DE4012238A1

DE4012238A1 - Verfahren zur erhoehung der volumenbezogenen produktivitaet (g/l/d) nichtionischer biopolymere

Info

Publication number: DE4012238A1
Application number: DE19904012238
Authority: DE
Inventors: Walter Dr Lindoerfer; Kai-Udo Dr Sewe; Fritz Prof Dr Wagner; Silvia Dr Muenzer; Udo Dr Rau
Original assignee: Wintershall AG
Current assignee: Wintershall AG
Priority date: 1989-04-25
Filing date: 1990-04-14
Publication date: 1991-01-03

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der volumenbe zogenen Produktivität (g/l/d) nichtionischer Biopolymere Mit hoher spezifischer Viskosität durch Züchtung von Pilzstämmen unter Belüftung und Bewegung im Temperaturbereich zwischen 15°C und 40°C und durch Erhitzen der Kultursuspension und durch Abtrennen des gebildeten Homopolysaccharids von der Zellmasse.

Biopolymere haben im technischen Bereich vielfache Anwendung gefunden. Diese können beispielsweise als Dispergier-, Verdickungs- oder als Wasserrückhalte-Mittel, zur Herstellung stabiler Emulsionen von Tensiden und von stabilen kolloid-dispersen Lösungen eingesetzt werden.

Diese können auch als Verdickungsmittel bei Sekundär- und Tertiär-Maß nahmen beim Fluten von Erdöllagerstätten, als Dispergiermittel in land wirtschaftlichen Chemikalien, als Mittel zur Herabsetzung von Reibungs widerständen in strömenden Flüssigkeiten, sowie im Nahrungs- und Futter mittelbereich verwendet werden. Die DE-OS 36 43 467 macht ein spezielles Verfahren zur extracellulären Herstellung nichtionischer Biopolymere mit hoher spezifischer Viskosität bekannt.

Dieses Verfahren verwendet zur Züchtung der Biomasse bestimmte Pilzstämme. Aus der Kulturlösung resultieren als Metaboliten Homopolysaccharide mit praktisch nur Glucose als Monomergrundkomponente mit extrem niedrigem Restgehalt an Protein.

Von diesem Stand der Technik geht das Verfahren der Erfindung aus zur Her stellung von nichtionischen Biopolymeren mit hoher spezifischer Viskosität.

Es ist die Aufgabe des Verfahrens der Erfindung, die Verfahrensbedingungen für die Optimierung der Produktivität zu entwickeln.

Weiter ist es eine Aufgabe des Verfahrens der Erfindung, das Verfahren der DE-OS 36 43 467 verfahrenstechnisch zu verbessern und dadurch die Produktivität (g/l/d) zu erhöhen.

Die Lösung der Aufgabe der Erfindung ist im kennzeichnenden Teil des Anspruches 1 definiert.

Diese ist dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion an Homopolysaccharid in kontinuierlicher Herstellung mit folgenden Maßnahmen für sich oder in deren Kombination erfolgt:
Sauerstofflimitierung in der Zuluft unter Steigerung der Produktivität, Scherung der Zellwände unter Homogenisierung der Kultursuspension und unter Vermeidung der Pelletbildung bei der Kultivierung.

Das Verfahren der Erfindung ist alternativ und bevorzugt in den Unteran sprüchen definiert. Diese betreffen bei kontinuierlicher Prozeßführung die Sauerstofflimitierung, die Verdünnungsrate, die Scherung der erzeugten Zellmasse im Bypass mit mehrfachem Umlaufvolumen des Reaktorinhaltes.

Ferner betreffen diese die Aufrechterhaltung einer homogenen Verteilung des Pilzmycels in der Kultursuspension bei der Scherung, sowie Maßnahmen zur Stabilisierung der Produktlösung, die Druckfiltration der viskosen Produktlösung zur Abtrennung der Zellmasse.

Ferner betreffen diese den Einsatz der Pilzstämme mit der DSM-Hinterle gungsnummer 3887, 3889, 3890, 3891, 3892, insbesondere mit der DSM-Nummer 3888.

Das Verfahren der Erfindung ist auch durch den Nebenanspruch 10 ausgestaltet, welcher die Maßnahme der Scherung der Zellwände in diskontinuierlicher Arbeitsweise ohne Sauerstofflimitierung beansprucht.

Den technischen Effekt des Verfahrens der Erfindung mit Sauerstoff limitierung und mit Scherung in kontinuierlicher Durchführung zeigt die folgende Tabelle in der Kombination dieser Maßnahmen.

