PT88472B

PT88472B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo lisostafina e metodos para a utilizacao de lisostafina no tratamento de mastite bovina e de outras infeccoes estafilococais

Info

Publication number: PT88472B
Application number: PT8847288A
Authority: PT
Inventors: Peter Blackburn; June Polak
Original assignee: New York Health Res Inst
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1988-09-09
Publication date: 1995-07-06
Also published as: PT88472A

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO LISOSTAFINA E MÉTODOS PARA A UTILIZAÇÃO DE LISOSTAFINA NO TRATAMENTO DE MASTITE BOVINA E DE OUTRAS INFECÇÕES ESTAFILOCOCAIS

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Este pedido de patente de invenção refere-se à utilização de lisostafina no tratamento e prevenção da infecção estafilicocal e, em particular, ao tratamento e prevenção de mastite bovina estafilococai.

A lisostafina é uma bacteriocina segregada por uma estirpe única conhecida de Staphylococcus simulans isolada inicialmente e chamada Stahylococcus staphylolyticus por Schindler e Schuhardt. A produção de lisostafina por S.staphylo lyticus foi descrita previamente na patente de invenção norte-americana N9 32 78 3 78 publjl cada em 11 de Outubro de 1966 e em Proceed ing of the National

Academy of Sciences, Vol. 51, pp. 414-421 (1964). 0 organismo sim pies 5. staphylolyticus (NRRL B-26 28) que produziu lisostafina /

-2foi recentemente identificado como uma (biovar) de S. Simulans por Sloan et al., Int. J. System. Bacteriol; Vol. 32 pp, 170-174 (1982 ). Visto que o nome £3. Staphyloly ti cus não se encontra na lista aprovada dos nomes de bactérias, o organismo que produz li sostafina foi designado como j5. simulans .

As bacteriocinas são proteínas segregadas por bactérias que matâm e algumas vezes provocam a lise nas bactérias relaciona das. Por exemplo, a lisostafina provoca a lise e mata praticamen te todas as espécies estafilococais conhecidas mas é inactiva con tra bactérias de todos os outros géneros.

A lisostafina isolada a partir de filtrados de cultura de £3. simulans (NRRL B-26 28 ) , desenvolvida de acordo com as referên cias publicadas, é uma endopeptidase que cinde a reticulação de poliglicina do peptidoglicano encontrado nas paredes celulares de estafilócocos . Além disso, as culturas que produzem lisostafina parecem ser resistentes às suas actividades enquanto as culturas desenvolvidas sob condições de não produção de lisostafina são sensíveis .

Estudos prévios têm mostrado que a lisostafina pode ser produzida por técnicas de fermentação em que £3. simulans é desen volvido em cultura líquida. Essas técnicas de fermentação são des critas na patente de invenção norte-americana NQ. 3 278 378 publicada em 11 de Outubro de 1966 e em Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 51,pp. 414-421 (1964). Vários aperfeiçoa mentos na produção de lisostafina mediante técnicas de fermentação

-3têm também sido feitos, como se documentou nas patentes de inven ção norte-americanas NSs. 3 398 0 56, publicada em 20 de Agosto de 1968 e 3 594 284, publicada em 20 de Julho de 1971. As últimas duas referências descrevem aperfeiçoamentos do meio de cultura e das técnicas de inoculação , pelo que a produção de lisostafina median te fermentação pode ser acelerada e melhorada. A lisostafina é pro duzida por S>. simulans durante o desenvolvimento exponencial, co mo um precursor inactivo. A proenzima é convertida em enzima madu ra activa pela protease produzida por culturasde fase estacionária de j[. simulans.

Além disso, a lisostafina pode ser produzida por microrganismos recombinantes , incluindo estirpes de E. coli , Bacillus Subtiiis e B, sphaericus que expressam o gene de lisostafina. Em contraste com a produção natural, a lisostafina acumula-se durante o desenvolvimento exponencial no meio de cultura de lisostafina recombinante, produzindo estirpes como enzima activa madura to_ talmente processada e está livre de contaminantes imunogénicos estaf ilococais .

A mastite bovina é um problema dispendioso para a indústria de lacticínios, custando para cima de 2 biliões de dólares por ano, só nos Estados Unidos. Segundo estimativas a doença afec ta, em algum grau, 50% das vacas leiteiras americanas, conduzindo a leite não utilizável, à diminuição da produção de leite e, em casos de infecção aguda, à morte do animal.

A mastite é provocada por infecção das glândulas mamárias i

-4principalmente por Staphylococcus aureus ou Streptococcus aga¹lactiae e em menor grau por E. coli e outras bactérias gramnegativas ou suas associações. A maior parte das infecções estreptococais mostraram ser, eficazmente tratáveis utilizando a terapia convencional dos antibióticos. A mastite estafilococai tem, porém, apresentado mais dificuldade na cura.

A prevenção tradicional de mastite bovina pode envolver um regime complexo de imersão diária da teta numa solução desiri fectante /”Ver, J. S. McDonald, Veterinary Clinics of North America Large Animal Practice , 6, 269 (1984)_7 e pode, nalguns casos, envolver a imersão da teta em soluções contendo antibióticos. No entanto , a terapia antibiótica de rotina deve ser adoptada com precaução, para minimizar a selecção das estirpes resistentes a antibióticos. Quando ocorre a infecção, é indicada a infusão intra mamária de antibióticos. A terapia de antibióticos destes tipo pode reduzir a infecção de forma a gue o leite produzido seja comer cializável, mas, geralmente, não conduz a completa eliminação do organismo causador.

Antigamente, a mastite estafilococa1 apresentava uma respos ta fraca à terapia de antibióticos e uma tendência para reaparecer e tornar-se crónica. Os estudos sobre a mastite indicaram gue parte do problema no tratamento da mastite é a existência de um número significativo de estafilo cocos gue permanecem viáveis na glândula mamária entre os leucócitos neutrófilos polimorfonucleares fagocíticos (PMN). Pensa-se gue os estafilococos entre os PMN são

-5protegidos dos efeitos dos antibióticos e guando ocorre a lise dos leucócitos, os estafilococos fagocitizados podem proporcionar uma fonte renovada de regeneração estafilococal produtora de mas ti te.

