DE3789582T3

DE3789582T3 - Samenspezifische Transkriptionsregulierung.

Info

Publication number: DE3789582T3
Application number: DE3789582T
Authority: DE
Inventors: Vic C. Knauf; Jean C. Kridl
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-07-31
Filing date: 1987-07-30
Publication date: 2002-10-17
Anticipated expiration: 2007-07-31
Also published as: DE3789582T2; EP0255378B2; AU7630287A; EP0255378B1; DE3789582D1; EP0255378A2; ES2054676T3; ES2054676T5; NZ221259A; AU612326B2; IN170125B; CN87106120A; EP0255378A3

Description

Technisches Gebiet

Es ist eine genetische Modifizierung von Pflanzenmaterial für samenspezifische Transkription vorgesehen. Die Herstellung von endogenen Produkten kann moduliert oder neue Fähigkeiten bereitgestellt werden.

Hintergrund

Bei der genetischen Modifizierung lag das Hauptaugenmerk auf Prokaryoten und Säugetierzellen. Aus mehreren Gründen erwiesen sich Pflanzen in ihrer Fähigkeit, Pflanzen genetisch zu manipulieren, als unflexibler als andere eukaryotische Zellen. Teilweise war dies auf die unterschiedlichen Ziele zurückzuführen, da Pflanzenmodifizierungen größtenteils auf die Modifizierung der gesamten Pflanze oder eines bestimmten Pflanzenteils in einer lebenden Pflanze und nicht auf das Modifizieren von Zellen in Kultur ausgerichtet war.
Für viele Anwendungen ist es wünschenswert, eine Transkription in einem bestimmten Pflanzenteil oder zu einem bestimmten Zeitpunkt im Wachstumszyklus der Pflanze vorzusehen. Zu diesem Zweck wird der Identifizierung endogener Pflanzenprodukte, deren Transkription oder Expression auf interessante Weise reguliert werden, ein hohes Maß an Aufmerksamkeit geschenkt. Beim Identifizieren solcher Produkte muß man zunächst Produkte ins Auge fassen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt im Zellwachstumsyklus oder in einem bestimmten Pflanzenteil auftreten, ihr Nichtvorhandensein zu anderen Zeitpunkten oder in anderen Teilen aufzeigen, mit dem Produkt assoziierte Nukleinsäuresequenzen identifizieren und dann die Sequenz im Genom der Pflanze identifizieren, um die mit der Transkription assoziierte untranslatierte 5'-Sequenz zu erhalten. Dies erfordert eine umfangreiche Forschungsarbeit, die zunächst das Identifizieren der jeweiligen Sequenz, danach die Bestätigung, daß es sich um die korrekte Sequenz handelt, und schließlich das Isolieren der gewünschten Transkriptions-Regulierungsregion umfaßt. Dann muß man geeignete Konstrukte herstellen und danach aufzeigen, daß die Konstrukte in der gewünschten Weise wirksam sind.
Das Identifizieren derartiger Sequenzen ist eine Herausforderung, die mit vielen unvorhergesehenen Hindernissen und Ungewißheiten verbunden ist. Es besteht jedoch ein großes Interesse daran, Pflanzen genetisch zu modifizieren, was die beträchtlichen Ausgaben und Anstrengungen gerechtfertigt, die auf die Identifizierung von Transkriptionssequenzen und ihr Manipulieren zur Bestimmung ihrer Nützlichkeit abzielen.

