DE3838184A1 - Immunologisches trenn- und nachweisverfahren fuer mehrfachbestimmungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren zur Bestimmung von wenigstens zwei Antigenen in einer Flüssigkeit unter Verwendung eines an seiner Innenseite mit Antikörpern beschichteten Röhrchens, einer mit Antikörpern beschichteten Kugel und lediglich einer Markierungsart.

Bei der Vielzahl der zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken zu bestimmenden Parameter besteht ein erhebliches Bedürfnis, solche Bestimmungen schnell und ungefährlich für das Laborpersonal, am besten parallel durchzuführen.

Für diese Zwecke erweisen sich immunologische Untersuchungsmethoden als besonders geeignet.

So schlägt die DE-C2 29 43 648 vor, zum Nachweis verschiedener Liganden in einer Flüssigkeitsprobe verschiedenartige mit Antikörpern beschichtete Festphasen, die sich leicht voneinander trennen lassen, einzusetzen. Nach der Inkubation dieser Festphasen mit den Probelösungen muß der radioaktive Überstand entfernt und anschließend die Festphasen voneinander getrennt werden.

Aus der DE-C2 32 77 032 ist ein vereinfachtes Separationsverfahren für immunologische Bestimmungen bekannt. Gemäß diesem Verfahren wird ein Antigen/Antikörperkomplex von der überstehenden Reagenzlösung durch eine trockene chromatographische Säule getrennt. Dieses Verfahren eignet sich aber nur zur Bestimmung einer unbekannten Substanz.

Die DE-C2 33 22 373 schlägt vor, Trägerpartikel mit einem fluoreszierenden Markierungsstoff zu markieren und anschließend mit Antigenen und/oder Antikörpern zu beladen. Die Unterscheidung zwischen den einzelnen Partikeln kann dadurch erfolgen, daß entweder unterschiedliche Fluoreszensmarkierungsstoffe verwendet werden oder aber die Partikel mit unterschiedlichen Konzentrationen oder mit mehreren Markierungsstoffen verbunden sind. Dieses Verfahren ist hinsichtlich der verschiedenen Markierungsstoffe und der damit verbundenen verschiedenen Einstellungen am Nachweisgerät mit Nachteilen behaftet.

Allgemeine Verfahrensweisen zur Durchführung eines Radioimmunoessays oder eines sogenannten immunoradiometrischen Tests (IRMA) sind in der Chemiker-Zeitung, 103, (1979) Nr. 2, S. 53-68 festgehalten.

Dem vorgenannten Stand der Technik haften die Nachteile an, daß entweder nur eine Substanz nachgewiesen werden kann oder die Trennung der zu bestimmenden Substanzen einen vergleichsweise hohen Aufwand erfordern.

Demgemäß liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine einfache und schnelle Trennung immunologisch nachweisbarer Substanzen ermöglicht und im Falle der Verwendung radioaktiver Markierungsmittel eine kontaminationssichere Verfahrensweise erlaubt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man ein erstes zu bestimmendes Antigen nach der IRMA-Technik an der Innenwand des Reaktionsgefäßes und ein zweites Antigen gemäß einem herkömmlichen Festphasen-RIA an einer Kugel bindet, die überstehende Flüssigkeit, die neben überschüssigen Reagenzien noch einen dritten zu bestimmenden Immunkomplex enthält, durch eine trockene Chromatographiesäule von den Festphasenkomplexen abtrennt und dabei den dritten zu bestimmenden Komplex in den oberen Teil der Säule wandern läßt, anschließend zur Messung die chromatographische Säule entfernen und in eine geeignete Meßvorrichtung einbringt, das Röhrchen verschließt, auf den Kopf stellt und den Immunokomplex im unteren Teil sowie den an der Kugel im Verschlußteil nacheinander mißt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung von lediglich zwei Antigenen einsetzen, indem man entweder die beschichtete Kugel wegläßt und einen zweiten Immunkomplex in der Chromatographiesäule nachweist oder indem man eine mit Antikörpern beschichtete Kugel einsetzt und die Chromatographiesäule nur zum Abtrennen bzw. Aufsaugen überschüssiger Reagenzien verwendet.

Die Markierung der Antikörper bzw. Antigene erfolgt vorzugsweise mit Radioisotopen, läßt sich aber je nach dem zu behandelnden analytischen Problem bzw. Laborgegebenheiten vorteilhafterweise auch durch Fluoreszenz- und Luminiszenzmarkierung oder durch enzymatische Methoden bewirken. Als bevorzugtes Radiosiotop wäre ¹²⁵Jod zu nennen. Zur Fluoreszenzmarkierung ließe sich in geeigneter Weise Fluoresceinisothiocyanat einsetzen. Im Falle einer Enzymmarkierung würde eine durchlässige Chromatographiesäule verwendet werden und die Bestimmung photometrisch erfolgen.

