DE3889783T2 - Verwendung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkung zum Schutz oder Modulation der biologischen Aktivität. - Google Patents

Verwendung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkung zum Schutz oder Modulation der biologischen Aktivität.

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen, um biologisch aktive Entitäten gegen in vivo - und in vitro - Desaktivierung zu schützen.
  • Biologisch aktive Entitäten, wie Enzyme, Hormone, Wachstumsfaktoren, Antikörper und Drogen werden in einer Vielzahl von medizinischen und industriellen Anwendungen eingesetzt, bei welchen ihre nützliche Lebensdauer durch Desaktivierung verkürzt werden kann. Solche Desaktivierung kann sich aus physikalischen, chemischen oder biologischen Reaktionen oder Bedingungen ergeben oder durch Selbstzersetzung im Fall bestimmter Enzyme, die in Konkurrenz zu den Reaktionen mit der gewünschten Aktivität in einer besonderen Anwendung auftreten; die Desaktivierung kann sich aus einer Kombination solcher Desaktivierungsreaktionen ergeben. In einigen Fällen tritt die Desaktivierung rasch ein, was ein ständiges Ersetzen der Aktivitätsentität notwendig macht.
  • V.V. Mozhaev et al. "Enzyme Microb. Technol.", 1984, Band 6, Seite 50 und folgende, rezensieren Struktur-Stabilitäts-Beziehungen in Proteinen und bestehende Ansätze, um Proteine zu stabilisieren. In "Chemical & Eng'r News", 30. September 1985, Seite 19 und folgende, findet sich eine Beschreibung von Albumin/Enzymkomplexen, die resistent sind gegenüber proteolytischer und Wärmedesaktivierung, während US-Patent Nr. 4,179,337 Polyethylenglykol/Enzymkomplexe erwähnt, die auch resistent sind gegenüber Desaktivierung.
  • Biologisch aktive Entitäten werden in einer markierten Form in verschiedenen Umgebungen verwendet, z.B. bei immunologischen Nachweisen und Diagnoseverfahren. Die Markierung kann üblicherweise eine radioa ktive Tsotop enmarkierung, Enzymmarkierung, Fluoreszenzmarkierung oder eine photometrisch bestimmbare Markierung sein. Eine Einschränkung findet die Auswahl der Markierung darin, daß sie nicht mit einer Position der biologisch aktiven Entität reagieren und diese damit möglicherweise desaktivieren sollte, die die gewünschte biologische Aktivität aufweist.
  • Verschiedene Lösungen sind vorgeschlagen worden, um die Aktivitätsverminderung in speziellen Fällen, in denen eine biologisch aktive Entität desaktivierenden Bedingungen ausgesetzt war, zu verlangsamen. Es wurde bisher jedoch kein grundsätzlicher Weg aufgezeigt, um den verschiedenen Desaktivierungsreaktionen mit einem Agenstyp zu begegnen.
  • In einer Veröffentlichung von Zyk et al., (Biochimica et Biophysica Acta, 302:402-28 (1973)):
  • wurden L-Asparaginase/Antikörperkomplexe untersucht, um die Natur und das Ausmaß der Stabilitätswechsel der Enzyme beim Komplexieren mit enzymspezifischem Antikörper zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, daß Antikörper von L-Asparaginase die Stabilität des Enzyms in Hinsicht auf thermische, proteolytische und pH-induzierte Desaktivierung erhöhten. In der EP-A 0 251 001 ist eine Zubereitung von reinem IL-2 offenbart, die über einen langen Zeitraum stabil ist. Die Stabilität wird durch Komplexieren von IL-2 mit einer Anzahl von verschiedenen Serumproteinen erreicht und durch die Resistenz gegenüber Desaktivierung durch Gefriertauen, Lyophilisation oder pH-Wechsel nachgewiesen. Der Komplex ist das Ergebnis einer nichtspezifischen Wechselwirkung zwischen IL-2 und Serumproteinen. EP-A 0 231 649 offenbart einen lagerfähigen Komplex von Albumin und anderen nützlichen Stoffen, wie Vitamin E oder flüssigem Fettöl. Die Bildung des Komplexes, eines Pulvers, bewirkt keine Veränderung der Qualität der darin enthaltenen nützlichen Stoffe. Der Komplex ist das Ergebnis einer nicht spezifischen Wechselwirkung zwischen IL-2 und den Serumproteinen.
  • Es ist daher Zweck dieser Erfindung, Wechselwirkungen zwischen monoklonalen oder einfachkettigen Antikörpern und biologisch aktiven Antigenen zu verwenden, um eine Modulation und insbesondere eine Verlängerung ihrer Aktivität zu bewirken.