Einschlägige Literatur

Crouch et al., Molecular Form and Function of the Plant Genome, von Vloten-Doting (Hrsg.), Groot und Hall, Plenum Publishing Corp. 1985, S. 555-566; Crouch und Sussex, Planta (1981) 153: 64-74; Crouch et al., J. Mol. Appl. Genet. (1983) 2: 273-283; und Simon et al., Plant Molecular Biology (1985) 5: 191-201 beschreiben verschiedene Aspekte von Brassica napus-Lagerproteinen. Beachy et al.. EMBO J. (1985) 4: 3047-3053; Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 3320-3324; Greenwood und Chrispeels, Plant Physiol. (1985) 79: 65-71 und Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8560-8564 beschrieben Untersuchungen über die Samenlagerproteine und Genmanipulation. Eckes et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 14-22 und Fluhr et al., Science (1986) 232: 1106-1112 beschreiben die genetische Manipulation von leicht induzierbaren Pflanzengenen.
Sengupta-Gopalan et al (1985), PNAS USA, 82, S. 3320-3324 beschreiben die Expression eines gesamten heterologen samenspezifischen Gens, Phaseolin, in Tabak unter der Regulierungssteuerung der Transkriptionsinitiationsregion, die natürlich eine Expression dieses Gens vorsieht.
EP-A-0142924 (Agrigenetics Research Limited) beschreibt ein Plasmid, das Phaseolin-5'- und -3'-Regulierungsregionen enthält und ein zwischen diese Regionen eingefügtes heterologes Gen aufweist. Das Ziel und die Lehren dieser Patentschrift bestehen darin, durch Expression des Bt-Proteins in ganzen Pflanzen Insektenresistenz zu verleihen.
Scofield et al (1985), J. Cell Biochem. Suppl. 9c, Abstract-Nummer 1695, offenbart die Isolation von genomischen Klonen, die für Napin kodieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden DNA-Konstrukte bereitgestellt, die beim Manipulieren von Pflanzenzellen verwendet werden, um samenspezifische Transkription zu ermöglichen. Insbesondere werden Speicherprotein-Transkriptionsregionen an andere Gene als das Gen der Wildform angefügt und in Pflanzengenome eingeführt, um samenspezifische Transkription zu ermöglichen. Die Konstrukte sorgen für Modulation endogener Produkte und für die Produktion heterologer Produkte.
In einem Aspekt bietet die Erfindung DNA-Konstrukte unter Verwendung einer Napin- Transkriptionsinitiationsregion, um die Expression einer DNA-Sequenz von Interesse zu regulieren.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Pflanze, um mittels eines derartigen DNA-Konstrukts Samen (zum Unterschied von anderen pflanzlichen Geweben) eine gewünschte Eigenschaft zu verleihen, und zum Züchten der Pflanze zur Erzeugung von Samen.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung DNA-Konstrukte unter Verwendung einer samenspezifischen Transkriptionsinitiationsregion, um die Expression eines Acyl-Trägerproteins zu regulieren.
In einem zusätzlichen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Pflanze, um Samen (zum Unterschied von anderen pflanzlichen Geweben) unter Verwendung einer samenspezifischen Transkriptionsinitiationsregion eine gewünschte Eigenschaft zu verleihen, damit die Expression eines Acyl-Trägerproteins reguliert wird, sowie Verfahren zum Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.
Diese Aspekte der Erfindung sind in den beiliegenden Ansprüchen näher dargelegt, obwohl die folgende Beschreibung an manchen Stellen einen weiteren Schutzumfang haben kann als die Ansprüche.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden neuartige DNA-Konstrukte bereitgestellt, die die Transkriptionsmodifizierung in Samen, insbesondere in Embryonen während der Samenreifung, ermöglichen. Die DNA-Konstrukte umfassen eine mit der Samenbildung assoziierte regulierte Transkriptionsinitiationsregion, vorzugsweise assoziiert mit Embryogenese und Samenreifung. Von besonderem Interesse sind jene Transkriptionsinitiationsregionen, die mit Lagerproteinen assoziiert sind, z. B. Napin, Cruciferin, β-Conglycinin u. ä. Die Transkriptionsinitiationsregionen können aus jedem geeigneten Wirt gewonnen werden, insbesondere aus Pflanzenwirten wie Brassica, z. B. napus oder campestris, Sojabohnen (Glycine max), Bohnen (Phaseolus vulgaris), Mais (Zea mays), Baumwolle (Gossypium sp.), Saflor (Carthamus tinctorius), Tomaten (Lycopersica esculentum) und Cuphea-Spezies.
Stromab von und unter der Transkriptionsinitiationsregulierung der samenspezifischen Region befindet sich eine interessante Sequenz, die die Modifizierung des Phenotyps des Samens durch Modulieren der Herstellen eines endogenen Produkts hinsichtlich der Menge, relativen Verteilung u. ä. oder die Herstellung eines heterologen Expressionsprodukts ermöglicht, um eine neuartige Funktion oder ein neuartiges Produkt im Samen zu schaffen. Das DNA-Konstrukt ermöglicht auch eine Terminationsregion, um eine Expressionskassette zu bilden, in die ein Gen eingesetzt werden kann. Geeigneterweise können die Transkriptions- und Terminationsregionen in Transkriptionsrichtung durch einen Linker oder einen Polylinker mit einer oder einer Vielzahl an Restriktionsstellen zum Einsetzen des Gens getrennt bereitgestellt sein, um unter der Transkriptionsregulierung der Regulierungsbereiche zu stehen. üblicherweise hat der Linker 1 bis 10, noch üblicher etwa 1 bis 8, vorzugsweise etwa 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen weist der Linker weniger als 100 bp, oft weniger als 60 bp und im allgemeinen zumindest etwa 5 bp auf.
Die Transkriptionsinitiationsregion kann zum Wirt nativ oder homolog oder zum Wirt fremd oder heterolog sein. Unter fremd ist zu verstehen, daß sich die Transkriptionsinitiationsregion nicht im Wirt des Wildtyps findet, in den die Transkriptionsinitiationsregion eingesetzt wird.
Transkriptionsinitiationsregionen von besonderem Interesse sind jene, die mit Brassica napus- oder -campestris-Napingenen assoziiert sind, Acylträgerproteine, Gene, die etwa von Tag 7 bis Tag 40 in Samen exprimiert werden, die insbesondere eine Maximal- Expression etwa von Tag 10 bis Tag 20 haben, wobei sich das exprimierte Gen nicht in Blättern findet, aber sich das exprimierte Produkt in Überfluß in Samen befindet.
