DE19826617C1 - Verfahren zur Herstellung von Immunosensoren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Immunosensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Gasen und Flüssigkeiten mittels des massensensitiven QCM-Prinzips sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung. Die Oberfläche solcher Sensoren werden mit dicken Schichten aus Polystyren und einer makrocyclischen Verbindung (Calixarene) belegt, welche die adsorptive Kopplung mit Immunreagenzien wesentlich verbessert und zugleich als Passivierung der verwendeten Silberelektroden beiträgt. Immunosensoren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind, eignen sich für den Einsatz in der chemischen und medizinischen Analytik.

Description

Die Erfindung betrifft einen Immunosensor zur Bestimmung spezifischer Komponenten in Proben gemäß dem Gattungsbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Immunosensors. Mit dem Immunosensor ist die qualitative und quantitative Bestimmung derartiger Komponenten in flüssigen oder gasförmigen Proben möglich.

Unter einem glasartigen Polymer sollen nachfolgend Polymere verstanden werden, deren Glasübergangstemperaturen höher als 30°C liegen.

Immunosensoren auf der Basis der Quarzkristall-Mikrowägung (QCM), bei denen die Bindungspartner an eine dünne, auf einen AT-Schnitt-Quarz aufgebrachte Polystyrol-Schicht gekoppelt sind, sind bekannt [z. B.: K. Yokoyama et al., Analytica Chimica Acta 304 (1995) 139- 145]. Durch das Erzeugen eines elektrischen Feldes wird bei einem derartigen Immunosensor der Quarz zu Dickenscherschwingungen angeregt. Chemische Wechselwirkungen zwischen den an die Polystyrol-Schicht gekoppelten Bindungspartnern und den Analyten aus einer Gas- bzw. Flüssigphase bewirken eine Massenänderung bzw. Änderung viskoelastischer Eigenschaften der Schichten. Dies führt zu meßbaren Verschiebungen der Resonanzfrequenz des Quarzes.

Es ist auch bereits ein Chemischer Sensor bekannt [X. C. Zhou et. al., Detection of organic amines in liquid with chemically coated quartz crystal microbalance devices, Sensors and Actuators B 42 (1997) 137-144], bei dem statt der Polystyrol-Schicht eine Calixaren-Schicht verwendet wird. Die als Käfigverbindungen bekannten Calixarene sollen bei diesem Sensor eine direkte Wechselwirkungen mit den zu detektierenden Aminen aus Flüssigkeiten eingehen. Der Nachteil eines derartigen Sensoraufbaus gegenüber Immunosensoren ist, daß die Calixarene nicht in der Lage sind, spezifische Wechselwirkungen mit den Analyten einzugehen.

Eine interessante und erfolgversprechende Anwendung von Immunosensoren ist das Monitoring von supramolekularen Wechselwirkungen zwischen den auf der Sensoroberfläche immobilisierten Bindungspartnern (Immunrezeptoren) und bioorganischen Substraten in wäßrigen Lösungen oder Körperflüssigkeiten. Der breite Einsatz von Immunosensoren mit massesensitivem Schwingquarz wird bisher durch die relativ geringe Empfindlichkeit derartiger Sensoren begrenzt, die hauptsächlich durch die geringen Bindungskräfte der verwendeten Polymerschichten bedingt ist.

Zudem erscheint die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse durch ungleichmäßige dünne Schichten auf den Sensoren [K. Yokoyama et al.] zu gering.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Immunosensor des im Gattungsbegriff des Anspruchs 1 beschriebenen Typs mit verbesserter Empfindlichkeit sowie homogenere Sensoroberflächen herzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen Immunosensor gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren zur Herstellung dieses Immunosensors nach Anspruch 5 gelöst. Vorzugsweise Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die in die Polymerschicht eingemischten makrocyclischen Verbindungen ermöglichen parallel zur Oberflächenversiegelung der Quarzoberfläche und der Silberelektroden die Einbringung einer zusätzlichen Anzahl reaktiver Endgruppen, wodurch sich die adsorptive Kopplung zwischen Polymerschicht und Biomolekülen durch starke zwischenmolekulare Wechselwirkungen verbessert. Gleichzeitig wird eine hohe Moleküledichte und eine homogene Verteilung der Biomoleküle auf der Sensoroberfläche erreicht.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform sind die in die Polymerschicht eingemischten makrocyclischen Verbindungen Calixarene. Calixarene zeichnen sich durch eine große Anzahl chemisch gut modifizierbarer Endgruppen aus, so daß durch diese Verbindung eine große Anzahl von Hydroxyl-, Carboxyl- oder Aminogruppen in der Polymerschicht geschaffen werden. Durch diese chemischen Modifizierungen an der Polymeroberfläche wird die Bindungsaffinität zu der Biomolekülen erhöht (Immobilisierung der Biomoleküle), ohne das sich die physikochemischen oder akustischen Eigenschaften der Polymerschicht auf der Sensoroberfläche verändern. Etwaige unbesetzte Bindungstellen werden anschließend durch Blockierung mit selektiven Blockierungsreagenzien, z. B. niedrigmolekularen Proteinen, inaktiviert. Nach entsprechender Trocknung ist der erzeugten Immunosensor auch in der Gasphase verwendbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine technologisch sehr kostengünstige und gut standardisierbare Vorgehensweise aus, die eine Serienfertigung dieser Sensoren ermöglicht.

