DE4033042A1

DE4033042A1 - Verwendung von 4,5 - disubstituierten imidazolen zur herstellung von antimykotischen oder fungiziden mitteln

Info

Publication number: DE4033042A1
Application number: DE19904033042
Authority: DE
Inventors: Otto Prof Dr Mueller; Calum Mackellar
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-18
Filing date: 1990-10-18
Publication date: 1992-05-07
Also published as: DE4042492C2; DE4033042C2

Description

Der menschliche, tierische und pflanzliche Organismus kann von verschiedenen Mikroorganismen befallen werden. Die pathogenen Mikroorganismen, zur Hauptsache Bakterien, Viren und Pilze, rufen eine große Anzahl von Infektionskrankheiten hervor.

Die pathogenen Pilze befallen zur Hauptsache beim Menschen Haut und Schleimhaut. Aus diesem Grunde sind die Dermatomykosen die häufigste Erscheinungsform dieser Erkrankung. Hierbei sind die Tinea, Candidosis (Soor) und Pityriasis zu nennen. Neben diesen Erkrankungen nehmen die Endomykosen, der Befall innerer Organe mit pathogenen Pilzen, immer mehr zu. Dies liegt zum Teil darin begründet, daß insbesondere Patienten, die unter einer Abwehr schwäche leiden, an diesen Sekundärinfektionen erkranken.

Patienten der Abdomialchirugie, Tumorpatienten, Patienten mit polytraumatischen Erkrankungen und Patienten, die unter einer Immunschwächekrankheit leiden (genetisch oder viral bedingt), gehören mit zu den Hauptangriffszielen der pathogenen Pilze.

Auch medikamentöse Behandlungen, die das natürliche Gleichgewicht zwischen Bakterien und Pilzen stören, z. B. die Behandlung mit antibiotischen Substanzen, die Anwendung oraler Kontrazeptiva (Soor - Vaginitis) und die Behandlung mit Corticosteoriden, führt in der Folge häufig zu Pilzinfektionen.

In der Bundesrepublik Deutschland sind jährlich mit rund 36 000 systemischen Pilzerkrankungen zu rechnen, von denen jährlich 7000-8000 (ca. 20%) letal ausgehen werden. Dies geschieht in Ermangelung einer erfolgreichen Therapie.

Die momentan eingesetzten Medikamente sind mit einer Vielzahl von Neben- und Wechselwirkungen behaftet, so daß eine Behandlung zur Hauptsache nur stationär durchgeführt werden kann. Bei den Wirkstoffen handelt es sich häufig um 1-substituierte Imidazole.

Die systemisch angewandten 1-Imidazole Ketoconazol und Miconazol weisen verschiedene Nebenwirkungen auf (nach Ammon):

1) Thrombophlebitis an der Injektionsstelle
2) Appetitlosigkeit
3) Übelkeit
4) Erbrechen
5) Magenbeschwerden
6) Diarrhoe
7) Pollakisurie
8) Dysurie
9) Albuminurie
10) Hyponatriämie
11) Leberfunktionsstörungen
12) Anstieg des Serumcortisolspiegels
13) Müdigkeit und toxische Psychosen (Clotrimazol)
14) Blutbildveränderungen durch Miconazol (Anämie, Neutropenie, Thrombopenie, Thrombozytose)
15) Atem- und Herzstillstand
16) letale Leberfunktionsstörungen bei Ketoconazol, daneben sind weiterhin möglich:
- a) Gynäkomastie
- b) Oligospermie
- c) Libidoverlust
- d) Haarausfall (Testosteronbildungshemmung)
- e) Cortisolproduktionshemmung
- f) Arthralgien
- g) Myalgien

Alle diese Nebenwirkungen erfordern bei einer systemischen Therapie mit Clotrimazol, Ketoconazol und Miconazol eine kli nische Überwachung der Patienten. Schwangere oder Personen mit diagnostizierten Leberfunktionsstörungen sollten einer Therapie mit diesen Substanzen nicht unterzogen werden.

Aufgabe dieser Erfindung ist es deshalb, neue Wirkstoffe zur Behandlung bereitzustellen, die gegenüber den bekannten anti mykotischen Substanzen gesteigerte Wirksamkeit aufweisen und die geringere oder keine Nebenwirkungen aufweisen. Außerdem sollten die Wirkstoffe universell einsetzbar sein, d. h. sie sollen gegen eine Vielzahl von Pilzen, Bakterien und Hefen wirksam sein. Die aufbereiteten Arzneiformen sollen sich gegen die verschiedensten Erscheinungsformen von Mykosen oral, topisch und parenteral anwenden lassen.