Je nach analytischem Problem wird man vorzugsweise polyclonale oder monoclonale Antikörper verwenden. In bevorzugter Weise können beide Antikörperarten auch nebeneinander verwendet werden oder zur Bindung von Antigenen mikrofeine Kieselsäure oder Proteine verwendet werden. Die biologischen Materialien können vorteilhafterweise mit dem Carbodiimidverfahren an die Festphase gekoppelt werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich in besonderer Weise die Vorrichtung aus der DE-C2 33 47 464 in Verbindung mit der Chromatographiesäule aus der DE-C2 37 17 032. Gegebenenfalls ist im oberen inneren Teil des Reaktionsgefäßes ein Ring vorgesehen, dessen innerer Durchmesser vorzugsweise 1 bis 2% kleiner ist als der Durchmesser der Kugel. Zur Messung wird somit die Kugel entweder durch Adhäsion in der Verschlußkappe der Vorrichtung oder am Ring des Reaktionsgefäßes fixiert. Sie verharrt in dieser Stellung auch noch nach mehrmaligem Wenden des Reaktionsgefäßes.

Vorteilhafterweise lassen sich zur Trennung der beiden Festphasen-Immunkomplexe magnetische Mittel einsetzen. So ist beispielsweise ein Permanentmagnet in der Verschlußkappe geeignet, eine eine metallische Substanz enthaltende Kugel zu fixieren.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Reagenzien und Vorrichtungsteile sind in einer Testkombination zusammengestellt. Diese Testkombination enthält die oben beschriebene Vorrichtung, wobei beispielsweise der untere Teil des Reaktionsgefäßes und die Kugel mit biologischen Materialien, beispielsweise Antigenen, Antikörpern und anderen Proteinen versehen sind. Weiterhin enthält diese Testkombination eine Verschlußkappe, eine trockene chromatographische Säule, weitere markierte und nichtmarkierte Antikörper sowie markierte und nichtmarkierte Antigene und 0,9%ige Kochsalzlösung.

Die mit der Erfindung erreichten Vorteile bestehen darin, daß Reaktionsdurchführung, Trennung und Nachweis in einer Vorrichtung durchgeführt werden können, ohne daß Zentrifugier- oder Dekantierschritte zwischengeschaltet werden müssen, ohne daß gegebenenfalls die Gefahr einer Kontaminierung des Labors oder Laborpersonals durch Verspritzen von Reagenzlösung besteht. Es eignet sich insbesondere für immunologisch nachweisbare Substanzen, die sinnvollerweise nebeneinander bestimmt werden.

Nachfolgend wird die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert.

Eine Möglichkeit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung einer Reaktions- und Separationsvorrichtung, die im oberen Teil eines Röhrchens 1 nahe der Röhrchenöffnung einen Ring 4 aufweist. Die Differenz zwischen Ringaußen- und Ringinnenradius beträgt etwa ¹/₁₀ des Außendurchmessers des Rings. Zwischen dem Boden des Röhrchens 1 und dem Ring 4 befindet sich eine Kugel 3, deren Durchmesser geringfügig größer als der Innendurchmesser des Rings 4 ist. Je nach durchzuführender Messung sind der untere Teil der Röhrcheninnenwand 2 und/oder die Kugel 3 mit biologischem Material beschichtet. Zwischen der Kugel 3 und einer Verschlußklappe 5 enthält die Vorrichtung eine herausnehmbare Chromatographiesäule 6.

Im folgenden reagieren Antikörper 1 und 1′ mit Antigen A, Antikörper 2 mit Antigen B und Antikörper 3 mit Antigen C.

Der untere Teil einer Röhrcheninnenwand ist mit gegen Antigen A gerichteten nicht markiertem Antikörper 1 überzogen. Eine Kugel ist mit gegen Antigen B gerichtetem Antikörper 2 beschichtet. Zur Testdurchführung werden zu den Antigen A-, B- und C-Standardlösungen sowie gegebenenfalls verdünntem Patientenseren, die zuvor in ein mit nichtmarkiertem Antikörper 1 beschichtetes Probenröhrchen pipettiert worden sind, ein Gemisch aus Antikörper 3, ¹²⁵J markiertem Antikörper 1′ und ebenso markiertem Antigen B und Antigen C hinzugegeben. Zum Volumenausgleich sowie zur Erhöhung der Spezifität der Nachweisreaktion werden gegebenenfalls noch weitere Zusätze verwendet. Die Teströhrchen werden mit einer Verschlußkappe verschlossen, gründlich mit einem Vibrations-Mischer geschüttelt und anschließend etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Da ein Überschuß von Antikörper 1 vorliegt, sind nach der Inkubation alle Antigen A-Moleküle sandwichartig zwischen den an der Gefäßwand immobilisierten Antikörpern 1 und den radioaktiv markierten Antikörpern 1′ gebunden. Gleichzeitig konkurrieren nicht markiertes Antigen C und markiertes Antigen C ebenso wie nicht markiertes, an der Kugel gebundenes Antigen B, sowie markiertes Antigen B um die Bindungsstellen an ihren jeweiligen Antikörpern.