Die Transkriptionskassette umfaßt in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung eine Transkriptions- und Translationsinitationsregion, eine interessierende Sequenz und eine in Pflanzen funktionale Transkriptions- und Translationsterminationsregion. Es können auch ein oder mehrere Introns vorhanden sein. Die DNA-Sequenz kann jeden offenen Leserahmen haben, der für ein interessierendes Peptid kodiert, z. B. ein Enzym oder eine zur Genomsequenz komplementäre Sequenz, worin die Genomsequenz ein offener Leserahmen, ein Intron, eine nichtkodierende Leader-Sequenz oder irgendeine andere Sequenz sein kann, wo die Komplementärsequenz die Transkription, die Boten-RNA-Verarbeitung, z. B. Spleißen, oder die Translation hemmt. Die interessierende DNA-Sequenz kann synthetisch, natürlich abgeleitet oder eine Kombination davon sein. Je nach Beschaffenheit der interessierenden DNA-Sequenz kann es wünschenswert sein, die Sequenz mit pflanzenbevorzugten Codons zu synthetisieren. Die pflanzenbevorzugten Codons können durch die Codons mit der größten Häufigkeit in den Proteinen bestimmt werden, die in der jeweiligen Pflanzenspezies in der größten Menge exprimiert werden.
Bei der Herstellung der Transkriptionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden, um für die DNA-Sequenzen in der richtigen Ausrichtung und geeigneterweise im richtigen Leserahmen zu sorgen. Zu diesem Zweck können Adapter oder Linker zum Verknüpfen der DNA-Fragmente verwendet werden oder andere Manipulationen erfolgen, um geeignete Restriktionsstellen, das Entfernen überflüssiger DNA, das Entfernen von Restriktionsstellen u. ä. zu ermöglichen. Dafür kann in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Anlagern, Resektion, Ligierung u. ä. verwendet werden, wobei Einfügungen, Löschungen oder Substitutionen, z. B. Transitionen und Transversionen, erfolgen können.
Die Terminationsregion wird vor allem nach dem Gesichtspunkt der Eignung verwendet, da die Terminationsregionen relativ austauschbar zu sein scheinen. Die Terminationsregion kann mit der Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, mit der betreffenden DNA-Sequenz nativ sein oder aus einer anderen Quelle abgeleitet sein. Geeignete Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, z. B. die Octopin-Synthase- oder Nopalinsynthase-Terminationsregionen.
Durch geeignete Manipulationen, z. B. Restriktion, Rückkauen oder Einfüllen von Überhängen zur Bildung stumpfer Enden, Ligieren von Linkern u. ä. können Komplementärenden der Fragmente zum Verknüpfen und Ligieren geschaffen werden.
Bei der Durchführung der verschiedenen Schritte wird Klonierung angewendet, um die DNA-Menge zu vergrößern und eine Analyse der DNA zu ermöglichen, um sicherzustellen, daß die Vorgänge in korrekter Weise erfolgen. Es ist eine große Vielfalt an Klonierungsvektoren verfügbar, worin der Klonierungsvektor ein in E.coli funktionelles Replikationssystem und einen Marker enthält, der eine Selektion der transformierten Zellen ermöglicht. Beispielhafte Vektoren umfassen pBR332, die pUC-Reihe, die M13mp-Reihe, pACYC184 etc. Somit kann die Sequenz an (einer) geeigneten Restriktionsstelle(n) in den Vektor eingesetzt, das Plasmid zur Transformation des E.coli-Wirts verwendet, der E.coli-Wirt in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und die Zellen geerntet und lysiert und das Plasmid gewonnen werden. Analysen können Sequenzanayse, Restriktionsanalyse, Elektrophorese oder dergleichen umfassen. Nach jeder Manipulation kann die im fertigen Konstrukt zu verwendende Sequenz restringiert und mit der nächsten Sequenz verknüpft werden, wobei jedes der Teilkonstrukte in dasselbe oder in ein unterschiedliches Plasmid kloniert werden kann.
Zusätzlich zum Transkriptionskonstrukt können je nach der Art der Einführung des Transkriptionskonstrukts in die Pflanze auch andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet wird, werden, wie dies weiter unten beschrieben ist, zumindest der rechte Randbereich und oft sowohl der linke als auch der rechte Randbereich der T-DNA der Ti- und Ri-Plasmide als Flankierregionen mit dem Transkriptionskonstrukt verbunden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen war Gegenstand umfassender Forschungsarbeit und ist in der EP-A-120.516 von Hoekma, in: "The Binary Plant Vector System", H Amsterdam, Offset Drukkerij Kanters B.V., 1985, Kapitel V, von Fraley et al., in Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und von An et al., in EMBO J. (1985) 4: 277-284 ausführlich beschrieben.
Zur Verbesserung der Integration in das Pflanzengenom können alternativ dazu terminale Wiederholungen von Transposonen als Randbereich in Verbindung mit einer Transposase verwendet werden. In dieser Situation sollte die Expression der Transposase induzierbar oder die Transposase inaktivierbar sein, sodaß nach Integration des Transkriptionskonstrukts in das Genom ersteres relativ stabil integriert ist und "Hüpfen" vermieden wird.
Das Transkriptionskonstrukt wird normalerweise mit einem Marker zur Selektion in Pflanzenzellen verknüpft: Geeignterweise kann der Marker gegenüber einem Biozid, insbesondere einem Antibiotikum, z. B. Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol u. ä. resistent sein. Der jeweils verwendete Marker ist einer, der die Selektion von transformierten Zellen im Gegensatz zu Zellen ohne die eingesetzte DNA ermöglicht.
Zum Einsetzen von DNA in einen Pflanzenzellenwirt ist eine Vielzahl an Verfahren bekannt. Zu diesen Verfahren gehören die Transformation mit Ti-DNA unter Verwendung von A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Transformationsmittel, Protoplastenfusion, Injektion, Elektroporation, usw. Zur Transformation mit Agrobacterium können Plasmide in E.coli hergestellt: werden, welche Plasmide DNA, die mit dem Ti-Plasmid homolog ist, und insbesondere T-DNA enthalten. Das Plasmid kann zur Replikation in Agrobacterium fähig sein oder nicht fähig sein, d. h. es kann ein prokaryotisches Replikationssystem, z. B. RK290, mit einem breiten Spektrum haben oder nicht, was teilweise davon abhängt, ob das Transkriptionskonstrukt in das Ti-Plasmid integriert oder als unabhängiges Plasmid beibehalten werden soll. Mittels eines Helferplasmids kann das Transkriptionskonstrukt auf A. tumefaciens übertragen und der resultierende transformierte Organismus zum Transformieren von Pflanzenzellen verwendet werden.
Geeigneterweise können Explantate mit dem A. tumefaciens oder A. rhizogenes kultiviert werden, um den Transfer des Transkriptionskonstrukts auf die Pflanzenzellen zu ermöglichen, die Pflanzenzellen in einem geeigneten selektiven Medium zur Selektion dispergiert werden, zu Kallus gezüchtet, Schößlinge gezüchtet und Pflänzchen aus den Schößlingen durch Wachsen in einem Einwurzelmedium regeneriert werden. Der Agrobacterium-Wirt enthält ein Plasmid, das die zum Transfer der T-DNA auf die Pflanzenzellen erforderlichen vir-Gene aufweist und T-DNA aufweist oder nicht. Zur Injektion und Elektroporation können "entwaffnete" Ti-Plasmide (weisen keine Tumorgene auf, insbesondere keine T-DNA-Region) in die Pflanzenzelle eingesetzt werden.