Kultivierungsbedingungen Prozeßführung
volumenbezogene Produktivität (g/l/d)
diskontinuierlich 0,1 V/Vm ohne Scherung
2,3
diskontinuierlich 0,1 V/Vm mit Scherung	4,0
kontinuierlich 0,1 V/Vm ohne Scherung	7,4
kontinuierlich 0,083 V/Vm mit Scherung	11,2

Beispiel 1

Dieses erläutert die Herstellung des Polysaccharids, Typ AW 114, mit dem Pilzstamm DSM 3888 in kontinuierlicher Arbeitsweise ohne Sauerstoff limitierung. Es wurde unter den in der Offenlegungsschrift 36 43 467, Beispiel 3, beschriebenen Bedingungen bei einer Begasungsrate von 0,1 V/Vm im Batch-Verfahren nach 76 h aus 10 l Kultursuspension eine Ausbeute von 72 g Polysaccharid erzielt. Diese entspricht einer Produktivität von 2,3 g/l/d.

Es wurde bei einer Verdünnungsrate von 0,068 h^-1 (die maximale Wachstumsrate beträgt 0,08 h^-1) im stationären Zustand eine Polysaccharid-Konzentration aus 4,5 g/l erhalten. Es resultiert daraus eine Produktivität von 7,4 g/l/d. Die Steigerung der Produktivität beträgt somit 320%, im Vergleich zur diskontinuierlichen Durchführung des Verfahrens.

Dieses Ergebnis mit dieser Änderung der Prozeßführung ist als überraschend zu bezeichnen.

Beispiel 2

Dieses erläutert die Herstellung des Polysaccharids, Typ AW 110, mit dem Pilzstamm DSM 3887 in kontinuierlicher Arbeitsweise unter Sauerstoff limitierung.

Es wurde die Vorkultur gemäß der Arbeitsweise der Offenlegungs schrift 36 43 467 gewonnen. Danach wurden 2 l dieser Vorkultur verwendet, um damit 20 l Nährmedium in einem Bioreaktor mit 30 l Gesamtvolumen der Firma Giovanola, Monthy, Schweiz, zu beimpfen. Der Bioreaktor war mit einem Intensor-System ausgerüstet. Das Nährmedium hatte folgende Zusammen setzung in g/1000 ml Wasser: Glukose 30, NaNO₃ 3, Hefeextrakt 1, K₂HPO₄ 1, KCl 0,5, MgSO₄ · 7 H₂O 0,5, FeSO₄ · 7 H₂O 0,05(g).

Der Pilzstamm wurde zunächst 2 Tage im Batch-Verfahren bei 22°C mit einer Begasungsrate von 0,031 V/Vm bei einem Anfangs-pH-Wert von 3,5 und bei einer Drehzahl von 1000 Upm angezogen.

Danach wurde die kontinuierliche Kultivierung mit dem vorstehenden Medium mit einer Verdünnungsrate von 0,01 h^-1 gestartet. Nach der Ein stellung des Gleichgewichtes bei Luftbegasung ergab sich eine konstante Konzentration an Polysaccharid von 5 g/l und ein Gehalt an Biotrockenmasse von 3 g/l. Es konnte durch Reduktion des Sauerstoffanteiles in der Zuluft, durch Verwendung eines Gasgemisches mit 60% Luft und 40%, Stickstoff bei einer konstanten Begasungsrate von 0,031 V/Vm nach der Einstellung des Gleichgewichtszustandes eine Konzentration an Polysaccharid von 7,5 g/l bei gleichem Gehalt an Biomasse erzielt werden.

Durch diese Arbeitsweise nach dem Verfahren der Erfindung wurden eine prozentuale Steigerung der Produktivität von 33% erzielt.

Beispiel 3

Dieses erläutert die Herstellung des Polysaccharids, Typ AW 114, mit dem Pilzstamm DSM 3888 unter Scherung der Zellwände und unter Homogenisierung der Kultursuspension und unter Vermeidung der Pelletbildung im diskonti nuierlichen Prozess.

Zusätzlich zu den Kultivierungsbedingungen, die in der Offenlegungs schrift 36 43 467, Beispiel 3, beschrieben sind, wurde eine Zahnradpumpe steril im bypass eingesetzt. Diese wurde so dimensioniert, daß einmal täglich innerhalb einer Stunde das dreifache Volumen des Reaktorinhaltes umgewälzt wurde. Durch diese Scherung der Zellwände während der Kultivie rung wird an der Zellwand haftendes Polysaccharid vermehrt gelöst und die Kultursuspension homogenisiert und dadurch eine Pelletbildung während der Kultivierung unterdrückt. Die Homogenisierung erfolgt im Spalt der fördernden Zahnräder. Zur Umwälzung von 30 bis 150 l Kultursuspension in einer Stunde mit entsprechender Scherwirkung kann die Zahnradpumpe der Fa. Verder, Düsseldorf, Typ 2032, mit Pumpenkopf V 150.12, verwendet werden.