Os estudos sobre o mecanismo possível de evasão aos antibió ticos de estafilococos fagocitizados no tratamento de mastite levaram à rejeição da lisostafina como uma candidata para destruir estafilococos fagocitizados. /Cravem et al., Research in Veterinary Science 29, p.57 (1980); Craven et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 21, p. 618 (1982); Craven et al., Comp. Immun.

Microbial. Infect. Pis 5, p. 447 (1982) Craven et al., Journal of Dairy Research 51, p. 513 (19 8 4 ) _7 .

Nestas experiências utilizou-se a lisostafina in vitro como um pré-tratamento para destruir estafi1icocos extracelulares antes de expór os estafilococos fagocitizados à cloxacilina, gentamicina ou lisostafina. Os resultados de Craven et al., sugerem fortemente gue a lisostafina não teria nenhum efeito sobre a mastite, visto gue os estafilococos intracelulares eram ainda viáveis após 20 horas de incubação numa solução contendo lisostafina; Journal of Dairy Research, 51, pp. 515-516 e Quadro 2.

A lisostafina foi também referida como capaz de penetrar nos monócitos humanos. Visto gue os monócitos são um tipo de células diferentes de PMN, não é fácil aplicar este modelo humano ao tratamento da mastite bovina fVan den Brock et al. , Scand. j. Immunol; 21, p. 189 (1985 )

-6A lisostafina revelou-se também eficaz no tratamento de abcessos renais estafilicocais em ratinhos, particularmente quari do utilizada em sequência com a administração de meticilina. Dixon et al., Yale J. Biol. Med, 41, p. 62 (1968).

No homem, a lisostafina foi também utilizada como um ageri te terapêutico para tràtamento de infecções estafilococais nasais crónicas /“Quickel, Jr. et al., Applied Microbiology, 22 p. 446 (1971)J7. Num caso de uma infecção estafilococal resistente admini£3 trou-se lisostafina sistemicamente £ Stark et al. , Medicai Intelli gence , 291, p.239 (1974)_7. Em geral, porém , tem havido grande cepticismo e relutância nas comunidades médica e veterinária relativamente à administração sistémica de lisostafina. A lisostafina foi considerada altamente imunogénica para utilização em geral, excepto aplicações tópicas.

Sumário da Invenção

Descobriu-se agora que a lisostafina pode ser utilizada com eficácia surpreendente para evitar e/ou curar a mastite estafilococal, mesmo sob a forma crónica, sem quaisquer efeitos imuno génicos adversos. Como um profiláctico, a lisostafina pode ser in troduzida como uma parte de um regime diário de imersão da teta.

-ΊΆ lisostafina pode ser utilizada isoladamente, mas, de pre ferência, o banho de imersão da teta incluirá lisostafina; outros agentes bacteriolíticos tais como mutanolisina, uma bacteriocina produzida por Streptococcus globisporus que é eficaz contra estrep tococos; e licozima, uma enzima muralítica que hidrolisa a estrutura polissacárida do peptidoglicano nas paredes celulares de bactérias gram positivas e gram negativas. A composição pode conter também um agente de quelação tal como etilenodiaminotetracetato (EDTA); e um agente tensioactivo suave que mostre favorecer a morte das bactérias. Agentes tensioactivos suaves incluem, inter alia, ésteres de polioxietileno-sorbitano e de ácidos gordos (Série Tween) octilfenoxi-polietoxi-etanol (Série Triton-X), ri-octil-/3-D-glucopiranósido , n-octil-/5-D-tioglucopiranósido , n_-decil-/)-D-glucopiranósido n-dodecil-C-D-glucopiranósido, e agentes tensioactivos que ocorram biologicamente, por exemplo, ácidos gordos, glicéridos, monoglicéridos, desoxicolato e ésteres de desoxicolato.

Para além do ano profiláctico do banho de imersão da teta de espectro largo, pode-se infundir vários componentes do banho na teta infectada para eliminar as bactérias e curar a mastite, por exemplo, lisostafina isolada ou com um agente tensioactivo suave, o que surpreendentemente aumenta o efeito estafilocidal da lisostafina mais de 1000 vezes. Além disso, a associação da iisostafina e da penicilina também exibe sinergia, de forma que se obser va um aumento de 1000 vezes na eliminação de estafilococos in vitro

Deste modo, uma composição para infusão terapêutica pode também

-8incluir penicilina ou um agente tensioactivo suave, com ou sem um agente de quelação.

Infusões de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico, com ou sem agentes tensioactivos , EDTA, penicilina ou outros agentes incentivadores são utilizadas para se conseguir a eliminação da infecção estafilococal. De preferência, essas infusões contêm entre 2 e 400 mg de lisostafina quando não estão presentes nenhuns ·agentes incentivadores. Em associações gue contenham agentes incentivadores, as doses eficazes necessárias de lisostafina podem ser diminuídas cerca de 1000 vezes (como um resultado do aumento sinérgico da sua actividade).

A actividade bactericida sinérgica da lisostafina e penici. lina foi observada mesmo com a administração a S. aureus positivo à penicilinase e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) . MRSA são normalmente resistentes a múltiplos antibióticos e são particularmente problemáticos, especialmente em seres humanos, bem como difíceis de matar. A associação de 1isostafina/penici1ina seria indicada para utilização em situações específicas em que a infecção grave de MRSA não pudesse ser controlada por terapia de antibióticos convencionais (por exemplo, penicilina). Além disso, a penicilina e outras substâncias que actuam de modo semelhante podem também ser eficazes em conjunto com a lisostafina como um ageri te contra a infecção estofilococal e a contaminação. Embora a utilidade das composições que contêm lisostafina, de acordo com a pre sente invenção seja ilustrada pela sua utilização no tratamento

-9da mastite, a eficácia aumentada da lisostafina nessas composições torna-as apropriadas para um certo número de outras aplicações envolvendo infecção e contaminação estafilococal. Deste modo, as com posições podiam ser utilizadas para controlar infecções estafiloco cais, incorporando-as em ligaduras e medicação para ferimentos , es covas, panos ou loções desinfectantes ou em implantes cirúrgicos. As composições poderiam também ser utilizadas para limpeza de instrumentos médicos e de soalhos, paredes, roupa de cama e análogos em circunstâncias em gue se deseja a desinfecção do meio ambiente. Outras utilizações potenciais incluem o uso como uma infusão nasal para reduzir o transporte intra-nasal de estafilococos e as utilizações relacionadas com alimentos tais como o tratamento de carne ovos, queijo e peixe ou equipamento de embalagem e manuseamento de alimentos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 representa um cromatograma de lisostafina produzida pela estirpe 00 de B, sphaericus transformante que contém o plasmídeo recombinante pBC16-lL que codifica para a lisostafina.

