FI95779B - Desinfiointikoostumus stafylokokkien tappamiseksi - Google Patents

Description

95779

Desinfiointikoostumus stafylokokkien tappamiseksi Tämä keksintö koskee lysostapiinin käyttöä stafylokokkeja tappavan desinfiointikoostumuksen valmistamiseksi.

5 Lysostafiini on bakteriosiini, jota erittää yksi ainoa tunnettu Staphylococcus simulans -kanta, jonka alunperin eristivät Schindler ja Schuhardt ja nimesivät Staphylococcus staphylolvticusiksi♦ S. staphvlolvticusin lysostafiini tuotantoa on aiemmin kuvattu US-patenttijulkai-10 sussa 3 278 378 (11. lokakuuta 1966) ja julkaisussa Proceedings of the National Academy of Sciences 51 (1964) 414 - 421. Ainoa lysostafiinia tuottava organismi S. staphv-lolvticus (NRRL B-2628) on vähän aikaa sitten identifioitu S. simulansin alalajiksi [Sloan et ai., Int. J. System.

15 Bacteriol. 32 (1982) 170 - 174]. Koska nimi S. staphvloly-ticus ei ole hyväksyttyjen bakteerinimien luettelossa, lysostafiinia tuottava organismi on nimetty uudelleen S.

simulansiksi.

..... *

Bakteriosiinit ovat bakteerien erittämiä proteiine-20 ja, jotka tappavat ja joskus hajottavat sukulaisbakteere-ja. Lysostafiini esimerkiksi hajottaa ja tappaa käytännöllisesti katsoen kaikki tunnetut stafylokokkilajit, mutta on inaktiivinen kaikkiin muihin sukuihin kuuluvia baktee-reja vastaan. Lysostafiini, joka on eristetty julkaistujen 25 viitteiden mukaisesti kasvatetun S. simulansin (NRRL B-2628) viljelmäsuodoksista, on endopeptidaasi, joka katkoo stafylokokkien soluseinämissä esiintyvän peptidoglykaanin polyglysiiniristisidoksia. Lisäksi lysostafiinia tuottavat viljelmät näyttävät olevan resistenttejä sen vaikutuksil-: 30 le, kun taas viljelmät, jotka on kasvatettu olosuhteissa, joissa lysostafiinia ei muodostu, ovat herkkiä.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että lysostafiinia voidaan tuottaa fermentointimenetelmin kasvattamalla S. simulansia nesteviljemässä. Tällaisia fermentointi-35 menetelmiä kuvataan US-patenttijulkaisussa 3 278 378 (11.

• ·' 2 95779 lokakuuta 1966) ja julkaisussa Proceedings of the National Academy of Sciences 51 (1964) 414-421. Lysostafiinin tuotantoon fermentointimenetelmin on myös tehty erilaisia parannuksia, joita kuvataan US-patenttijulkaisuissa 3 398 5 056 (20. elokuuta 1968) ja 3 594 284 (20. heinäkuuta 1971). Kahdessa viimeksi mainitussa viitteessä esitetään parannuksia kasvualustaan ja inokulointimenetelmiin, joilla voidaan nopeuttaa ja parantaa lysostafiinituotantoa fermentoinnissa. S. simulans tuottaa lysostafiinia ekspo-10 nentiaalisen kasvun aikana inaktiivisena esiasteena. Pro-entsyymin muuttaa aktiiviseksi, valmiiksi entsyymiksi pro-teaasi, jota syntyy stationaarivaiheessa olevissa S. simulans -viljelmissä.

Lysostafiinia voivat lisäksi tuottaa yhdistelmämik-15 ro-organismit, mukaan luettuina E. coll. Bacillus subtilis ja B. sphaericus -kannat, joissa lysostafiinigeeni ilmentyy. Toisin kuin luonnollisessa tuotannossa lysostafiinia kertyy eksponentiaalisen kasvun aikana lysostafiinia tuottavien yhdistelmäkantojen kasvualustaan täysin prosessoi-20 tuna, valmiina, aktiivisena entsyyminä, ja se on vapaa stafylokokkiperäisistä, immunogeenisista epäpuhtauksista.

Lehmien utaretulehdus on kallis ongelma meijeri-teollisuudelle; kustannukset ovat vuosittain yli 2 miljar-*. dia dollaria pelkästään Yhdysvalloissa. Tämän sairauden 25 arvioidaan vaivaavan jonkinasteisesti 50 %:a amerikkalaisista lypsylehmistä, ja se johtaa käyttökelvottomaan maitoon, alentuneeseen maidontuotantoon ja vakavan infektion ollessa kyseessä eläimen kuolemaan.

Utaretulehduksen aiheuttaa maitorauhasten infekti-: 30 oituminen pääasiassa Staphylococcus aureusilla tai Strep- . · tococcus aoalactiaella ja vähemmässä määrin E. colilla ja muilla gram-negatiivisilla bakteereilla tai niiden yhdistelmillä. Useimpien streptokokki-infektioiden on osoitettu olevan hoidettavissa tehokkaasti käyttämällä tavanomaista 35 antibioottihoitoa. Stafylokokkien aiheuttama utaretulehdus .· on kuitenkin osoittautunut vaikeammaksi hoitaa.

3 95779

Lehmien utaretulehduksen perinteiseen ehkäisyyn liittyy monimutkainen ohjelma, jossa nisät pestään päivittäin desinfiointiaineliuoksella [katso. J. S. McDonald, Veterinary Clinics of North America Large Animal Practice 5 6 (1984) 269], ja joissakin tapauksissa saatetaan käyttää antibiootteeja sisältäviä nisienpesuliuoksia. Rutiininomaiseen antiobioottihoitoon täytyy kuitenkin suhtautua varovasti antibioottiresistenttien kantojen valikoitumisen minimoimiseksi. Infektion ilmetessä on syytä antaa anti-10 biootteja utareensisäisenä infuusiona. Tällainen antibioottihoito voi vähentää infektiota, niin että tuotettava maito on myytävissä, mutta se ei yleensä johda aiheutta-jaorganismin täydelliseen häviämiseen.