  • Es ist ein weiterer Zweck dieser Erfindung, eine biologisch aktive Entität bereitzustellen, die gegen die Desaktivierung einer gewünschten biologischen Aktivität stabilisiert ist.
  • Es ist noch ein anderer Zweck der vorliegenden Erfindung, einen Mechanismus für das langsame Freisetzen einer biologisch aktiven Entität bereitzustellen, um eine Langzeitaktivität zur Verfügung zu stellen.
  • Das wird dadurch erreicht, daß in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Komplexes bereitgestellt wird, der durch eine erhöhte Resistenz gegenüber Desaktivierung gekennzeichnet ist und die Schritte umfaßt (A) Binden eines biologisch aktiven Moleküls mit einem monoklonalen oder einfachkettigen Antikörper, der sich spezifisch an dieses Molekül anlagert, um einen biologisch aktiven Komplex herzustellen; und (B) Messen der Verlängerung der biologischen Aktivität des genannten Komplexes relativ zu der Aktivität des genannten Moleküls für sich allein, wenn der Komplex einer Bedingung unterworfen wird, die das genannte Molekül für sich allein desaktiviert. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt Schritt (A), daß das biologisch aktive Molekül einem monoklonalen Antikörper ausgesetzt wird, der das Molekül erkennt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Antikörperentität ein Antikörperfragment oder ein einfachkettiger Antikörper.
  • In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Komplex bereitgestellt worden, der (i) ein Molekül mit einer biologischen Aktivität und (ii) eine das Molekül erkennende monoklonale oder einfachkettige Antikörperentität umfaßt, wobei der Komplex eine biologische Aktivität zeigt, die bezogen auf die biologische Aktivität des freien Moleküls resistent ist gegenüber Desaktivierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Molekül ein Enzym.
  • In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren bereitgestellt worden, das die Schritte umfaßt (1) Bereitstellen eines Komplexes bestehend aus einem biologisch aktiven Molekül und einer Antikörperentität, wie oben beschrieben, wobei der genannte Komplex zumindest eine freie Bindungsposition für ein markierendes Mittel bietet; (2) den Komplex dem markierenden Mittel so auszusetzen, daß das markierende Mittel an der freien Bindungsposition gebunden wird; und dann (3) Bewirken einer Dissoziation des Komplexes, um das Molekül, das das genannte markierende Mittel trägt, freizusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das biologisch aktive Molekül selbst ein Antikörper.
  • Andere Zwecke, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung ersichtlich werden. Es sollte sich jedoch von selbst verstehen, daß die detaillierte Beschreibung und die speziellen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, der Veranschaulichung dienen.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung veranschaulicht, wobei:
  • Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, bei der die Restaktivität (in Gegenwart von Trypsin) der biologisch aktiven Entität, Asparaginase, als Funktion der Zunahme der Konzentration verschiedener Antikörperentitäten oder anderer Proteine aufgetragen ist, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.
  • Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Restaktivität von Asparaginase in Gegenwart von Trypsin zeigt, wenn das Enzym mit verschiedenen Kombinationen von monoklonalen Antikörpern in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geschützt ist.
  • Es ist festgestellt worden, daß eine breite Vielfalt biologisch aktiver Moleküle durch das Ausnutzen monoklonaler oder einfachkettiger Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen resistent gegenüber Desaktivierung gemacht werden kann, um angreifbare Positionen solcher Moleküle vor schädlichen Einwirkungen einer jeglichen Desaktivierungsreaktion zu schützen, wodurch der Verlust an biologischer Aktivität dramatisch verlangsamt wird.
  • Um eine Verlängerung der biologischen Aktivität in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu erreichen, wird eine Bindungsentität (wie weiter unten definiert) hergestellt, die zumindest eine Position eines Moleküls ("biologisch aktive Entität") erkennt, wobei diese Position für die Aktivität notwendig ist und unter bestimmten Bedingungen, wie disruptive Temperatur- oder pH-Störungen oder die Gegenwart einiger Mittel, wie proteologische Enzyme, Alkohol oder Oxidationsmittel, normalerweise der Desaktivierung unterliegt. Eine geeignete Bindungsentität kann in diesem Zusammenhang ein monoklonaler Antikörper sein, der durch das Anregen des Immunsystems eines standardisierten Labortieres mit der ganzen oder einem Teil der biologisch aktiven Entität erzeugt wird. Alternativ kann die Bindungsentität ein einfachkettiger Antikörper sein, der die biologisch aktive Entität erkennt. Der vorliegenden Erfindung folgend ist es in jedem Fall eine Routinesache, mutmaßliche Bindungsentitäten abzutrennen, diejenigen zu identifizieren, die die erforderlich Spezifität aufweisen, z.B. diejenigen, die die biologisch aktive Entität in einer die Desaktivierung verhindernden Weise binden, ohne die biologische Aktivität unnötig zu verringern.
