DE3884200T2

DE3884200T2 - Verfahren zur Behandlung von Mastitis und anderen Staphylokokkeninfektionen.

Info

Publication number: DE3884200T2
Application number: DE88308667T
Authority: DE
Inventors: Peter Blackburn; June Pollack
Original assignee: Applied Microbiology Inc
Current assignee: Applied Microbiology Inc
Priority date: 1988-08-29
Filing date: 1988-09-19
Publication date: 1994-02-03
Anticipated expiration: 2008-09-20
Also published as: AU2179388A; EP0359873A1; EP0359873B1; AU623864B2; DE3884200D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Behandlung und Vorbeugung von Staphylokokkeninfektionen, insbesondere - jedoch nicht ausschließlich - zur Behandlung und Vorbeugung boviner Staphylokokkenmastitis.
Lysostaphin ist ein Bakteriozin, das durch einen einzelnen bekannten Stamm von Staphylococcus simulans abgesondert wird und ursprünglich durch Schindler und Schuhardt isoliert und Staphylococcus staphylolyticus benannt wurde. Die Produktion von Lysostaphin durch S. staphylolyticus wurde bereits im US- Patent No. 3 278 378, veröffentlicht am 11.10.1966, und in den "Proceedings of the National Academy of Sciences", Band 51, S. 414 - 421 (1964), beschrieben. Der einzelne Organismus S. staphylolyticus (NRRl B-2628), der Lysostaphin produziert, wurde kürzlich als ein Biovar von S. simulans durch Sloan et al., Int. J. System. Bacteriol., Band 32, S. 170 bis 174 (1982) identifiziert. Da der Name S. staphylolyticus sich nicht auf der "Approved list of Bacterial Names", befindet, wurde der Lysostaphin produzierende Organismus wieder S. simulans benannt.
Bakteriozine sind Proteine, die von Bakterien abgesondert werden, die verwandte Bakterien abtöten und manchmal lysieren. Z. B. lysiert und tötet Lysostaphin praktisch alle bekannten Staphylokokkenarten ab, ist aber inaktiv gegen Bakterien aller anderen Gattungen. Lysostaphin, isoliert aus Kulturfiltraten von S. simulans (NRRL B-2628) und angezüchtet nach entsprechenden Publikationen, ist eine Endopeptidase, die die Polyglyzin-Querverbindung des Peptidoglycans, das in den Zellwänden der Staphylokokken gefunden wird, aufspaltet. Zusätzlich scheinen die Kulturen, die Lysostaphin produzieren, resistent gegen seine Aktivitäten zu sein, während Kulturen, die unter Bedingungen angezüchtet werden, bei denen Lysostaphin nicht produziert wird, empfindlich sind.
Frühere Studien haben gezeigt, daß Lysostaphin durch Fermentationstechniken gewonnen werden kann, wobei S. simulans in Flüssigkeitskulturen angezüchtet wird. Solche Fermentationstechniken werden im US-Patent No. 3 278 378 und in den "Proceedings of the National Academy of Sciences", Band 51, s. 414 - 421 (1964) beschrieben. Bei der Produktion von Lysostaphin durch Fermentationstechniken wurden verschiedene Verbesserungen erzielt, was in den US-Patenten No. 3 398 056, und 3 594 284 dokumentiert ist. Die letzten beiden Referenzen offenbaren Verbesserungen am Kulturmedium und bei Beimpfungstechniken, wodurch die Produktion von Lysostaphin durch Fermentation beschleunigt und verbessert wird. Lysostaphin wird durch S. simulans während der exponentiellen Wachstumsphase als inaktiver Vorläufer produziert. Das Proenzym wird durch Protease zum aktiven reifen Enzym umgewandelt, erzeugt durch Kulturen von S. simulans in der stationären Phase.
Zusätzlich kann Lysostaphin durch rekombinante Mikroorganismen, wozu die Stämme von E. coli, Bacillus subtilis und B. sphaericus, die das Lysostaphin-Gen ausdrücken, gehören, produziert werden. Im Gegensatz zur natürlichen Produktion akkumuliert sich Lysostaphin während der exponentiellen Wachstumsphase im Kulturmedium von rekombinanten, Lysostaphin produzierenden Stämmen als ein vollständig verändertes, reifes, aktives Enzym und frei von immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen.
Bovine Mastitis ist ein kostspieliges Problem für die Milchwirtschaft, das allein in den Vereinigten Staaten Unkosten von 2 Milliarden $ pro Jahr verursacht. Man schätzt, daß die Krankheit 50 % der amerikanischen Milchkühe bis zu einem bestimmten Grad betrifft, dieses führt zu unbrauchbarer Milch, sinkender Milchproduktion, und in Fällen einer schweren Infektion bis zum Tod des Tieres.
Mastitis wird durch eine Infektion der Milchdrüsen verursacht, hauptsächlich durch Staphylococcus aureus oder Streptococcus agalactiae und in einem geringeren Ausmaß durch E. coli und andere gram-negative Bakterien oder durch Mischinfektionen. Die meisten Streptokokkeninfektionen erwiesen sich durch die Anwendung konventioneller Antibiotika als effektiv behandelbar. Jedoch hat sich die Heilung einer Staphylokokkenmastitis als schwieriger erwiesen.
Die traditionelle Vorbeugung der bovinen Mastitis bedeutet die aufwendige Anwendung einer Desinfektionslösung, die zum täglichen Benetzen der Zitzen (Dippen) aufgetragen wird, (siehe J. S. McDonald, 6 Veterinary Clinics of North America large Animal Practice 269 (1984), und in einigen Fällen können die lösungen zur Zitzenbenetzung (Dippen) Antibiotika beinhalten. Man muß eine prophylaktische Antibiotikaanwendung mit Vorsicht handhaben, um die Selektion der antibiotikaresistenten Stämme zu minimieren. Wenn eine Infektion auftritt, ist eine intramammare Infusion von Antibiotika indiziert. Eine antibiotische Therapie dieser Art kann die Infektion so weit reduzieren, dar die produzierte Milch zu verkaufen ist, aber es führt im allgemeinen nicht zu einer kompletten Elimination der kausalen Organismen.
In der Vergangenheit zeigte die Staphylokokkenmastitis eine nur ungenügende Reaktion auf Antibiotika-Gaben und eine Tendenz, daß die Infektionen wieder auftreten und chronisch werden können. Studien über die Mastitis haben ergeben, daß ein Teil des Problems in der Behandlung von Mastitis ist, daß eine erhebliche Zahl der Staphylokokken in den Milchdrüsen innerhalb der phagozytierenden, polymorphkernigen, neutrophilen Leukozyten (PMN) lebensfähig verbleibt. Man glaubt, daß die Staphylokokken innerhalb der PMN vor den Auswirkungen der Antibiotika geschützt bleiben, und wenn eine Lysis der Leukozyten auftritt, können die phagozytierten Staphylokokken zu einer neuen Quelle einer Mastitis verursachenden Vermehrung von Staphylokokken werden.