Stafylokokkiutaretulehdus on reagoinut aiemmin hei-15 kosti antibioottihoitoon, ja infektiolla on ollut taipumus uusia ja muuttua krooniseksi. Utaretulehdustutkimukset ovat osoittaneet, että osa utaretulehduksen hoitoon liittyvästä ongelmasta on se, että merkittävä määrä stafylokokkeja säilyy hengissä utareessa fagosyyttisissa polymor-20 fonukleaarisissa neutrofiilisissä leukosyyteissä (PMNris-sä). Otaksutaan, että PMN:issä olevat stafylokokit ovat suojassa antibioottien vaikutuksilta, ja kun leukosyytti hajoaa, voivat fagosytoituneet stafylokokit toimia uutena il lähteenä utaretulehduksen aiheuttavalle stafylokokkien 25 uudelleenkasvulle.

Tutkimukset, jotka ovat koskeneet mekanismia, jolla fagosytoituneet stafylokokit torjuvat antibiootit utaretulehduksen hoidossa, osoittavat, että lysostafiini on torjuttu fagosytoituneiden stafylokokkien tuhoajaehdokkaana.

30 Katso Craven et ai., Research in Veterinary Science 29 (1980) 57; Craven et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 21 (1982) 618; Craven et al., Compl. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 5 (1982) 447; Craven et al., Journal of Dairy Research 51 (1984) 513. Näissä kokeissa käytettiin 35 lysostafiinia in vitro esikäsittelynä solun ulkopuolisten • · 95779 4 stafylokokkien tuhoamiseksi ennen fagosytoitujen stafylokokkien käsittelyä kloksasilliinilla, gentamysiinilla tai lystostapiinilla. Craven et ai.’n tulokset viittaavat vahvasti siihen, ettei lysostafiinilla olisi vaikutusta uta-5 retulehdukseen, sillä solunsisäiset stafylokokit olivat edelleen eläviä 20 tunnin inkuboinnin jälkeen lysostafii-nipitoisessa liuoksessa. Katso Journal of Dairy Research 51, sivut 515 - 516 ja taulukko 2.

Lysostafiinin on ilmoitettu tunkeutuvan myös ihmi-10 sen monosyytteihin. Koska monosyytit ovat erityyppisiä soluja kuin PMN:t, ei tämä ihmismalli ole todennäköisesti sovellettavissa lehmän utaretulehduksen hoitoon [van den Broek et ai., Scand. J. Immunol. 21 (1985) 189].

Lysostafiinin on osoitettu myös olevan tehokas sta-15 fylokokkien aiheuttamien märkäpesäkkeiden hoidossa hiirten munuaisissa, erityisesti käytettäessä sitä peräkkäin meti-silliinin kanssa [Dixon et ai., Yale J. Biol. Med. 41 (19-68) 62].

Lysostafiinia on käytetty myös terapeuttisena ai-20 neena ihmisillä stafylokokkien aiheuttamien kroonisten nenäinfektioiden hoidossa [Quickel, Jr. et ai., Applied Microbiology 22 (1971) 446]. Eräässä resistentissä stafylokokki -infektiotapauksessa lysostafiinia on annettu sys-*: teemisesti [Stark et ai., Medical Intelligence 291 (1974) 25 239]. Lääketieteen ja eläinlääketieteen piirissä on kui tenkin suhtauduttu epäilevästi ja vastahakoisesti lyso-stapiinin systeemiseen antoon. Lysostafiini on katsottu liian immunogeeniseksi ollakseen yleisesti käyttökelpoinen muuhun kuin paikalliseen käyttöön.

• 30 Nyt on havaittu, että lysostafiinia voidaan käyttää yllättävän tehokkaasti stafylokokkien aiheuttaman utaretulehduksen ehkäisyyn ilman haitallisia immunogeenisia vaikutuksia. Niinpä esillä oleva keksintö koskee desinfioin-tikoostumusta stafylokokkien tappamiseksi. Koostumukselle 35 on tunnusomiasta, että se sisältää lysostafiinia ja vähin- « 95779 5 tään yhtä ainetta, joka parantaa synergistisesti lysosta-fiinin bakterisidista aktiivisuutta ja joka on kelatoiva aine, mieto pinta-aktiivinen aine tai muu membraaneihin vaikuttava aine, stafylokokkeja tappavia määriä.

5 Ehkäisevänä aineena käytettäessä lysostafiinia si sältävä desinfiointikoostumus voidaan lisätä osaksi päivittäistä nisienpesuohjelmaa. Nisienpesuaine sisältää edullisesti lystostapiinia; muita bakteriolyyttisiä aineita, kuten mutanolysiiniä, joka on streptokokkeja vastaan 10 tehokas Streptococcus alobisporusin tuottama bakteriosii-ni; ja lysotsyymiä, muralyyttistä entsyymiä, joka hydrolysoi gram-positiivisten ja gram-negatiivisten bakteerien soluseinämissä olevan peptidoglykaanin polysakkaridirun-koa. Koostumus voi sisältää myös kelatoivaa ainetta, kuten 15 etyleenidiamiinitetra-asetaattia (EDTA); ja mietoa pinta- aktiivista ainetta, jonka on havaittu tehostavan bakteerien tappamista. Soveltuviin mietoihin pinta-aktiiviisiin aineisiin kuuluvat mm. polyoksietyleenisorbitaanin ja ras- \ vahappojen esterit (Tween-sarja), oktyylifenoksipolyetok-20 sietanoli (Triton-X-sarja), n-oktyyli-B-D-glukopyranosidi, n-oktyyli-B-D-tioglukopyranosidi, n-dekyyli-B-D-glukopy-ranosidi, n-dodekyyli-B-D-glukopyranosidi ja luonnossa esiintyvät pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi rasvaha-I pot, glyseridit, monoglyseridit, deoksikolaatti ja deoksi- 25 kolaattiesterit. Mieto pinta-aktiivinen aine vahvistaa lysostafiinin stafylosidisen vaikutuksen yli 1000-kertai-seksi.