    • (i) "Biologisch aktive Entität"
  • Insbesondere kann eine für die vorliegende Erfindung geeignete biologisch aktive Entität ein Molekül sein, daß eine gewünschte biologische Reaktion begünstigt oder aktiv an ihr teilnimmt und das zumindest eine erste Position aufweist, die für die gewünschte biologische Reaktion empfindlich ist, zu dieser beiträgt oder an ihr teilnimmt. Im allgemeinen wird eine geeignete biologisch aktive Entität zusätzlich zumindest eine zweite Position aufweisen, die im wesentlichen nicht zu der gewünschten biologischen Reaktion beiträgt.
  • Mit "im wesentlichen nicht zu der Reaktion beitragend" ist gemeint, daß die zumindest eine zweite Position für die Leistungsfähigkeit der ersten Position in der gewünschten biologischen Reaktion nicht wesentlich ist. Insbesondere kann die zweite Position eine Rolle spielen bei Reaktionen, die auf eine Desaktivierung der biologisch aktiven Entität hinauslaufen, bezogen auf die gewünschte biologische Aktivität. Diese Desaktivierung kann sich aus einer physikalischen, chemischen oder biologischen Reaktion ergeben oder aus einer Kombination solcher Reaktionen.
  • Biologisch aktive Entitäten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können z.B. Enzyme, Hormone, Wachstumsfaktoren und Antikörper sein, ebenso wie chemische Spezies, die biologische Umwandlungen bewirken, wie Drogen und Medikamente. Geeignete biologisch aktive Entitäten umfassen Enzyme, wie Amylasen, gleich α-Amylase und β-Amylase; Glucoamylase, Glucose-Ketoisomerase, Invertase; Proteasen, wie Trypsin und Subtilisin; Pectinase , L-Asparaginase, α-1,4-Glucosidase, Cholesterinesterase, Uricase, Katalase, Superoxiddismutase und Glucose-6-phosphatase. Andere biologisch aktive Entitäten sind Interferon, Gewebeplasminogenak tivator und mutierte Proteine derselben und solche Antikörper wie CEA (karzinogenes embryonales Antigen) , Antikörper zu HTLV und Antikörper zu Mäuse-IgG.
  • Für Enzyme, Hormone und ähnlichem wird es üblicherweise eine Vielzahl aktiver erster Positionen geben und im allgemeinen eine Vielzahl zweiter Positionen. In Abhängigkeit von der einzelnen Anwendung nehmen entweder die erste oder die zweite Position, aber nicht beide, an der Antikörper/Antigen-Wechselwirkung teil. Wenn die Bindungsentität (siehe unten) eine Antikörperentität ist, sind solche Positionen Epitope, an denen sich die Antikörperentität anlagert. Im Fall von Drogen und Medikamenten kann die erste Postion eine chemische Konfiguration oder ein Ligand sein, der für die gewünschte biologische Aktivität empfindlich ist, und die zweite Position kann in gleicher Weise eine chemische Konfiguration oder ein Ligand sein.
  • Vorzugsweise sind die erste und die zweite Position räumlich voneinander getrennt, so daß nach dem Verbinden mit der Bindungsentität keine sterische oder andere störende Beeinflussung der ersten durch die zweite Position auftreten kann.
    • (ii) "Bindungsentität"
  • Die Bindungsentität ist insbesondere eine monoklonale Antikörperentität, die einen speziellen Teil oder eine Position der biologisch aktiven Entität "erkennt" (sich daran anlagert). Eine für die vorliegende Erfindung geeignete Antikörperentität kann ein monoklonaler Antikörper sein oder eine Aminosäuresequenz, die den variablen Bereich eines Antikörpers enthält. Eine Antikörperentität kann auch abgeleitete hypervariable Bereiche enthalten, jeweils von den schweren oder leichten Ketten eines Antikörpers, wobei diese Ketten gebunden sein können:
  • - in ihrer natürlichen (in vivo) Konfiguration, z.B. wie in einem Fab-Rest,
  • - über eine chemische Modifikation unter Verwendung von bifunktionalen Linkern, um eine Vernetzung in vitro zu erzielen oder
  • - durch eine Bindungsentität, bestehend aus einer Peptidkette mit variabler Länge, wodurch ein einfachkettiger Antikörper oder ein sogenanntes "Antigen-Bindungs-Protein" bereitgestellt wird, wie z.B. in US-Patent Nr. 4 704 692 offenbart.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann DNA, die sowohl die biologisch aktive Entität wie die Antikörperentität kodiert, durch rekombinierende DNA-Techniken in einen Mikroorganismus oder eine tierische Zelle integriert werden, um die gleichzeitige Synthese beider Entitäten zu bewirken, was zu einem Komplex aus beiden Entitäten führt. Alternativ kann man genauso herangehen, um eine neue, kovalent integrierte Entität zu synthetisieren, die das zu Beginn ausgewählte biologisch aktive Molekül und die zu Beginn ausgewählte Antikörperentität entweder direkt oder über die verbindende Entität miteinander verbindet, wobei die komplementären Positionen der zwei ausgewählten Entitäten einen Komplex bilden.
