DE3922666A1

DE3922666A1 - Antitumor-mittel

Info

Publication number: DE3922666A1
Application number: DE3922666A
Authority: DE
Inventors: Shin Hasegawa; Luke K T Lam
Original assignee: Toyotama Koryo Co Ltd
Current assignee: Toyotama Koryo Co Ltd
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1989-07-10
Publication date: 1990-03-22
Also published as: GB2222769A; FR2636533A1; JPH0283320A; GB8914429D0; US5041425A; FR2636533B1; CH678919A5; GB2222769B; JP2724333B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Antitumor-Mittel aus der Gruppe der Citrus-Limonoide. Sie betrifft insbesondere eine pharma kologische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Citrus-Limonoids und einen pharmakologisch akzep tablen Träger enthält, und deren Verwendung in einem Verfah ren zur Behandlung eines Tumors.

Limonin und Nomilin kommen zusammen mit anderen Limonoiden in Rutaceen-Pflanzen vor, welche gewöhnliche eßbare Früchte umfassen, wie Orangen, Zitronen, Limonen und Grapefruit. Die Molekülstruktur der Limonoide enthält einen Furanrest, an den in der 3-Position ein stark oxidiertes Triterpen gebunden ist. Furan enthaltende Naturprodukte, wir Kahweol und Cafestol, die aus grünen Kaffeebohnen isoliert wurden, inhibieren, wie gefunden wurde, die chemisch induzierte Neoplasie. Die Inhi bierungswirkung dieser und anderer Klassen von Anticarcino genen wird mindestens zum Teil ihrer Fähigkeit zugeschrieben, eine erhöhte Aktivität des Detoxifizierungsenzyms Glutathion- S-Transferase (GST) zu induzieren (vgl. V.L. Sparnins, P.L. Venegus und L.W. Wattenberg in "J. Natl. Cancer Inst.",68, 483-496 (1982), und A.M. Benson, R.P. Batzinger, S.Y.L. Ou, E. Bueding, Y.N. Cha und P. Talalay in "Cancer Res.", 38, 4486-4495 (1978)). Der Furanrest in Kahweol und Cafestol wurde als funktionelle Gruppe ermittelt, die verantwortlich ist für die Induktion der erhöhten GST-Aktivität bei Versuchs tieren (vgl. L.K.T. Lam, V.L. Sparnins und L.W. Wattenberg in "J. Med. Chem.", 30, 1399-1403 (1987)).

Da Limonoide, wie z.B. Limonin und Nomilin, Furan enthaltende Naturprodukte sind, die von der allgemeinen Bevölkerung regel mäßig verzehrt werden, wurde die GST-induzierende Aktivität dieser Limonoide gefunden und es wurde festgestellt, daß die zuletztgenannte Verbindung ein starkes Enzym-Induktionsmittel ist, während die zuerstgenannte Verbindung nur schwach aktiv ist. In dieser Untersuchung wird die Enzym-induzierende Akti vität in Korrelation gesetzt zur Inhibierung des durch BP induzierten Vordermagen-Tumors durch Limonin und Nomilin bei ICR/Ha-Mäusen.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmakologische Zu sammensetzung, die eine pharmakologisch wirksame Menge eines Citrus-Limonoids und einen pharmakologisch akzeptablen Träger enthält.

Unter den Citrus-Limonoiden sind Limonin und Nomilin beson ders wirksam. Diese Zusammensetzung ist brauchbar für die Behandlung eines Tumors.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung eines Krebses, das heißt, zur Behandlung und Inhi bierung eines Tumors durch Verabreichung einer pharmakologisch wirksamen Menge eines Citrus-Limonoids an einem Patienten, der an Krebs und einem Tumor leidet.

Die erfindungsgemäß verwendeten Citrus-Limonoide sind ver wendbar als Antitumor-Mittel.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Citrus- Limonoide als Antitumor-Mittel und ihre Verwendung zur Her stellung eines Antitumor-Mittels.

Erfindungsgemäß wird das obengenannte spezifische Citrus-Li monoid, wie z.B. Limonin und Nomilin, aus der Citrusfrucht iso liert und ist, wie gefunden wurde, brauchbar zur Behandlung eines Tumors. Es ist auch brauchbar als Lebensmittel-Zusatz. Es dient als bitterschmeckende Komponente.

Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich zur Behand lung, Inhibierung und Verhinderung des Magen-Tumors.