Studien über die möglichen Mechanismen der Wirkungslosigkeit der Antibiotika den phagozytierten Staphylokokken gegenüber bei der Mastitisbehandlung zeigen, daß Lysostaphin als eine Möglichkeit zum Zerstören der phagozytierten Staphylokokken abzulehnen sei. Craven et al., 29 Research in Veterinary Science 57 (1980); Craven et al., 5 Comp. Immun. Microbial. Infect. Dis. 447 (1982); Craven et al., 51 Journal of Dairy Research 513 (1984); Craven et al., 44 Am. J. Vet. Res. 709. In diesen Experimenten wurde Lysostaphin in vitro benutzt, um die extrazellulären Staphylokokken vor oder während des Aussetzens der phagozytierten Staphylokokken der verschiedenen Testantibiotika, inklusive synthetischer Penicilline, wie Cloxacillin und Gentamicin oder Lysostaphin, zu zerstören. Die Ergebnisse von Craven et al. zeigen deutlich, daß Lysostaphin keine Wirkung auf Mastitis haben würde, da intrazelluläre Staphylokokken nach 20stündiger Inkubation in einer Lysostaphinhaltigen lösung immer noch lebensfähig wären, 51 Journal of Dairy Research, s. 515 - 516 und Tabelle 2.
Es wurde auch berichtet, daß Lysostaphin menschliche Monozyten penetriert. Da Monozyten ein anderer Zelltyp als PMN sind, ist dieses menschliche Modell wahrscheinlich nicht auf die Behandlung der bovinen Mastitis anwendbar (van den Broek et al., 21 Scand. J. Immunol. 189 (1985).
Man hat nachgewiesen, daß Lysostaphin auch bei der Behandlung renaler Staphylokokkenabzesse bei Mäusen wirksam ist, besonders wenn man es in einer Reihenfolge mit der Gabe von Methicillin verwendet. Dixon et al., 41 Yale J. Biol. Med. 62 (1968).
Beim Menschen wurde Lysostaphin auch als therapeutisches Agens zur Behandlung von chronischen Staphylokokkennaseninfektionen benutzt (Quickel, Jr. et al., 22 Applied Microbiology 446 (1971)). In einem Fall einer resistenten Staphylokokkeninfektion wurde Lysostaphin systemisch gegeben (Stark et al., 291 Medical Intelligence 239 (1974)). Im allgemeinen jedoch hatte es in der Ärzteschaft und bei den Tierärzten große Skepsis und Zurückhaltung in Bezug auf die systemische Gabe von Lysostaphin gegeben. Man schätzte Lysostaphin zu immunogen ein, als daß man es für etwas anderes als eine topische Applikation benutzen könnte.
Man hat festgestellt, daß Lysostaphin als eine Zusammensetzung mit überraschender Wirksamkeit zum Abtöten von Staphylokokken formuliert werden kann, besonders um einer Staphylokokkenmastitis vorzubeugen oder zu heilen, selbst in ihrer chronischen Form, ohne gegenteilige immunogene Effekte zu beobachten. Die Zusammensetzung beinhaltet Lysostaphin, vorzugsweise in einer Konzentration von wenigstens 0,01 mg/ml und wenigstens einem zellwandaktiven Antibiotikum, insbesondere Penicillin, in einer synergistischen Kombination, wie dargelegt in Anspruch 1. Als ein Prophylaktikum kann die Zusammensetzung als Teil einer täglichen Zitzenbenetzungsanwendung (Dippen) eingeführt werden. Die Zusammensetzung beinhaltet wenigstens ein anderes bakteriolytisches Agens, wie Mutanolysin, ein Bakteriocin, produziert durch Streptococcus globisporus, das wirksam gegen Streptokokken ist; und Lysozym, ein muralytisches Enzym, welches das Polysaccharidgerüst des Peptidoglycans in den Zellwänden von gram-positiven und gram-negativen Bakterien hydrolysiert. Die Rezeptur kann auch ein chelatbildendes Agens, wie z. B. Ethylendiamin- Tetra-Essigsäure (EDTA) enthalten; und ein mild oberflächenentspannendes Agens, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 %, dieses soll die bakterizide Wirkung verstärken. Passende milde, oberflächenentspannende Agenzien beinhalten, u. a. die Ester der Polyoxyethylen-Sorbitan und Fettsäuren (Tween series), Octylphenoxy-Polyethoxy-Ethanol (Triton-X series), n-Octyl-β-D-Glucopytranoside, n-octyl-β- D-thioglucopyranoside, n-Decyl-β-D-Glucpytranoside, n-Dode- cyl-β-D-Glucopyranoside und biologisch auftretende Surfactants, z. B. Fettsäuren, Glyzeride, Monoglyzeride, Deoxycholate und Ester der Deoxycholate.
Die Kombination von Lysostaphin und Penicillin entfaltet solch eine Synergie, daß ein 1000facher Anstieg bei der Abtötung der Staphylokokken in vitro beobachtet worden ist.
Infusionen einer therapeutisch wirksamen Menge an Lysostaphin mit oder ohne oberflächenentspannendem Agens oder EDTA, aber mit Penicillin oder anderen genannten antibiotisch potenzierenden Agenzien werden benutzt, um eine Elimination der Staphylokokkeninfektion zu erreichen. Während solche Infusionen zwischen 2 bis 400 mg Lysostaphin enthalten, wenn keine potenzierenden Agentien vorhanden sind, können die erforderlichen effektiven Dosen des Lysostaphins in Kombinationen, wie sie in dieser Erfindung verwendet werden, (als ein Ergebnis ihrer synergistisch verbesserten Aktivität) bis zu 1000fach verringert werden.
Die synergistische bakterizide Wirkung des Lysostaphins und des Penicillins wurde selbst bei Anwendung bei penicillinasepositiven S. aureus und methicillin-resistenten S. aureus ("MRSA") beobachtet. MRSA sind gewöhnlich sowohl gegen eine Vielzahl von Antibiotika resistent und außergewöhnlich problematisch besonders beim Menschen, als auch schwierig abzutöten. Die Lysostaphin/Penicillin-Kombination würden zur Anwendung in besonderen Situationen, in denen eine schwere MRSA-Infektion nicht durch konventionelle Antibiotika (z. B. Penicillin) kontrolliert werden kann, indiziert sein. Zusätzlich kann Penicillin oder ähnlich wirkende Substanzen (zellwandwirksame Antibiotika) zusammen mit Lysostaphin als ein Agens gegen Staphylokokkeninfektion und -kontamination nützlich sein.