  • Eine Antikörperentität gemäß der vorliegenden Erfindung sollte daher in der Lage sein, sich an die zweite(n) Position(en) der biologisch aktiven Entität anzulagern, um die Beteiligung der zweiten Position(en) an einer Reaktion, die zu einer Verringerung der gewünschten biologischen Aktivität führt, mit welcher zumindest eine erste Position zusammenhängt, im wesentlichen zu verhindern oder zu verzögern. Die Antikörperentität kann in einer immunologischen Reaktion gebildet werden, wobei die zweite Position als eine antigene oder Antikörper-Erkennungsstelle wirkt; dies ist jedoch nicht essenziell, da die Antikörperentität sich nur an die zweite Position anlagern muß, so daß diese nicht an einer Desaktivierungsreaktion teilnimmt. Des weiteren sollte die Antikörperentität sich an die für die gewünschte biologische Aktivität verantwortlichen Positionen nicht in dem Ausmaß anlagern oder sie störend beeinflussen, daß die gewünschte biologische Aktivität nicht mehr einem nutzbringenden Verwendungszweck dienen kann.
  • Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind gut bekannt, genauso wie Antikörperfragmente, die sich an ein biologisch aktives Molekül anlagern. Ein geeignetes Verfahren kann das Immunisieren eines Kaninchens oder eines anderen Standard-Labortieres mit der biologisch aktiven Entität umfassen, die zuvor modifiziert worden sein kann, um die gewünschten ersten Positionen zu "maskieren" und die Bildung von hemmenden Antikörpern zu verhindern, die die ersten Positionen erkennen. Es kann z.B. zunächst ein Antikörper hergestellt werden, der sich an die erste Position anlagert; dann kann der Komplex aus diesem Antikörper und dem biologisch aktivem Molekül als Antigen verwendet werden, um die nicht hemmenden polyklonalen Sera zu stärken. Mittels üblicher Techniken können dann von Tieren erhaltene Antisera als Ausgangsstoff für einen Antikörper verwendet werden, der sich an die biologisch aktive Entität anlagert, ohne deren Aktivität zu zerstören, z.B. um einen Antikörper durch Erkennen der zweiten Position(en), jedoch nicht der aktiven Position der biologisch aktiven Entität, herzustellen.
  • Es können übliche Verfahren der somatischen Fusion angewendet werden, wie z.B. im Überblick dargestellt von Kennett et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 77-91 (1978), um zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete monoklonale Antikörper herzustellen. Mäuse können z.B. in bekannter Weise mit der biologisch aktiven Entität oder einem Teil davon immunisiert werden. Milzzellen der immunisierten Mäuse werden dann entfernt und mit einer immortalisierten Zell-Reihe, wie die Murin-Myeloma-Reihe BALB/C NS-1Ag4-1 (ATCC Nr. TIB18), nach dem Verfahren von Kohler und Milstein, siehe z.B. Nature 256: 495-97 (1975) fusioniert und die sich ergebenden Fusionsprodukte werden nach solchen Produkten durchmustert, die in einer Kultur überleben und monoklonale Antikörper der gewünschten Spezifität herstellen. In dieser Weise können verschiedene Hybridome für die Herstellung monoklonaler Antikörper getestet werden, die zusammen mit der biologisch aktiven Entität einen Komplex bilden, der (relativ zum freien Molekül) unter desaktivierenden Bedingungen eine Langzeitaktivität zeigt.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann eine biologisch aktive Entität analysiert werden, um die spezifischen Positionen zu erkennen, an die sich die Bindungsentität anlagern soll. Es können z.B. Fragmente der biologisch aktiven Entität, die keine aktiven Positionen aufweisen, als Antigen zur Herstellung des Antikörpers verwendet werden, der sich an die biologisch aktive Entität ohne Beeinträchtigung ihrer Aktivität anlagert.