Diese Aufgabe wird durch 4,5-disubstituierte Imidazole der allgemeinen Strukturformel I gelöst,

worin R und R′ Alkyl- (1-10 Kohlenstoffatome ), Aryl-, Halogenyl-, N-Verbindungen, S-Verbindungen, Carbonyl-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heterocyclen-, und die Kombination aus den genannten Resten darstellen können.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß 4,5-disubstituierte Imidazole der Formel I eine ausgezeichnete antimikrobielle Wirk samkeit gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen zeigen. So wurde z. B. bei der Untersuchung von 4,5-Di-n-hexylimidazol mittels Agardiffusionstest festgestellt, daß die Substanz wirksam war gegen

a) Pilze der Gattungen Penicillium
b) Pilze der Gattungen Fusarium
c) pathogene Hefen

Diese in vitro gefundenen Wirksamkeiten rechtfertigen den Schluß, daß diese Eigenschäften ebenfalls in vivo anzutreffen sind. Auf Grund dieser Wirsamkeiten ist somit zu erwarten, daß die 4,5-disubstituierten Imidazole der allgemeinen Formel I therapeutisch gegen die verschiedensten Erscheinungsformen von Pilz-, Bakterien- und Hefeinfektionen anzuwenden sind, wie z. B.

a) Soor
b) Windeldermatitis
c) Genitalmykosen
d) Balanitis
e) Balanoposthitis
f) Perlèche
g) Analekzem
h) Kolpitis
i) Hefe-Meningitis
j) Hefe-Encephalitis
k) europäische Blastomykose
l) Gallenblasenmykosen
m) Darm- und Magenmykosen
n) Vaginamykosen
o) Gehörgangekzeme
p) Lungenaspergillose
q) Penicillosen

Ferner ist zu erwarten, daß die 4,5-disubstituierten Imidazole der Formel I durch die verschiedenen Arzneiformen an den Wirkort gebracht werden können.

Bei den festen Arzneiformen sind hier insbesondere Pulver, Puder Tabletten, Kapseln und Dragees zu nennen.

Die peroralen Depotarzneiformen Kapseln (Hart- und Weichgelatine kapseln), Zäpfchen, Vaginalkugeln und Arzneistäbchen stellen weitere Formen der Anwendung dar.

Bei den halbfesten Arzneiformen Salben und Cremes (Lipogele, Emulsionsgele, PEG-Gele, Hydrogele, Augensalben und Spezial salben) sind weitere Anwendungsmöglichkeiten vorhanden. Zu er wähnen wären weiterhin Pasten und Pflaster.

Eine weitere Gruppe stellen die Lösungen, Emulsionen und die Sus pensionen dar. Um Organmykosen wirksam behandeln zu können, muß auf die Gruppe der Injektions- und Infusionslösungen verwiesen werden. Bei der Behandlung von Lungenmykosen sind Aerosole und Inhalate angebracht. Zur Behandlung von Pilzerkrankungen am Auge sind Augentropfen und Augenwässer zu erwähnen.

Da Imidazolderivate auch gegen Bakterien und Dermatophyten wirk sam sind, lassen sich auf Grund dieses Wirkungsspektrums die Anwendungsmöglichkeiten stark erweitern.

Da auf Grund der enormem Wirksamkeit die verabreichte Dosis z. B. des 4,5-Di-n-hexylimidazol sehr gering gehalten werden kann, kann damit gerechnet werden, daß sich die Nebenwirkungen einer Therapie mit dem erfindungsgemäßen Wirkstoff im Vergleich zu den Wirkstoffen des Standes der Technik beträchtlich verringern, damit Personen therapiert werden können, die von einer Imidazolbe handlung bisher ausgeschlossen waren, wie z. B. Schwangere und Personen mit Leberfunktionsstörungen.

Da z. B. bei 4,5-Di-n-hexylimidazol in starker Verdünnung (1,7×10^-6 Mol/ml) eine starke antimykotische Wirkung nach gewiesen werden konnte, ist zu erwarten, daß

a) allergische Reaktionen
b) Myalgien
c) Wirkung auf das zentrale Nervensystem
d) Thrombophlebitis
e) Störung der Hämatopoese
f) Gastrointestinale Beschwerden bei oraler Anw.
g) Appetitlosigkeit
i) Gynäktomastie
j) Hemmung der Spermatogenese
k) Anstieg des Serumcortisonspiegel
l) Exantheme
m) lokale Reizung und Haarausfall
n) Gelenkschmerzen
o) Herz- und Atemstillstand

zurückgehen oder überhaupt nicht mehr auftreten.