Die Konstrukte können auf viele verschiedene Arten verwendet werden. Insbesondere können die Konstrukte zur Modifizierung der Fettsäurezusammensetzungen in Samen, d. h. zum Verändern des Verhältnisses und/oder der Mengen der verschiedenen Fettsäuren hinsichtlich Länge, Ungesättigtheit u. ä. verwendet werden. Somit kann die Fettsäurezusammensetzung variieren, wodurch die Fettsäuren mit 10 bis 14 C-Atomen verglichen mit den Fettsäuren mit 16 bis 18 C-Atomen verstärkt werden, Fettsäuren mit 20 bis 24 C-Atomen zunehmen oder abnehmen und ein erhöhter Anteil an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bereitgestellt wird u. ä. Diese Ergebnisse können durch das Vorsehen einer Expressionsreduzierung von einem oder mehreren endogenen Produkten, insbesondere Enzymen oder Co-Faktoren, Herstellen eines Transkriptionsprodukts, das zum Transkriptionsprodukts eines nativen Gens komplementär ist, um die Reifung und/ oder Expression des Transkriptionsprodukts zu hemmen, oder durch Erzielen von Expression eines endogenen oder exogenen, mit der Fettsäuresynthese assoziierten Gens erzielt werden. Mit Fettsäuresynthese assoziierte Expressionsprodukte umfassen Acylträgerprotein, Thioesterase, Acetyl-Transacylase, Acetyl-coA-Carboxylase, Ketoacyl-Synthasen, Malonyl-Transacylase, Stearoyl-ACP-Desaturase und ander Desaturase-Enzyme.
Alternativ dazu kann es wünschenswert sein, verschiedene Produkte aus anderen Quellen einschließlich Säugetieren vorzusehen, z. B. Blutfaktoren, Lymphokinen, koloniestimulierenden Faktoren, Interferonen, Plasminogenaktivatoren, Enzymen, z. B. Superoxid- Dismutase, Chymosin, usw., Hormonen, Rattenbrust-Thioesterase 2, Phopholipidacyl- Desaturasen, die bei der Synthese von Eicosapentaensäure beteiligt sind, und Human- Serumälbumin. Ein weiteres Ziel besteht darin, den Anteil von Samenproteinen, insbesondere von mutierten Samenproteinen, zu steigern, die eine verbesserte Aminosäureverteilung aufweisen, die dem Nährwert des Samens besser entspricht. In dieser Situation könnte man durch Herstellen einer komplementären DNA-Sequenz zur nativen Kodierungsregion oder Nichtkodierungsregion, worin die Komplementärsequenz mit der mutierten Sequenz nicht wirkungsvoll hybridisieren würde, eine Hemmung des nativen Samenproteins vorsehen oder die native Transkriptionsfähigkeit inaktivieren.
Die transformierten Zellen können gemäß herkömmlicher Verfahren zu Pflanzen gezüchtet werden. Siehe beispielsweise McCormick et al., Plant Cell Reports (1986) 5: 81- 84. Diese Pflanzen können dann gezüchtet werden und entweder mit demselben transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden, wobei das resultierende Hybrid identifiziert wird, das die gewünschte phenotypische Eigenschaft aufweist. Zwei oder mehrere Generationen können gezüchtet werden, um sicherzustellen, daß die vorliegende phenotypische Eigenschaft stabil aufrechterhalten und vererbt wird, und dann können Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß das gewünschte Phenotyp oder eine andere Eigenschaft erzielt wurde.
Als Wirtszelle kann jede Pflanzenvarietät verwendet werden, die einen Samen von Interesse liefert. Somit werden vorwiegend jene Pflanzen ausgewählt, deren Samen in großen Mengen erzeugt wird oder bei denen ein interessierendes samenspezifisches Produkt beteiligt ist. Samen von Interesse sind ölsamen, z. B. die Brassica-Samen, Baumwollsamen, Sojabohne, Saflor, Sonnenblume u. ä.; Getreidesamen, z. B. Weizen, Gerste, Reis, Klee, Mais u. ä.
Das Identifizieren nützlicher Transkriptionsinitiationsregionen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Wenn das Samenprotein isoliert wurde oder wird, kann es teilweise sequenziert werden, sodaß eine Sonde zum Identifizieren von samenspezifischer Boten- RNA konstruiert werden kann. Um die Konzentration der spezifisch mit Samen assoziierten Boten-RNA weiter zu verbessern, kann cDNA hergestellt und die cDNA mit Boten-RNA oder cDNA von nichtsamenassoziierten Zellen subtrahiert werden. Die restliche cDNA kann dann zum Sondieren des Genoms für Komplementärsequenzen mittels einer geeigneten, aus Pflanzenzellen hergestellten Sammlung verwendet werden. Mit cDNA hybridisierende Sequenzen können anschließend isoliert, manipuliert und die mit der Kodierungsregion assoziierte, untranslatierte 5'-Region isoliert und in Expressionskonstrukten verwendet werden, um die Transkriptionsaktivität der untranslatierten 5'-Region zu identifizieren.
In einigen Fällen kann die Forschungsarbeit durch direkte Verwendung einer Sonde zum Screenen einer Genomsammlung und identifizieren von mit der Sonde hybridisierenden Sequenzen weiter verkürzt werden. Die Sequenzen werden zum Identifizieren der untranslatierten 5'-Region wie oben manipuliert.
Die unter Verwendung der untranslatierten 5'-Regionen hergestellten Expressionskonstrukte können wie bereits beschrieben in Pflanzenzellen transformiert werden, um ihre Fähigkeit, mit einem heterologen Strukturgen zu funktionieren (einem anderen als dem offenen Leserahmen des Wildtyps, der mit der untranslatierten 5'-Region assoziiert ist) und die Samenspezifität zu bestimmen. Auf diese Weise können spezifische Sequenzen zur Verwendung mit Sequenzen für samenspezifische Transkription identifiziert werden. Expressionskassetten von besonderem Interesse umfassen Transkriptionsinitiationsregionen aus Napingenen, insbesondere Brassica-Napingenen, vor allem Brassica napus oder Brassica campestris-Genen, mit der Lipidproduktion, insbesondere der Fettsäureproduktion assoziierten Regulierungsstrukturgenen, einschließlich Acylträgerproteinen, die zu der betreffenden Pflanze endogen oder exogen sein können, z. B. Spinat-Acylträgerprotein, Brassica-Acylträgerprotein, Acylträgerprotein, entweder napus oder campestris, Cuphea-Acylträgerprotein, Acetyl-Transacylase, Malonyl-Transacylase, β-Ketoacyl-Synthasen I und II, Thioesterase, insbesondere Thioesterase II aus Pflanzen-, Säugetier- oder Bakterienquellen, z. B. Ratten-Thioesterase II, Acyl-ACP oder Phospholipidacyldesaturasen.
Die folgenden Beispiele dienen als Veranschaulichung und sind keinesfalls einschränkend.