  • Wenn die biologisch aktive Entität selbst ein Antikörper ist, kann ihre das Antigen bindende Position dem vorliegenden zufolge entweder unter Verwendung eines normalerweise durch den Antikörper gebundenen Antigens oder durch einen Anti-ideotypischen Antikörper, z.B. einen Antikörper, der die Antigen-Bindungsposition erkennt, geschützt werden.
    • (iii) "Desaktivierung"
  • Die erfindungsgemäßen Entitäten können bedingt durch physikalische, chemische oder biologische Reaktionen desaktiviert werden, die sich innerhalb der Arbeitsumgebung der Entität ereignen. Z.B. bewirken disruptive Temperaturerhöhungen oder -senkungen, ebenso wie eine Oxidation eine Desaktivierung. Wenn die biologisch aktive Entität ein Enzym ist, kann die Desaktivierung auch durch enzymatische Selbstzerstörung bewirkt werden.
  • Eine erfindungsgemäße biologisch aktive Entität kann in jeder Umgebung eingesetzt werden, in der die Entität vorher eingesetzt wurde, genauso wie in Umgebungen, in denen sie vordem bedingt durch die Kurzzeit-Aktivität nicht praktisch anwendbar war. Z.B. ist die Verwendung von Enzymen als Arzneimittel oder als therapeutisches Agens durch ihren biologischen Abbau oder ihre Desaktivierung im Körper begrenzt; erfindungsgemäß wird ein Mittel bereitgestellt, das dieses Problem überwindet.
  • Ferner kann ein Antikörper, der erfindungsgemäß als biologisch aktive Entität verwendet wird, mit einer gewünschten Droge, einem Agens oder einer anderen Spezies markiert oder komplexiert werden, ohne eine aktive Position des Antikörpers zu beeinträchtigen, die in dem die Immunreaktion auslösenden oder diagnostischen Prozeß benötigt wird. So werden Antikörper oft chemisch modifiziert, um sie zu markieren. Die meisten dieser Reaktionen verlaufen statistisch und ein bestimmter Prozentsatz des Antikörpers verbleibt desaktiviert, bedingt durch die chemische Modifikation der Bindungspositionen. Dies kann erfindungsgemäß verhindert werden, wenn der Antikörper vor der chemischen Modifizierung (Markierung) mit seinem Antigen zur Reaktion gebracht wird, um einen erfindungsgmäßen Komplex zu bilden (vorzugsweise mit einem auf einer festen Oberfläche immobilisierten Antigen), so daß die Bindungsposition besetzt und geschützt ist. Nach Beendigung der Markierungsreaktion kann der Antikörper/Antigen-Komplex dissoziiert werden, z.B. mit einem Puffer mit niedrigem pH, und der markierte Antikörper kann gesammelt und verwendet werden.
  • Umgekehrt kann dann, wenn ein Antigen zu markieren ist, sein Antikörper immobilisiert, das Antigen hinzugefügt und die Markierung (und die anschließende Eluierung) durchgeführt werden, um den Antikörper zu entfernen.
  • Wachstumsfaktoren, wie Interferon und Erythropoietin, haben eine sehr kurze Halbwertszeit in Serum, hauptsächlich bedingt durch den enzymatischen Abbau. Dieses Problem wird beseitigt, wenn das Arzneimittel durch technische Organismen hergestellt wird, im Rahmen derer normale Glykosylierung nicht bewirkt wird und, als Folge davon, Kohlenhydratrückstände, wie sie das spontan entstehende Molekül aufweist, fehlen. Im Fall von Erythropoietin schützen diese Rückstände gegen enzymatischen Abbau. Spezielle erfindungsgemäße Antikörperentitäten ermöglichen einen vergleichbaren Schutz, wodurch die Verwendung des weniger kostspieligen, gentechnisch hergestellten Erythropoietins ermöglicht wird. Wachstumsfaktoren, wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) , die zur Beeinflussung von Wachstum und Proliferation bestimmter Zelltypen verwendet werden, haben eine Wirksamkeit, die durch abbauende Enzyme, die von im Wachstum befindlichen Zellen abgesondert werden, vermindert ist. Ihre Wirksamkeit kann daher erfindungsgemäß durch Verbinden mit einer Antikörperentität verbessert werden.
  • Tierische Wachstumshormone können zur Erhöhung des Körpergewichts oder der Milchproduktion in der Tierzucht verwendet werden. Man hält es jedoch wegen der schnellen Desaktivierung der injizierten Hormone durch proteolytische und andere Enzyme in vitro für notwendig, tägliche Injektionen der Hormone zu geben, was lästig ist. Aber der Schutz der Wachstumshormone durch Binden der Hormone mit spezifischen erfindungsgemäßen Antikörpern kann die Hormone vor enzymatischem Abbau schützen, ohne ihre Wirksamkeit übermäßig zu reduzieren. Folglich kann der wirksame Hormonspiegel mit geringeren Dosen und weniger Injektionen aufrecherhalten werden.