Lysostafiinin parantunut teho keksinnön mukaisissa koostumuksissa tekee niistä käyttökelpoisia lukuisiin mui-: 30 hin käyttötarkoituksiin, joihin liittyy stafylokokki-kon taminaatio. Niinpä näitä koostumuksia voitaisiin käyttää stafylokokken tappamiseen sisällyttämällä niitä haavakää-reisiin, desinfioiviin pesuaineisiin, pyyhkeisiin tai emulsioihin. Koostumuksia voitaisiin käyttää myös lääke-35 tieteellisten instrumenttien, lattioiden, seinien, vuode- 6 95779 vaatteiden tms. puhdistukseen olosuhteissa, joissa halutaan ympäristön desinfiointia. Muihin mahdollisiin käyttötarkoituksiin kuuluvat käyttö elintarvikkeisiin liittyvät käyttötarkoitukset, kuten lihan, kananmunien, juuston ja 5 kalan tai elintarvikkeiden pakkaus- ja käsittelyvälineiden käsittely.

Kuvio 1 on transformanttikannan B. sphaericus 00, joka sisältää lysostafiinia koodittavan yhdistelmäplasmi-din pBC16-IL, tuottaman lysostafiinin kromatogrammi.

10 Tämän keksinnön mukaiseen käyttöön soveltuvaa ly sostafiinia voidaan saada joko luonnollisista tai yhdis-telmälähteistä. Lysostafiinia saadaan edullisesti Bacillus sphaericus -kannasta 00, joka sisältää yhdistelmäplasmi-din, joka ohjaa lysostafiinisynteesiä, sillä täten saadaan 15 aikaan sekä suurina tuotantomäärinä stafylokokkiperäisis-tä, immunogeenisistä epäpuhtauksista suurin piirtein vapaata lysostafiinia että lysostafiinin helppo puhdistus, sillä lysostafiini kerääntyy suoraan kasvualustaan. Bacil- \ lus sphaericus -transformantit, jotka sisältävät plasmidin 20 pBC16-IL, on havaittu erityisen sopiviksi tähän tarkoitukseen, vaikka muutkin kannat ovat käyttökelposia lysosta-fiinilähteinä. Eräs menetelmä lysostafiinin saamiseksi mikro-organismeista, jotka on transformoitu lysostafiinia koodittavan geenin sisältävillä yhdistelmäplasmideilla, 25 esitetään täydellisesti US-patenttihakemuksessa 034 464 (jätetty 10. huhtikuuta 1987), joka on osittain jatkoa US-patenttihakemukselle 852 407. Molemmat hakemukset mainitaan tässä viitteinä.

Keksinnön mukaisia desinfiointikoostumuksia nisien-1 30 pesuaineina käytetäään ennen jokaista lypsyä ja sen jäl keen, edullisesti karjan kaikille lehmille. Nisienpesuai-neet sisältävät edullisesti noin 1,0 pg/ml lysostafiinia hyväksyttävässä kantajassa. Lisäksi tämän keksinnön mukaiseen käyttöön tarkoitetut nisienpesuaineet voivat sisältää 35 noin 1,0 pg/ml mutalolysiiniä, noin 10 pg/ml lysotsyymiä 7 95779 ja mietoa pinta-aktiivista ainetta. Hyväksyttäviä kantajia ovat sellaiset, joilla saadaan aikaan puskuroitu väliaine, jonka pH on noin 8,0, ja niihin kuuluvat vesipohjaiset puskurit ja hydrofiiliset salvapohjat. Kantajana voidaan 5 käyttää esimerkiksi ionittomia pinta-aktiivisia aineita, rasvahappoja tai muita mietoja pinta-aktiivisia aineita, proteiinikantajia, kuten seerumialbumiinia tai gelatiinia, jauhettua selluloosaa ja kannelia (carmel). Tämän keksinnön mukainen nisienpesuaine voi edullisesti sisältää myös 10 kelatoivia aineita, kuten EDTA:a, väriaineita ja kosteuttavia aineita, kuten glyserolia tai sorbitolia.

Mutanolysiiniä saadaan Streptomvces globisporusis-ta. Lysotsyymiä saadaan munanvalkuaisesta.

Esimerkit 1 la 2 15 Tehtiin in vitro -kokeita, jotta saataisiin määri tetyksi lysostafiinia, mutanolysiiniä ja lysotsyymiä sisältävien koostumusten bakterisidinen vaikutus S. aureusta ja muita utaretulehdusta aiheuttavia patogeenejä vastaan. Koeohjelma oli seuraava: 20 Koeohjelma eläviä soluna käytettäessä 1. Yön yli inkuboidusta maljasta (inkubointilämpö-tila 37 °C) saadut bakteerisolut (yleensä 109 solua/ml) suspendoitiin Tris-puskuriin (20 mmol/1 Tris, pH 8).

; 2. Yhdistettiin 10 μΐ bakteerisolususpensiota ja 1 25 ml vertailuformulaatiota tai tutkittavaa nisienpesuformu- laatiota (ts. maitoa, puskuria tai puskuroitua pinta-aktiivista ainetta, jne., joka sisälsi lysostafiinikoostu-musta).