Während die Verwendbarkeit der Lysosthapin-enthaltenden Rezepturen gemäß der Erfindung nur in Zusammenhang mit der Mastitisbehandlung dargestellt wird, macht die verstärkte Wirksamkeit des Lysostaphins in diesen Rezepturen diese verwendbar für eine Anzahl anderer Anwendungen, die Staphylokokkeninfektionen und -kontaminationene umfaßt. So könnten die Rezepturen zur Bekämpfung von Staphylokokkeninfektionen durch Einarbeiten in Wundverbandsmaterial und Medikationen, Desinfektionshandreinigungsmittel, Wischtücher oder Lotionen oder in chirugischen Implantaten benutzt werden. Die Rezepturen könnten auch zur Reinigung von medizinischen Instrumenten, Fußböden, Wänden, Betten und ähnlichen Erfordernissen, wo Umgebungsdesinfektion gewünscht wird, benutzt werden. Eine andere mögliche Verwendung beinhaltet den Gebrauch als nasale Infusion, um die intranasale Übertragung von Staphylokokken zu reduzieren, und nahrungsmittelbezogene Benutzung, wie die Behandlung von Fleisch, Eirne, Käse und Fisch oder Nahrungsmittelverpackungen und Handhabungsgerät.
Figur 1 stellt ein Chromatogramm von Lysostaphin dar, produziert durch den transformierten B. sphaericusStamm 00, der das rekombinante Plasmid pBC16-1L enthält, das für Lysostaphin codiert ist.
Lysostaphin zum Gebrauch gemäß der beanspruchten Erfindung kann entweder aus natürlichen oder rekombinanten Quellen erhalten werden. Vorzugsweise wird Lysostaphin vom Bacillus sphaericus Stamm 00 gewonnen, der ein rekombinantes Plasmid enthält, welches die Synthese von Lysostaphin einleitet, dieses sorgt für ein hohes Niveau an Lysostaphinproduktion, gänzlich frei von immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen, und erleichterte Lysostaphinreinigung, da sich das Lysostaphin direkt in dem Anzuchtsmedium ansammelt. Man hat herausgefunden, daß die Bacillus sphaericus-Transformanten, die das Plasmid pBC16-1L enthalten, sich besonders für diesen Zweck eignen, obwohl andere Stämme auch als eine Quelle für Lysostaphin nutzbar sind. Eine Methode zur Gewinnung von Lysostaphin von Mikroorganismen, die durch rekombinante Plasmide transformiert worden sind, und das Gen enthalten, das für Lysostaphin codiert ist, wird in der US-Patentanmeldung 034 464, die eine kontinuierliche Fortsetzung der US-Anmeldung 852 407 ist, vollständig beschrieben. Auf beide Anmeldungen wird hier Bezug genommen.
Prophylaktische Zusammensetzungen zur Behandlung von boviner Mastitis gemäß der Erfindung beinhalten die Verwendung von Lysostaphin-/zellwandaktiven, antibiotika-enthaltenden Zitzenbenetzungsmitteln. Solche Lysostaphin-enthaltenden Zitzenbenetzungsmittel sorgen für eine wirksame Vorbeugung boviner Mastitis, wenn sie vor und nach jedem Melken aufgetragen werden. Vorzugsweise wird die vorbeugende Maßnahme bei allen Kühen der Herde angewendet. Vorzugsweise enthalten die Zitzenbenetzungsmittel ungefähr 1,0 ug/ml Lysostaphin in einem akzeptablen Träger. Zusätzlich können die Zitzenbenetzungsmittel zum Gebrauch gemäß der Erfindung ungefähr 1,0 ug/ml Mutanolysin, ungefähr 10 ug/ml Lysozym und ein mildes oberflächenentspannendes Agens beinhalten. Akzeptable Träger sind solche, die für ein gepuffertes Medium mit einem pH-Wert von ungefähr 8,0 sorgen und wässrige Puffer oder hydrophile Salbengrundlagen enthalten. Z. B. können nichtionische Detergentien, Fettsäuren oder andere milde oberflächenentspannende Agenzien, Proteinträger, wie Serumalbumin oder Gelatine, pulverige Zellulose und Carmel als Trägerstoff verwendet werden. Das Zitzenbenetzungsmittel gemäß dieser Erfindung kann auch vorteilhafterweise chelatbildende Agenzien enthalten, wie EDTA, Farbstoffe und Lösungsmittel, wie Glycerol oder Sorbit.
Mutanolysin wird von Streotomyces globisporus gewonnen. Lysozym wird aus Hühnereiweiß gewonnen.
Die intramammare Infusion von Lysostaphin kann zur wirksamen Behandlung von infizierten Tieren, die entweder eine chronische oder eine akute bovine Staphylokokkenmastitis trotz einer prophylaktischen Behandlung entwickelt haben, angewendet werden. Eine einzelne Dosis von 2 bis 400 mg Lysostaphin pro Milchdrüse wird die Infektion eliminieren und die Staphylokokkenmastitis in den meisten Fällen heilen. Zusätzliche Dosen von Lysostaphin können dort angezeigt sein, wo die Infektion persistiert. Dosen, die erheblich höher als 400 mg liegen, werden nicht empfohlen, da sie zu ungewollten und zu potentiell gegenteiligen Nebeneffekten führen können, die eine vorübergehende Schwellung, Empfindlichkeit und herabgesetzte Milchproduktion umfassen. Diese Nebenwirkungen sind auf das zu behandelnde Euterviertel beschränkt, jedoch können höhere Dosen bei einem einzelnen Euterviertel bei schweren und lebensbedrohenden Situationen indiziert sein. In lebensbedrohlichen Fällen könnte eine andersartige Applikation als das infizierte Viertel angezeigt sein, um so eine systemische Gabe zu erreichen, das bedeutet, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre und rektale oder orale Applikation von entsprechend eingekapselten Rezepturen, in denen das Lysostaphin vor einer Inaktivierung im Darm geschützt wird.
Es erwies sich, daß die Infusion einer Kombination von Lysostaphin und Penicillin wegen einer offensichtlich synergistisch verbesserten bakteriziden Aktivität in dieser Kombination überraschenderweise viel wirkungsvoller als die Applikation von Lysostaphin allein ist. Man glaubt, daß die therapeutischen Zusammensetzungen andere zellwandaktive, antibiotische Agenzien beinhalten können, die die bakterizide Aktivität des Lysostaphins potenzieren, z. B. synthetische Penicilline. Die Zusammensetzungen können auch chelatbildende Agenzien enthalten, milde, oberflächenentspannende Agenzien, (z. B. Desoxycholat) und andere membranaktive Agentien, die die Penetration von Lysostaphin zum Ort der Infektion erleichtern. In Rezepturen, die z. B. Penicillin beinhalten, kann die Dosis des Lysostaphins als ein Ergebnis der potenzierten, bakteriziden Aktivität des Lysostaphins herabgesetzt werden. Da eine so hohe Dosis von Lysostaphin ungewollte und potentiell gegenteilige Nebeneffekte induzieren kann, ist dieser synergistische Effekt nicht nur allein für die Wirksamkeit wichtig, sondern auch für die Vermeidung der potentiellen Nebenwirkungen. In den folgenden darstellenden Beispielen sind die Bezeichnungen "Tween" und "Triton" registrierte Warenzeichen.

