DE4035714C2

DE4035714C2 -

Info

Publication number: DE4035714C2
Application number: DE19904035714
Authority: DE
Inventors: Herbert Bauser; Harald Gunsilius; Guenter 7000 Stuttgart De Hellwig; Manfred 7403 Ammerbuch De Otto
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1990-11-09
Publication date: 1993-03-04
Also published as: DE4035714A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Mes sung des Dipolmoments von in einem Fluid eingebrachten Molekülen und/oder der Konzentration von Molekülen mit einem Dipolmoment in einem Fluid.

Eine der Eigenschaften von biochemischen Makromolekülen wie Proteinen und Nucleinsäuren ist ihr elektrisches Dipolmoment. Dieses Dipolmoment kann grundsätzlich mittels der dielektrischen Relaxation gemessen werden. Moleküle mit Dipolmomenten in einer bestimmten Lösung erzeugen in einem elektrischen Wechselfeld bei einer jeweils molekültypischen Relaxationsfrequenz ein Maxi mum der dielektrischen Verluste und eine Stufe im Real teil der komplexen Dielektrizitätszahl.

Zur Messung des Dipolmoments wird deshalb gemäß dem Stand der Technik die komplexe Kapazität und/oder der Verlustfaktor im Bereich der Relaxationsfrequenz gemes sen. Das Dipolmoment kann dann aus dem Relaxations betrag, d. h. aus der Differenz der Dielektrizitätszahlen bei tiefen (ε_s) und hohen Frequenzen (ε_∞) ermittelt werden. Alternativ kann das Dipolmoment aus dem Inte gral über die frequenzabhängigen dielektrischen Verluste (bei Auftragung über dem Logarithmus der Frequenz) bestimmt werden. Zur praktischen Durchführung der Mes sung werden die Substanzen meist in ein organisches Lösungsmittel verbracht (was bei vielen Proteinen und anderen Biomolekülen problematisch ist), um durch Aus nützung der elektrisch isolierenden Eigenschaften den störenden Einfluß von elektrischen Leitungsphänomenen auszuschalten. Die Messung erfolgt - je nach Frequenz - in einem Kondensator oder in einem Hohlraumresonator oder dergleichen.

Häufig erschweren jedoch zwei Probleme die Messung:

Die Relaxationsfrequenz ist insbesondere bei kleinen Molekülen sehr hoch und liegt typischerweise zwischen 1 GHz und 100 GHz. Darüber hinaus sind die Relaxations signale vergleichsweise klein. Aus beiden Gründen sind die Relaxationsbanden im Verlustspektrum der direkten Messung nur mit aufwendigen Geräten zugänglich. Selbst bei Proteinen, bei denen zuweilen recht hohe Dipol momente auftreten können (z. B. einige hundert Debye), sind die direkten Relaxationssignale relativ klein, wenngleich die Relaxationsfrequenzen in diesem Fall niedriger liegen. Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Messung des Dipolmoments von in einem Fluid eingebrachten Molekülen und/oder der Konzentration von Molekülen mit einem Dipolmoment in einem Fluid anzugeben, bei dem zum leichteren Nachweis der dielektrischen Signale von Dipolmomenten die Messung bei vergleichsweise niedrigen Frequenzen und mit einer vergleichweise großen Signalgröße durchgeführt kann.

Eine erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist mit ihren Weiterbildungen in den Patentansprüchen gekenn zeichnet.

Die Erfindung geht von dem Grundgedanken aus, die übli cherweise als störend empfundene Anwesenheit von - bereits vorhandenen oder absichtlich dem Lösungsmittel zugefügten - Ladungsträgern zur empfindlichen Messung des Dipolmoments von gelösten Molekülen auszunützen. Dabei ist erfindungsgemäß erkannt worden, daß der Absolutwert der Dielektrizitätszahländerung im Bereich der Ladungsträger-Relaxationsfrequenz um mehrere Grö ßenordnungen größer ist als das Maximum der Dielek trizitätszahl im Bereich der Dipol-Relaxationsfrequenzen. Für die Messung wird eine kapazitive Meßsonde verwendet, deren Elektroden durch eine dünne Isolator schicht gegen die Meßflüssigkeit isoliert sind, so daß die Ladungsträger die Meßsonde nicht "kurzschließen können".