3. Soluja inkuboitiin vaihtelevia aikoja lämpöti- 30 lassa 37 °C.

4. Bakteerisuspensioita sentrifugoitiin 2 min pienessä pöytäsentrifugissa solujen pelletoimiseksi.

5. Pelletti pestiin kahdesti 1,0 ml:11a Phage-pus- kuria.

* · β 95779 6. Solut suspendoitiin uudelleen 1,0 ml:aan Phage-puskurla, tehtiin sopiva laimennussarja Phage-puskuriin ja siirrostettiin 100 μΐ laimennosta GL-agarille (S. aureus.

E. coli. Klebisella pneumoniae) tai Trypticase Soy -aga- 5 rille (S. aaalactiae).

7. Maljoja inkuboitiin yön yli lämpötilassa 37 °C ja vertailu- ja testimaljoista laskettiin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (tästedes CFU) elossa olevien solujen prosenttiosuuden määrittämiseksi.

10 Phaae-puskurin koostumus 50 mmol/1 Trisiä, pH 7,8; 1 mmol/1 MgS04:a; 4 mmol/1 CaCl2:a; 100 mmol/1 NaCl:a; 1,0 g/1 gelatiinia (Phage-pus-kuri edistää käsittelyssä mahdollisesti hajoamattomien protoplastien ja sferoplastien stabiloitumista).

15 GL-aaarin koostumus (litraa kohden) 3,0 g Difco-kasaminohappoja; 3,0 g Difco-hiivauu-tetta; 5,9 g NaClra; 3,3 ml Na-laktaattia [60-prosenttista (massa/tilavuus)]; 4,0 ml 25-tilavuusprosenttista glyserolia; 15 g agaria; pH säädetään arvoon 7,8.

20 Trypticase Sov -aaarln koostumus (litraa kohden) 15 g Bacto Tryptonea; 5 g Bacto Soytonea; 5 g NaCl-:a, 15 g agaria, pH säädetään arvoon 7,3.

in vitro -kokeiden tulokset, jotka osoittavat eri-;* laisten lysostafiiniformuloiden bakterisidisen tehon, esi- 25 tetään taulukoissa IA ja IB. Tulokset esitetään S. aureus -kantojen Newbould 305, kannan RN451, penisilliiniresis-tenttien kantojen RN1753 (penisillinaasituottaja) ja Col-kannan (metisilliiniresistentti) eloon jäävien bakteerien prosenttiosuutena.

30 Taulukossa IA esitetään tulokset, joita saatiin

• · I

formulaatioilla, jotka sisälsivät 1 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,01 pg/ml ja 0,00 pg/ml (vertailunäyte) lysostafiinia. Kuten näistä tuloksista on nähtävissä, kaikki tutkitut lysosta-fiinipitoisuudet tappoivat bakteereja puskuriväliaineessa 35 (50 mM Tris, pH 8,0). Maidossa vain pitoisuudet 1 pg/ml ja *· 0,1 pg/ml vähensivät elossa olevien bakteerien määrää.

9 95779

Taulukko IB osoittaa, millainen vaikutus on miedon ionittoman pinta-aktiivisen aineen, oktyylifenoksyylipo-lyetoksi(10)etanolin (Triton X-100), lisäämisellä lysosta-fiinikoostumukseen. Alle 0,001 % soluista jää esimerkiksi 5 henkiin käsiteltäessä solut formulaatiolla, joka sisältää 0,1 pg/ml lysostafiinia ja 0,1 % Triton X-100:a; henkiin-jäämisprosentti oli 2,2 % ja vastaavasti 7,7 % käytettäessä jompaa kumpaa yhdistettä yksinään. Vielä yllättävämpää • oli, että alle 0,001 % soluista säilyi hengissä, kun for- 10 mula sisälsi 0,01 pg/ml lysostafiinia ja 0,1 % Triton X-100:a.

15 TAULUKKO IA

Lysostafiinin vaikutus S. aureusin elinkykyyn 20

Kanta Väliaine Inkubointiaika Elossa olevia (¾)

1,0L 0,IL 0,01L VERTJÄYTE

S. aureus 25 Newbould 305 Maito 15 min 2,8 75,0 100 100 2 h 0,1 82,0 100 100 RN451 Maito 15 min <0,1 22 100 100 30 2 h <0,0141 100 100

Puskuri 2 h ei määr. 2,2 20 100 35 10 95779

TAULUKKO IB

Ionittoman pinta-aktiivisen aineen vaikutus lyso-5 stapiinin bakterisidiseen vaikutukseen S. aureusta vas taan

Inku- 10 Väli- boin*

Kanta aine tiaika Elossa olevia [%) VERTAILU 0,01L 0.1« 0,IL O,OIL LUNÄYTE +0rUT+0,m 15 S. aureus Puskurit RN451 ±0,1*

Tritonia 2 h 2,2 20 7,7 <0,001 <0,001 100 20 _

Lisäksi lysostafiinin, mutanolysiinin ja lysotsyy-min vaikutuksia koskevat kokeet, joissa mitattiin eläviä S. aureus. S. aaalactiae ja E.coli tai Klebsiella pneumo- 25 nlae -soluja sisältävien suspensioiden sameuden vähenemis tä aallonpituudella 600 nm, osoittivat, että kelatoivat aineet (esimerkiksi EDTA) vahvistavat kunkin bakteriolyyt-!’. tisen entsyymin hajotusvaikutusta.

Tulokset osoittavat, että lysostafiini on nopeasti 30 vaikuttava, hyvin tehokas stafylosidi, jonka bakterisidi-sen vaikutuksen mieto pinta-aktiivinen aine, Triton X-100, voimistaa yli 1000-kertaiseksi. Kelatoivan aineen sisällyttäminen koostumukseen vahvistaa edelleen lysostafiinin vaikutusta. Lysostafiini on tehokas stafylosidi maidossa, 35 mutta puskuriliuoksessa lysostafiinin bakterisidinen ak tiivisuus on noin 10-kertainen maidossa havaittuun nähden.