EXPERIMENTELLER TEIL

Materialien und Verfahren

Klonierungsvektoren

Zu den verwendeten Klonierungsvektoren gehören pUC-Vektoren, pUC8 und pUC9 (Vieira und Messing, Gene (1982) 19: 259-268); pUC18 und pUC19 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106; Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119), und analoge Vektoren, die für die Ampicillin-Resistenz der oben beschriebenen pUC-Plasmide Chloramphenicol-Resistenz (CAM) als Marker austauschen (pUC-CAM (pUC12-Cm, PUC13- Cm), Buckley, D., Dissertation, U.C.S.D., CA 1985). Die Mehrfach-Klonierungsstellen von pUC18- und pUC19-Vektoren wurden mit jenen von pUC-CAM ausgetauscht, um pCGN565 und pCGN566 zu bilden, die CAM-resistent sind. Es wurden auch pUC118 und pUC1 19 verwendet, die jeweils pUC18 und pUC19 mit der intergenen Region von M13 von einer HgiAI-Stelle bei 5465 zur AhaIII-Stelle bei 5941 sind, die an der NdeI- Stelle von pUC eingefügt ist. (Erhältlich von Vieira J. und Messing, J. Waksman Institute, Rutgers University, Rutgers, N.J.)

Materialien

Terminale Desoxynukleotid-Transferase (TDT), RNaseH, E.coli DNA-Polymerase, T4-Kinase und Restriktionsenzyme stammten von den Bethesda Research Laboratories; E.coli DNA-Ligase stammte von den New England Biolabs; reverse Transkriptase von Life Sciences, Inc.; Isotope von Amersham, X-gal von Bachem, Inc., Torrance, CA, USA.