Die Meßsonde kann dabei ein Plattenkondensator mit isolierten Platten, aber auch eine andere kapazitive Anordnung, beispielsweise ein Wellenleiter oder ein Hohlraumresonator sein. Ein Plattenkondensator mit isolierten Platten ist für eine Anordnung zur Über wachung des Mischungsverhältnisses zweier Flüssigkeiten, die jedoch auf einem anderen Prinzip beruht, aus der DE 35 17 065 A1 bekannt.

In jedem Falle wird erfindungsgemäß die Dielektrizi tätszahl gemessen, bevor und nachdem sich die Konzen tration von mit Dipolmomenten behafteten Substanzen, insbesondere von Biomolekülen oder von Reaktanden bei durch Biomoleküle ausgelösten Reaktionen, geändert hat.

Damit ist es möglich bei niedrigeren Frequenzen, die häufig sogar unterhalb von 10 MHz und manchmal sogar noch um Größenordnungen unter diesem Wert liegen, aus der Änderung der in Abhängigkeit von der Frequenz ge messenen Dielektrizitätszahl nach dem Einbringen der Dipolmomente aufweisenden Moleküle in das Fluid bei bekannter Konzentration die Größe des Dipolmoments bzw. bei bekanntem Dipolmoment die Konzentration der Moleküle zu bestimmen.

Darüber hinaus erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Erfassung von Änderungen des Dipolmoments. Interes sante Anwendungen sind die Erfassung von Dipolmoment änderungen bei der Bildung von Assoziaten oder bei Ände rungen der chemischen Konstitution, z. B. des Redox zustandes von biologisch relevanten (Makro-)Molekülen. Damit können auch neuartige Biosensoren realisiert wer den, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren arbeiten.

Im folgenden soll zunächst die Funktionsweise des er findungsgemäßen Verfahrens erläutert werden:

Bei Anwesenheit von Ladungsträgern in einem Fluid, bei spielsweise einem Lösungsmittel, zwischen den Elektro den einer kapazitiven Anordnung entsteht ein dielek trisches Relaxationssignal, dessen Relaxationsfrequenz einerseits durch die Konzentration und Beweglichkeiten der Ladungsträger und andererseits durch die Geometrie der kapazitiven Anordnung bestimmt ist. Von den Ladungs trägereigenschaften unabhängig sind einige wichtige Größen des Relaxationssignals, insbesondere der Relaxa tionsbetrag und die Höhe des Verlustfaktormaximums.

Diese und andere Signalgrößen, die zwar an die Anwesen heit von Ladungsträgern gebunden, jedoch in ihrer Größe von den Ladungsträgerdaten bzw. von Leitfähigkeitsdaten weitgehend unabhängig sind, werden erfindungsgemäß für die Erfassung von zusätzlich vorhandenen Dipolmolekülen (d. h. Molekülen mit elektrischen Dipolmomenten) heran gezogen werden. Voraussetzung dafür ist, daß die Re laxationsfrequenz der Dipolmoleküle größer ist als die Relaxationsfrequenz der Ladungsträger in der jeweiligen geometrischen Anordnung. In diesem Fall werden nämlich die vorgenannten Signalgrößen der Ladungsträgerrelaxa tion als Folge des bei höheren Frequenzen ablaufenden Dipolrelaxationsvorganges in definierter Weise verän dert. Beispielsweise wird das Maximum des dielektri schen Verlustfaktors mit zunehmender Konzentration der Dipolmomente erniedrigt. Dabei kann die Erniedrigung des Maximums um einen um Größenordnungen höheren Betrag erfolgen als die Höhe des der Dipolrelaxation zugehöri gen Verlustmaximums. Durch diesen systemimmanenten Verstärkungsfaktor ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung der Dipolmolekülkonzentration oder - bei bekannter Konzentration - des Dipolmoments empfindli cher als die Messung bei der Dipolrelaxationsfrequenz. Insbesondere können Relaxationssignale, die sonst unter der Nachweisgrenze liegen, durch das erfindungsgemäße Verfahren erfaßbar gemacht werden.