• « 11 95779

Esimerkki 3

Noudattamalla esimerkeissä 1 ja 2 esitettyä yleistä ohjelmaa tehtiin lisää in vitro -kokeita bakteriolyyttisia entsyymejä, ionitonta pinta-aktiivista ainetta ja pusku-5 roitua, kelatoivaa ainetta sisältävän lysostafiinikoostu-muksen bakterisidisen aktiivisuuden arvioimiseksi. Kuten taulukosta II ilmenee, formulaatio, joka sisälsi 1 % Triton X-100:a, 0,1 mg/ml lysostafiinia, 10 mg/ml lysotsyymiä ja 5 mmol/1 EDTA:a 20 mM Tris-puskurissa, pH 8,0 (AMBI 10 Teat Dip-0,1) oli hyvin tehokas monia utaretulehdusta ai heuttavia patogeenejä vastaan, mukaan luettuina S. aureus -kanta Newbould 305, S. epidermidis. Streptococcus aaalac-tiae -kannat McDonald ja C48 ja kliinisesti eristetyt Streptococcus uberis. E. coli ja Klebsiella pneumoniae -15 kannat.

« ( 1 1 »· 12 95779

TAULUKKO II

AMBI Teat Dip-1 -valmisteen teho utaretuleh-5 dusta aiheuttavia patogeenejä vastaan in vitro

Kanta Elävien solujen määrä Elossa olevia (%) 10

Staphylococcus 7,0 x 105 <0,001 aureus (Newbould 305) 15

Staphylococcus 5,7 x 105 <0,001 aureus (RN451) 20 Staphylococcus 8,3 x 105 <0,001 epidermidis (PS)

Streptococcus 3,9 x 105 <0,001 25 aaalactiae (McDonald)

Streptococcus 2,9 x 101 <0,001 aaalactiae 30 (C48)

Streptococcus 6,9 x 105 <0,001 uberis (PS) .: 35

Escherichia 9,1 x 105 <1,0 coli (PS) 40 Klebsiella 9,6 x 105 <1,0 pneumoniae (PS) 45

Esimerkki 4

Tehtiin lehmillä kokeita, jotka osoittivat lyso-stafiinipitoisten nisienpesukoostumusten tehokkuuden in vitro. Testit tehtiin noudattaen yleisesti ohjelmaa Pro- 13 95779 tocol A of the National Mastitis Council. Yleisesti ilmaistuna nisät puhdistettiin 1 % jodia sisältävällä pesu-liuoksella ja kuivattiin paperipyyhkeellä. Nisät huuhdottiin sitten alkoholilla ja annettiin kuivua ilmassa. Seu-5 raavaksi lehmän kaikki neljä nisää kasteltiin suspensiossa, joka sisälsi 108 solua/ml S. aureus -kantaa Newbould 305, siten että suspensio peitti puolet nisästä, ja annettiin kuivua ilmassa 30 min. Kaksi nisää (oikeanpuoleinen etummainen ja vasemmanpuoleinen takimmainen) kasteltiin 10 sitten tutkittavassa lysostafiinipitoisessa nisienpuhdis-tusformulassa (10 pg/ml lysostafiinia 0,85-%:isessa suolaliuoksessa) siten, että 2/3 nisästä kastui, ja annettiin kuivua ilmassa 30 min; toiset kaksi nisää toimivat käsittelemättöminä vertailunisinä. Kunkin nisä pyyhittiin ensin 15 kostealla puuvillavanulla ja pestiin sitten 10 ml:11a steriiliä 0,85-%:ista NaCl-liuosta; pesuvesi kerättiin steriiliin 30 ml:n putkeen. 0,2 ml pesivesinäytettä ja sen sopivia laimennoksia siirrostettiin veriagarille kahtena rinnakkaisnäytteenä ja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C 24 -20 48 tuntia. Määritettiin pesäkkeitä muodostavat yksiköt ja laskettiin elossa olevien S. aureus -solujen prosenttiosuus vertailunäytteisiin nähden.

Liuokset, jotka sisälsivät 10 pg/ml lysostafiinia ;· 0,85-%:isessa NaCl-liuoksessa, poistivat täydellisesti S.

25 aureusin lehmien nisien pinnoilta. Lisäksi lysostafiinil-la, jota levitettiin nisäpinnoille ennen nisien käsittelyä S. aureus -suspensioilla, oli jäljellä riittävästi aktiivisuutta nisän pinnalla pesäkkeiden muodostumisen estämiseksi nisällä. Jäännösaktiivisuutta voitiin parantaa si-' ·1 30 säilyttämällä polymeeristä adsorbointiainetta ja/tai iner- ttiä kantajaproteiinia lysostafiinin poishuuhtoutumisen estämiseksi.

Esimerkki 5

Esimerkissä 4 in vitro saatujen tulosten perusteel-35 la tutkittiin parannettua nisienpesukoostumusta (AMBI Teat • · 14 95779

Dip 1,0), joka sisälsi 1,0 mg/ml lysostafiinia, 10 pg/ml Tris-puskuria, 1,0 % Triton X-100:a ja 5 mmol/1 EDTA:a 20 mM Tris-puskurissa, pH 8,0, desinfiointiaineena S. aureus -kantaa Newbould 305 vastaan. Nisät kasteltiin suspensios-5 sa, joka sisälsi 10® solua/ml S. aureus -kantaa Newbould 305, ja annettiin kuivua ilmassa 30 min. Käsitellyt nisät kasteltiin sitten tutkittavassa AMBI Teat Dip-1,0 -liuoksessa (1,0 mg/ml lysostafiinia, 10,0 pg/ml lysotsyymiä, 1,0 % Triton X-100:a, 5 mmol/1 EDTA:a, 20 mmol/1 Tris-pus-10 kuria, pH 8,0) ja annettiin kuivua ilmassa 30 min. Nisät pyyhittiin kostealla puuvillavanulla ja huuhdottiin 10 ml:11a steriiliä, 0,85-%:ista NaCl-liuosta. Vanutuppo ja huuhteluliuos siirrostettiin erikseen veriagarmaljoille, inkuboitiin ja määritettiin CFU-luku. Tulokset, jotka esi-15 tetään taulukossa IIIA, osoittavat selvästi tämän valmis teen tehokkuuden. Käsitellyiltä nisiltä talteenotettujen S. aureus -solujen määrä väheni vähintään kolme kertalukua; 50 % käsitellyistä nisistä oli vapaita S. aureus -soluista.