/ !

t

V . ..

-10 Descrição Permenorizada da Invenção

A lisostafina para utilização de acordo com a presente in_ venção pode ser obtida a partir de quaisquer fontes naturais ou recombinantes. De preferência, obtém-se a lisostafina a partir da estirpe 00 de Bacillus sphaericus , que contém um plasmideo recom binante que dirige a síntese de lisostafina, o que proporciona '' tanto níveis elevados de produção de lisostafina substancialmente livre de contaminantes imunogénicos estafilococais, como a fácil purificação de lisostafina, visto que a lisostafina se acumula d_i rectamente no meio de desenvolvimento. Tem-se verificado que os transformantes de Bacillus sphaericus contendo o plasmideo pBC16-lL são particularmente adaptados para este propóáito, em bora outras estirpes sejam também úteis como fonte de lisostafina Descreve-se um método para a obtenção de lisostafina a partir de microrganismos transformados por plasmídeos recombinantes contendo o gene que codifica para a lisostafina, no pedido de patente de invenção norte-americana nS 034 464 depositado em 10 de Abril de 1987, que é uma continuação em parte do pedido de patente de invenção norte-americana nQ. 852 407. Ambos os pedidos de patente de invenção são incorporados aqui para referência.

-11Método de Tratamento

Os tratamentos profilácticos da mastite bovina, de acordo com a invenção,envolvem a utilização de banhos de imersão da teta contendo lisostafina. Os banhos da imersão da teta contendo liso£ tafina proporcionam prevenção eficaz de mastite bovina, quando uti. lizados antes e após todas as mungiduras. O regime preventivo é utilizado, de preferência, para todas as vacas da manada. Os banhos da teta compreendem cerca de 1,0 pg/ml de lisostafina em um veícu lo aceitável. Além disso, os banhós da teta para utilização de acordo com a invenção podem incluir cerca de 1,0 pg/ml de mutanolisina, cerca de 10 pg/ml de lisozima e um agente tensioactivo sua ve. Veículos aceitáveis são os gue proporcionam um meio tamponado de aproximadamente pH 8,0 e incluem tampões aquosos ou bases de pomadas hidrófilas . Por exemplo, detergentes não iónieos, ácidos ou outros agentes tensioactivos suaves, veículos de proteínas, tais como albumina de soro ou gelatina, celulose em pó e caramelo podem ser utilizados como um veículo. O banho de imersão da teta de acordo com a invenção pode também incluir vantajosamente agentes guelantes, tais como EDTA, corantes e humectantes tais como glicerol ou sorbitol.

A mutanolisina é obtida a partir de Streptomyces globisporus A disozima é obtida a partir das claras de ovos de galinhas.

-12A infusão intramamária de lisostafina pode ser utilizada para tratar de modo eficaz animais infectados, que tenham desenvolvido tanto mastite bovina estafilococal crónica como aguda, apesar do tratamento profiláctico. Uma dose única compreendida en tre 2 e 400 mg de lisostafina por glândula mamária eliminará a infecção e curará a mastite estafilococal na maioria dos casos. As doses adicionais de lisostafina podem ser indicadas guando a infecção for persistente. As doses segnificativamente superiores a

400 mg não são recomendadas, porgue podem conduzir a efeitos secundários indesejáveis e potencialmente prejudiciais, incluindo intumescência transitória, fragilidade e produção de, leite redu zida. Estes efeitos estão limitados, porém , a glândula tratada, de modo que doses mais elevadas só para uma glândula podem ser apropriadas para situações agudas e de perigo de vida. Em casos de perigo de vida, a via de administração podia também incluir oij tros locais além da glândula infectada, de forma a conseguir-se libertação sistémica, isto é, administração intravenosa, subcutânea ou intramuscular e rectal ou oral de composições farmacêuticas encapsuladas de modo apropriado nas quais a lisostàfina é protegida a partir da inactivação no intestino.

Verificou-se também que a infusão de uma associação de lisostafina e penicilina é surpreendentemente muito mais eficaz do que a lisostafina isolada, devido a uma aparente actividade bactericida sinergísticamente aumentada, desta associação. Além disso,

-13acredita-se que a composição terapêutica de lisostafina pode tam bém incluir outros agentes que aumentam a actividade bactericida da lisostafina, por exemplo, penicilinas sintéticas e outros antibióticos, agentes guelantes, agentes tensuioactivos suaves (por exemplo, desoxicolato e outros agentes activos de membrana gue podem facilitar a penetração da lisostafina no local da infecção. Em composições gue incluam, por exemplo, penicilina, a dosagem de lisostafina pode ser diminuída , como um resultado do aumento da actividade bactericida da lisostafina. Visto que uma dose demasiado elevada de lisostafina pode induzir efeitos secun dários indesejáveis e potencialmente prejudiciais, este efeito sinérgico é significativo, não só para a eficácia como também p_a ra evitar possíveis efeitos secundários.

-14Exemplos 1-4

Efectuaram-se experiências in vitro para determinar a acti_ vidade bacteriacida de composições farmacêuticas de lisostafina, mutanolisina e lisozima em relação a S. aureus e a outros agen tes patogénicos de mastites.

protocolo foi o seguinte:

Protocolo para ensaios de células viáveis , 9

1. As células bacterianas (geralmente 10 células/ml) pr£ venientes de um prato de uma noite (incubadas a 37°C) foram ressuspensas em tampão Tris (Tris 20 mM, pH 8).

2. Combinaram-se 10 μΐ de suspensões de células bacterianas e 1 ml de controlo e composição de teste do banho de imersão da teta (isto é leite, tampão ou detergente tamponada etc., conteri do a composição de lisostafina)

3. As células foram incubadas várias vezes à temperatura de 37°C.

4. As suspensões bacterianas foram centrifugadas durante 2 minutos em microcentrifugas até se formarem agregados de células .

/

-155. Os agregados foram lavados duas vezes com 1,0 ml de tampão de Fago.

6. As células foram ressuspensas em 1,0 ml de tampão de Fago, diluídas em série em tampão de Fago, de modo apropriado, e plaquearam-se 100 jul sobre agar GL (S. aureus, E. coli. Klebsiell pneumoniae.)ou agar de Soja Tripticase (S. agalactiae).

7. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C e as placas de teste e de controlo e fez-se a contagem das unidades formadoras de colónias (a seguir CFU) para determinar a sobrevivência percentual.

Composição do Tampão de Fago:

Tris 50 mM , pH 7,8; M SO. lmM; CaCl„ 4 mM; NaCl 100 mM;

g 4 2 '

Gelatina, 1,0 g/1. (O tampão de Fago auxilia a estabilizar quais quer protoplastos e esferoplastos que não tenham sido submetidos à lise durante o tratamento).

Composição de agar de GL por litro:

casaminoácidos Difco, 3,0 g; extracto de levedura Difco, 3,0 g; NaCl, 5,9 g; lactato de sódio (60% p/v), 3,3 ml; 25% de glicerol (v/v), 4,0 ml; agar, 15 g; pH ajustado para 7,8.

-16Composição de agar de soja tripticase por litro:

Triptona Bacto, 15 g; tom de soja Bacto, 5g; NaCl, 5 g;

agar, 15 g; pH ajustado para 7,3.

Os resultados de experiências in vitro , demonstrando a ef^ cácia bactericida de várias-composições terapêuticas de lisostafina, apresentam-se nos Quadros IA-IC. Os resultados estão expressos como as percentagens das sobrevivências para estirpes S. aureus Newbould 305, estirpe RN451 , as estirpes RN1753 (Produtor de Penicillinase) resistentes à penicilina e estirpe Col (resistente à meticilina).

O Quadro IA apresenta resultados para composições que contêm 1 jjg/ml , 0 ,1 jjg/ml, 0 ,0 1 pg/ml e 0 ,00 pg/ml (CNTRL) de lisos, tafina. Como se pode verificar a partir destes resultados, todos os níveis de lisostafina testados foram eficazes para matar os o_r ganismos em um veículo tampão (Tris 50 mM, pH 8,0). Num veículo de leite, apenas 1 pg/ml e 0 ,1 pg/ml reduziram a sobrevivência da bactéria.

O Quadro IB mostra o efeito de adição ao leite de um ageri te tensioactivo não iónico suave, octilfenoxil-polietoxi(10)-eta nol, (Triton X-100), à composição de lisostafina. Por exemplo menos do que 0 ,001% das células sobrevivem à esposição a 0 ,1 pg/ml de lisostafina e 0 ,1% de Triton X-100 , enquanto 2,2% e 7,7%, respectivamente, sobreviveram à exposição a cada um dos compostos ί

-17isoladamente. Ainda mais surpreendente foi a sobrevivência inferior a 0 ,001% observada para 0 ,01 pg/ml de lisostafina e 0 ,1% de

Triton X-100.

O Quadro IC mostra o efeito sinérgico de associações liso£ tafina/penicilina sobre três estirpes de estafilococos. Dependendo das doses de cada uma, as associações de lisostafina mais pen_i cilina podem ser 100 a 1000 vezes mais eficazes do que a lisostafina ou a penicilina isoladamente com todas as três estirpes.

O Quadro ID mostra o efeito da associação de lisostafina e penicilina comparado com o seu efeito sequencial sobre S. aureus.

S. aureus foi suspenso a uma concentração de 10 celulas/ml em leite e incubado para as vezes indicadas no Quadro com lisostaf_i na e penicilina em conjunto ou sequencialmente. Após a incubação as amostras foram centrifugadas para se obter aglomerados de célu las gue foram lavadas duas vezes, ressuspensos em 1,0 ml de tampão de Fago , diluídos e 100 _pl colocados em placas sobre agar GL. As unidades formadoras de colónias (CFU) foram contadas após incuba ção durante a noite a 37°C para determinar a percentagem de sobrevivências em relação aos controles apropriados. A associação lisostafina/penicilina exibe uma actividade bactericida sinérgicamente aumentada contra S, aureus, gue é pelo menos 3 ordens de grandeza maior do gue a verificada-guando os dois agentes são adi/ cionados seguencialmente

Quadro IA

Efeito de lisostafina sobre a viabilidade de S. Aureus

I

II ‘s___- ;.·

-18tempo de

estirpe	Veículo	incubação		% de	sobrevivência
			1 ,0 L	0 ,1L	0 ,0 lL CNTRL
S. aureus
Newbould 30 5	leite	15 ¹	2,8	75 ,0	100 100
		2h	o ,1	82 ,0	100 100
RN451	leite	15 '	40 ,1	22	100 100
		2h	<0 ,01	41	100 100
	tampão	2h	nd	2 , 2	20 100

Quadro IB

Efeitos do detergente não iónico sobre a actividade bactericida de lisostafina relativamente a S, aureus estirpe tempo de

Veículo incubação % de sobrevivência ,1L 0 ,0lL 0 ,1%T 0 ,1L 0,01L CNTRL + 0 ,1%Τ4θ ,1%T

S. aureus t a m pão

R N 4 51 +0 ,1 %

Triton

2h 2,2 20 7,7 40 ,00 1 <0 ,00 1 100 /

-19Quadro IC

Efeito da Penicilina sobre a actividade bactericida da lisostafina relativamente a S. aureus

Tempo de

Estirpe	Veículo	incubação			% de sobrevivência
			0 ,1L	0 ,0lL	0 ,1P 0 ,1L 0 ,01L	CNTRL
					+ 0 ,1P +0 ,1P
S. aureus	leite	30 ¹	19	10 0	76 2,8 45	10 0
RN451		2h	26	10 0	17 <0 ,0 1 0,4	10 0

(10 P ) (10 P ) (10 P )

RN1753 leite	2h	1,9	66	46<0 ,0 1 14 100
positiva à
penicilinase
Col resis- leite	2h	1 ,o	100	(10P) (10P) (10P) 6 7 <0 ,01 0,5

tente à meticilina'

-20Quadro ID

Comparação do efeito da associação da lisostafina e pènicilina em função dos seus efeitos requerenciais sobre a sobrevivência de (estirpe RN451) em leite a

37°C cõmbo(2h)

Ispn(2h) pen(2h)

Pen(2h ) / Ispn(0 ,5h)

Ispn(2h)/ pen (0 , 5h) % de sobre 0 ,000 5 23 vivência

0,3 10

Ispn = lisostafina; pen = penicilina

-21Além disso, ensaios para as actividades de lisostafina, nm tanolisina e lisozima que medem a diminuição da turvação a 600 nm de suspensão de S. aureus, S. agalactiae e E, coli ou Klebsiella pneumoniae vivos, respectivamente, indicaram que agentes quelantes (por exemplo, EDTA) aumentam a actividade lítica de cada uma das três enzimas bacteriolíticas.