Der Relaxationsbetrag der Ladungsträgerrelaxation wird bei Anwesenheit von Dipolmolekülen konzentrationspro portional erniedrigt, allerdings ohne den beim Verlust faktor wirksam werdenden Verstärkungsfaktor. Doch be steht auch hier der Vorteil, daß dieser Effekt bei tieferen Frequenzen als der Relaxationsfrequenz des Dipolmoleküls detektiert werden kann. Wenn beispiels weise Dipolmoleküle in einer wäßrigen Flüssigkeit auf gelöst werden, erniedrigt sich unter den obengenannten Bedingungen der Verlustfaktor der Ladungsträgerrelaxa tion. Bei Häm-Proteinen mit Dipolmomenten von einigen hundert Debye ist es beispielsweise möglich, Konzentra tionen unter 10 µmol auf diese Art nachzuweisen. Eine interessante Anwendung des Verfahrens ist die Änderung des Dipolmoments bei enzymatischen Reaktionen, wenn z. B. das Substrat ein größeres Dipolmoment besitzt als das Produkt - oder umgekehrt. Ein Beispiel ist der Abbau von Pektinpolymeren durch Pektinase.

Es ist bekannt, daß bei gewissen Enzymen das Dipolmo ment eine Rolle spielt bei der Bildung eines zeitweili gen Komplexes zwischen Enzym und Ligand (z. B. Sub strat). In diesen Fällen ändert sich das Dipolmoment. Dies ist z. B. der Fall bei der Bildung eines Komplexes zwischen dem Enzym Cytochrom-c-Oxidase und dem Substrat Cytochrom c. Eine Erniedrigung des Dipolmoments kann in diesem Fall durch einen Anstieg des Verlustfaktormaxi mums der Ladungsträgerrelaxation nachgewiesen werden.

Damit kann über die Konzentration des Zwischenzustandes die Substratkonzentration gemessen werden. Auch Dipol änderungen von Enzymen infolge von Redoxreaktionen sind auf diese Weise nachweisbar.

Bei genügend hoher Empfindlichkeit der dielektrischen Meßanordnung und genügend hoher Konzentration der Enzy me (bzw. der mit einem Dipolmoment behafteten Moleküle) lassen sich solche Änderungen des Dipolmoments auch direkt (d. h. bei der Relaxationsfrequenz des Enzyms bzw. Dipolmoleküls) erfassen. Wenn dies möglich ist, kann man beide Signale verwenden, d. h. das direkte und das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren über die Ände rung des niederfrequenten Relaxationssignals ermittelte Signal, so daß die Werte redundant und somit mit höhe rer Meßsicherheit gemessen und eventuelle Störeffekte ausgeschaltet werden können.

Eine andere Anwendung ist der Nachweis von Antigen- Antikörperkomplexen, insbesondere in Form eines Immun sensors.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es erforderlich, daß die Ladungsträgerrelaxationsfrequenz kleiner als die Dipolrealaxationsfrequenz ist. Dabei sind besonders kleine Werte meßtechnisch von Vorteil:
Eine Erniedrigung der Ladungsträgerrelaxationsfrequenz kann z. B. durch eine geeignete Geometriewahl der kapa zitiven Sonde erfolgen. Dabei sollte insbesondere das Verhältnis der Kapazität der Flüssigkeit zu der Kapazi tät der Isolierschicht klein sein. Eine andere Methode ist die Verringerung der Ionenkonzentration mittels Elektrodialyse. Dabei müssen die Elektrodialysemembra nen (oder eine Kombination von Elektrodialysemembranen mit Ultrafiltrations- oder Hyperfiltrationsmembranen oder Dialysemembranen) so gewählt werden, daß die Di polmoleküle selbst zurückgehalten werden.