20 Tehtiin vastaavia kokeita, joissa nisät kasteltiin valmisteissa, jotka sisälsivät 2 - 107 solua/ml Streptococcus aaalactiae -kantaa McDonald, ja annettiin kuivua ilmassa 30 min. Näiden kokeiden tulokset esitetään taulukos-[ sa IIIB. Kaikki käsitellyt nisät olivat vapaita S. agalac- 25 tiaesta.

* 1

Il I «Hik Kill I i * *» · is 95779

TAULUKKO IIIA

AMBI Teat-Dip-1,0 -valmisteen teho lehmien nisillä 5 olevaa Staphylococcus aureusta vastaan in vitro

VERTAILUKOE KÄSITELTY

(CFU/ml) (CFU/ml) 10

Lehmän nro LF RH LH RF

1 225 1675 13 0 15 2 24500 19500 8 175 3 300 15000 0 15 4 78 155 0 150 5 50500 18750 5 8 6 44250 65500 0 0 20 7 75 43 35 3 8 175 1150 0 0 9 68 58 0 5 10 550 300 0 0 25

Keskiarvo 12072 12213 6 36

Negatiivisten näytteiden 30 osuus 0/10 0/10 6/10 4/10 16 95779

TAULUKKO 11 IB

AMBI Teat Dip-1,0 -valmisteen teho lehmien nisillä 5 olevan Streptococcus aaalactiaen (kanta McDonald) suhteen in vivo

VERTAILUKOE KÄSITELTY

10 (CFU/ml) (CFU/ml)

Lehmän nro LF RH LH RF

15 1 5 15 0 0 2 53 360 0 0 3 115 48 00 4 150 10 00 5 13750 1200 0 0 20 6 16250 725 0 0 7 95 320 0 0 8 0 450 0 0 9 1175 775 0 0 10 150 300 0 0 25 _

Keskiarvo 2574 420 0 0

Negatiivisten Y: 30 näytteiden osuus 1/10 0/10 10/10 10/10

Lvsostafiinin tuotanto Bacillus-kannan avulla Tämän keksinnön mukaiseen käyttöön soveltuvaa lyso-35 stafiinia voidaan saada joko luonnollisista tai yhdistel-mälähteistä. Lysostafiinia tuotetaan edullisesti viljel-. mässä, joka sisältää Bacillus sphaericus -kantaa 00, joka on transformoitu lystostapiinisynteesiä ohjaavilla yhdis-telmäplasmideilla, tavalla, jota kuvataan avoinna olevassa 40 rinnakkaishakemuksessa nro 034 464 (jätetty 10. huhtikuuta 1987), joka on osittain jatkoa hakemukselle nro 852 407 • l 17 95779 (jätetty 16. huhtikuuta 1986). Tällä menetelmällä saadaan aikaan suuria määriä lysostafiinia, joka on suurin piirtein vapaata stafylokokkiperäisistä immunogeenisistä epäpuhtauksista. Lysostafiinin puhdistus helpottuu, sillä 5 aktiivinen lysostafiini kerääntyy suoraan kasvualustaan.

Tämän menetelmän yhteydessä on Bacillus sphaericus 00 -transformantit, jotka sisältävät plasmidin pBC16-lL (B. sphaericus 00/pBC16-lL), havaittu erityisen soveltuvaksi mainittuun tarkoitukseen, vaikka muutkin transformoidut 10 Bacillus-kannat ovat käyttökelpoisia lysostafiinilähteinä.

Lysostafiinia tuottavaa organismia kasvatetaan olosuhteissa, jotka johtavat lysostafiinin tuotantoon. Optimiolosuhteet vaihtelevat kannasta toiseen; tietyn tyyppisten kasvualustojen fermentointiolosuhteiden tiedetään kui-15 tenkin edistävän lysostafiinin tuotantoa. Bacillus sphaericus 00/pBC16-lL -transformantin ollessa kyseessä on edullinen kasvualusta VY-liemi [25 g BVeal Infusion + 5 g Yeast Extract/1 (vasikanliha-hiivauutealusta)] hyvin il-maistetuissa olosuhteissa (katso taulukko V).

20

TAULUKKO V

Ilmastuksen vaikutus Bacillus sphaericus 00/pBC16-lL -transformantin lysostafiinituotantoon 25 Sekoitusnopeus

Klett-pullo 100 min'1 200 min'1 200 min'1 320 min'1 (poimutettu) m ie 95779 300 ml:n Klett-pulloissa olevat viljelmät (40 ml) inokuloitiin 4 ml:11a yön yli kasvatettua viljelmää. Kasvualusta: Vy-liemi, joka sisälsi 5 pg/ml erytromysiiniä.

Näytteitä otettiin ajoittain kasvatuksen aikana.

5 Supernatanteista analysoitiin lysostafiiniaktiivisuus mittaamalla turbidometrisesti kuolleita S. aureus -soluja sisältävien suspensioiden kirkastuminen. Tulokset esitetään lysostafiinipitoisuuksina (pg/ml).