  • Zusätzlich zu dem Schutz von Enzymen gegen Desaktivierung durch andere Enzyme kann die vorliegende Erfindung zum Schutz eines Enzyms gegen Selbstzersetzung eingesetzt werden. Proteolytische Enzyme z.B., wie das in vielen Waschmitteln verwendete Subtilisin, können gemäß der vorliegenden Erfindung durch spezifische Antikörperentitäten gegen Selbstzersetzung geschützt werden.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, eine Markierungsentität zu verwenden, die sonst, bedingt durch Nebenreaktionen, die die gewünschte, die Aktivität aufweisende Position beeinträchtigen, ungeeignet sein könnte. So wird die gewünschte Position zuerst mit der Bindungsentität unter Bildung eines Komplexes verbunden, dann wird der Komplex mit dem Markierungsagens mittels üblicher Verfahren markiert, wobei die Markierungsentität durch die zumindest eine zweite Position gebunden wird. Nachdem die Markierungsentität an die zweite Position gebunden wurde, wird die Bindungsentität durch übliche Verfahren von dem markierten Komplex entfernt, um die markierte biologisch aktive Entität zur Verfügung zu stellen, bei welcher die erste Position frei und das Markierungsagens gebunden ist, so daß es nicht länger für eine Reaktion mit der ersten Position verfügbar ist. Durch die vorliegende Erfindung kann eine biologisch aktive Spezies mit der Bindungsentität komplexiert werden, um eine langsame Freisetzung über die Dauer der Spezies sicherzustellen. In der Weise kann eine einzige hohe Dosis der komplexierten Spezies verwendet werden, die sonst wegen der Toxizität oder wegen Nebenreaktionen unannehmbar sein könnte, und häufig wiederholte Verabreichungen (oder höhere Dosen einer rasch abgebauten Spezies) können folglich vermieden werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird des weiteren unter Bezugnahme auf die folgenden illustrativen Beispiele beschrieben.
    • Beispiel 1. Der Einfluß von Trypsin auf durch Antikörper geschützte und ungeschützte Asparaginase
  • Monoklonale Antikörper (MAbs) von L-Asparaginase wurden nach dem Verfahren von Kohler und Milstein hergestellt. 50 ug von in Phosphatpuffer und "Vollständigem Freund's Adjuvans"(Volumenverhältnis 1:1) suspendierter L-Asparaginase wurden intraperitonal in jede von vier BALB-C Mäusen injiziert. Am 12. Tag nach der Injektion wurde ein erster Booster i.p. in Form von 50 ug des Enzyms in Phosphatpuffer gegeben. Am 15. Tag wurden die Mäuse angezapft und ihr Antikörpertiter wurde durch die ELISA-Methode bestimmt. Diejenigen mit dem höchsten Titer bekamen einen zweiten Booster derselben Zusammensetzung und wurden drei Tage später geopfert und ihre Milzzellen wurden für die Verwendung in einer somatischen Fusion entfernt.
  • Nach 7 Tagen wurden die sich beim Züchten an der Oberfläche befindlichen Hybridome durch das ELISA-Verfahren auf eine positive Reaktion gegen L-Asparaginase getestet. Die am meisten versprechenden Hybride wurden mittels des "Verfahrens der begrenzten Verdünnung" geklont, wie durch Lefkovits und Waldmann in LIMITING DILUTION ANALYSIS OF CELLS IN THE IMMUNE SYSTEM (Cambridge Univ. Press, 1979) offenbart. Es wurden bei der Produktion monoklonaler Antikörper 6 Klone erhalten und in der Reihenfolge Nr. 12, Nr. 19, Nr. 29, Nr. 33, Nr. 34 und Nr. 35 markiert.
  • Fünf Proben eines Enzym-Antikörper-Komplexes wurden wie folgt hergestellt. Zu Proben, die 25ul (0.05 Einheiten) L-Asparaginase enthielten, wurden Antikörper in einer solchen Menge hinzugefügt, daß Verhältnisse von jeweils 1, 2, 6, 10 und 20ug Protein pro Enzymeinheit erhalten wurden. Wasser wurde hinzugefügt, um ein Probenendvolumen von 500ul zu ergeben. In dieser Weise wurden Proben mit den Monoklonen Nr. 12, Nr. 29, Nr. 34 und Nr. 35 und mit Rinderserum Albumin (BSA) hergestellt und vor dem Testen, wie unten beschrieben, über Nacht bei 4ºC aufbewahrt.
