CN104447650B - 一种柠檬苦素类化合物、制备方法与医药用途 - Google Patents

一种柠檬苦素类化合物、制备方法与医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及一种新的柠檬苦素类化合物、制备方法及该化合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。该化合物是一种新颖的柠檬苦素类化合物，体外试验具有抗宫颈癌的作用，可以用来制备治疗宫颈癌的药物。

Description

一种柠檬苦素类化合物、制备方法与医药用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种新的柠檬苦素类化合物、制备方法及该化合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
背景技术
柠檬苦素(Limonin)是植物次生代谢生成的一个含呋喃环并且高度氧化的四环三萜类化合物，它主要存在于芸香科和楝科的多种植物中。20世纪60年代，Arigoni和Barton等学者用化学和X-ray的方法法对柠檬苦素的结构进行了研究，阐明了柠檬苦素分子结构。自1989年发现柠檬苦素具有激活谷胱甘肽S-转移酶活性的功能以来，人们对其生物活性进行了大量研究，研究发现柠檬苦素具有广泛的药理活性，尤具是其具有多途径的抗肿瘤活性，使得它的疗效和保健功能越来越受到人们的重视。有学者研究了柠檬苦素对人乳腺癌细胞(MCF-7)的生长抑制及细胞周期动力学的影响。结果显示柠檬苦素能明显抑制MCF-7的生长，抑制率高于70％，并随作用时间和剂量增加其效果增强。
柠檬苦素类化合物是和柠檬苦素一类的化合物，是由大戟烷或甘遂烷型三萜衍生而来的一类高度氧化的四降三萜类化合物，是芸香目主要特征的化学成分，主要存在于芸香科和楝科植物中，叶柄花科和苦木科等亦有分布。柠檬苦素类化合物以苷元和糖苷两种形式存在。这类化合物具有明显抗癌和抗菌等生物活性，近年来的研究集中在其化学结构、生物合成和生物活性等方面。有学者研究了柠檬苦素等五种柠檬苦素类化合物对人肿瘤细胞株(L-60、SKOV-3、HeLa、NCI-SNU-1、HepG2和MCF-7)抑制增殖活性作用，结果发现五种檬苦素类化合物对人乳腺癌细胞MCF-7均具有明显的增殖抑制作用，且呈一定的剂量时间依赖关系。
川楝(MeliatoosendanSieb.EtZucc.)为楝科(Meliaceae)楝属(Melia)植物，主要分布在我国西南部，是我国传统的驱肠寄生虫中草药，含有大量的柠檬苦素类化合物。由于楝属植物具有生长迅速、用途广泛、具有较大经济价值，其所含的柠檬苦素类化合物多结构复杂、活性多样化的特点，引起了各国研究工作者的广泛兴趣和重视，中国、印度、日本等国研究此属者尤多。川楝子为川楝的干燥成熟果实，冬季果实成熟时采收，除去杂质，干燥，具有舒肝行气止痛、驱虫的作用；通常用于胸胁、脘腹胀痛，疝痛，虫积腹痛。主产于四川、贵州、湖北、湖南、河南及甘肃南部等。
宫颈癌(Cancerofcervix)是指发生于子宫颈的上皮性恶性肿瘤，是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二种最常见的恶性肿瘤，是威胁妇女健康、导致妇女死亡的主要恶性肿瘤之一。全球每年新发50万例，死亡20万例。我国宫颈癌发病率每年新增发病数超过13万，占世界新发病例近30％，我国每年将有20万妇女死于宫颈癌。此外，我国宫颈癌近年发病呈现年轻化趋势。目前研究认为，宫颈癌的病因与多种因素有关。Hausen提出人乳头瘤病毒(HumanPapillomaVirus，HPV)可能与宫颈癌发生有关的假说后(HausenZH,Papillimavirusesinhumancancer,Cancer,1987)，国内外学者就两者的关系进行了大量的研究，随着分子生物学技术的发展HPV检测方法的不断改进，现已证实HPV是宫颈癌的主要致病因子。目前已报道的HPV有120多种，其中约35种亚型可以感染生殖道，约20种与肿瘤有关。约有99.8％的宫颈癌合并HPV感染，故HPV致癌分子机制及高危型HPV和病原微生物之间的协同作用愈来愈引起人们的关注。研究发现，HPV表达的E6和E7致癌蛋白分别能使肿瘤抑制蛋白p53和pRb失活，使得肿瘤细胞疯狂生长和繁殖。
发明人在对川楝子化学成分研究的过程中，分离得到了一种新的柠檬苦素类化合物。该化合物为首次报道。发明人对该化合物进行了抗肿瘤活性研究，发现该化合物能抑制多种宫颈癌细胞生长和繁殖(包括HPV阳性和阴性宫颈癌细胞)，可以用来制备治疗宫颈癌的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种从川楝子中分离得到的一种新的柠檬苦素类化合物A。
本发明的另一目的是提供一种从川楝子中分离纯化化合物A的制备方法。
本发明的再一目的在于提供化合物A在制备治疗宫颈癌等HPV相关肿瘤的药物中的应用。
根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式的化合物A：
根据本发明的另一目的是提供一种从川楝子中分离纯化化合物A的制备方法，其制备步骤包括：
A.将川楝子干燥药材粉碎，用醇或醇溶液提取一次或多次，过滤，收集滤液，减压浓缩得醇浸膏；
B.醇浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，萃取液浓缩得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏。
C.正丁醇浸膏用柱色谱分离纯化得到纯的化合物A。
步骤C详细包括：(1)正丁醇浸膏用水混悬，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，乙醇-水系统梯度洗脱，收集60％-70％乙醇洗脱部分；(2)60％-70％乙醇洗脱部分上硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(20:1,15:1,10:1,5:1,2:1,V/V)，收集二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脱部分，减压回收溶剂；(3)取二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脱部分进一步用正己烷-丙酮进行梯度洗脱(10:1,5:1,2:1，V/V)，收集正己烷-丙酮(2:1)洗脱部分，减压回收溶剂；(4)正己烷-丙酮(2:1)洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水(85:15)等度洗脱，收集5-6柱体积洗脱部位，浓缩；(5)取步骤(4)浓缩物用半制备型高效液相色谱分离制备，乙腈-水(75:25)等度洗脱，得到纯的化合物A。
根据本发明的再一目的，提供化合物A在制备治疗宫颈癌药物中的应用。为实现该目的，本发明采用标准药理学试验研究了化合物A对四种人宫颈癌细胞CaSki、SiHa、HeLa和C33a的抑制作用，并研究了该化合物对正常人皮肤表皮角质形成细胞(HEKn)的细胞毒作用。结果表明，化合物A能抑制宫颈癌细胞，且对正常细胞细胞毒作用较弱，可以用来制备治疗宫颈癌的药物。
附图说明
图1：不同浓度化合物A(0-25μM)作用48小时后细胞活力变化
具体实施方式
实施例1：化合物A的制备方法
川楝子干燥药材(购自安徽亳州中药材市场)10kg，室温条件下采用渗漉法用70％乙醇提取3次，每次体积30L，合并乙醇提取液，减压回收，得醇浸膏855g。醇浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，萃取液浓缩得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏(310g)。正丁醇浸膏用水混悬，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，乙醇-水系统梯度洗脱，收集60％-70％乙醇洗脱部分(190g)；60％-70％乙醇洗脱部分上硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(20:1,15:1,10:1,5:1,2:1,V/V)，收集二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脱部分，减压回收溶剂(80g)；取二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脱部分进一步用正己烷-丙酮进行梯度洗脱(10:1,5:1,2:1，V/V)，收集正己烷-丙酮(2:1)洗脱部分，减压回收溶剂(18g)；正己烷-丙酮(2:1)洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水(85:15)等度洗脱，收集5-6柱体积洗脱部位，浓缩；取浓缩物用半制备型高效液相色谱分离制备，乙腈-水(75:25)等度洗脱，得到纯的化合物A(32mg)。
化合物A结构确证：黄色粉末；HR-ESIMS显示[M+H]+为m/z437.1944，结合核磁可得分子式为C26H28O6，不饱和度为13，说明该化合物是一个高度氧化且不饱和度高的化合物；1HNMR(MeOH-d4,δppm,600MHz)和13CNMR(MeOH-d4,δppm,150MHz)数据见表1。结合二维谱及该类化合物核磁数据可确定其结构。
表11HNMR和13CNMR信号归属
实施例2：MTT法测定各细胞活力
细胞特点：CaSki(HPV18阳性，HPV16阳性)、SiHa(HPV16阳性)、HeLa(HPV18阳性)和C33a(HPV阴性性)
细胞活力测定采用MTT法。取对数生长期的细胞，接种1×104个于96孔板，过夜，设不加药组(空白组)和加药组，每组设5或6个复孔，加入不同浓度化合物A(0-25μM)，空白组加等体积DMSO。培养24小时，弃上清，加入20μl含5mg/ml的MTT无血清培养液37℃培养4小时，弃上清，加入200μlDMSO，放置于微型振荡仪上振荡10min，再置于酶标仪上570nm处测OD值。结果见附图1。
从附图1可以看出化合物A对四种宫颈癌细胞均显示浓度依赖性抑制作用。化合物A对人正常细胞(HEKn)的抑制作用较弱，对正常细胞细胞毒作用较弱。