Os dados indicam que a lisostafina é um agente de actuação rápido, um estafilócido altamente eficaz cuja actividade bacteri^ cida é aumentada mais de 1000 vezes pela penicilina ou o agente tensioactivo suave Triton χ-100. A inclusão de um agente quelante aumenta ainda mais a actividade bactericida da lisostafina. Verifica-se também que as penicilinas sintéticas e os antibióticos activos nas paredes das células aumentarão a actividade de liso^s tafina. A lisostafina é um estafilócido eficaz em leite, mas em tampão a actividade bactericida da lisostafina é aproximadamente vezes a observada em leite.

Exemplo 5

De acordo com o protocolo geral descrito nos Exemplos 1-4 realizaram-se outras experiências in vitro para calcular a actividade bactericida de uma composição de lisostafina que compreen de enzimas bacteriolíticas, um detergente não iónico e um agente quelante tamponado. Como se mostra no Quadro II uma composição que contém 1% de Triton X-100, 0,1 jug/ml de lisostafina 10 jug/ml de lisozima i s \______ - /

-22e EDTA 5 mM em Tris 20 mM, pH 8 (AMBI-banho de imersão da teta -0,1) foi extremamente eficaz contra uma larga gama de agentes patogénicos causadores de mastite, incluindo a estirpe S. aureus Newbould 305, S. epidermidis, estirpe, Streptococcus agalactiae de McDonald e a estirpe C48 e isolados clínicos de Streptococcus uberis, E. coli e Klebsiella pneumoniae.

/

-23Quadro II

Eficácia in vitro do banho 1 de imersão da teta AMBI contra agentes patogénicos de mastites

Estirpe

Contagem viável % de sobrevivência

Staphylococcus (Newbould 30 5 )

Staphylococcus (RN451 )

Staphylococcus (PS )

Streptococcus ( McDonald)

Streptococcus (C48 )

Streptococcus (PS)

Escherichia (PS )

Klebsiella ( PS ) aureus aureus epidermidis agalactiae agalactiae uberis coli pneumoniae

7,0 X 10⁵

5,7 X 10⁵

8,3 X 10⁵

3.9 X 10 ⁵

2.9 X 10 ⁴

6.9 X 10 ⁵

9,1 X 10⁵

9,6 X 10 ⁵ <0 ,00 1 <0 ,00 1 <0 ,00 1 <0 ,00 1 <0 ,00 1 <0 ,00 1 <1,0 <1,0 /

-24Exemplo 6

Realizaram-se experiências com vacas que demonstraram a efi. cácia in vivo de composições de banho de imersão de tetas, contendo lisostafina. Os testes foram realizados geralmente de acordo com o Protocolo A da National Mastitis Council. Em geral, lavaram-se as tetas com solução de lavagem de iodo a 1% e secaram-se com uma toalha de papel. As tetas foram depois enxaguadas com álcool e deixaram-se secar ao ar. Quatro tetas por vaca foram a seguir mergulhadas alternadamente numa suspensão de 10 células da estirpe Newbould 305 de S. aureus até cobrir metade da teta e deixou-se secar ao ar durante 30 minutos.

Duas tetas (anterior direita e posterior esquerda) foram depois mergulhadas numa composição de banho da teta de teste de lisostafina (10 jjg/ml de lisostafina em 0 ,85% de solução salina) até cobrir 2/3 da teta e deixou-se secar ao ar durante 30 minutos;

as restantes duas tetas actuaram como controlos não tratados. Cada teta foi em primeiro lugar esfregada com um esfregão de algodão húmido e depois lavada com 10 ml de solução salina estéril a 0,85%; a solução de lavagem foi colhida num tubo esterilizado de 30 ml. Uma amostra de 0 ,2 ml da solução de lavagem e diluições apropriadas correspondentes foram colocadas sobre placas em agar sanguíneo, em duplicado e foram incubadas a 37°C durante 24-48 hc> ras. Determinaram-se unidades formadoras de colónias e calculou-se a sobrevivência em percentagem de S. aureus relativa aos con trolos .

-25Soluções de 10 pg/ml de lisostafina em solução salina a 0,85% desinfectaram completamente libertando-se S. aureus a partir das superfícies das tetas da vaca. Além disso, a lisostafina aplicada às superfícies das tetas antes da exposição das tetas às suspensões de S. aureus tinha actividade residual suficiente na superfície da teta para evitar a formação de colónias nas tetas.

A actividade residual podia ser aumentada por inclusão de um adsoç vente polimérico e /ou veículo de proteína inerte para reduzir a remoção da lisostafina pela lavagem.

Exemplo 7

De acordo com os resultados do Exemplo 6 e os dados obtidos in vitro uma composição melhorada de imersão da teta (AMBI banho de imersão 1,0) compreendendo 1,0 pg/mi de lisostafina, 10 pg/ml de lisozima, 1,0% de Triton X-100 e EDTA 5 mM em Tampão de Tris 20 mM pH 8 ,0 foi ensaiada como um desinfectante contra a estirpe Newbould30 8 de S. aureus . As tetas foram mergulhadas em 10 células/ml de estirpe Newbould 305 de S. aureus e deixaram-se secar ao ar durante 30 minutos. As tetas tratadas foram depois mergulhadas numa solução de banho de imersão -1,0 de teta de teste AMBI (1,0 pg/ml de lisostafina, 10 ,0 pg/ml de lisozima, 1,0% de triton X-100 , EDTA 5 mM , tampão de Tris 20 mM pH 8 ,0 ) e deixou-se secar ao ar durante 30

-26minutos. As tetas foram esfregadas com um esfregão de algodão húmi_ do e enxaguadas com 10 ml de solução salina estéril a 0 ,85%. 0 esfregão e a solução resultante do enxaguamento foram colocados em placas de agar sanguíneo separadamente, incubadas durante 24-48 h e determinou-se o CFU. Os resultados apresentados no Quadro III A demonstraram claramente a eficácia desta composição. Observou-se uma redução de, pelo menos, 3 vezes a ordem de grandeza nos números de S. aureus recuperados a partir das tetas tratadas; 50% das tetas tratadas ficaram livres da invasão de 5. aureus.