Es sind 37 Arten von Limonoiden aus der Citrusfrucht erhältlich und sie weisen, wie gefunden wurde, in ihrer jeweiligen Struktur eine Furangruppe auf. Unter den Limonoiden wurden Limonin und Nomilin als die wirksamsten Komponenten isoliert. Limonin und Nomilin sind durch die nachstehend angegebenen Formeln (1) und (2) definiert. In ihren Strukturen ist die Furangruppe in ih rer 3-Position an eine stark oxidierte Triterpen-Gruppe an der C-17-Position gebunden. Sie liegen in der Citrusfrucht auch in kom binierter Form mit Glucose vor, wie durch die nachstehend an gegebenen Formeln (3) und (4) dargestellt.

Die Limonoide, wie Limonin und Nomilin, sind die bitteren Prinzipien (Grundstoffe), die in den gewöhnlichen eßbaren Citrusfrüchten vorkommen. Wenn Nomilin alle 2 Tage dreimal in einer Menge von 5 und 10 mg pro Tier verabreicht wird, induziert es eine erhöhte Glutathion-S-Transferase-Aktivität, 2,48 bzw. 3,44 mal so stark wie die Kontrolle in der Leber von weiblichen ICR/Ha-Mäusen. Die Erhöhung der GST-Aktivität in der Dünndarm-Schleimhaut betrug das 3,00fache bzw. 4,17fache derjenigen der Kontrolle. Bei der Verabreichung von Limonin in den gleichen Dosen war es in der Leber nicht aktiv. Es wurde jedoch eine geringe Aktivität in der Dünn darm-Schleimhaut festgestellt. Es wurde gefunden, daß das aktivere Enzym-induzierende Mittel Nomilin, die durch Benzo(a) pyren-induzierte Neoplasie im Vormagen von ICR/Ha-Mäusen in hibiert. Die Anzahl der Mäuse mit einem Tumor wurde von 100% auf 72% vermindert und die Anzahl der Tumoren pro Maus wur de signifikant erniedrigt als Folge der Nomilin-Behandlung. Limonin, das ein schwaches Enzym-induzierendes Mittel ist, war weniger wirksam als Inhibitor der Benzo(a)pyren-induzier ten Neoplasie. Dies legt nahe, daß Limonoide als eine Klasse von regelmäßig verzehrten Naturprodukten wirksame Chemo prophylaxemittel darstellen können.

Wenn die erfindungsgemäße Verbindung als Antitumor-Mittel verwendet wird, wird sie in der Regel oral oder parenteral (intramuskulär oder subkutan) verabreicht. Die Dosis unter liegt keinen speziellen Beschränkungen und variiert in Ab hängigkeit vom Typ der Erkrankung, von den Symptomen, dem Alter, dem Zustand und Körpergewicht des Patienten, einer anderen Behandlung, die eventuell gleichzeitig mit dieser Behandlung durchgeführt wird, der Häufigkeit der Behandlung und der Qualität des gewünschten Effekts. Wenn sie oral an Erwachsene verabreicht wird, beträgt die Dosis in der Regel etwa 1 bis etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 20 mg, insbesondere etwa 8 bis etwa 10 mg pro Tag. Sie wird einmal oder mehrmals am Tage verabreicht. Wenn sie durch Injektion verabreicht wird beträgt die Dosis etwa 0,01 bis etwa 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,03 bis etwa 0,1 mg/kg.

Das erfindungsgemäße Mittel kann beispielsweise in Form von Pulvern, feinen Körnchen, Granulaten, Tabletten, Kapseln, Sup positorien oder Injektionspräparaten vorliegen. Bei der For mulierung wird ein üblicher Träger verwendet und es wird ein übliches Herstellungsverfahren angewendet.

Ein orales festes Präparat wird hergestellt durch Zugabe ei nes Exzipienten und, falls erforderlich, eines Bindemittels, eines Desintegrators, eines Gleitmittels (Schmiermittels) , Färbemittels, Korrektionsmittels und dgl., zu dem aktiven Bestandteil (Wirkstoff) und Formen der Mischung zu Tabletten, beschichteten Tabletten, Granulaten, eines Pulvers oder Kapseln unter Anwendung eines üblichen Verfahrens.