Claims (3)

1.一种化学结构式如下的柠檬苦素类化合物化合物A，
2.权利要求1所述的化合物A的制备方法，其制备步骤包括：
A.将川楝子干燥药材粉碎，用醇或醇溶液提取一次或多次，过滤，收集滤液，减压浓缩得醇浸膏；
B.醇浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，萃取液浓缩得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
C.正丁醇浸膏用柱色谱分离纯化得到纯的化合物A；
步骤C的详细步骤包括：(1)正丁醇浸膏用水混悬，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，乙醇-水系统梯度洗脱，收集60％-70％乙醇洗脱部分；(2)60％-70％乙醇洗脱部分上硅胶柱层析，依次用体积比为20:1、15:1、10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比为5:1的洗脱部分，减压回收溶剂；(3)取二氯甲烷-甲醇体积比5:1洗脱部分进一步用硅胶柱层析进行分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的正己烷-丙酮进行梯度洗脱，收集正己烷-丙酮体积比为2:1洗脱部分，减压回收溶剂；(4)正己烷-丙酮体积比2:1洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水体积比85:15等度洗脱，收集5-6柱体积洗脱部位，浓缩；(5)取步骤(4)浓缩物用半制备型高效液相色谱分离制备，乙腈-水体积比75:25等度洗脱，得到纯的化合物A。
3.权利要求1所述的化合物A在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
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