Beispiel 1

Konstruktion eines Napin-Promotors

Es gibt 298 Nukleotide stromauf vom ATG-Startcodon des Napin-Gens auf dem pgN1- Klon, einem 3,3 kb-EcoRI-Fragment von B. napus-Genom-DNA, die ein Napin-Gen enthält, das in pUC8 kloniert ist (erhältlich bei Marti Crouch, University of Indiana). pgNI-DNA wurde mit EcoRI und SstI digeriert und an EcoRI/SstI-digeriertes pCGN706 ligiert. (pCGN706 ist ein Xho/PstI-Fragment, das 3'- und Polyadenylierungssequenzen eines weiteren Napin-cDNA-Klons pN2 enthält (Crouch et al., 1983 siehe oben). Der resultierende Klon pCGN707 wurde mit SaII digeriert und mit dem Enzym BaI31 behandelt, um einen Teil der Kodierungsregion des Napin-Gens zu entfernen. Die resultierende resezierte DNA wurde nach der BaI31-Behandlung mit SmaI digeriert und neuerlich ligiert. Einer der Klone, pCGN713, wurde größenselektiert, durch EcoRI- und Bam- HI-Digestion sowohl in EcoRI/BamHI-digeriertes pEMB118 (Dente et al., Nucleic Acids Res. (1983) 11: 1645-1655) als auch in pUC118 kloniert, um jeweils E418 und E4118 zu ergeben. Das Ausmaßder BaI31-Digestion wurde durch Sanger-Didesoxy-Sequenzieren der E418-Schablone bestätigt. Die BaI31-Löschung der Promotorregion erstreckte sich nur bis zu 57 Nukleotide stromab vom Startcodon, wodurch sie das 5-Ende der Napin-Kodierungssequenz und etwa 300 bp der nichtkodierenden 5'-Region enthielt. E4118 wurde zugeschnitten, um die gesamte Kodierungsregion von Napin einschließlich des ATG-Startcodons durch in vitro-Mutagenese mittels des Verfahrens gemäß Zoller und Smith (Nucleic Acids Res. (1982) 10 : 6487-6500) unter Verwendung des Oligonukleotid-Primers 5' GATGTTTTGTATGTGGGCCCCTAGGAGATC-3' zu löschen. Das Screenen hinsichtlich des geeigneten Mutanten erfolgte durch zwei Transformationen in den E.coli-Stamm JM83 (Messing j., in: Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Veröffentlichungsnr. 79-99, 2 Nr. 2, 1979, S. 43-48) und SmaI-Digestion vermeintlicher Transformanten. Der resultierende Napin-Promotorklon ist pCGN778 und enthält 298 Nukleotide von der EcoRI-Stelle von pgN1 zum A-Nukleotid unmittelbar vor dem ATG-Startcodon von Napin. Die Promotorregion wurde durch Digerieren mit EcoRI und BamHI und Ligieren an EcoRI/BamHI-digeriertes pCGN565 in einen Chloramphenicol-resistenten Hintergrund subkloniert, um pCGN779c zu ergeben.

Extension des Napin-Promotor-Klons

pCGN779c enthält nur 298 Nukleotide einer potentiellen 5'-Regulierungssequenz. Der Napin-Promotor wurde mit einem Fragment von 1,8 kb erweitert, das sich stromauf von der 5'-EcoRI-Stelle des ursprünglichen λBnNa-Klons befand. Das etwa 3,5 kb XhoI-Fragment von λBnNa (erhältlich bei M. Crouch), das die Napin-Region enthält, wurde in SaII-digeriertes pUC119 subkioniert, um pCGN930 zu ergeben. Eine HindIII-Stelle in der Nähe einer 5'-XhoI-Stelle wurde verwendet, um das HindIII/EcoRI-Fragment von pCGN930 in HindIII/EcoRI-digeriertes Bluescript+ (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) zu subklonieren, um pCGN942 zu ergeben. Ein extendierter Napin-Promotor wurde durch Ligation von mit EcoRI und PstI digeriertem pCGN779c und von mit EcoRI und PstI digeriertem pCGN942 hergestellt, um pCGN943 zu bilden. Dieser Promotor enthält etwa 2,1 kb der Sequenz, die sich stromauf vom ursprünglichen ATG des auf λBnNa enthaltenen Napin-Gens befindet. Ein Teil der Sequenz der Promotorregion ist in Fig. 1 dargestellt.

Napin-Kassetten

Der extendierte Napin-Promotor und eine Napin-3'-Regulierungsregion werden kombiniert, um eine Napin-Kassette zum samenspezifischen Exprimieren von Genen herzustellen. Die verwendete Napin-3'-Region ist vom Plasmid pCGN1924, das das XhoI/Eco- RI-Fragment von pgN1 enthält (die Xho-Stelle befindet sich 18 Nukleotide vom Stopcodon des Napingens), das in EcoRI/SaII-digeriertes pCGN565 subkloniert ist. HindIII/PstI- digerierte pCGN943 und pCGN1924 werden ligiert, um die Napin-Kassette pCGN744 mit einzelnen Klonierungsstellen SmaI, SaII und PstI zum Einfügen von Genen herzustellen.

Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus Spinatblättern

Gesamt-RNA wurde aus jungen Spinatblättern in einen 4M Guanidinthiocyanat-Puffer extrahiert, wie dies durch Facciotti et al. (Biotechnology (1985) 3: 241-246) beschrieben ist. Gesamt-RNA wurde zweimal einer Oligo(dt)zellulose-Säulenchromatographie unterworfen, um poly(A)-RNA zu ergeben, wie dies durch Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York beschrieben ist. Eine cDNA-Sammlung wurde in pUCI3-Cm mit geringfügigen Veränderungen gemäß dem Verfahren von Gubler und Hoffman konstruiert (Gene (1983) 25: 263-269). RNasin wurde in der Synthese von cDNA des ersten Strangs nicht verwendet, da es die Synthese des zweiten Strangs beeinträchtigte, oder vollständig entfernt sowie dCTP verwendet, um die Vektor-DNA zu schwänzen und dCTP verwendet, um die doppelstrangige cDNA zu schwänzen, anstatt das Gegenteil davon durchzuführen, wie dies im Artikel beschrieben ist. Die angelagerte cDNA wurde in geeignete E.coli JM83 (Messing (1979) siehe oben) Zellen gemäß dem Verfahren von Hanahan (). Mol. Biol. (1983) 166: 557- 580) transformiert und auf LB Agarplatten ausgebreitet (Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), die 50 lug/ml Chloramphenicol und 0,005% X-Gal enthielten.