Realizaram-se testes correspondentes em que as tetas foram mergulhadas em composições contendo 2x10^ células/ml da estirpe McDonald de Streptococcus agalactiae e depois deixou-se secar ao ar durante trinta minutos. Os resultados destes testes apresentam-se no Quadro IIIB. Todas as tetas tratadas ficaram livres de S, agalactiae.

-7.1Quadro III A

Eficácia in vivo da Imersão da teta- 1,0 AMBI contra Staphylococcus aureus em tetas de vaca

Vaca n2	Controlo CFU por ml	Controlo CFU por ml
LF	I RH	LH	RF
1	225	1.675	13	0
2	24,500	19.500	8	175
3	30 0	15 ,000	0	15
4	78	155	0	150
5	50 .500	18 .750	5	8
6	44.250	65 .500	0	0
7	75	43	35	3
8	175	1 150	0	0
9	68	58	0	5
10	5 50	300	0	0
Média	12 .0 72	12 .213	6	36
Total· de
Qtrs
Negativo	0/10	0/10	6/10	4/10

-28Quadro III Β

Eficácia in vivo da Imersão da teta -1,0 contra Streptococcus agalactiae (estirpe McDonald) em tetas de vaca

Vaca NQ

Controlo

Tratado

	CFU ' s	por ml	CFU ' s	por ml
	LF	RH	LH	RF
1 .	5	15	0	0
2 .	53	360	0	0
3 .	115	48	0	0
4 .	150	10	0	0
5 .	13.750	1.200	0	0
6 .	16,250	725	0	0
7 .	95	3 20	0	0
8 .	0	4 50	0	0
9 .	1.175	775	0	0
10 .	150	300	0	0
Média	2.574	4 20	0	0
Total de Qtrs
negativo:	1/10	0 /10	10/10	10 /10

-29Exemplo 8

Infectaram-se glândulas mamárias de cobaias com 200-300 CFU da estirpe Newbould 30 5 de S. aureus . Três dias após a infecção, as glândulas foram infundidas com uma dose simples de lisostafina dissolvida em 200 jil de solução salina estéril a 0 ,85%. As amostras de leite foram colhidas das glândulas 6 horas após o tratamento e com intervalos de 12 horas, subseguentemente durante, pelo menos, dias após o tratamento. Amostras de leite de 100 ^pl das glândulas infectadas tratadas e não'tratadas foram colocadas sobre placas de agar sanguíneo. Após 24-48 horas de incubação, as placas foram ccr tadas para determinar o CFU. As doses únicas de lisostafina que fo ram suficientes para eliminar a infecção não produziram efeitos se cundários prejudiciais e indicaram gue infusões intramamárias de lisostafina são eficazes contra mastites estafilococais. Para 125 gg/ml as glândulas ficaram livres da infecção, 6 horas após o tratamento e conservaram-se limpas durante o estudo.

-30 Quadro IV

Eficácia da infusão intramamária de lisostafina relativamente a

Mastites estafilococais experimentais em cobaias.

Dose de lisostafina jug/kg

Número	de	animais	ZERO	i ,o	5,0	25 ,0	62,5	125 ,0
livres	de	infecção	(0 /10 )	(1/0 )	(1/2 )	(2/2)	(1/1 )	( 7/7)

-31Pode-se verificar a partir destes exemplos que a lisostafina é eficaz para tratamento de mastites estafilococais e o seu efeito é fortemente aumentado quando utilizada em associação com penicilina ou substâncias tais como agentes tensioactivos suaves e agentes quelantes.

Produção de lisostafina a partir de Bacillus

A lisostafina para ser utilizada de acordo com a presente invenção pode ser obtida a partir de fontes naturais ou recombinan tes. De preferência, a lisostafina é obtida a partir de culturas derivadas da estirpe 00 de Bacillus sphaericus transformada por plasmídeos recombinantes que orientam a síntese da lisostafina como se descreveu no pedido de patente de invenção co-pendente sé rie N2. 0 34 464 depositado em 10 de Abril de 1987, que é uma conti nuação em parte da série N9. 852 40 7 depositado em 16 de Abril de 1986. Este método proporciona níveis elevados de produção de lisos^ tafina substancialmente livre de contaminantes imunogénicos estafi lococais. A purificação de lisostafina é facilitada, visto que a lisostafina activa se acumula directamente no meio de desenvolvimen to. Utilizando este método, transformantes Bacillus sphaericus 00 contendo o plasmí-pBClõ-1L (B. sphaericus OO/pBC16-lL) mostraram-se particularmente apropriados para este fim, embora outras estir pes de Bacillus transformados sejam também úteis como uma fonte de lisostafina.

/

I

-32Ο organismo produtor de lisostafina é desenvolvido sob condições que levam à produção de lisostafina. As condições óptimas variarão de estirpe para estirpe; porém, conhecem-se certos tipos de meios de desenvolvimento e condições de fermentação para aumen tar a produção de lisostafina. No caso do transformante Bacillus sphaericus OO/pBC16-lL, o meio de desenvolvimento preferido é o caldo VY (25 g de infusão de vitela + 5 g de extracto de levedura /litro) sob condições bem arejadas (Ver Quadro V).

-33Quadro V

Efeito do arejamento sobre a produção de lisostafina por transformante do Bacillus Sphaericus 00/ pBC16-lL

Klett	10 0 rpm	Velocidade de agitação
200 rpm	200 rpm (com vibração)	320 rpm
250	21,8	36 ,2	35 ,9	30 ,0
350	40 ,1	68 ,9	45 , 3	45 ,0
400	88,5	62,7	10 2,8	71,4
4 50	n/a	86 ,4	52 , 3	135 ,9
O/N	64,4	31,3	37,6	57,5

As culturas (40 ml) em frascos de 300 ml foram inoculadas com 4 ml de cultura primária de uma noite. Meio de desenvolvimento:

Caldo VY contendo 5 pg/ml de eritromicina.