Beispiele 1 bis 4

Es wurden in vitro-Experimente durchführt, um die bakterizide Aktivität des Lysostaphins, Mutanolysins und der Lysozymzusammensetzungen gegen S. aureus und anderer pathogener Mastitiserreger zu bestimmen. Das Protokoll war wie folgt:

Protokoll zur Lebendzellbestimmung

1. Bakterielle Zellen (im allgemeinen 10&sup9; Zellen pro Milliliter) von einer übernacht-Platte (inkubiert bei 37 º C) werden in Tris-Puffer (20 mM Tris, pH 8) resuspendiert.
2. 10ul einer bakteriellen Zellsuspension und 1 ml einer kontroll- und Zitzenbenetzungsmittelprobenrezeptur (d. h. Milch, Puffer oder gepufferte Detergentien etc., die die Lysostaphinzusammensetzung enthalten) wurden kombiniert.
3. Die Zellen wurden für unterschiedlich lange Zeiten bei 37 º C inkubiert.
4. Die bakteriellen Suspensionen wurden für 2 Minuten in einer Benchtop-Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren.
5. Das Kügelchen wurde zweimal mit 1,0 ml Phagenpuffer gewaschen.
6. Die Zellen wurden in 1,0 ml Phagenpuffer resuspendiert, und entsprechend in Reihen mit Phagenpuffer versetzt, und 100ul wurden auf GL Agar (S. aureus, E. coli, Klebsielle-pneumoniae) oder Trypsin Soja Agar (S. agalactiae) geimpft.
7. Die Platten wurden bei 37 º C über Nacht inkubiert, kontrolliert, und die Testplatten wurden nach koloniebildenden Einheiten (nachfolgend KbE) ausgezählt, um die prozentuale überlebensrate zu bestimmen.

Zusammensetzung des Phagenpuffers:

50 mM Tris, pH 7,8; 1 mM MgSO&sub4;; 4mM CaCl&sub2;; 100 mM NaCl; Gelatine, 1,0 g/l. (Phagenpuffer hilft, jene Protoplasten und Spheroplasten, die während der Behandlung nicht lysiert worden sind, zu stabilisieren).

Zusammensetzung des GL Agars pro Liter:

Difco Casaminosäure, 3,0 g; Difco Hefeextrakt, 3,0g; NaCl, 5,9 g; Na-Lactat (60 % w/v), 3,3 ml; 25 % (v/v) Glycerol, 4,0 ml; Agar, 15 g; pH eingestellt bei 7,8.

Zusammensetzung des Trypsin-Soja-Agars pro Liter:

Bacto-Trypsin, 15 g; Bacto Soja, 5 g; NaCl, 5 g; Agar, 15 g; pH eingestellt bei 7,3.
Die Ergebnisse der in vitro-Experimente, die die bakterizide Wirksamkeit der verschiedenen therapeutischen Lysostaphinrezepturen zeigt, werden in den Tabellen IA - IC dargestellt. Die Ergebnisse werden als prozentuale Überlebensraten für die S. aureus-Stämme Newbould 305, Stamm RN451, der penicillin-resistenten Stämme RN1753 (Penicillinaseproduzenten) und der Col-Stamm (methicillin-resistent) angegeben.
Tabelle IA stellt die Ergebnisse für Rezepturen dar, die 1 ug/ml, 0,1 ug/ml, 0,01 ug/ml and 0,00 ug/ml (CNTRL) Lysostaphin enthalten. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, waren alle getesteten Gehalte an Lysostaphin wirksam, um die Organismen in einem Puffervehikel (50 mM Tris, pH 8,0) abzutöten. In einem Milchvehikel reduzierten nur 1 ug/ml und 0,1 g/ml bakterielles Leben.
Tabelle IB zeigt die Wirkung der Gabe eines milden, nichtionischen, oberflächenentspannenden Agens, Octylphenoxylpolyethoxy(10)Ethanol, (Triton X-100), zur Lysostaphinrezeptur. Z. B. überlebten 0,001 % der Zellen, als sie 0,1 ug/ml Lysostaphin und 0,1 % Triton X-100 ausgesetzt wurden, während jeweils 2,2 % und 7,7 % überlebten, als sie den einzelnen Verbindungen ausgesetzt wurden. Noch überraschender war, daß eine Überlebensrate von 0,001 % bei 0,01 ug/ml Lysostaphin und 0,1 % Triton X-100 beobachtet wurde.
Tabelle IC zeigt die synergistische Wirkung der Lysostaphin/Penicillin-Kombinationen auf drei Staphylokokkenstämme Abhängig von der jeweiligen Dosis kann die Kombination von Lysostaphin plus Penicillin 100 bis 1000mal mehr wirksam sein als die alleinige Gabe von Lysostaphin oder Penicillin bei allen drei Stämmen.
Tabelle ID zeigt die Wirkung der Kombination von Lysostaphin und Penicillin, verglichen mit ihrer nacheinander erfolgenden Wirkung auf S. aureus. S. aureus wurde mit 10&sup7; Zellen/ml in Milch suspendiert und wurde für die Zeiten, die in der Tabelle jeweils für Lysostaphin und Penicillin zusammen oder aufeinanderfolgend angegeben wurden, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben zentrifugiert, um Zellkügelchen zu erhalten, die zweimal gewaschen wurden, und in 1,0 ml Phagenpuffer resuspendiert wurden, versetzt und 100 ul auf GL Agar aufgebracht wurden. Die koloniebildenden Einheiten (KbE) wurden nach der Ubernacht-Inkubation bei 37 º C ausgezählt, um die prozentuale Uberlebensrate relativ zu geeigneten Kontrollen zu bestimmen. Die Lysostaphin/Penicillin-Kombination entfaltet eine synergistisch verbesserte bakterizide Aktivität gegen S. aureus, diese ist wenigstens 3 Ordnungen größer, als sie beobachtet werden kann, wenn beide Agenzien aufeinanderfolgend zugegeben werden. Tabelle IA Die Wirkung von Lysostaphin auf die Lebensfähigkeit von S. aureus Stamm Vehikel Inkubationszeit prozentuale Überlebensrate Kontrollgruppe (CNTRL) S. aureus Newbould 305 Milch Puffer Tabelle IB Die Wirkung von nichtionischen Detergentien auf die bakterizide Aktivität von Lysostaphin auf S. aureus Stamm Vehikel Inkubationszeit prozentuale Überlebensrate Kontrollgruppe (CNTRL) S. aureus RN451 Puffer +0,1 % Triton Tabelle IC Die Wirkung von Penicillin auf die bakterizide Aktivität von Lysostaphin auf S. aureus Stamm Vehikel Inkubationszeit prozentuale Überlebensrate Kontrollgruppe (CNTRL) S. aureus RN451 RN1753 penicillinase positiv Col Methicillinresistent Milch Tabelle ID Ein Vergleich des Effekts der Kombination von Lysostaphin und Penicillin gegenüber ihren nacheinander erfolgenden Wirkungen auf die Überlebensrate von Staphylococcus aureus (Stamm RN451) in Milch bei 37 º C Kombination (2H) prozentuale Überlebensrate lspn = Lysostaphin; pen = Penicillin
Zusätzlich ergaben die jeweiligen Analysen von Lysostaphin-, Mutanolysin- und Lysozym-Aktivitäten, die den Abfall der Trübheit bei 600 nm der Suspensionen von lebenden S. aureus, S. agalactiae und E. coli und Klebsiella pneumoniae messen, daß die chelatbildenden Agenzien (z. B. EDTA) die lytische Aktivität von jedem der drei bakteriolytischen Enzyme potenzieren.
Die Daten zeigen, daß Lysostaphin sehr schnell agiert, hochwirksam Staphylokokken abtötet, und daß die bakterizide Aktivität von Lysostaphin mehr als 1000fach durch Penicillin oder einem milden, Oberflächenentspannenden Agens, Triton X-100, potenziert wird. Der Einschluß eines chelatbildenden Agens potenziert weiterhin die bakterizide Aktivität des Lysostaphins Man glaubt, daß synthetische Penicilline und zellwandaktive Antibiotika die Aktivität des Lysostaphins potenzieren werden. Lysostaphin ist in Milch wirksam staphylokokken-abtötend, aber in einem Puffer beträgt die bakterizide Aktivität des Lysostaphins ungefähr das 10fache von dem, was in der Milch beobachtet werden kann.

Beispiel 5

Nach dem allgemeinen Protokoll, beschrieben in den Beispielen 1 bis 4, wurden weitere in-vitro-Experimente durchgeführt, um die bakterizide Aktivität einer Lysostaphinzusammensetzung, bestehend aus bakteriolytischen Enzymen, einem nichtionischen Detergenz und einem gepufferten, chelatbildenden Agens, zu bestimmen. Wie dargestellt in Tabelle II war eine Rezeptur, die 1 % Triton X-100, 0,1, ug/ml Lysostaphin, 10 ug/ml Lysozym und 5 mM EDTA in 20 mM Tris, pH 8,0 (AMBI Zitzenbenetzungsmittel-0,1) enthält, extrem wirksam gegen ein weites Spektrum an mastitis-erregenden, pathogenen Keimen, dazu gehören S. aureus-Stamm Newbould 305, S. epidermidis, Streptococcus agalactiae-Stamm McDonald und Stamm C48 und klinischen Isolaten von Streptococcus uberis, E. coli und Klebsiella pneumoniae. Tabelle II In-Vitro-Wirksamkeit des AMBI-Zitzenbenetzungsmittels-1 gegen pathogene Mastitis-Erreger Stamm Ausgangszahl der Lebenden prozentuale Überlebensrate Staphylococcus aureus (Newbould 305) Staphylococcus aureus (RN451 ) Staphylococcus epidermidis (PS) Streptococcus agalactiae (McDonald) Streptococcus agalactiae (C48) Streptococcus uberis (PS) Escherichia coli (PS) Klebsiella pneumoniae (PS)

Beispiel 6

Erprobungen an Kühen wurden ausgeführt, die die Wirksamkeit der Lysostaphin-Zitzenbenetzungsmittel-Zusammensetzungen in vivo zeigten. Die Tests wurden allgemein nach Protokoll A des National Mastitis Council durchgeführt. Im allgemeinen wurden die Zitzen mit einer 1%igen jodhaltigen Waschlösung gesäubert und mit einem Papierhandtuch getrocknet. Die Zitzen wurden dann mit Alkohol gespült und dann an der luft zum Trocknen gelassen. Alle 4 Zitzen jeder Kuh wurden in 10&sup8; Zellen/ml-Suspension des S. aureus-Stamms Newbould 305 eingetaucht, um die Hälfte der Zitzen zu benetzen, und dann an der Luft zum Trocknen für 30 Minuten gelassen. Zwei Zitzen (die rechte vordere und die linke hintere) wurden dann in einer Lysostaphin-Test-Zitzenbenetzungsmittelrezeptur (10 ug/ml Lysostaphin in 0,85 %iger Kochsalzlösung) eingetaucht, um 2/3 der Zitze zu benetzen und für 30 Minuten an der Luft zum Trocknen gelassen. Die übrigen zwei Zitzen agierten als nicht behandelte Kontrollgruppen. Jede Zitze wurde als erstes mit einem feuchten Baumwolltupfer abgetupft und dann mit 10 ml einer 0,85 %igen sterilen Kochsalzlösung gewaschen; das Spülwasser wurde in einem sterilen 30 ml-Rohr aufgefangen. Eine 0,2 ml-Probe des Spülwassers und entsprechende Verdünnungen davon wurden jeweils zweifach auf Blutagar aufgebracht und bei 37 º C für 24 bis 48 Stunden inkubiert, die koloniebildenden Einheiten wurden bestimmt, und die prozentuale Überlebensrate von S. aureus relativ zu den Kontrollgruppen berechnet.
10 ug/ml Lösungen von Lysostaphin in 0,85 %iger Kochsalzlösung desinfizierten S. aureus von den Kuhzitzenoberflächen. Weiterhin hatte Lysostaphin, welches vor den S. aureus-Suspensionen auf die Zitzen aufgetragen wurde, eine genügende Residualaktivität auf der Zitzenoberfläche, um eine Kolonisierung auf der Zitze zu verhindern. Die Residualaktivität könnte durch das Einschließen eines polymeren Adsorbens und/oder eines inaktiven Trägerproteins verbessert werden, um das Auswaschen von Lysostaphin zu reduzieren.