Identifizierung von Spinat ACP-I-cDNA

Insgesamt etwa 8000 cDNA-Klone wurden durch Southern Blots (Southern,). Mol. Biol. (1975) 98: 503) und Dot-Blot- (unten beschrieben) Hybridisierungen mit Klonanalysen- DNA aus 40 Pools gescreent, die jeweils 200 cDNA-Klone darstellen (siehe unten). Ein 5'-Ende-markiertes synthetisches Oligunukleotid (ACPP4), das zumindest zu 66% mit einer Aminosäureregion von Spinat ACP-I(5' GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCCAC- ATTGATACCAAACTCCTCCTC-3') homolog ist, ist das Gegenstück zu einer DNA-Sequenz, die für das 16-Aminosäuren-Peptid glu-glu-glu-phe-gly-ile-asn-val-asp-glu-asp-lys- ala-gln-asp-ile, Reste 49-64 von Spinat ACP-I (Kuo und Ohlrogge, Arch. Biochem. Biophys. (1984) 234: 290-296) kodieren konnte und wurde als ACP-Sonde verwendet.
Klonanalysen-DNA für Southern und Dot-Blot-Hybridisierungen wurde wie folgt hergestellt. Transformanten wurden von Agarplatten auf LB, das 50 pg/ml Chloramphenicol enthielt, in Gruppen von 10 Klonen pro ml Medium übertragen. Kulturen wurden über Nacht in einem 37ºC-Schüttelinkubator inkubiert und dann mit einem gleichen Mediumvolumen verdünnt und 5 Stunden lang gezüchtet. Durch Mischen des Inhalts von 20 Proben erhielt man Pools von jeweils 200 cDNA-Klonen. DNA wurde aus diesen Zellen extrahiert, wie dies durch Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res. (1979) 7: 1513- 1523) beschrieben ist. DNA wurde durch Extraktionen mit Phenol und Chloroform und anschließendes Ethanol-Ausfällen gereinigt, um das Digerieren mit Restriktionsenzymen zu ermöglichen. DNA wurde in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und 1 ug jeder der 40 gepoolten DNA-Proben mit EcoRI und HindIII digeriert und durch 0,7% Agarosegelen elektrophoresiert. DNA wurde auf Nitrozellulose-Filter übertragen, bevor das Blot-Hybridisierungsverfahren nach Southern erfolgte.
ACPP4 wurde mittels γ-³²P-dATP und T4-Kinase gemäß der Angaben des Herstellers 5'- endmarkiert. Nitrozellulose-Filter aus dem Southern Blot-Transfer von Klonanalysen- DNA wurden gemäß Berent et al. (BioTechniques (1985) 3: 298-220) hybridisiert (24 Stunden, 42ºC) und gewaschen. Dot-Blots desselben Satzes von DNA-Pools wurden durch Aufbringen von 1 ug jedes DNA-Pools auf Nylonmembranfilter in 0,5 M NaOH hergestellt. Diese Blots wurden (24 Stunden lang bei 42ºC) in 50% Formamid/1 % SDS/ 1 M NaCl mit der Sonde hybridisiert und bei Raumtemperatur mit 2 · SSC/0,1% SDS (1 · SSC = 0,15 M NaCl; 0,015 M Na-Citrat, SDS-Natriumdodecylsulfat) gewaschen. DNA aus dem Pool, die durch die ACPP4-Oligosonde hybridisiert wurde, wurde auf JM83- Zellen transformiert und wie oben plattiert, um einzelne Transformanten zu ergeben. Dot-Blots dieser einzelnen cDNA-Klone wurden durch Aufbringen von DNA auf Nitrozellulosefilter hergestellt, die mit der ACPP4-Oligunkleotidsonde hybridisiert wurden, und unter Verwendung der Probenbedingungen wie bei den Southern Blots der gepoolten DNA-Proben analysiert.

Nukleotidsequenzanalyse

Der positive Klon, pCGNISOL, wurde durch Digestion mit Restriktionsenzymen analysiert und die folgende Teilkarte erhalten.
**Polylinker mit verfügbaren Restriktionsstellen angegeben
Der cDNA-Klon wurde unter Verwendung von Standard-Laborverfahren wie Restriktion, Ligation, Transformation und Analyse in pUC118 und pUC119 subkloniert (Maniatis et al., (1982), siehe oben). Eine Einzelstrang-DNA-Schablone wurde hergestellt und die DNA-Sequenz mittels des Sanger Didesoxyverfahrens bestimmt (Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Die Sequenzanalyse erfolgte unter Verwendung eines Softwarepakets von Intelli-Genetics, Inc.
pCGNISOL enthält eine cDNA-Einfügung von (etwa) 700 bp einschließlich eines Abschnitts von A-Resten am 3'-Terminus, der den poly(A) Schwanz der mRNA darstellt. Man nimmt an, daß ein ATG-Codon an Position 61 für das MET-Translationsinitiationscodon kodiert. Dieses Codon ist der Beginn eines offenen Leserahmens von 411 Nukleotiden, von denen die Nukleotide 229-471 für ein Protein kodieren, dessen Aminosäuresequenz fast perfekt mit der obig bereits beschriebenen veröffentlichten Aminosäuresequenz von ACP-1 von Kuo und Ohlrogge übereinstimmt. Zusätzlich zu reifem Protein kodiert das pCGN1SOL auch für eine Transitpeptidsequenz mit 56 Resten, wie man dies von einem kernkodierten Chloroplastprotein erwarten könnte.

Napin - ACP-Konstrukt

pCGN796 wurde durch Ligieren von mit HindIII/BamHI digeriertem pCGN1SOL, mit HindIII und BamHI digeriertem pUC8 und mit BamHI digeriertem pUC118 konstruiert. Das ACP-Gen aus pCGN796 wurde durch Digestion mit BamHI und Ligation mit Bam- HI-digeriertem pCGN565 auf einen Chloramphenicol-Hintergrund übertragen. Das resultierende pCGN 1902 wurde mit EcoRI und SmaI digeriert und mit EcoRI/SmaI-digeriertem pCGN1920 ligiert, um pCGN1920 zu ergeben. Das ACP-Gen in pCGN1920 wurde an der NcoI-Stelle digeriert, durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt, mit SmaI digeriert und neuerlich ligiert, um pCGN1919 zu bilden. Dieses eliminierte die 5'-Kodierungssequenzen aus dem ACP-Gen und regenerierte das ATG. Dieses ACP-Gen wurde mit PstI-Stellen durch Digerieren von pCGN1919 mit EcoRI, Auffüllen der Stelle mit dem Klenow-Fragment und Ligieren eines PstI-Linkers flankiert. Dieser Klon wird als pCGN945 bezeichnet.
Das ACP-Gen von pCGN945 wurde als BamHI/PstI-Fragment zu mit BamHI und PstI digeriertem pUC118 bewegt, um pCGN945a zu bilden, sodaß sich eine SmaI-Stelle (durch pUC118 vorgesehen) am 5'-Ende der ACP-Sequenzen befindet, um das Klonieren in die Napinkassette pCGN944 zu erleichtern. Mit SmaI und PstI digeriertes pCGN945a wurde mit SmaI- und PstI digeriertem pCGN944 ligiert, um die Napin ACP-Kassette pCGN946 zu bilden. Die Napin ACP-Kassette wurde anschließend durch Klonierung von der HindIII-Stelle in den Binärvektor pCGN783 transferiert, um pCGN948 herzustellen.