Die Exzipienten umfassen beispielsweise Lactose, Maisstärke, weißen Zucker, Glucose, Sorbit, kristalline Cellulose und Siliciumdioxid. Die Bindemittel umfassen beispielsweise Poly vinylalkohol, Polyvinyläther, Ethylcellulose, Methylcellulo se, Akaziengummi , Tragant-Gummi, Gelatine, Schellack, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylstärke und Polyvinyl pyrrolidon. Die Desintegrationsmittel umfassen beispielsweise Stärke, Agar, Gelatinepulver, kristalline Cellulose, Calcium carbonat, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcitrat, Dextrin und Pektin. Die Schmier- bzw. Gleitmittel umfassen beispielsweise Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglycol, Siliciumdioxid und gehärtete pflanzliche Öle. Die Färbemittel umfassen beispiels weise solche, wie sie als Färbemittel für Arzneimittel zuläs sig sind. Die Korrekturmittel umfassen beispielsweise Kakao pulver, Menthol, aromatisches Pulver, Pfefferminzöl, Borneol und Zimtpulver. Diese Tabletten und Körnchen können zweckmäßig mit Zucker, Gelatine und dgl. beschichtet sein.

Bei der Herstellung des Injektions-Präparats werden Zusätze, wie z.B. pH-Einstellmittel, Puffermittel, Stabilisatoren oder Solubilisatoren, erforderlichenfalls zu dem aktiven Be standteil (Wirkstoff) zugegeben und ein intravenöses Injek tionspräparat wird unter Anwendung eines üblichen Verfahrens daraus hergestellt.

Pharmakologischer Test

Limonin und Nomilin wurden jeweils getestet im Hinblick auf ihr potentielles Enzym-Induzierungsvermögen und ihr Vermögen, einen durch Benzopyren induzierten Magentumor zu inhibieren.

BP (Benzo(a)pyren) und CDNB (1-Chloro-2,4-dinitrobenzol) wur den von der Firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA, bezogen. 3-BHA (3-tert-Butyl-4-hydroxyanisol) wurde durch Um kristallisation aus handelsüblichem BHA (bezogen von der Fir ma Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) gereinigt. Gluta thion wurde von der Firma Sigma Chemical Co. bezogen. Limonin und Nomilin wurden aus Grapefruitsamenkörnern wie nachstehend angegeben isoliert. Samenkörnermehle wurden mit Hexanen gründ lich gewaschen und die Limonoide wurden mit Aceton extrahiert. Limonin wurde durch fraktionierte Kristallisation aus dem Ge misch in Dichlormethan erhalten und Nomilin wurde durch Kristallisation aus dem Rückstand in Aceton erhalten. Ihre Strukturen wurden durch NMR-Spektralanalyse bestätigt.

Cytosol-Herstellung

Weibliche ICR/Ha-Mäuse mit einem Alter von 8 Wochen aus dem Harlan Sprague Dawley-Laboratorium (Indianapolis, IN, USA) wurden mit einer halbgereinigten Diät (ICN Nutritional Bio chemical, Cleveland, OH, USA) eine Woche lang gefüttert, be vor sie in experimentelle Gruppen und Kontrollgruppen - je weils drei Mäuse pro Gruppe - aufgeteilt wurden. Den experi mentellen Gruppen wurden drei Dosen der Testverbindungen, suspendiert in Baumwollsamenöl, jeden zweiten Tag verab reicht. Der Kontrollgruppe wurde Baumwollsamenöl allein ver abreicht. 24 Stunden nach der letzten Intubation wurden die Mäuse durch Cervicaldislokation getötet und die Leber, die Lunge, der Vordermagen und die Schleimhaut des vorderen Drittels des Dünndarms wurden entnommen für die Enzymherstellung. Die Gewebe wurden in einer 1,15%igen KCl-Lösung mittels eines Brinkman-Homogenisators homogenisiert. Das Cytosol wurde nach einstündigem Zentrifugieren mit 100000 g erhal ten und bis zur Verwendung bei -80°C eingefroren. Die Pro teinkonzentration der Proben wurde nach der Lowry-Methode bestimmt. Jede Probe repräsentiert ein Gewebe aus jedem ein zelnen Tier.

GST-Assay

Die Aktivität des cytosolischen GST wurde nach der Methode von Habig et al bestimmt unter Verwendung von CDNB als Sub strat. Die Reaktionsrate wurde bei 340 nm in einem Hewlett Packard HP 8450 A-Spektrophotometer überwacht. Es wurden Assays bei 30°C in einem 0,1 M Phosphat-Puffer mit pH 6,5 in Gegenwart von 5 nm GSH und 1 nM CDNB durchgeführt. Als Kon trolle wurde ein vollständiges Assay-Gemisch ohne Enzym ver wendet.