  • Zusätzlich wurden 1.5 Aquivalente (3.75ug) jedes enzymspezifischen MAb zu einer Einheit von 0.5 (2.33ug) L-Asparaginase hinzugefügt. In gleicher Weise wurden Proben des Enzym-Antikörperkomplexes unter Verwendung von jeweils 4 MAbs (Nrn. 12, 29, 34 und 35) und 3 MAbs (Nr. 12, 29 und 34) in Kombination hergestellt.
  • Ein Gilford "Response"-Spektrometer mit einem temperaturgesteuerten, 6-Position, 10mm-Kuvettenhalter wurde auf 37ºC eingestellt und 50ul jeder der unter Verwendung von einem monoklonalen Antikörper hergestellten 5 Proben wurde in separate Kuvetten gegeben. Wasser (35ul) und Trypsin (15ul; 1.5 Einheiten) wurden hinzugefügt und die Lösungen wurden bei 37ºC 5 Minuten lang inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Kuvetten herausgenommen und in Eiswasser gekühlt. Nachdem das Spektrometer auf 25ºC abgeglichen worden war, wurden die Kuvetten wieder eingesetzt und über 5 Minuten equilibriert. Wasser (100ul; pH 9.0) und Substrat (200ul) wurden hinzugefügt und mit einer Pasteurpipette gemischt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit (Abnahme der Absorption/Minute bei 197nm) von L-Asparagin zu L-Asparaginsäure wurde für jede Probe bestimmt.
  • In einem separaten Experiment wurden 65ul (0.065 Einheiten) jeder der vier Multi-MAb-Proben in separate Kuvetten des Spektrometers eingefüllt. Wasser (15ul), Trypsin (20ul, 2 Einheiten) und Substrat (200ul) wurden hinzugefügt und die Umwandlungsgeschwindigkeit von L-Asparagin zu L-Asparaginsäure wurde für jede Probe bestimmt. Eine Kontrollprobe, hergestellt durch Verdünnen von 25ul des Enzyms mit Wasser auf ein Endvolumen von 650ul wurde ebenfalls mit und ohne Zugabe von Trypsin laufen gelassen.
  • Ein Diagramm der Rückstandsaktivität von L-Asparaginase, aufgetragen gegen die Antikörperkonzentration (pro Einheit von L-Asparaginase zugefügte pg an Protein) für jede der 4 Einfach-MAb-Proben und für die BSA-MAb-Probe ist in Fig. 1 dargestellt. Die prozentuale Umwandlung von 1 mM L-Asparaginase zu L-Asparaginsäure ist in Fig. 2 für die Multi-MAb-Proben gegen die Zeit aufgetragen. Diese Ergebnisse zeigen, daß (1) das Ausmaß des Schutzes von MAb zu MAb variierte, wobei Nr. 12 am wirksamsten war und (2) ein ungebundenes Protein (BSA) praktisch keinen Schutz gibt. Ein merkliches Ausmaß an Schutz wurde allein mit MAb Nr. 12 erreicht
  • --ungeschütztes, von Trypsin angegriffenes Enzym verlor unter denselben Bedingungen über 90% seiner Aktivität-- aber ein Schutz, der sich an das Ergebnis der nicht angegriffenen Kontrollprobe annähert, erforderte die Verwendung von 4 oder 5 monoklonalen Antikörpern.

Claims (32)

1. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Komplexes, charakterisiert durch eine gesteigerte Resistenz gegenüber Desaktivierung, das folgende Schritte umfaßt
(A) Verbinden eines Moleküls, das biologisch aktiv ist, mit einem monoklonalen Antikörper oder einem einfachkettigen Antikörper, der sich zur Bildung eines biologisch aktiven Komplexes spezifisch an das genannte Molekül anlagert; und
(B) Messen einer Verlängerung der biologischen Aktivität des genannten Komplexes relativ zu der Aktivität des genannten Moleküls allein, wenn der genannte Komplex einer Bedingung unterworfen wird, die das genannte Molekül allein desaktiviert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Molekül ein Enzym ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die genannte Bedingung ausgewählt ist aus disruptiver Temperatur, der Gegenwart eines proteolytischen Enzyms, disruptivem pH, der Gegenwart eines oxidierenden Agens und der Gegenwart eines Alkohols.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die genannte Bedingung die Gegenwart eines proteolytischen Enzyms ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die genannte Bedingung ausgewählt ist aus disruptivem pH, der Gegenwart eines oxidierenden Agens und der Gegenwart von Alkohol.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das genannte Molekül Subtilisin ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das genannte Molekül α-Amylase ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das genannte Molekül L-Asparaginase ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das genannte Molekül Trypsin ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das genannte Molekül Glucoamylase ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt (A) das Verbinden eines Moleküls, das biologisch aktiv ist, mit einem monoklonalen Antikörper umfaßt, der sich an das genannte Molekül zur Bildung eines Komplexes spezifisch anlagert, wobei die biologische Aktivität des genannten Komplexes relativ zu der Aktivität des genannten Moleküls allein verlängert ist, wenn der genannte Komplex einer Bedingung unterworfen wird, die das genannte Molekül allein desaktiviert.