Die 4,5-disubstituierten Imidazole der Formel I können nicht nur zur Herstellung von Antimykotika verwendet werden, sondern auch zur Herstellung von anderen fungiziden Mitteln, wie z. B. von Holzschutzmitteln gegen Schimmelbefall, von Pflanzenschutz mitteln, von Konservierungsmitteln für Saatgut und als fungi zide Farben in der Farbstoffindustrie.

Ferner können die 4,5-disubstituierten Imidazole der Formel I in der Waschmittelindustrie und in der Kosmetikindustrie zur Herstellung fungizider Wasch- und Pflegemittel verwendet werden.

Alle übrigen Bereiche, die zur Bekämpfung von Pilzen und Hefen wirksame Mittel nötig haben ( z. B. Tropenanwendung ), stellen weitere Anwendungsmöglichkeiten der 4,5-disubstituierten Imidazole dar.

Die Erfindung hat dadurch nicht nahegelegen, da 4,5-disubsti tuierte Imidazole als Histamin-H₂-Antagonisten in der Ulkus therapie eingesetzt werden. Die Anwendung zeigt bei bestimmungs gemäßen Gebrauch keinerlei toxischen Effekte. Über die Biotrans formation dieser Stoffe gibt es zahlreiche Untersuchungen. Aus dieser Indikation läßt sich nicht schliessen, daß diese Sub stanzen auch für den hierin genommenen Zweck, nämlich für die Verwendung als Antimykotika, wirksam sind.

Die Darstellung der 4,5-disubstituierten Imidazole erfolgt nach bekannten Verfahren, wie sie z. B. bei H. Bredereck, Chem. Ber. 86, 93 (1953) beschrieben sind.

Nachfolgend wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und Versuchen näher beschrieben. Die im Test genannten Pilze und Hefearten wurden wie folgt getestet:

Bestimmung der antimykotischen Aktivität

Die Prüfung der antimykotischen Aktivität erfolgt mit dem Platten verdünnungstest. Bei dieser Methode wird das Antimykotikum in einer Reihe von abgestuften Konzentrationen einer Agarplatte mit dem zu untersuchenden Bakterien- oder Pilzstamm gegeben, die dann bebrü tet wird. Die niedrigste Konzentration, die das Anwachsen des In okulums verhindert, wird als minimale Hemmkonzentration (MHK) bezeichnet.

Agardiffusionstest

Das Prinzip dieses Tests ist, daß eine Substanz von dem Auf tragspunkt aus dem Agar diffundiert, der vorher mit einem Mikro organismus beimpft wurde. Für das Einbringen der Substanz auf die Agarplatten wurde der Lochplattentest benutzt. Mit einem abge flammten Korkbohrer (d = 4 mm) wird ein Loch in den Agar ge stanzt, das Agarscheibchen entfernt und das entstandene Loch mit einem genau abgemessenen Volumen des zu testenden Antimykotikums gefüllt. Der Wirkstoff diffundiert langsam entsprechend der Kon zentration und den Substanzeigenschaften in den Agar ein.

Die Größe bzw. der Durchmesser nach der Bebrütung des auf der Agarplatte entstehenden Hemmhofes ist proportional zu der Em pfindlichkeit des geprüften Stammes gegenüber dem entsprechenden Chemotherapeutikum.

Bei quantitativen Untersuchungen mit dem Agardiffusionstest muß wegen der vielen äußeren Einflüsse nicht nur eine Standardi sierung der Versuchsbedingungen erreicht werden, sondern auch bei jedem Ansatz ein interner Standard mitgeführt werden.

Bestimmung der antimykotischen Aktivität

Zur Ermittlung der Quantifizierung der in vitro bakteriellen und mykotischen Wirkung wurden der Diffusionstest, der im Ver gleich mit anderen Produkten ein Maß für die Aktivität darstellt, und der Reihenverdünnungstest, der ein quantitatives Ergebnis für eine einzelne Substanz liefert, gemacht. Bei beiden Methoden mißt man die Hemmhöfe, wobei bei dem Reihenverdünnungstest eine geo metrische Verdünnungsreihe der zu prüfenden Substanz auf der Agar platte hergestellt wird.