VY-alustassa kasvatettu B. sphaericus 00/pBC16-lL -10 transformantti tuotti ja eritti noin 130 mg lysostafiinia litraa kohden kasvualustaa, mikä on yli nelinkertainen määrä verrattuna määrään, jonka S. simulans tuottaa parhaissa tällä hetkellä käytettävissä olevissa fermentoin-tiolosuhteissa. Lysostafiini kerääntyy kasvualustaan hajo-15 amatta tai hajoten vain vähän jopa pitkien inkubointiaiko-jen ollessa kyseessä, ja sen osuus on yli 80 % solun ulkopuolisen proteiinin kokonaismäärästä.

Lysostafiini eristetään kasvualustasta tunnetuin fraktiointisaostusmenetelmin. Erityisen tehokas puhdistus 20 saadaan vaihtoehtoisesti aikaan yhdistämällä lysostafiinia tuottavien B. sphaericus 00/pBC16-lL -transformanttivil-jelmien fermentointiliemen saostus ja kromatografinen erotus.

* Solut poistetaan fermentointiliemestä esimerkiksi 25 sentrifugoimalla tai ultrasuodattamalla, ja supernatant-tiin lisätään kiinteää ammoniumsulfaattia 40 - 60 %, edullisesti 50 % kyllästyspitoisuudesta. Kun seosta on pidetty tunti lämpötilassa 4 °C, lysostafiinia sisältävä sakka otetaan talteen sentrifugoimalla. Saanto on tässä vaiheessa 30 yli 80 %.

Sakka liuotetaan uudelleen mahdollisimman pieneen tilavuuteen 10 mM natriumfosfaattipuskuria pH 7,00, 50 mmol/1 NaCl:a) ja dialysoidaan 100 tilavuusosaa vastaan samaa puskuria. Mahdollisen hiukkasmaisen materiaalin poi-35 stamisen jälkeen dialysoitu liuos käsitellään kromatogra- 19 95779 fisesti kationinvaihtopylväällä (edullisesti Pharmacia FPLC Mono S) ja eluoidaan käyttämällä puskuroitua suola-gradienttia, jossa NaCl-pitoisuus kasvaa 0,05 mol/l:sta 0,25 mol/l:iin. Lysostafiinisaanto oli yhdessä kromatogra-5 fiavaiheessa yli 90 %. Lysostafiiniaktiivisuus liittyy suurimpiin piikkeihin (kuvio 1). Myöhemmin eluoitava ly-sostafiinipiikki koostuu ei-kovalenttisista proteiiniagg-regaateista. Nämä aggregaatit hajoavat laimennettaessa puskurilla ja natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidi-10 geelielektroforeesin olosuhteissa.

Lvsostafiinia koodittavan geenin sisältävän plas-midivektorin PBC16-1L konstruointi

Lysostafiinia tuottavia Bacillus sphaericus -kantoja voidaan saada aikaan käyttämällä yhdistelmä-DNA-me-15 netelmiä ja edullisesti menetelmiä, joita kuvataan avoinna olevissa rinnakkaishakemuksissa 852 407 ja 034 464. Tarkemmin määriteltynä S. simulansin kokonais-DNA pilkotaan osittain sopivalla restriktioendonukleaasilla, ja siten muodostuneet DNA-fragmentit ligatoidaan sitten linearisoi-20 tuun tunnettuun vektoriin (pUC8), jossa on yhteensopivat päät ja joka sisältää antibioottiresistenssimarkkerin ja lac Z * -geenin (ts. β-galaktosidaasigeenin). Ligaatioseos siirretään sitten E. coliin (JM105) tekemällä transfor-mointi. Lysostafiinigeenin onnistuneet sijoittamiset plas-25 midiin voidaan löytää valikoimalla transformantit kasvattamalla siitä sopivaa antibioottia sisältävällä alustalla ja etsimällä sitten transformantit, joilla on lac Z' -negatiivinen fenotyyppi. Lysostafiinituotanto detektoidaan mittaamalla turbidimetrisesti S. aureus -suspension kir-• . 30 kastuminen joko liuoksesta tai agarmaljoilla olevista pin takerroksista .

Erilaisten lysostafiinia tuottavien E. coli JM105 -transformanttien käyttö ja JM105-plasmidi-DNA:n restrik-tioanalyysi ja alikloonaus osoittivat, että lysostafiinia 35 koodittava DNA-sekvenssi sijaitsi 1,5 kiloemäsparin (ke) 20 95779

Hpall - Hindlll -DNA-fragmentissa. Tämä fragmentti saatiin elektroforeesin jälkeen näkyväksi etidiumbromidivärjäyk-sellä ja siirrettiin nitroselluloosasuodatinliuskalle.

Liuska pestiin NET-puskurilla (0,15 mol/1 NaCl:a, 0,1 5 mol/1 EDTA:a, 0,02 mol/1 Trisiä, pH 8,0), ja siirretty DNA eluoitiin inkuboimalla liuskaa NET-puskurissa, joka sisälsi 1 mol/1 NaCl:a, yksi tunti lämpötilassa 65 °C. Etidium-bromidi poistettiin DNA:sta uuttamalla n-butanolilla. DNA, joka saostettiin lisäämällä kaksinkertainen tilavuus kyl-10 mää, 95-%:ista etanolia vesifaasiin, otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin 80-%:isella etanolilla ja liuotettiin TE-puskuriin (10 mmol/1 Trisiä, 1 mmol/1 EDTA:a, pH 8,0). Yhdistelmäplasmidit, joilla voidaan transformoida B. subtllis samoin kuin B. sphaericus lysostafiinia tuot-15 taviksi, konstruoitiin käyttämällä kloonausvektorina plas-midin pBC16 johdannaista (pBC16-l). pBC16 on tetrasyklii-niresistentti (Tetr) Bacillus-plasmidi, joka on alunperin eristetty B. cereusista [K. Bernhard, H. Schremph ja W.

