischen Produkte aus der Kulturflüssigkeit, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Fermentation jeweils einen Pilzstamm mit reduzierter Katabolitrepression bezüglich des zu gewinnenden Enzyms heranzieht und die Fermentation in einem Regime durchführt, das die katabolische Repression der Enzym­ bildung unterdrückt.

4. Verfahren gemäß, Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man den gewählten Pilzstamm obiger Kennzeichnung in einem Substrat fermentiert, das feste, insbesondere cellulosehaltige, Roh­ stoffe enthält.

5. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man den gewählten Pilzstamm obiger Kennzeichnung in einem Regime fer­ mentiert, in dem man die Substrate dem Fermentationsmedium intermittierend oder kontinuierlich in der Weise zugibt, daß reprimierende Konzentrationen nicht erreicht werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 6 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß man Cellulase, Glucanase, Hemicellulase, Amylase und/oder Lipase gewinnt.