Durch die Scherung mit dieser Zahnradpumpe liegen bei Beendigung der Kultivierung nach 76 h in der Kultursuspension 12,6 g/l Polysaccharid in Lösung vor, entsprechend einer Produktivität von 4 g/l/d.

Daraus ergibt sich im Vergleich zu einer Kultivierung ohne Zahnradpumpe im bypass mit 7,2 g/l Polysaccharid eine Produktivität von 2,3 g/l/d ent sprechend einer Steigerung von 76%.

Dieses Beispiel zeigt also den technischen Effekt der Scherwirkung auf die Zellwände durch den Einsatz einer Zahnradpumpe als Verfahrensmaßnahme im bypass der zirkulierenden Kultursuspension in diskontinuierlicher Arbeits weise jedoch ohne eine Sauerstofflimitierung.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung des Polysaccharids, Typ AW 114, mit dem Pilzstamm DSM 3888 in kontinuierlicher Arbeitsweise in Kombination mit der Sauerstofflimitierung und der Scherwirkung auf die Zellwände im bypass mit einer Zahnradpumpe.

Die Herstellung der Vorkultur ist in der Offenlegungsschrift 36 43 467, Beispiel 3, beschrieben. Es werden 1 l dieser homogenisierten Kulturen verwendet um 10 l Nährmedium in einem Bioreaktor der Fa.B. Braun Diessel Biotech, Melsungen, zu beimpfen.

Der Bioreaktor war mit einem Wendelrührer der folgenden Abmessungen ausge stattet in cm:

Rührerdurchmesser:
16,0
Wendelblechdurchmesser:	1,6
Abstand des Rührers zur Kesselinnenwand	1,7
Form des Rührers:	2,5fache Wendel
Verhältnis d. Durchmessers:	Rührer/Kessel: 0,84

Das Medium zur Anzucht des Pilzstammes und zur Dosage während der kontinu ierlichen Kultivierung hatte die folgende Zusammensetzung je 1000 ml Wasser:
Glukose 30, technische Hefeextrakt 3, K₂HPO₄ · 3 H₂O, MgSO₄ · 7 H₂O 0,5 (g).
Anfangswert pH = 5,3.

Die Kultivierung wurde bei 27°C und 300 Upm durchgeführt. Bei einer Be gasungsrate von 1,0 l Luft pro 1 Liter Nährmedium und Minute wurde nach 48 h in kontinuierlicher Arbeitsweise durch gewichtsgeregelte Zudosage des Mediums begonnen.

Dabei wurde gleichzeitig die Begasungsrate auf 0,083 l Luft pro 1 Nähr medium und Minute reduziert. Die Zahnradpumpe wurde zur Homogenisierung der Kultursuspension wie im Beispiel 3 beschrieben, verwendet. Nach der Einstellung des Gleichgewichtes ergab sich bei einer Verdünnungsrate von 0,07 h^-1 eine Konzentration an Polysaccharid von 6,6 g/l und eine Biomasse von 2 g/l entsprechend einer Produktivität von 11,2 g/l/d.

Es wird nachstehend ein Beispiel für die Berechnung der Produktivität be schrieben. Die Produktivität ist als Menge/Volumen/Tag in den Dimensionen g/l/d definiert. Luftbegasung:
5 g/l × 0,01 h^-1 × 24 h = 1,2 g/l/d.
Bei 60% Luft + 40%, Stickstoff:
7,5 g/l . 0,01 h^-1 × 24 h = 1,8 g/l/d.
Die Zunahme der Produktivität beträgt 33%.

Polysaccharid-produzierende Pilzstämme synthetisieren in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration extracelluläre Glucanasen und Glucosidasen, die das Gebildete Polysaccharid depolymerisieren bzw. zu Glucose hydroly sieren.

Für das Verfahren der Erfindung ist es deshalb vorteilhaft, diese Hydrolyse möglichst rasch zu inaktivieren. Es beginnt beispielsweise bei einer Batch-Kultivierung des Pilzstammes mit der Hinterlegungsnummer DSM 3888 bei einer Glucosekonzentration von 0,9 bis 1,0 g/l in der Kultur suspension die Synthese von Glucanasen und Glucosidasen, wie die folgende Tabelle erläutert. Es werden die spezifischen Aktivitäten, U/ml, von Enzymen ermittelt.