Beispiel 7

Gemäß den Ergebnissen von Beispiel 6 und den Daten, die invitro gewonnen wurden, wurde eine verbesserte. Zitzenbenetzungsmittelrezeptur (AMBI Teat Dip 1,0), die 1,0 ug/ml Lysostaphin, 10 ug/ml Lysozym, 1,0 % Triton X-100 und 5 mM EDTA in 20 mM Tris-Puffer enthielt, bei einem pH-Wert von 8,0, als ein Desinfektionsmittel eingesetzt gegen den S. aureus-Stamm Newbould 305, ausgewertet. Die Zitzen werden mit 10&sup8; Zellen/ml-Suspension vom S. aureus-Stamm Newbould 305 benetzt, und man läßt sie für 30 Minuten an der luft trocknen. Die behandelten Zitzen werden dann mit der AMBI-Test-Zitzenbenetzungsmittel-1,0-Lösung (1,0 ug/ml Lysostaphin, 10,0 ug/ml Lysozym, 1,0 % Triton X-100, 5 mM EDTA, 20 mM Tris-Puffer, pH 8,0) benetzt und läßt sie für 30 Minuten an der luft trocknen. Die Zitzenwerden mit einem feuchten Baumwolltupfer abgetupft und mit 10 ml einer sterilen 0,85 %igen Kochsalzlösung abgespült. Der Tupfer und die Spülflüssigkeit werden getrernt auf Blutagarplatten aufgebracht, 24 bis 48 Stunden inkubiert und die koloniebildenden Einheiten (KbE) bestimmt. Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle IIIA, zeigen deutlich die Wirksamkeit dieser Zubereitung. Wenigstens in 3facher Größenordnung wurden die auf den behandelten Zitzen überlebenden S. aureus reduziert; 50 % der behandelten Zitzen waren frei von infizierenden S. aureus.
Korrespondierende Tests wurden durchgeführt, bei deren die Zitzen mit Zubereitungen, die 2 x 10&sup7; Zellen/ml vom Streptococcus aqalactiae-Stamm McDonald enthielten, benetzt wurden, und dann an der luft für 30 Minuten zum Trocknen gelassen. Die Ergebnisse dieser Tests werden in Tabelle IIIB dargestellt. Alle behandelten Zitzen waren frei von S. aqalactiae. Tabelle IIIA In-Vivo-Wirksamkeit des AMBI-Zitzenbenetzungsmittels-1,0 gegen Staphylococcus aureus auf Kuhzitzen Kuh-Nr. Kontrollgruppe KbE pro ml Durchschnitt Total Qtrs negativ Tabelle IIIB In-Vivo-Wirksamkeit des Zitzenbenetzungsmittels-1,0 gegen Streptococcus agalactiae (McDonald-Stamm) auf Kuhzitzen Kuh-Nr. Kontrollgruppe KbE pro ml behandelt KbE pro ml Durchschnitt Total Qtrs negativ

Beispiel 8

Meerschweinchenmilchdrüsen wurden mit 200 bis 300 KbE des S. aureus-Stamms Newbould 305 infiziert. Nach dreitägiger post-infection wurden die Drüsen mit einer einfachen Dosis von Lysostaphin, die in 200 ul 0,85 %iger steriler Kochsalzlösung gelöst war, infundiert. Milchproben der Drüsen wurden 6 Stunden nach der Behandlung und in 12-Stunden-Intervallen für wenigstens 5 Tage nach der Behandlung gesammelt. 100 ul- Milchproben von behandelten und nichtbehandelten infizierten Drüsen wurden auf Blutagar aufgebracht. Nach einer 24 bis 48stündigen Inkubation wurden die Platten ausgezählt, um die KbE zu bestimmen. Die einzelnen Dosen von Lysostaphin, die ausreichend waren, um die Infektion zu eliminieren, riefen keine unerwünschten Nebenwirkungen hervor und zeigten, daß intramammare Infusionen von Lysostaphin wirksam gegen Staphylokokkenmastitiden sind. Bei 125 ug/kg waren die Drüsen durch die Probe, die 6 Stunden nach der Behandlung genommen worden war, frei von einer Infektion und blieben es während der ganzen Untersuchung. Tabelle IV Wirksamkeit einer intramammaren Infusion von Lysostaphin gegen experimentelle Staphylokokken-Mastitis beim Meerschweinchen Lysostaphin-Dosis g/kg Zahl der von einer Infektion befreiten Tiere
Es kann aus diesen Beispielen ersehen werden, daß Lysostaphin wirksam für die Behandlung einer Staphylokokkenmastitis ist, und daß seine Wirksamkeit stark verbessert werden kann, wenn es in einer Kombination mit Penicillin oder mit Substanzen, wie milden, oberflächenentspannenden Agenzien und chelatbildenden Agenzien eingesetzt wird.