Nach der etwa einstündigen Inkubation wird eine Chromatographiesäule in das Röhrchen auf die Kugel gestellt und durch Kapillarwirkung die Lösung des Probenröhrchens aufgesaugt. Dabei wird sie von dem an der Röhrchenwand befindlichen Antigen A-Sandwich-Komplex und dem an der Kugel vorhandenen Antigen B-Antikörper-Komplex getrennt. Durch Hinzufügen von 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung werden die Festphasen-Immunkomplexe gewaschen und überdies an der Gefäßwand adsorbiertes Material gelöst und ebenfalls in die Säule aufgesaugt.

Durch die Chromatographie werden Reaktionsprodukte und Reaktanten entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt. Antikörper und Immunkomplexe wandern aufgrund ihres höheren Molekulargewichtes in den oberen Teil der Chromatographiesäule, wohingegen niedermolekulare Reaktionsmittel im unteren Teil der Säule verbleiben, so auch die markierten Antigene. Der Antigen C-Antikörper-Komplex wird somit im oberen Teil der Säule zu finden sein.

Zur Antigen C-Messung wird die gesamte Vorrichtung in das Meßgefäß eines Gamma-Counters gestellt und die Impulsrate bestimmt. Die Antigen B-Messung erfolgt ohne Säule, wobei das Röhrchen umgedreht, also mit der Öffnung nach unten, ins Meßgefäß hineingestellt wird. Die Kugel mit dem zu messenden Antigen B Antikörper-Komplex befindet sich nun in der Verschlußkappe. Zur Bestimmung des Antigen A wird das Röhrchen wiederum umgedreht, also in die normale Position gebracht, wobei die Hohlkugel in leicht benetztem Zustand in der Verschlußkappe bleibt und nicht auf den Boden des Röhrchens zurückfällt. In dieser Stellung wird das Röhrchen in die Meßzelle des Gamma-Counters zur Messung des wandständigen Antigen A-Festphasen-Immunkomplexes hineingestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich aber auch mit einem Ring an der oberen Röhrcheninnenseite durchführen, wobei dann die Kugel nicht in der Verschlußkappe, sondern durch Adhäsionskraft an dem Ring haftet und ebenfalls bei senkrecht, in Normalposition stehendem Röhrchen nicht auf den Röhrchenboden zurückfällt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zur Bestimmung unbekannter Mengen TSH (Thyreotropes Hormon) und FT₃ (freies Trÿodthyronin) und FT₄ (freies Thyroxin) wird zu jeweils 100 µl Serumproben und FT₃-, FT₄- und TSH-Standardlösungen in ein mit Maus-anti-TSH-Antikörpern beschichtetes Röhrchen, welches eine mit T₄-Antikörpern beschichtete Hohlkugel enthält, ein Gemisch von 200 µl aus ¹²⁵J markiertem monoklonalen TSH-Antikörpern und ¹²⁵J markierten T₃ und T₄ sowie entsprechenden hochspezifischen polyklonalen T₃-Antikörpern hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf einem Vibrations-Mischer gemischt und etwa eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.

Nun wird eine Chromatographiesäule in das Reaktionsgefäß eingebracht und dadurch die flüssige Phase aufgesaugt und entsprechend ihres Molekulargewichts derart getrennt, daß die hochmolekularen Lösungsbestandteile in den oberen Teil der Säule wandern. Nachdem die Röhrchenwand und damit die Festphasen-Immunkomplexe sowohl der Hohkugel als auch der Röhrchenwand mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen worden sind und diese Lösung ebenfalls durch die Chromatographiesäule aufgesaugt wurde, wird das Röhrchen aufrecht mit Hohlkugel und Säule in die Meßzelle eines Gamma-Counters zur FT₃-Messung gestellt und die Impulsrate gemessen.

Nach Entfernung der Chromatographiesäule und Drehung des nahezu trockenen Röhrchens auf den Kopf wird es mit der Öffnung nach unten, wobei die Hohlkugel auf dem Ring aufliegt, in die Meßzelle zur Bestimmung der FT₄-Impulsrate gebracht. Anschließend wird das Röhrchen wieder in die normale Stellung, mit Röhrchenöffnung nach oben, gedreht, wobei die Kugel durch den Ring im oberen Teil des Röhrchens festgehalten wird, und zur Bestimmung der TSH-Impulsrate in die Meßzelle des Gamma-Counters gestellt.