Der erfindungsgemäße Immunosensor ermöglicht die Verwendung kostengünstiger AT- Schwingquarze mit beiderseitig aufgedampften Silberelektroden, weil die dicke Polymerschicht die Rauhigkeit der Quarzoberfläche egalisiert und gleichzeitig eine Passivierung der Silberelektrode gegenüber einer Oxidation durch Luftsauerstoff bewirkt. Mit Hilfe dieser homogenen Schicht ist eine weitere chemische Oberflächenmodifizierung im Sinne einer Bioimmobilisierung möglich. Anderseits ist das Betreiben der Quarz-Sensoren mit Polymeren im µm-Schichtdicken-Bereich durch die Verwendung glasartiger Polymere gewährleistet, da sich dadurch die Güte der Sensoren in Gasen und in Flüssigkeiten nicht wesentlich ändert.

Im folgenden ist die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispieles unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen mit weiteren Einzelheiten näher erläutert.

Dabei zeigen

Fig. 1 die Frequenzänderung während der Anti-Insulinimmobilisierung auf dem Quarz bei drei verschiedenen Anti-Insulinzugaben,

Fig. 2 die Frequenzänderung infolge der Sensorreaktion durch Antikörper gegen Insulin bei drei verschieden behandelten Quarzen

Für den Aufbau einer Meßeinrichtung mit einer Meßzelle unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immunosensors wurden wesentliche Komponenten eines QCM- Flüssigkeitsmeßsystems verwendet, deren detaillierte Beschreibung bereits veröffentlicht wurde [R. Lucklum et al. Sens. Act. B35-36 (1996) 103-11].

Die Meßeinrichtung enthält neben den erforderlichen Baugruppen zur digitalen Frequenzauswertung auch die dazugehörige Oszillatorelektronik [B. Adler et al. DE 195 22 278 A1 (06.05.1996)] und einen AD-Umsetzer für zwei Temperaturfühler. Das Meßeinrichtung ist so gestaltet, daß der parallele Betrieb von mehreren Schwingquarzen möglich ist. Durch diese Anordnung ist die Erfassung mehrerer Analyte bzw. der Ausgleich von Veränderungen der Viskosität, der Ionenstärke oder des pH-Wertes im umgebenden Medium möglich.

Als Quarztypen kamen 5-25 MHz AT-Schnitt-Quarze im HC-49-Gehäuse zum Einsatz. Zur Herstellung des Ausgangsproduktes für die aufzubringende Polymerschicht wurde Polystyrol in Chloroform gelöst und dieser Lösung etwa 1-20 Masse-% Calixarene (bezogen auf die Polystyrol-Masse) zugesetzt. Dieses Gemisch wurde auf die Quarzoberfläche und die Silberelektroden so aufgebracht, daß nach der Lufttrocknung eine glatte und homogene Polymerschicht mit einer Dicke von ca. 1 bis 4 µm vorlag.

In der Meßzelle wurde humanes Insulin oder ein monoklonaler Antikörper gegen humanes Insulin durch Inkubation in Karbonatpuffer (pH 9,5) an der wie vorstehend beschriebenen präparierten Polymerschicht immobilisiert. Die Frequenzänderung während des Immobilisierungsprozesses ist in Fig. 1 für drei verschiedene Anti-Insulinzugaben dargestellt. Die Anti-Insulinzugaben betrugen 10 µg/ml an Quarz 1; 4 µg/ml an Quarz 2 und 4,3 µg/ml an Quarz 3. Anschließend wurden freie Bindungsstellen durch Inkubation mit 1% Rinderserumalbumin blockiert.

Bei der folgenden Inkubation mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper (10 µg/ml) gegen humanes Insulin kommt es zur spezifischen Wechselwirkung mit dem immobilisierten Insulin und damit zur Masseanlagerung am Immunosensor. Diese Veränderung wurde anhand der Verringerung der Resonanzfrequenz quantifiziert. Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf dieser Frequenzänderung für drei verschieden behandelte Quarze: Quarz 1 mit immobilisiertem Insulin, Quarz 2 ohne immobilisiertes Insulin und Quarz 3 mit immobilisiertem Antikörper gegen Insulin. In parallelen Mesungen konnte keine unspezifische Bindung des Insulins an Quarzoberflächen ohne Antikörper nachgewiesen werden.

Die Nachweisempfindlichkeit des Immunosensor kann durch eine sekundäre Immunonreaktionen weiter gesteigert werden, indem in die Meßzelle mit dem Immunosensor zusätzlich an Mikropartikel gebundene sekundäre Immunoreagenzien eingeleitet werden.

Claims (5)

1. Immunosensor zur Bestimmung spezifischer Komponenten in Proben, mit mindestens einem massesensitiven Schwingquarz, auf dessen Oberfläche eine dünne Schicht eines glasartigen Polymers, z. B. Polystyrol, aufgebracht ist, an die spezifische Bindungspartner für die jeweils nachzuweisenden spezifischen Komponenten gekoppelt sind, dadurch gekennzeichnet, daß in die dünne Polymerschicht eine oder mehrere makrocyclische Verbindungen eingemischt sind.

2. Immunosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die makrocyclischen Verbindungen Calixarene sind.

3. Immunosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der massesensitive Schwingquarz ein AT-Schnitt-Quarze mit beidseitig aufgedampften Silberelektroden ist.

4. Immunosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichtdicke des glasartigen Polymers etwa 1 bis 4 µm beträgt.

5. Verfahren zur Herstellung eines Immunosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen Biomoleküle durch adsorptive oder kovalente Kopplung an die Polymerschicht gebunden werden und anschließend unbesetzte Bindungsstellen durch Aufbringen nicht selektiver Blockkierungsreagenzien besetzt werden.