As amostras foram recolhidas em tempos determinados, durante o desenvolvimento. Os sobrenadantes foram testadas para a actividade da lisostafina por determinando por turbidometria a limpidez de suspensõesde células mortas de S. aureus. Os resultados apresentarn -se em pg de lisostafina por ml. Transformante B. sphaericus 00 /pBCl6-lL desenvolvido no meio VY produziu e segregou aproximadamente 130 mg de lisostafina por litro de meio de cultura, o gue é mais do que 4 vezes a quantidade produzida por S. simulans sob as

-34melhores condições de fermentação disponíveis normalmente. A lisostafina acumula-se no meio de desenvolvimento com pouca ou nenhuma degradação, mesmo após incubação prolongada de culturas e é responsável por mais do que 80% da proteína extracelular total.

A lisostafina é isolada do meio de cultura de acordo com processos conhecidos de precipitações fraccionada (saltingout) . Alternativamente, consegue-se uma purificação particularmente eficaz combinando uma precipitação e uma separação cromatografica do caldo de fermentação a partir das culturas de transformantes B. sphaericu 00 produtora de lisostafina/pBC16-1L.

As células são removidas do caldo de fermentação , por exemplo , por centrifugação ou ultrafiltração e adiciona-se sulfato de amónio sólido ao sobrenadante para 40-60%, de preferência 50% de saturação. Após 1 hora a 4°C, recupera-se mediante centrifugação o precipitado que contém lisostafina. A recuperação neste passo é su perior a 80%.

Dissolve-se novamente o precipitado num volume mínimo de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,00, NaCl 50 mM) e submete-se a diálise contra 100 volumes do mesmo tampão. Após remoção de part^i cuias existentes , a solução submetida a diálise é cromatografada nu ma coluna de permuta catiónica (de preferêncià ·Pharmacia FPLC Mono S) e eluída utilizando um gradiente tamponado de aumento de concen tração de sal compreendido entre NaCl 0 ,05 M e NaCl 0 ,25 Μ. A recuperação de lisostafina em um só passo cromatográfico foi superior

BAD ORIGINAL

C-Λ /

-35a 90%. A actividade da lisostafina está associada a dois picos principais (Fig.l). O último pico de eluição da lisostafina é cons truído pelos agregados não covalentes da proteína. Estes agregados dissociam-se com a diluição em tampão e sob condições de electrofo rese de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio.

Construção do vector plasmídeo pBC16-lL que contém o gene que codifica para a lisostafina

As estirpes de Bacillus sphaericus produtoras de lisostaf_i na podem ser produzidas utilizando técnicas de DNA recornbinante e, de preferência, as descritas nos pedidos de patente de invenção

co-penden tes	n° . 852 40 7 e 0 34 464. Especificamente, o DNA de S. si-
mulans total	é parcialmente clivado por endonuclease de restrição
apropriada e	os fragmentos de DNA produzidos desse modo são depois
ligados a um	vector conhecido linearizado (pUC8) com extremidades
compatíveis,	transportando um marcador de resistência a antibióti-
cos e o gene	lac Z' (isto é o gene, de p-galactosidaáe). A mistura
de ligação é	depois tranferida para E. coli (JM105) por transforma

ção. As inserções bem sucedidas do gene de lisostafina no plasmídeo podem ser encontradas seleccionando os transformantes por cultura do antibiótico apropriado e depois escolhendo os que possuem um fe nótipo negativo lac Z1 A produção de lisostafina é detectada por determinação turbidométrica da limpidez de uma suspensão de S. aureu tanto sob a forma de solução como de revestimento de placas de agar .

-36Utilizando vários transformarites E, coli JM105 produtores de lisostafina, a análise de restrição e a subclonagem do DNA do plasmídeo JM105 mostrou que a sequência de DNA que codifica para a lisostafina foi localizada para um fragmento de DNA HindII-HindII de 1,5 kpB Hpa. Este fragmento foi visualizado após electroforese por coloração com brometo de etídio e transferido para uma tira de papel de filtro de nitrocelulose. A tira foi lavada com tampão NET (NaCl 0 ,15 M, EDTA 0,1 M, Tris 0 ,0 2 M, pH 8 ,0 ) e o DNA transfe rido foi eluído por incubação da tira em tampão NET contendo NaCl 1 M, durante 1 hora a 65°C. 0 brometo de etídio foi removido do DNA por extracção com n-butanol. O DNA precipitado por adição de dois volumes de etanol frio a 95% à 'fase aquosa, foi recolhido por centrifugação, lavado com etanol a 80% e dissolvido em tampão TE (Tris 10 mM, EDTA lmM, pH 8,0). Os plasmídeos recombinantes ca pazes de transformar B.Subtilis bem como B. sphaericus para expres sar a lisostafina foram construídos utilizando um derivado do pla£ mídeo pBC16(pBC16-1) como um vector de clonagem. pBC16 é um piasmídeo de Bacillus resistente a tetraciclina (Tet ) , isolado inicial, mente a partir de B, cereus (K. Bernhard, H.Schremph e W. Gorbel ,

J . Bact , 133, p. 897, 1978). Os plasmídeos indistinguíveis de pBC16 por análise de restrição e Hibridação de Southern foram também encontrados em isolados de manchas de B. subtiiis e B.sphaericus (J. Polak e R.N. Novick, Plasmid, 7, p. 152, 1982).

O derivado de pBC16 (pBC16-l) utilizado como vector de clonagem foi construído por ligação do fragmento TaqlA do plasmídeo pE 194 (B. weisblum, M ,Y. Graham, T. Gryczan e D. Dubnau ,

-37J. Bact. , 137 p. 635, 1979) um plasmídeo de S. aureus resistente à eritromicina (erm^r) com uma digestão de Taql parcial do plasmídeo pBC16 utilizando ligase T4 . Após transferência da mistura de liga.'.; ção a B. Subtilis por transformação de protoplasto (S. Chang . e S.N. Cohen , Molec. Gen. Genet., 168, p. 111, 1979 ) foram seleccionados os clones que eram resistentes tanto à tetraciclina como à eritromicina. Um clone desse tipo foi designado pBC16-l.

A análise de restrição revelou que pBC16-l continha todos os fragmentos Taql de pBC16 mais o fragmento TaqlA de pEl94 que contém o determinante da resistência à eritromicina. pBC16-l foi depois digerido com a endonuclease PvuII de restrição, removendo deste modo cerca de 25% do DNA de plasmídeo incluindo a maior pa_r te do determinante de resistência à tetraciclina. 0 vector pBC16-l digerido com Pvu II foi tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitela. 0 fragmento de DNA de l,5KpB gue cofifica para a lisostafina foi tratado com o fragmento klenow de DNA polimerase. O fragmento de DNA de 1,5 kpB e o DNA de plasmídeo foram depois mis turados e ligados utilizando ligase T4 e a mistura de ligação foi transferida para B. subtilis por transformação de protoplastos.