Benutzte Lösungen und Agarplatten Kimmig Agarplatten

50 g Kimmig-Agar ( Pilzagar der Firma Merck Nr. 5414 ) werden in einem Liter destilliertem Wasser und 5 ml Glycerin suspendiert. Danach wird die Mischung unter häufigen Umschütteln bis zur voll ständigen Lösung im siedendem Wasserbad erhitzt. Die Sterili sation erfolgt im Autoklaven (15 Minuten bei 121 grd. C).

Das Agar wird heiß in die Petrischalen pipettiert (20 ml) und danach 24 Stunden gekühlt.

Sabouraud-4%-Glucose-Agarplatten

65 g Sabouraud-Agar (Pilzagar der Firma Merck Nr. 7315) werden in einem Liter destilliertem Wasser bis zur vollständigen Lösung im siedenden Wasserbad erhitzt. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven (15 min. bei 121 grd. C ).

Das Agar wird heiß in die Petrischalen gefüllt (20 ml ) und 24 Stunden gekühlt.

Flüssiges Medium

1,5 g Yeast extract (Fa. Difco)
3,0 g Bacto-Pepton (Fa. Difco)
3,0 g D-Glucose
0,75 g CaCO₃
0,15 g KH₂PO₄
0,15 g KNO₃
150 ml dest. H₂O

Die Mischung wird im Autoklaven sterilisiert (15 min. bei 121 grd C).

Flüssiges Agar

5,0 g Bacteriological-Pepton (Fa. Oxoid L37),
5,0 g Trypticase (Fa. Oxoid L37),
20,0 g D-Glucose,
1000 ml bidest. H₂O.

Durchführung

Die gesamte Aufarbeitung muß unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Tag

Von einer Sabouraud-Agarplatte, die mit dem entprechenden Pilz bewachsen ist, werden drei kleine Agarteilchen entnommen und in 50 ml eines flüssigen Mediums überimpft, das sich in einem 100 ml Schüttelkolben befindet. Die Mischung wird dann 60 h bei 27 grd C gerührt.

3. Tag

Von dem geschüttelten, pilzhaltigen, flüssigen Medium werden 10 ml entnommen und in 40 ml neues flüssiges Medium in einen 100 ml Schüttelkolben gegeben. Die Lösung wird dann weitere 24 Stunden bei 27 grd C gerührt.

4. Tag

Um den Hemmhoftest zu machen, werden 100 µl des erhaltenen Pilzmediums auf Kimmig-Agarplatten mit dem Drigalski-Spatel plattiert. Die Petrischalen werden dann 6 Minuten bei 60 grd C erwärmt und ca. 3 Stunden stehengelassen. Um die Löcher zu machen werden mit Hilfe eines sterilen Korkbohrers 6 Löcher von 4 mm Durchmesser kreisförmig angeordnet. In jedes Loch werden dann mit einer Eppendorfpipette 20 µl einer wäßrigen oder Agarlösung, die das Antimykotikum enthält, zugegeben. Diese Lösungen werden vorher mit Essigsäure (100%) oder Ammoniak (25%) neutralisiert. Als Vergleich befindet sich auf jeder Platte ein Loch mit Nystatin (10 mg/ml Flüssigagar). Nach drei Stunden werden die Petrischalen umgekehrt im Brut schrank bei 30 grd C gelagert. Dabei muß beachtet werden, daß die Pilze Sauerstoff brauchen und die Deckel der Platten nicht ganz geschlossen sind. Nach 16 Stunden können die Hemmhöfe ge messen werden. Zu jeder Platte wird parallel eine zweite Platte in gleicher Weise hergestellt, um eine Durchschnittsbildung durchführen zu können.

Minimale Hemmkonzentrationen ermittelt nach dem Agardiffusionstest

Die im Agardiffusionstest ermittelten minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) werden in folgender Tabelle aufgelistet. Die Substanz 4,5-Dihexylimidazol (Beispiel für ein 4,5-disubstituiertes Imidazol) wird mit Substanzen des Standes der Technik verglichen.

Der mit pathologischen Hefen durchgeführte Test zeigte auf der Agarplatte starke Hemmwirkung.