Produktion von Lysostaphin vom Bacillus

Lysostaphin kann gemäß der Erfindung entweder aus natürlichen oder rekombinanten Quellen gewonnen werden. Vorzugsweise wird Lysostaphin aus Kulturen gewonnen, die vom Bacillus sphaericus- Stamm 00 stammen, der durch rekombinante Plasmide transformiert worden ist, die die Lysostaphinsynthese einleiten, wie beschrieben in der Anmeldung, Serien-Nr. 034 464, die eine teilweise Fortsetzung der Serien-Nr. 852 407 ist. Diese Methode sorgt für eine hohe Lysostaphin-Produktion, die gänzlich frei von immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen ist. Die Lysostaphinreinigung wird erleichtert, da das aktive Lysostaphin sich direkt in dem Anzuchtmedium sammelt. Man fand heraus, daß sich bei Anwendung dieser Methode besonders die Bacillus sphaericus-00-Transformanten, die das Plasmid pBC16-1L enthalten (B. sphaericus 00/pBc16-1L), für diesen Zweck eignen, obwohl andere transformierte Bacillusstämme ebenso nützlich als Quelle für Lysostaphin sein können.
Der Lysostaphin-produzierende Organismus wird unter Bedingungen, die optimal für die Produktion von Lysostaphin sind, angezüchtet. Die optimalen Bedingungen werden sich von Stamm zu Stamm unterscheiden; jedoch sind bestimmte Typen von Wachstumsmedien und Fermentationsbediingungen bekannt, die die Lysostaphinproduktion verbessern können. Im Fall der Bacillus sphaericus-00/pBC16-1L-Transformanten ist das bevorzugte Wachstumsmedium vy-Bouillon (25 g Kalbsbeimischung + 5 g Hefeextrakt/Liter) unter gut belüfteten Bedingungen (s. Tabelle V). Tabelle V Wirkung der Belüftung auf die Lysostaphin-Produktion durch Bacillus sphaericus-00/pBC16-1L-Transformanten Rührgeschwindigkeit Klett rpm (geriffelt) rpm = Umdrehungen/min
Kulturen (40 ml) in 300 ml Klettkolben werden mit 4 ml Übernacht-Primärkultur beimpft. Wachstumsmedium: VY-Bouillon, enthält 5 ug/ml Erythromycin.
Zu bestimmten Zeiten wurden Proben während des gesamten Wachstums gezogen. Die Überstände werden auf Lysostaphinaktivität durch turbidometrisches Entfernen der toten Zellsuspensionen von S. aureus bestimmt. Die Ergebnisse werden als ug Lysostaphin pro ml gegeben.
B. sphaericus-00/pBC16-1L-Trransformanten, angezüchtet im VY-Medium, produzierten und sonderten ungefähr 130 mg Lysostaphin pro liter Kulturmedium ab, dies ist mehr als das 4fache der Menge, die von S. simulans unter den besten, z. Zt. erhältlichen Fermentationsbedinguungen produziert wird. Lysostaphin sammelt sich in dem Wachstumsmedium mit nur geringem oder gar keinem Zerfall an, selbst nach verlängerter Inkubation der Kulturen und es beträgt mehr als 80 % des gesamten extrazellulären Proteins.
Lysostaphin wird vom Wachstumsmedium gemäß der bekannten fraktionellen Ausfällungsverfahren (Aussalzen) isoliert. Alternativ kann eine besonders wirksame Reinigung durch Kombination einer Ausfällung und einer chromatographischen Trennung der Fermentations-Bouillon von den Kulturen der lysostaphin-produzierenden B. sphaericus-00/pBC16-1L-Transformanten erzielt werden.
Die Zellen werden z. B. durch Zentrifugation und Ultrafiltration aus der Fermentations-Bouillon entfernt und festes Ammoniumsulfat wird zu 40 bis 60 % in den Überstand hinzugegeben, vorzugsweise bis zu 50 % des Sättigungsgrades. Nach einer Stunde bei 4 º C wird der Lysostaphin-enthaltende Niederschlag durch Zentrifugation zurückgewonnen. Die Rückgewinnung ist bei diesem Schritt größer als 80 %.
Der Niederschlag wird in einem Minimum-Volumen von 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0, 50 mM NaCl) wieder gelöst und gegen 100 Volumenteile desselben Puffers dialysiert. Nach der Entfernung jeglichen partikulären Materials wird die dialysierte Lösung auf einer Kation-Austausch-Säule (vorzugsweise Pharmacia FPLC Mono S) chromatographiert und unter Verwendung eines gepufferten Gradienten mit wachsender Salzkonzentration von 0,05 bis 0,25 M NaCl eluiert. Die Wiedergewinnung von Lysostaphin bei einem einzelnen chromatographischen Schritt betrug mehr als 90 %. Die Lysostaphinaktivität ist mit zwei größeren Spitzen (peaks) (Figur 1) verbunden. Der späte Eluierungs-Peak des Lysostaphins besteht aus nichtkovalenten Häufungen des Proteins. Diese Häufungen dissoziieren bei Verdünnung im Puffer und unter Bedingungen der Natrium- Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese.

Konstruktion des Plasmidvektors pBC16-1L, der das Gen enthält, das für Lysostaphin codiert ist