Wenn es bei genügend hohem Frequenzabstand zwischen Ladungsträger- und Dipolrelaxation nur darum geht, die Ladungsträgerrelaxation nach tieferen Frequenzen (in einem bequemeren Meßbereich) zu verschieben, kann man die Viskosität eines Mediums erhöhen, indem man bei spielsweise viskositätserhöhende Substanzen zufügt, z. B. (vorzugsweise ungeladene) Polymere wie etwa Poly ethylenglykol oder (vorzugsweise ungeladene) Füll stoffe, um dadurch die Relaxationsfrequenz zu tieferen Frequenzen zu verschieben.

Eine andere Möglichkeit der gezielten Frequenzverschie bung ist die Verbindung von Gelen im kapazitiv erfaßten Meßraum. Dazu kann man bekannte Gele einsetzen, die man zur Immobilisierung von Enzymen verwendet.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des all gemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbei spielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung exemplarisch beschrieben, auf die im übrigen bezüglich der Offenbarung aller im Text nicht näher erläuterten erfindungsgemäßen Einzelheiten ausdrücklich verwiesen wird. Es zeigt

Fig. 1 die Verlustfaktorbande für Ladungsträgerrela xation,

Fig. 2 die Kurve in Fig. 1 in logarithmischer Darstel lung,

Fig. 3 die Änderung der Kapazität C, und

Fig. 4 und 5 zwei Beispiele für die Verlustfaktorbande.

Fig. 1 zeigt exemplarisch die Verlustfaktorbande D für Ladungsträgerrelaxation in einem Fluid als Funktion der Frequenz f. Die Verlustfaktorbande D weist bei ca. 2 kHz ein Maximum auf, dessen Höhe von der Anwesenheit von Molekülen mit Dipolmomenten abhängt. Die gestri chelte Kurve gibt den Fall an, daß keine Moleküle mit einem Dipolmoment in das Fluid eingebracht sind, wäh rend die ausgezogene Kurve den Fall zeigt, daß Molekü le mit einem Dipolmoment von 350 D mit einer Konzentra tion c von 10 µmol/l vorhanden sind. Der Unterschied des Signals ist hier wesentlich größer als bei der eigent lichen Dipolrelaxationsfrequenz (hier bei 10⁷ Hz).

Fig. 2 zeigt die in Fig. 1 dargestellte Kurve in loga rithmischer Auftragung der Verlustfaktorbande D, um das Dipolrelaxationsmaximum besser sichtbar zu machen.

Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Kapazität C der kapa zitiven Anordnung von der Frequenz.

Im folgenden sollen zwei numerische Beispiele zur wei teren Erläuterung der Erfindung beschrieben werden:

Beispiel 1

Eine kapazitive Meßsonde mit einem Plattenabstand von 2 mm und einer Isolatorschicht von ca. 10 nm taucht in Wasser geringer Ionenkonzentration (Leitfähigkeit ca. 10^-4 S/m). Fig. 4 zeigt, daß dabei ein Verlustfaktor maximum von D_m = 5,1 bei 2,5 kHz auftritt. Durch die Zugabe von Cytochrom c wird das Verlustfaktormaximum erniedrigt auf 3,5. Die Erniedrigung des Verlustmaxi mums entspricht einer Dipolkonzentration von 150 µmol/l.