Die Auswertung der Meßergebnisse von FT₃, FT₄ und TSH erfolgte unter Verwendung der vorliegenden Meßprotokolle und Eichkurve aus 5 Standards. Zur Erstellung der Standardeichkurve wurde die gemessene Prozentbindung gegen die entsprechende Standardkonzentration nach der Spline-Approximation-Standardkurve aufgetragen.

Messung zu Beispiel (1)

Protokoll: FT₃-RIA

Protokoll: FT₄-RIA

Protokoll: TSH-RIA

Beispiel 2

Zur Bestimmung des Total-T₃ und Total-T₄ und des TSH im Serum werden jeweils 100 µl Serumproben und Standardlösungen aus Total-T₃, Total-T₄ und TSH wie in Beispiel 1 in Reaktionsröhrchen mit den entsprechenden Antikörpern pipettiert sowie 500 µl eines flüssigen Gemisches von entsprechenden Tracern und T₃-Antikörpern mit Zusatz von 0,03 M Thiomersal als Deblockierungsmittel zur vollständigen Freisetzung von T₃ und T₄ aus ihren Trägerproteinen wie z. B. TBG. Anschließend wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, verfahren. Die erhaltenen Werte sind in den folgenden Meßprotokollen und Kurven ausgeführt.

Messung zu Beispiel (2)

Protokoll: TT₃-RIA

Protokoll: TT₄-RIA

Protokoll: TSH-IRMA

Claims (14)

1. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren zur Bestimmung von wenigstens zwei Antigenen in einer Flüssigkeit unter Verwendung eines an seiner Innenseite mit Antikörpern beschichteten Röhrchens, dadurch gekennzeichnet, daß man

• - ein erstes zu bestimmendes Antigen mittels der IRMA-Technik an der Röhrcheninnenwand, ein zweites Antigen mittels eines herkömmlichen Festphasen-RIA an einer Kugel bindet,
• - die überstehende Flüssigkeit, die neben überschüssigen Reagenzien noch einen dritten zu bestimmenden Immunkomplex enthält, durch eine trockene Chromatographiesäule von den Festphasenkomplexen abtrennt und dabei den dritten zu bestimmenden Immunkomplex in den oberen Teil der Säule wandern läßt.
• - zur Messung die chromatographische Säule in eine geeignete Meßvorrichtung einbringt, das Röhrchen verschließt, auf den Kopf stellt und getrennt die Messung im unteren Teil des Röhrchens und im Verschlußteil in einer Meßvorrichtung durchführt.

2. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von zwei Antigenen mit dem beschichteten Röhrchen und der chromatographischen Säule arbeitet.

3. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene mit einem Radioisotop markiert.

4. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Radioisotop ¹²⁵Jod einsetzt.

5. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man monoclonale Antikörper einsetzt.

6. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene fluoreszenzmarkiert.

7. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene luminiszenzmarkiert.

8. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene enzymatisch markiert.

9. Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugel zur Messung an einem im oberen inneren Teil des Röhrchens angeordneten Ring fixiert.

10. Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugel durch magnetische Mittel von dem am Boden des Röhrchens vorliegenden Festphasenkomplex trennt.

11. Reaktions- und Separationsvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Röhrchen (1) im oberen Teil nahe der Öffnung einen Ring (4) aufweist, wobei die Differenz zwischen Ringaußen- und Ringinnenradius etwa ¹/₁₀ des Außendurchmessers des Rings beträgt und zwischen dem Röhrchenboden und dem Ring (4) eine Hohlkugel (3) vorgesehen ist, deren Durchmesser geringfügig größer als der Innendurchmesser des Rings (4) ist.

12. Reaktions- und Separationsvorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Kugeldurchmesser 1 bis 2% größer als der Innendurchmesser des Rings ist.

13. Reaktions- und Separationsvorrichtung nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß an die Röhrcheninnenwand und/oder die Kugel biologische Materialien gebunden sind.

14. Testkombination, enthaltend eine Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 13 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche aus Antikörpern beschichteten Röhrchen und Kugeln, einem Verschlußteil und einer chromatographischen Säule, wobei gegebenenfalls das Röhrchen einen im oberen inneren Teil angeordneten Ring enthält, dessen Innendurchmesser 1 bis 2% kleiner als der Kugeldurchmesser ist, sowie markierte und nicht markierte Antikörper bzw. Antigene und 0,9%ige Kochsalzlösung.