Lysostaphin-produzierende Stämme von Bacillus sphaericus können durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken produziert werden, und wobei die bevorzugt verwendet werden, die in den Anmeldungen 852 407 und 034 464 beschrieben werden. Die gesamte S. simulans-DNA wird teilweise durch entsprechende Restriktionsendonucleasen spezifisch gespalten, und die so geschaffenen DNA-Fragmente werden dann zu einem linearisierten bekannten Vektor (pUC8) mit kompatiblen Enden ligiert, die eine antibiotische Resistenzmarkierung und das lac Z'-Gen (d. H. β-Galactosidase-Gen) tragen. Die Ligaturmischung wird dann in die E. coli (JM105) durch Transformation transferriert. Erfolgreiche Insertionen des Lysostaphin-Gens in das Plasmid können durch Selektierung der Transformanten durch Anzüchtung auf dem passenden Antibiotikum identifiziert werden und dann können diejenigen mit dem lac Z' negativen Phänotyp erkannt werden. Die Lysostaphin-Produktion wird durch turbidometrische Klärung einer Suspension von S. aureus entweder in Lösungsform oder als Überschichtung auf Agarplatten identifiziert.
Die Verwendung verschiedener Lysostaphin-produzierende E. coli-JM105-Transformanten, Restriktionsanalysen und Subklonierung der JM105-Plasmid-DNA zeigten, daß die DNA-Sequenz, die für Lysostaphin codiert ist, auf einem 1,5 kbp Hpa II- Hind III-DNA-Teilstück lokalisiert ist. Dieses Teilstück wurde nach der Elektrophorese durch Ethylbromidfärbung sichtbar gemacht und auf einen Nitrozellulosefilterstreifen übertragen. Der Streifen wurde mit NET-Puffer gewaschen (0,15 M NaCl, 0,1 m EDTA, 0,02 M Tris, pH 8,0), und die transferrierte DNA wurde dann durch Inkubation des Streifens in NET-Puffer, der 1 M NaCl enthielt, für eine Stunde bei 65 º C eluiert, Ethylbromid wurde aus der DNA mit n-Butanol extrahiert. Die DNA wurde durch Hinzugabe von 2 Volumeneinheiten von 95 %igem kalten Ethanol zur wässrigen Phase ausgefällt, wurde dann durch Zentrifugation gesammelt, mit 80 %igem Ethanol gewaschen und in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 MM EDTA, pH 8,0) gelöst. Rekombinante Plasmide, befähigt zur Transformation von B. subtilis und B. sphaericus, zur Expression von Lysostaphin, wurden durch Verwendung eines Abkömmlings des Plasmid pBC16 (pBC16-1) als ein Klonierungsvektor konstruiert. pBC16 ist ein tetracyclin-resistentes (Tetr) Bacillus-Plasmid, das ursprünglich aus B. cereus (K. Bernhard, H. Schremph und W. Goebel, 133 J. Bact. 897, 1978) isoliert worden ist. Plasmide, die nicht von pBC16 durch Restriktionsanalyse und südlicher Hybridisation zu unterscheiden waren, wurden auch in Erdisolaten von B. subtilis und B. sphaericus (J. Polak und R. N. Novick, 7 Plasmid 152, 1982) gefunden.
Der pBC16-Abkömmling (pBc16-1), der als Klonierungsvektor verwendet wurde, wurde durch Ligierung des TaqIA-Teilstücks des Plasmids pE194 (B. Weisblum, M. .Y. Graham, T. Gryczan und D. Dubnau, 137 J. Bact. 635, 1979) konstruiert; dieses ist ein erythromycin-resistentes Plasmid (ermr) aus S. aureus, und unter Anwendung einer T&sub4;-Ligase mit einem teilweisen TaqI- Abbauprodukt des Plasmids pBC16. Nach Transfer der Ligaturmischung in B. subtilis durch Protoplastentransformation (S. Chang und S. N. Cohen, 168 Molec. Gen. Genet. 111, 1979) wurden Klone selektiert, die resistent gegen beides, Tetracyclin und Erythromycin sind. Ein solcher Klon wurde als pBC16-1 gekennzeichnet.
Die Restriktionsanalyse zeigte, daß pBC16-1 alle pBC16-TaqI- Teilstücke zusätzlich zum TaqIA-Teilstücks des pE194 enthielt, welche die Erythromycin-Resistenz-Determinante enthält. pBc16-1 wurde dann mit der Restriktions-Endonuclease PvuII digeriert, dadurch wurden ungefähr 25 % der Plasmid-DNA zusammen mit dem größten Teil der Tetracyclin-Resistenz-Determinante entfernt. Der PvuII-digerierte Vektor pBC16-1 wurde dann mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm behandelt. Das 1,5 kbp DNA-Teilstück, das für Lysostaphin codiert ist, wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt. Das 1,5 kbp DNA-Teilstück und die Plasmid-DNA wurden gemischt und unter Anwendung der T4-ligase ligiert, und dann wurde die Ligaturmischung durch Protoplastentransformation in B. subtilis transferriert. Die Transformanten waren resistent gegen Erythromycin, sensibel gegenüber Tetracyclin und produzierten Lysostaphin, wie durch Aufklärungshöfe erkennbar wurde, wenn sie auf Agar, der tote S. aureus-Zellen enthielt, angezüchtet wurden. Ein solcher Lysostaphin-produzierender Klon wurde ausgewählt und als B. subtilis/pBc16-1L gekennzeichnet. Die Plasmid-pBC16-1L-DNA wurde aus B. subtilis/pBC16-1L-Transformanten extrahiert und nach Ultrazentrifugation in einem Ethylbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegefälle isoliert. Die Plasmid-pBc16-1L-DNA wurde durch Protoplastentransformation in verschiedene Spezies des Bazillus, inklusive B. sphaericus-Stamm 00 transferriert. Die Transformanten waren resistent gegen Erythromycin und produzierten Lysostaphin. Der B. sphaericus-00/pBc16-1L-Transformant sorgte für eine maximale Produktion an Lysostaphin und ermöglichte das Sammeln eines intakten, enzymatisch aktiven Produkts. Der B. sphaericus-Stamm 00 wurde ursprünglich aus dem Erdreich isoliert und ist in der Kultursammlung (RN3106) des Public Health Research Institute, New York, New York enthalten. B. sphaericus-00/pBC16-1L ist in der Kultursammlung des Public Health Research Institute New York, New York enthalten und wird in der American Type Culture Collection unter der ATCC-Zugangs-Nr. 67393 aufbewahrt.

Claims

1. Eine Lysostaphin enthaltende Zusammensetzung zum Abtöten von Staphylokokken (welche deshalb selbst keine Staphylokokken enthält), dadurch gekennzeichnet, daß sie auch wenigstens ein zellwandaktives Antibiotikum in einer Menge enthält, die synergistisch wirksam ist, um den bakteriziden Effekt des Lysostaphins gegen Staphylokokkenmastistis zu verstärken.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Antibiotikum Penicillin ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Penicillin in einer Konzentration von 0,1 bis 10,0 Mikrogramm/l enthalten ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum ein Synthetisches Penicillin ist.

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysostaphin in einer Konzentration von wenigstens 0,01 Mikrogramm/l vorhanden ist.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine milde, oberflächenaktive Substanz enthält.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die oberflächenaktive Substanz in einer Konzentration von 0,1 bis zu 1 % enthalten ist.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein chelatbildendes Agens enthält.

9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin wenigstens ein zusätzliches bakteriolytisches Agens enthält.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin Mutanolysin und Lysozym enthält.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysostaphin von einem transformierten Mikroorgnismus abstammt, der ein rekombinantes Plasmid enthält, welches für Lysostaphin codiert ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid das designierte pBC16-1L ist und in den Zellen vom Bacillus sphaericus Stamm 00 ATC 67398 vorhanden ist.

13. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin einen annehmbaren Trägerstoff enthält.

14. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Behandlung oder der Vorbeugung gegen Staphylokokkenmastitis.

15. Zusammensetzung nach jedem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung als Zitzenbenetzungsmittel bei der Vorbeugung der bovinen Staphylokokkenmastitis.