Tumor-Inhibierung

Es wurden Tumor-Inhibierungs-Versuche durchgeführt unter An wendung vorveröffentlichter Verfahren. 120 weibliche ICR/Ha- Mäuse (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, USA), mit einem Alter von 8 Wochen wurden gleichmäßig in 6 Gruppen auf geteilt. Den Mäusen wurde eine Woche vor Beginn des Versuchs eine halbgereinigte Diät verabreicht und sie wurden bis 3 Ta ge nach der letzten Dosis der Carcinogen-Behandlung mit der gleichen Diät gefüttert. BP wurde 2 mal pro Woche 4 Wochen lang in einer Menge von 1 mg (in 0,2 mL Maisöl) pro Dosis durch p.o.-Intubation verabreicht. Die Inhibitoren wurden durch p.o.-Intubation dreimal pro Woche an den anderen Tagen als die Carcinogen-Behandlung verabreicht. Es wurden drei zusätzliche Dosen von Inhibitoren, zwei vor der ersten Dosis und eine nach der letzten Dosis des Carcinogens, verabreicht. Drei Ta ge nach der letzten Dosis von BP wurden die Tiere bis zur Beendigung des Versuchs wieder mit normalem Laborfutter ge füttert. 18 Wochen nach der ersten Dosis von BP wurden die Mäuse getötet und die Mägen wurden entnommen und durch i.g.- Injektion von Formalin fixiert. Dann wurden sie in Längs richtung aufgeschnitten. Die Tumoren des Vordermagens wurden unter einem Präparier-Mikroskop mit einer Millimeter-Skala ausgezählt. Tumoren, die größer als 0,5 mm waren, wurden aufgezeichnet und histopathologisch untersucht.

Statistische Analyse

Die Signifikanz der Anzahl der Tumoren tragenden Mäuse wur de nach dem Chi Square-Test analysiert. Die Anzahl der Tumo ren pro Maus und die Enzym-Assay-Statistiken wurden nach dem Student′s-t-Test analysiert.

Ergebnisse

Die nachfolgende Tabelle I zeigt die induzierenden Effekte von Limonin und Nomilin auf die Aktivität von GST in der Le ber und in der Dünndarm-Schleimhaut von ICR/Ha-Mäusen. In beiden Geweben wurde das bekannte Enzym-Induzierungsmittel und Anticarcinogen BHA als positive Kontrolle verwendet. No milin induzierte bei 5 und 10 mg pro Dosis eine erhöhte GST-Aktivität, die um den Faktor 2,48 bzw. 3,44 höher war als die Kontrolle in der Leber der Maus. Bei den gleichen Dosis werten war Limonin nicht aktiv. In der Dünndarm-Schleimhaut, die ein empfindlicheres Gewebe in bezug auf das Ansprechen auf Induktionsmittel darstellt, waren die erhöhten Aktivitä ten von GST durch 5 und 10 mg Nomilin jeweils um den Faktor 3,00 bzw. 4,17 größer als bei der Kontrolle. In diesem Gewe be wies Limonin eine geringe Aktivität als Enzym-Induktions mittel auf (um den Faktor 1,33 und 1,36 höher als bei der Kontrolle).

Die Wirksamkeit als Inhibitoren von durch BP induzierten Vorder magen-Tumoren bei ICR/Ha-Mäusen stand in positiver Korrelati on zu der Enzym-induzierenden Aktivität dieser Verbindungen. Die folgende Tabelle II zeigt die Inhibierungseffekte von Li monin und Nomilin auf durch BP induzierte Neoplasie des Vorder magens bei Mäusen. Bei einer Dosis von 10 mg wiesen 72% der Tiere Tumoren auf, verglichen mit 100% der Tiere in der Kon trollgruppe. Als positive Kontrolle wurde in diesem Versuch der bekannte Inhibitor BHA verwendet. In dieser Gruppe wiesen 69% der Tiere, wie gefunden wurde, Vormagen-Tumore auf. Die Inhibierung durch sowohl 10 mg Nomilin als auch 7,5 mg BHA war signifikant verschieden von derjenigen der Kontrolle. Die Anzahl der Tumoren pro Maus war ebenfalls signifikant vermin dert in der 10 mg Nomilin-Gruppe. Die 5 mg Nomilin-Gruppe war von der Kontrollgruppe statistisch nicht verschieden, obgleich eine geringe Abnahme der Anzahl der Tiere mit Tumoren festzu stellen war. Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten mit den beiden Dosiswerten von Limonin.