Os transformantes eram resistentes à eritromicina, sensíveis à tetraciclina e produziram lisostafina, o que foi revelado, por zonas de limpidez quando desenvolvidos em agar contendo células S. aureus mortos. Esse clone produtor de lisostafina foi colhido e designado por B. subtilis/pBC16-lL. O DNA do plasmídeo pBCló-lL,

-38extraído do transformante B. subtilis/pBC16-lL foi isolado após ultracentrifugação num gradiente de densidade de brometo de etí_ dio-cloreto de césio. 0 DNA de plasmídeo pBC16-lL foi transferido por transformação do protoplasto para várias espécies de Bacillus incluindo a estirpe 00 de B. sphaericus. Os transformantes eram re sistentes à eritromicina e produziram lisostafina. 0 transformante de B. sphaericus 00/pBC16-lL proporciona uma produção máxima de lisostafina e permite a acumulação de produto intacto, activo sob o ponto de vista enzimático. A estirpe 00 de B. sphaericus foi ini. cialmente isolada da mancha e é conservada na colecção de culturas (RN3106) do Public Health Research Institute, New York, New York. B. sphaericus 00/pBC16-lL é conservado na colecção de culturas do Public Health Research Institute, New York, New York e foi deposi_ tado na American Type Culture Collection com o número de acesso

Claims

Reivindicaçoes /1, - Processo para a preparação de uma composição f armaceutica para combater os estafilococos, caracterizado por se incorporar lisostafina e pelo menos um agente que aumenta sinergicamente a actividade bactericida da lisostafina seleccionado do grupo que consiste em penicilina, penicilinas sintéticas, outros antibióticos, agentes quelantes, agentes tensioactivos suaves e outros agen tes activos das paredes celulares em quantidades eficazes para combater os estafilococos.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a lisostafina estar presente numa concentração de pelo menos 0,01 ze-q/ml.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

-40çor a penicilina estar presente numa quantidade eficaz para tornar' possível o efeito de combate da- lisostafina.
4.- Processo de acordo com a- reivindicação 3, caracterizado por a penicilina se encontrar presente numa quantidade compreendida entre 0,1 ;tg/ml e 10,0 tug/ml.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente tensioactivo suave se encontrar presente numa quantidade eficaz para tornar possível o efeito de combate da lisostafina .
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o agente tensioactivo suave se encontrar compreendido numa quantidade entre 0,1% e 1,0%.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a penicilina e o agente tensioactivo suave se encontrarem presentes em quantidades eficazes para tornar possível o efeito de combate da lisostafina.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar também mutanolisina e lisosima.
9.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

-41por a lisostafina ser derivada de um· microrganismo transformante que contém um plasmídeo recombinante que codifica a lisostafina.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o microrganismo transformante conter o plasmídeo pBC16-12.
11. - Método para o tratamento da mastite estafilococal caracterizado por compreender a administração, a uma glândula infectada, por infusão intramamãria de um agente terapêutico que com preende lisostafina num veículo aceitável numa quantidade eficaz· para eliminar a mastite estafilococal.
12. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a quantidade de lisostafina administrada a uma glândula mamária bovina estar compreendida entre 2 mg e 400 mg.
13. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a lisostafina ser produzida por transformantes Bacillus sphaerlcus que contêm um plasmídeo recombinante que codifica a lisosta fina.
14. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a lisostafina ser produzida por um microrganismo transformante que contém o plasmídeo pBC16-12.

-42f }

i \
15. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o agente terapêutico compreender ainda um agente tensioactivo suave numa quantidade eficaz para tornar possível o efeito terapêutico da lisostafina.
16. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o agente terapêutico compreender também, pelo menos, um agente que torna possível a actividade bactericida da lisostafina seleccionado do grupo que consiste em penicilina, penicilinas sintéticas, antibióticos aetivos das paredes celulares, agentes quelantes e agentes tensioactivos suaves numa quantidade eficaz para aumentar de modo sinérgico o efeito terapêutico da lisostafina.
17,- Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o agente terapêutico compreender ainda um agente tensioactivo suave numa quantidade eficaz para tornar possível o efeito terapêutico da lisostafina.
18. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o agente terapêutico compreender também, pelo menos, um agente bacteriolítico adiccional.
19. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o agente bacteriolítico adicional ser seleccionado do grupo que consiste em mutanolisina e lisosima.

-4320. - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o agente terapêutico compreender também, pelo menos, um agente bacteriolltico adicional.
21. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o agente bacteriolltico ser seleccionado do grupo que consiste em mutanolisina e lisosima.
22. - Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o agente terapêutico compreender também, pelo menos, um agente bacteriolítico adicional.
23. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o agente bacteriolltico adicional ser seleccionado do grupo que consiste em mutanolisina e lisosima.
24. - Método de acordo com q reivindicação 17, caracterizado por o agente terapêutico compreender também, pelo menos, um agente bacteriolltico adicional.
25. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o agente bacteriolltico adicional ser seleccionado do grupo que consiste em mutanolisina e lisosima.
26.- Método para evitar a mastite bovina caracterizado por

-44se mergulhar as tetas antes e depois da ordenha, numa solução que compreende cerca de 0,01 y^g/ml a 10,0 z^g/ml de lisostafina / num veículo apropriado.
27. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a solução compeender também mutanolisina e lisosima.
28. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a lisostafina ser produzida pelo transformante Bacillus sphaericus contendo um plasmídeo recombinante que codifica a lisostafina.
29. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o transformante Bacillus sphaericus conter o plasmídeo pBC16-12.
30. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a solução compreender também mutanolisina e lisosima.
31. - Método de acordo com a.reivindicação 26, caracterizado por a lisostafina ser produzida pelo transformante Bacillus sphaericus contendo um plasmídeo recombinante que codifica .a lisostafina .
32. - Método de acordo com areivindicação 26, caracterizado

-45/ /

I por o transformante Bacillus sphaericus conter o plasmídeo pBCl6-lL. lisosima,