Beispiel 2

Fig. 5 zeigt, daß in einer 0,5%igen Pektinlösung ein Verlustsignal D_max=4,9 mit der Meßsonde von Beispiel 1 gemessen wird. Nach Zugabe Pektinase (Konzentration in der Lösung ca. 2 µmol/l) steigt das Signal auf 5,4 an. Bei zehnfach höherer Pektinasemenge erhält man den gleichen Signalzuwachs, d. h. in beiden Fällen erfolgte eine vollständige Umsetzung des Pektins. Durch den Ab bau des Pektins wird das gesamte wirksame Dipolmoment erniedrigt. Der Effekt kann dadurch vergrößert werden, daß die entstehenden Pektinmonomere durch eine selekti ve Membran entfernt werden und ihr Dipolmoment nicht mehr zum Signal beiträgt. Auf diese Weise kann man eine Nachweisempfindlichkeit von ca. 0,5 mmol/l (bezogen auf das Monomer) erreichen.

Durch Änderung der Geometrie der kapazitiven Sonde (Kapazitätserniedrigung bei Erhöhung der Kapazität der Isolierschicht) kann die Nachweisgrenze unter 100 µmol/l gesenkt werden.

Claims

1. Verfahren zur Messung des Dipolmoments von in einem Fluid eingebrachten Molekülen und/oder der Konzentration von Molekülen mit einem Dipolmoment in einem Fluid, bei dem

- eine kapazitiven Anordnung verwendet wird, in die das Fluid eingebracht wird, und die Elektroden auf weist, die zur Isolation gegen das Fluid mit einer Isolationsschicht versehen sind, und an die ein elek trisches Wechselfeld angelegt ist, dessen Frequenz variiert werden kann,
- in das Fluid Ladungsträger eingebracht werden, deren Relaxationsfrequenz kleiner als die der ein Di polmoment aufweisenden Moleküle ist, und
- aus der Änderung der in Abhängigkeit von der Fre quenz gemessenen Dielektrizitätszahl aufgrund der Di polmomente aufweisenden Moleküle die Größe des Dipol moments bzw. die Konzentration der Moleküle bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die komplexe Dielektrizi tätszahl oder aus ihr abgeleitete Größen im Bereich der Ladungsträgerrelaxationsfrequenz erfaßt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung des Verlust faktormaximums im Bereich der Ladungsträgerrelaxations frequenz erfaßt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung des Realteils der Kapazität der kapazitiven Anordnung im Frequenz bereich oberhalb der Ladungsträgerrelaxationfrequenz erfaßt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als mit einem Dipolmoment behaftete Substanzen Substrate oder Produkte einer enzymatischen Reaktion gemessen werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als mit einem Dipolmoment behaftete Substanzen Enzyme in verschiedenen Zustands formen, wie Grundzustand und Zwischenzustand, gemessen werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als mit einem Dipolmoment behaftete Substanzen ein Enzym im Grundzustand und ein Enzym in Form eines Komplexes mit einem Reaktanden gemessen wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als mit einem Dipolmoment behaftete Substanzen ein Enzym in oxidierter oder redu zierter Form gemessen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als mit einem Dipolmoment behafteten Substanzen Antigene, Antikörper und Antigen- Antikörper-Komplexe gemessen werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluid Wasser und als Ladungsträger Elektrolytionen verwendet werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluid eine organische Flüssigkeit und als Ladungsträger Ionen und/oder geladene Komplexe verwendet werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Ladungsträger Polyelek trolyte verwendet werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine kapazitive Anordnung verwendet wird, bei der das Verhältnis der Kapazität des Fluids zu der Kapazität der Isolierschicht klein ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reduzierung der La dungsträgerrelaxationsfrequenz die Ionenkonzentration mittels Elektrodialyse verringert wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reduzierung der La dungsträgerrelaxationsfrequenz dem Fluid viskositäts erhöhende Substanzen zugesetzt sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß in die kapazitive Anordnung Gele zur Verschiebung der Relaxationsfrequenz einge bracht werden.