Die folgenden Tabellen III und IV zeigen, wie einige Arten der Limonoide die GST-Aktivität auf Geweben von Dünndarm-Schleim haut und Leber induzieren.

Diskussion

Es wurde gefunden, daß eine beträchtliche Anzahl von Inhibito ren der chemischen Carcinogenese eine erhöhte Aktivität des detoxifizierenden Enzyms GST induziert. Die Ergebnisse dieser Untersuchung bestätigen ferner die Korrelation zu den in der Natur vorkommenden Limonoiden. Die Enzym-induzierenden und Carcinogenese - inhibierenden Wirkungen von Nomilin lagen, wie gefunden wurde, in der gleichen Größenordnung wie die jenigen von BHA bei den in diesem Versuch angewendeten Dosen. Da das Molekulargewicht von Nomilin dreimal höher ist als das jenige von BHA wird die biologische Aktivität des erstgenann ten als höher angenommen als diejenige des phenolischen Anti oxidationsmittels, bezogen auf Molbasis. Eine längere Diät- Verabreichung dieser Limonoide kann eine bessere Inhibierungs wirkung gegenüber der durch BP induzierten Neoplasie ergeben.

Nomilin, ein wirksamerer Inhibitor der chemischen Carcinoge neses als Limonin liegt in Citrus-Säften in einer geringeren Konzentration als die zuletztgenannte Verbindung vor. Das Verhältnis von Limonin zu Nomilin in Citrus-Säften hängt von einer Reihe von Faktoren ab, welche die Art der Frucht, die Erntezeit, die Zeit nach der Herstellung des Saftes und den Umstand, ob der Saft einer Wärmebehandlung unterzogen worden ist, umfassen. Im allgemeinen ist die Konzentration des Limo nins 5- bis 10mal höher als diejenige von Nomilin. Der bitte re Geschmack von Limonin kann festgestellt werden, wenn seine Konzentration in dem Saft mehr als 6 ppm beträgt. Der generel le Verzehr an diesen beiden Limonoiden ist daher nicht sehr hoch. Vorläufige Daten in bezug auf andere Limonoide mit einer verwandten Struktur zeigten jedoch eine ähnliche enzyminduzie rende Aktivität an. Es wird angenommen, daß diese Verbindungen ebenfalls wirksame chemoprophylaktische Agentien sind. Der kumula tive Effekt von Limonoiden und Limonoid-artigen Naturprodukten kann somit wesentlich sein.

Limonoid-Glucosid wird im Darm hydrolysiert durch einen Virus unter Bildung der entsprechenden Limonoide, die in dem Darm absorbiert werden. Das Limonoid-Glucosid ist in Wasser lös lich und nicht so bitter. Dies ist der Grund dafür, warum das Glucosid erfindungsgemäß leichter verwendbar ist.

Tabelle I

Wirkungen von Limonin, Nomilin und butyliertem Hydroxyanisol auf die Aktivität der Glutathion-S-Transferase in Geweben von weiblichen ICR/Ha-Mäusen

Tabelle II

Wirkungen von Limonin und Nomilin auf die durch BP induzierte Neoplasie des Vermögens von ICR/Ha-Mäusen^a)

Tabelle III

Dünndarm-Schleimhaut

Tabelle IV

Leber

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf spe zifische bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims

1. Pharmakologische Zusammensetzung, dadurch gekenn zeichnet, daß sie eine therapeutisch wirksame Menge eines Citrus-Limonoids und einen pharmakologisch akzeptablen Träger enthält.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Citrus-Limonoid um Limonin oder Nomilin handelt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Citrus-Limonoid um ein Glucosid desselben handelt.

4. Verwendung der pharmakologischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem Verfahren zur Behand lung eines Tumors, bei dem einem Patienten, der an einem Tu mor leidet, eine therapeutisch wirksame Menge eines Citrus- Limonoids verabreicht wird.

5. Verwendung eines Citrus-Limonoids als Antitumor-Mittel.