12. Komplex, der (i) ein Molekül mit einer biologischen Aktivität enthält und (ii) eine Antikörperentität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem monoklonalen Antikörper und einem einfachkettigen Antikörper, der sich an das genannte Molekül spezifisch anlagert, wobei die biologische Aktivität des genannten Komplexes relativ zu der biologischen Aktivität des genannten Moleküls allein verlängert ist, wenn der genannte Komplex einer Bedingung unterworfen ist, die das genannte Molekül allein desaktiviert.
13. Komplex nach Anspruch 12, wobei das genannte Molekül ein Enzym ist.
14. Komplex nach Anspruch 13, wobei das genannte Molekül Subtilisin ist.
15. Komplex nach Anspruch 13, wobei das genannte Molekül α-Amylase ist.
16. Komplex nach Anspruch 13, wobei das genannte Molekül L-Asparaginase ist.
17. Komplex nach Anspruch 13, wobei das genannte Molekül Trypsin ist.
18. Komplex nach Anspruch 13, wobei das genannte Molekül Glucoamylase ist.
19. Komplex nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei der genannte Komplex (i) ein Molekül mit einer biologischen Aktivität enthält und (ii) einen monoklonalen Antikörper, der das genannte Molekül erkennt.
20. Komplex nach Anspruch 12, wobei der genannte Komplex das Produkt eines Verfahrens ist, das folgende Schritte beinhaltet:
(A) Verbinden des genannten Moleküls und der genannten Antikörperentität, so daß ein Molekül-Antikörperentität-Komplex gebildet wird; und
(B) Messen der Aufrechterhaltung der genannten biologischen Aktivität durch den genannten Komplex relativ zu der Aktivität des genannten Moleküls allein, wenn der genannte Komplex einer Bedingung unterworfen wird, die das genannte Molekül allein desaktiviert.
21. Komplex nach Anspruch 20, wobei die genannte Bedingung die Gegenwart eines proteolytischen Enzyms ist.
22. Komplex nach Anspruch 20, wobei mehr als ein monoklonaler Antikörper oder einfachkettiger Antikörper an das genannte Molekül gebunden ist.
23. Verfahren zur Markierung eines biologisch aktiven Moleküls, dar die Schritte beinhaltet:
(A) Bereitstellen eines Komplexes, der ein Molekül enthält, das biologisch aktiv ist und einen Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Molekül zumindest eine Bindungsposition für ein Markierungsagens aufweist;
(B) den genannten Komplex dem genannten Markierungsagens auszusetzen, so daß das genannte Markierungsagens sich an die genannte Bindungsposition anlagert; und dann
(C) Bewirken einer Dissoziation des genannten Komplexes, um das genannte, an das genannte Markierungsagens gebundene, Molekül freizusetzen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das genannte Molekül ein Antikörper ist.
25. Komplex nach Anspruch 12, der ein rekombinanter, gleichzeitig synthetisierter Komplex ist, der eine biologisch aktive Entität enthält, die durch eine Bindungsentität kovalent an einen einfachkettigen Antikörper gebunden ist.
26. Eine kontinuierliche, rekombinante DNA-Sequenz, die den rekombinanten Komplex nach Anspruch 25 kodiert.
27. Rekombinanter Komplex nach Anspruch 25, wobei die biologisch aktive Entität einem Enzym entspricht.
28. Rekombinanter Komplex nach Anspruch 25, wobei die biologisch aktive Entität einem Hormon entspricht.
29. Rekombinanter Komplex nach Anspruch 25, wobei die biologisch aktive Entität einem Wachstumsfaktor entspricht.
30. Rekombinanter Komplex nach Anspruch 25, wobei die biologisch aktive Entität einer Droge entspricht.
31. Rekombinanter Komplex nach Anspruch 25, wobei die biologisch aktive Entität einem Antikörper entspricht.
32. Rekombinanter Komplex nach Anspruch 25, wobei die genannte desaktivierende Bedingung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus disruptiver Temperatur, disruptivem pH, der Gegenwart eines proteolytischen Enzyms, der Gegenwart eines oxidierenden Agens und der Gegenwart eines Alkohols.
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