Goebel, J. Bact. 133 (1978) 897]. Plasmideja, joita ei 20 pystytty erottamaan pBC16:sta restriktioanalyysillä eikä Southern-hybridisaatiolla, on löytynyt myös maasta eristetyistä B. subtilis ja B. sphaericus -kannoista [J. Polak ja R. N. Novick, Plasmid 7 (1982) 152].

: Kloonausvektorina käytetty pBC16-johdannainen 25 (pBC16-l) konstruoitiin ligatoimalla plasmidin pE194 [B.

Weisblum, M. Y. Grahan, T. Gryczan ja D. Dubnau, J. Bact.

137 (1979) 635], joka on erytromysiiniresistentti (ermr) S. aureus -plasmidi. TaqIA-fragmentti plasmidin pBC16 Taql osittaispilkkomistuotteeseen käyttämällä T4-ligaasia. Kun \ 30 ligaatioseos oli siirretty B. subtilisiin protoplasti- transformaatiolla [S. Chang ja S. N. Cohen, Molec. Gen.

Genet. 168 (1979) 111], valikoitiin kloonit, jotka olivat resistenttejä sekä tetrasykliinille että erytromysiinille. Eräälle tällaiselle kloonille annettiin nimeksi pBC16-l.

35 Restriktioanalyysi osoitti, että pBC16-l sisälsi kaikki • ·

,1 iU i tfilll I i I IM

21 95779 pBC16:n TaqI-fragmentit ja pE194:n sen TaqIA-fragmentin, joka sisältää erytromysiiniresistenssideterminantin. Sitten pBC16-l pilkottiin restriktioendonukleaasilla PvuII, jolloin poistui noin 25 % plasmidi-DNA:sta mukaan luettuna 5 suurin osa tetrasykliiniresistenssideterminantista. PvuII :11a pilkottu vektori pBC16-l käsiteltiin vasikan suolistosta saadulla alkalisella fosfataasilla. Lysostafiinia koodittavat 1,5 ke:n DNA-fragmentti käsiteltiin DNA-poly-meraasin Klenow-fragmentilla. Sitten 1,5 ke:n DNA-frag-10 mentti ja plasmidi-DNA sekoitettiin keskenään ja ligatoi-tiin käyttämällä T4-ligaasia ja ligaatioseos siirrettiin B. subtilisiin protoplastitransformoinnilla. Transforman-tit olivat erytromysiiniresistenttejä ja herkkiä tetrasyk-liinille ja tuottivat lysostafiinia, minkä osoitti kirkas-15 tumisvyöhykkeiden muodostuminen kasvatettaessa transfor- mantteja agarilla, joka sisältää kuolleita S. aureus -soluja. Eräs tällainen lysostafiinia tuottava klooni poimittiin eroon ja nimettiin B. subtilis/pBC16-lL:ksi♦ B. sub-tilis/pBC16-lL -transformantista uutettu plasmidin pBC16-20 1L-DNA eristettiin etidiumbromidi-cesiumkloriditiheysgra- dientissa tehdyn ultrasentrifugoinnin jälkeen. Plasmidin pBClö-lL DNA siirrettiin protoplastitransformoinnilla erilaisiin Bacillus-lajeihin, mukaan luettuna B. sphaericus -* kanta 00. Transformantit olivat resistenttejä erytromysii- 25 nille ja tuottivat lysostafiinia. B. sphaericus 00/pBC16- 1L -transformantilla saadaan aikaan paras lysostafiinituotanto ja sen mahdollistaa muuttumattoman, entsymaattisesti aktiivisen tuotteen keräämisen. B. sphaericus -kantaa 00 on alunperin eristetty maasta, ja sitä pidetään yllä the ‘ 30 Public Health Research Instituten, New York, New York, viljelmäkokoelmassa (RN3106). B. sphaericus 00/pBC16-lL:ä pidetään yllä the Publich Health Research Institute'n, New York, viljelmäkokoelmassa ja se on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collectioniin ATCC-nume-35 rolla 67398.

Claims (12)

1. 22 95779
2. 1. Desinfiointikoostumus stafylokokkien tappamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää lysostafii-5 nia ja vähintään yhtä ainetta, joka parantaa synergisti-sesti lysostafiinin bakterisidista aktiivisuutta ja joka on kelatoiva aine, mieto pinta-aktiivinen aine tai muu membraaneihin vaikuttava aine, stafylokokkeja tappavia määriä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lysostafiinia on läsnä vähintään pitoisuutena 0,01 pg/ml.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tu nnettu siitä, että se sisältää lysostafiinin 15 tappavaa vaikutusta tehostavan määrän mietoa pinta-aktiivista ainetta.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää 0,1 - 1,0 % mietoa pinta-aktiivista ainetta.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää mutanoly-siiniä ja lysotsyymiä.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lysostafiini on peräisin 25 transformanttimikro-organismista, joka sisältää lysostafiinia koodattavan yhdistelmäplasmidin.
8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että transformanttimikro-organismi sisältää plasmidin pBC16-lL. .30 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus käytet- täväksi nisienpesuaineena.
9. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lysostafiinia on läsnä vähintään pitoisuutena 0,01 pg/ml. 23 95779
10. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tu nnettu siitä, että se sisältää lysostafiinin tappavaa vaikutusta tehostavan määrän mietoa pinta-aktiivista ainetta.
11. 11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi mutanoly-siiniä ja lysotsyymiä.
12. 12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lysostafiini on peräisin 10 transformanttimikro-organismista, joka sisältää lysosta-fiinia koodittavan yhdistelmäplasmidin. \ m , · 24 95779