Dieser Vergleich zeigt, daß durch die relativ hohe Aktivität an ß-1,3-Glucanase durch Kettenbruch eine starke Erniedrigung der Viskosität erfolgt. Um dies zuverhindern, ist also eine rasche Inaktivierung dieser Enzyme vorteilhaft.

Die folgende Tabelle zeigt die Temperaturoptima dieser Enzyme.

Enzym
Temperatur °C
β-1,3-Glucanase
65
β-1,6-Glucanase	50
β-Glucosidase	70

Das Verfahren der Erfindung verwendet den technischen Effekt des kurz zeitigen Erhitzens auf 80°C bis 90°C und des raschen Abkühlens auf unter 30°C der Kultursuspension als alternative und bevorzugte Maßnahme.

Die folgende Tabelle erläutert die Reaktionstemperatur in °C sowie die Inaktivierungszeit in min.

Es wird also bei kurzzeitigem Erhitzen auf 80°C bis 90°C im Maximum von 8 min die Inaktivierung dieser Enzyme ohne Einsatz von Chemikalien bei intensiver Durchmischung der Kultursuspension unter gleichzeitiger Stabi lisierung des erzeugten Polysaccharides erreicht. Die rasche Abkühlung gemäß dem Verfahren der Erfindung auf unter 30°C unterbindet eine hohe Lysis der Zellmasse.

Das Verfahren der Erfindung führt zu einer Erhöhung der volumenbezogenen Produktivität des nichtionischen Homopolysaccharides unter Erhaltung der Qualitätsmerkmale des Verfahrens der Offenlegungsschrift 36 43 467.

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung der volumenbezogenen Produktivität (g/l/Tag) nichtionischer Biopolymere mit hoher spezifischer Viskosität durch Züchtung von Pilzstämmen unter Belüftung und Bewegung im Temperatur bereich zwischen etwa 15°C und 40°C und durch Erhitzen der Kultursus pension und durch Abtrennen des gebildeten Homopolysaccharids von der Zellmasse, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion an Homopoly saccharid in kontinuierlicher Herstellung mit folgenden Maßnahmen für sich oder in deren Kombination erfolgt:
Sauerstofflimitierung in der Zuluft unter Steigerung der Produktivi tät, Scherung der Zellwände unter Homogenisierung der Kultursuspension und unter Vermeidung der Pelletbildung bei der Kultivierung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sauerstoff limitierung bei einer Belüftungsrate von 0,02 bis 0,09 V/V/min (Volumen/Volumen/min) erfolgt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der kontinuierlichen Kulturführung eine Verdünnungsrate von 0,04 bis 0,08 h^-1 eingestellt wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scherung der erzeugten Zellmasse in der Kultursuspension im Bypass mit einem mehrfachen, insbesondere einem 3fachen, Umlaufvolumen des Reaktorinhaltes unter mechanischer oder hydrodynamischer Durchmischung mittels einer Zahnradpumpe erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Scherung der Zellmasse eine homogene Verteilung des Pilzmycels in der Kultursuspension eingestellt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultursuspension kurzzeitig auf 80°C bis 90°C erhitzt wird zur Stabilisierung der Produktlösung und diese danach rasch auf unter 30°C abgekühlt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das kurzzeitige Erhitzen bei einer Inaktivierungszeit von maximal 8 min erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der Zellmasse von der Produktlösung durch ein- oder mehr stufige Druckfiltration oder durch Zentrifugation oder durch Cross- Flow-Filtration mit 1 µm Ausschlußgrenze, gegebenenfalls nach vorge schalteter Verdünnung einer hohen Produktkonzentration, erfolgt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Pilzstämme mit der DSM-Hinterlegungsnummer 3887, 3889, 3890, 3891, 3892, insbesondere mit der DSM-Nummer 3888, eingesetzt werden.

10. Verfahren zur Erhöhung der volumenbezogenen Produktivität (g/l/Tag) nichtionischer Biopolymere mit hoher spezifischer Viskosität durch Züchtung von Pilzstämmen unter Belüftung und Bewegung im Temperatur bereich zwischen etwa 15°C und 40°C und durch Erhitzen der Kultursus pension und durch Abtrennung des gebildeten Homopolysaccharids von der Zellmasse in Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion an Homopolysaccharid in diskonti nuierlicher Herstellung unter Scherung der Zellwände unter Homogeni sierung der Kultursuspension und unter Vermeidung der Pelletbildung bei der Kultivierung erfolgt.