Trotz der Kleinheit des Moleküls (Molekulargewicht: 236,403), läßt sich im Vergleich zu den Substanzen des Standes der Technik (Clotrimazol Molekulargewicht: 344,84, Nystatin Molekulargewicht: 926,107) eine erhöhte Wirksamkeit feststellen. Hingewiesen werden muß außerdem auf die Halogenfreiheit, die gute Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln und die geringe Toxizität der Substanz. Weitere Punkte sind:

1) Di-n-hexylimidazol besitzt eine rund doppelte Wirksamkeit im Vergleich zu Nystatin (Konzentrationsvergleich).
2) Der Vergleich mit Clotrimazol zeigt eine um rund zwanzigfache erhöhte Wirksamkeit von Di-n-hexylimidazol (Konzentrationsvergleich).
3) Diese in vivo gefundenen Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß mit 4,5-disubstituierten Imidazolen auch in vivo bessere Therapieerfolge zu erwarten sind.

Tierversuche

Die an nackten Meerschweinchen (spezielle Züchtung zum Test antimykotischer Aktivität) durchgeführten Tierversuche zeigten erstaunliche Resultate. Nach den bekannten Methoden zum Test antimykotischer Wirkung (s. mykosen, 18 Heft 8, 1975) wurden bei den verwendeten Tieren eine vollständige Rückbildung der Pilzherde beobachtet.

Eine fünfprozentige ethanolische Lösung zeigte den besten Erfolg im Vergleich zu einer Blindlösung (ohne Wirkstoff).

Eine höhere Dosierung zeigte einen geringeren Erfolg, was eben falls auf eine ausgezeichnete Wirksamkeit des Präparates hindeutet. Die topische Anwendung des Trägerstoffes Ethylalkohol mit dem Wirkstoff, läßt ebenfalls den Schluß zu, daß weitere topische An wendungsformen zum Erfolg führen.

Die geringe Toxizität der Substanz führt zur Anwendung im paren teralen und oralen Bereich. Da bereits 4,5-disubstituierte Imidazole als Antihistaminika in der Ulkustherapie oral ein gesetzt werden, können diese Substanzen als Modelle der toxischen Wirkung herangezogen werden.

Durch den zu erwartenden geringeren Einsatz an Wirksubstanz werden die Nebenwirkungen, wie sie von Substanzen des Standes der Technik ausgehen, drastisch veringert.

Die im Tierversuch gemachten Erfahrungen, bestätigen eine völlige Beschwerdefreiheit der Versuchstiere. Somit können ebenfalls im Humanbereich Personen therapiert werden, die bislang von einer Imidazoltherapie ausgeschlossen waren.

Nachfolgend werden die Behandlungserfolge im Tierversuch durch Fotografien dokumentiert.

Claims

1. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen der allge meinen Formel I zur Herstellung von Antimykotika (Arzneimitteln), worin R und R′ Alkyl-, (verzweigte oder unverzweigte mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen), Aryl-, Halogenyl-, N-Verbindungen, S-Verbindungen, Carbonyl-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heterocyclen und die Kombination aus-den genannten Resten darstellen können. Desgleichen die Mischungen dieser 4,5-disubstituierter Imidazole zur Herstellung von topisch, oral oder parenteral anwendbarer Antimykotika oder von fungizi den Mitteln.

2. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem verwendeten Imidazol um das 4,5-Di-n-hexylimidazol handelt.

3. Verwendung von 4,9-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein fungizides Mit tel, ein Holzschutzmittel oder um ein Pflanzenschutzmittel oder um ein Konservierungsmittel für Saatgut handelt.

4. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem fungiziden Mittel um ein Wasch- oder Pflegemittel handelt.

5. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den fungiziden Wasch- oder Pflegemitteln um ein kosmetisches Wasch- oder Pflegemittel handelt.

6. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem topisch an wendbaren Antimykotikum um eine Salbe, um einen Puder, eine Lösung, eine Emulsion, eine Suspension, ein Spray, eine Paste oder um ein Pflaster handelt.

7. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem oral anwend baren Antimykotikum um eine Tablette, um eine Kapsel (Weich- oder Hartgelatinekapsel), um ein Granulat oder um ein Pulver handelt.

8. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem parenteral anwendbaren Antimykotikum um Injektionslösungen, um Infusions lösungen oder um Pflaster handelt.

9. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem am Auge an zuwendenen Antimykotikum um eine Augensalbe, ein Augenwasser oder Lösung handelt.

10. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem peroral ein gesetzten Antimykotikum, um ein Zäpfchen, um Vaginalkugeln, Arznei stäbchen oder um Kapseln handelt.

11. Verwendung von 4,5-disubstituierten Imidazolen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei an der Lunge an wendbaren Antimykotikum, um Aerosole, Sprays oder Inhalate handelt.