Konstruktion des Binärvektors pCGN783

pCGN783 ist ein binäres Plasmid, das den linken und rechten T-DNA Randbereich von A. tumefaciens (Barker et al., Plant Mol. Biol. (1983) 2: 335-350); das Gentamicinresistenz-Gen von pPH1JI (Hirsch et al., Plasmid (1984), 12: 139-141), den 35S-Promotor von Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), das Kanamycinresistenz-Gen von Tn5 (Jorgensen et al., weiter unten, und Wolffet al., ebda (1985) 13: 355-367) und die 3'-Region von Transkript 7 von pTiA6 (Barker et al., weiter oben, (1983)) enthält.
Um den Gentamicinresistenz-Marker zu erhalten, wurde das Gentamicinresistenz-Gen aus einem 3,1 kb EcoRI-PstI-Fragment von pPHIJ1 isoliert und in pUC9 kloniert, um pCGN549 zu ergeben. Das HindIII-BamHI-Fragment, das das Gentamicinresistenz-Gen enthielt, wurde für das HindIII-BgIII-Fragment von pCGN587 substituiert, wodurch pCGN594 entstand.
pCGN587 wurde wie folgt hergestellt: Das HindIII-SmaI-Fragment von Tn5, das das gesamte Strukturgen für APHII enthielt (jorgenson et al., Mol. Gen. Genet. (1979) 177: 65) wurde in pUC8 kloniert (Vieira und Messing, Gene (1982) 19 : 259), wodurch das Fragment in ein HindIII-EcoRI-Fragment umgewandelt wurde, da sich unmittelbar angrenzend zur SmaI-Stelle eine EcoRI-Stelle befindet. Das PstI-EcoRI-Fragment, das den 3-Abschnitt des APHII-Gens enthält, wurde dann mit einem EcoRI-BamHI-SaII-PstI-Linker in eine EcoRI-Stelle von pUC7 (pCGN546 W) kombiniert. Da dieses Konstrukt keine Kanamycinresistenz verleiht, wurde Kanamycinresistenz durch Einfügen des BgIII-PstI-Fragments des APHII-Gens in die BamHI-PstI-Stelle (pCGN546X) erreicht. Dieses Verfahren stellt das APHII-Gen neu zusammen, sodaß EcoRI-Stellen das Gen flankieren. Ein ATG- Codon befand sich stromauf von und außerhalb des Leserahmens mit dem ATG-Initiationscodon von APHII. Das unerwünschte ATG wurde durch Einfügen eines Sau3A-PstI- Fragments vom 5'-Ende von APHII, welches Fragment kein überflüssiges ATG aufweist, in die BamHI-PstI-Stelle von pCGN546W, vermieden, um Plasmid pCGN550 zu bilden.
Das EcoRI-Fragment, das das APHII-Gen enthielt, wurde anschließend in die einzige EcoRI-Stelle von pCGN451 kloniert, die eine Octopin-Synthase-Kassette zur Expression enthält, um pCGN552 zu bilden (1 ATG).
pCGN451 enthält eine Octopin-Kassette, die etwa 1556 bp der nichtkodierenden 5'-Region enthält, die durch einen EcoRI-Linker mit der nichtkodierenden 3'-Region des Octopin-Synthase-Gens von pTiA6 verschmolzen ist. Die ph-Koordinaten sind 11.207 bis 12.823 für die 3'-Region und 13.643 bis 15.208 für die 5-Region, wie dies durch Barker et al., Plant Mol. Biol. (1983) 2: 325 definiert ist.
Das 5'-Fragment wurde wie folgt erhalten. Ein kleines subkloniertes Fragment, das das 5'-Ende der Kodierungsregion enthält, wurde als ein BamHI-EcoRI-Fragment in pBR322 als Plasmid pCGN407 kloniert. Das BamHI-EcoRI-Fragment hat eine XmnI-Stelle in der Kodierungsregion, während pBR322 zwei XmnI-Stellen aufweist. pCGN407 wurde mit XmnI digeriert, mit Ba131-Nuklease reseziert, und es wurden EcoRI-Linker an diese Fragmente angefügt. Nach der EcoRI- und BamHI-Digestion wurden die Fragmente größenfraktioniert, die Fraktionen kloniert und sequenziert. In einem Fall waren die gesamte Kodierungsregion und 10 bp der untranslatierten 5'-Sequenzen entfernt worden, wobei die untranslatierte 5'-Region, die mRNA-Kappenstelle und 16 bp der untranslatierten 5'- Region (zu einer BamHI-Stelle) intakt blieben. Dieses kleine Fragment wurde durch Größenfraktionierung auf einem 7% Acrylamidgel erhalten, und es wurden Fragmente von etwa 130 bp Länge eluiert.
Diese größenfraktionierte DNA wurde in M13mp9 ligiert, mehrere Klone sequenziert und die Sequenz mit der bekannten Sequenz des Octopin-Synthase-Gens verglichen. Das M13-Konstrukt wurde als p14 bezeichnet, welches Plasmid mit BamHI und EcoRI digeriert wurde, um das kleine Fragment zu bilden, das an ein Fragment von XhoI bis BamHI, das stromauf liegende 5'-Sequenzen von pTiA6 enthält (Garfinkel und Nester,). Bacteriol. (1980) 144: 732), und an ein Fragment von EcoRI bis XhoI ligiert wurde, das die 3'-Sequenzen enthält.
Das resultierende XhoI-Fragment wurde in die XhoI-Stelle eines pUC8-Derivats kloniert, das als pCGN426 bezeichnet wird. Das Plasmid unterscheidet sich insofern von pUC8, als die einzige EcoRI-Stelle mit DNA-Polymerase I aufgefüllt ist und es die PstI- und HindIII-Stelle durch Nukleaseverunreinigung von HindII-Restriktionsendonuklease verloren hat, als XhoI-Linker ein die einzige HincII-Stelle von pUC8 eingefügt wurde. Das resultierende Plasmid pCGN451 hat eine einzige EcoRI-stelle für die Einfügung der Proteinkodierungssequenzen zwischen der 5'-Nichtkodierungsregion (die 1.550 bp der nichttranskribierten 5'-Sequenz enthält, die den rechten Randbereich der T-DNA, die mRNA-Kappenstelle und 16 bp an nichttranslatierter 5'-Sequenz umfaßt) und die 3'-Region (die 267 bp der Kodierungsregion, das Stopcodon, 196 bp von nichttranslatierter 3'-DNA, die polyA-Stelle und 1.153 bp von nichttranskribierter 3'-Sequenz enthält). pCGN451 enthält auch den rechten T-DNA-Randbereich.
Das resultierende Plasmid pCGN451 mit ocs 5' und ocs 3' in der richtigen Ausrichtung wurde mit EcoRI digeriert und das EcoRI-Fragment von pCGN551, das das intakte Kanamycinresistenz-Gen enthält, in die EcoRI-Stelle eingefügt, um pCGN552 zu erhalten, das das Kanamycinresistenz-Gen in der richtigen Ausrichtung aufweist.
Dieses ocs/KAN-Gen wurde verwendet, um einen selektierbaren Marker für den Binärvektor pCGN587 von Transtyp vorzusehen.
Der 5'-Abschnitt der konstruierten Octopin-Synthase-Promotorkassette besteht aus ph- A6-DNA aus dem XhoI an bp 15208-13644 (Barkers Numerierung), das auch die T- DNA-Randsequenz enthält (Randbereich), die beim T-DNA-Transfer beteiligt ist. Im Plasmid pCGN587 sieht das ocs/KAN-Gen aus pCGN552 einen selektierbaren Marker sowie den rechten Randbereich vor. Der linke Randbereich wurde zuerst in M13mp9 als ein HindIII-SmaI-Stück kloniert (pCGN502) (Basenpaare 602-2213) und erneut als Kpn-EcoRI-Fragment in pCGN565 kloniert, um pCGN580 zu bilden. PCGN565 ist ein Klonierungsvektor auf der Grundlage von pUC8-Cm, der aber pUC18-Linker enthält.
pCGN580 wurde mit BamHI linearisiert und verwendet, um das kleinere BgIII-Fragment von pVCK102 zu ersetzen (Knauf und Nester, Plasmid (1982) 8: 45), wodurch pCGN- 585 entstand. Durch Ersetzen des kleineren SaII-Fragments von pCGN585 durch das XhoI-Fragment aus pCGN552, das das ocs/KAN-Gen enthält, erhielt man pCGN587.
Die pCGN594 HindIII-BamHI-Region, die ein 5'-ocs-Kanamycin-ocs 3' (ocs ist Octopin- Synthase, wobei 5' die Promotorregion und 3' die Terminatorregion kennzeichnet, siehe die U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 775.923, eingereicht am 13. September 1985) Fragment enthält, wurde durch die HindIII-BamHI-Polylinker-Region aus pUC18 ersetzt.
pCGN566 enthält den EcoRI-HindIII-Linker von pUC18, der in die EcoRI-HindII-Stellen von pUC13-Cm eingesetzt ist. Das HindIII-BgIII-Fragment von pNW31C-8,29-1 (Thomashow et al., Cell (1980) 19 : 729), das ORF1 und -2 von pTiA6 enthält, wurde in die HindIII-BamHI-Stellen von pCGN566 subkloniert, wodurch pCGN703 hergestellt wurde.
Das Sau3A-Fragment von pCGN703, das die 3'-Region von Transkript 7 enthält (entspricht den Basen 2396-2920 von pTiA6 (Barker et al., (1983 weiter oben)) wurde in die BamHI-Stelle von pUC19 subkloniert, wodurch pCGN709 hergestellt wurde. Die EcoRI- SmaI-Polylinkerregion von pCGN709 wurde mit dem EcoRI-SmaI-Fragment von pCGN- 587 substutiert, das das Kanamycinresistenz-Gen (APH3-II) enthält, wodurch pCGN726 hergestellt wurde.
Das EcoRI-SaII-Fragment von pCGN726 plus das BgIII-EcoRI-Fragment von pCGN734 wurden in die BamHI-SaII-Stelle von pUC8-Cm eingesetzt, wodurch pCGN738 hergestellt wurde. pCGN726c wird durch Löschen des 900 bp EcoRI-EcoRI-Fragments aus pCGN738 abgeleitet.
Zur Konstruktion von pCGN167 wurde das AluI-Fragment von CaMV (bp 7144-7735) (Gardner et al., Nucl. Acid Res. (1981) 9: 2871-2888) durch Digerieren mit Alul erhalten und in die HincII-Stelle von M13mp7 kloniert (Messing et al., Nucl. Acids Res. (1981) 9: 309-321), um C614 zu bilden. EcoRI-Digestion von C614 erzeugte das EcoRI- Fragment aus C614, das den 355-Promotor enthielt, der in die EcoRI-Stelle von pUC8 kloniert wurde (Vieira und Messing, Gene (1982) 19: 259), um pCGN146 herzustellen.
Zum Zurechtschneiden der Promotorregion wurde die BgIII-Stelle (bp 7670) mit BgIII behandelt und mit BaI31 reseziert, und danach wurde ein BgIII-Linker an die BaI31-behandelte DNA angefügt, um pCGN147 herzustellen.
pCGN148a, das eine Promotorregion, einen selektierbaren Marker (KAN mit 2 ATG) und eine 3'-Region enthält, wurde durch Digerieren von pCGN528 mit BgIII und Einfügen des BamHI-BgIIII-Promotorfragments aus pCGN147 hergestellt. Dieses Fragment wurde in die BgIII-Stelle von pCGN528 kloniert, sodaß die BgIII-Stelle proximal des Kanamycingens von pCGN528 war.
Der für dieses Konstrukt verwendete Shuttle-Vektor (pCGN528) wurde wie folgt hergestellt. pCGN525 wurde durch Digerieren eines Plasmids, das Tn5 enthält, das ein Kanamycingen enthält ()orgenson et al., Mol. Gen. Genet. (1979) 177: 65), mit HindIII-Bam- HI und durch Einfügen des HindIII-BamHI-Fragments, das das Kanamycingen enthält, in die HindIII-BamHI-Stellen im Tetracyclingen von pACYC184 hergestellt (Chang und Cohen,). Bacteriol. (1978) 134: 1141-1156). pCGN526 wurde durch Einfügen des BamHI- Fragments 19 von pTiA6 (Thomashow et al.,Cell (1980) 19: 729-739), das mit den in die SmaI-Stelle eingefügten XhoI-Linkern modifiziert war, in die BamHI-Stelle von pCGN- 525 hergestellt. pCGN528 wurde durch Löschen des kleinen XhoI-Fragments aus pCGN526, durch Digerieren mit XhoI und erneutem Ligieren erhalten.
pCGN149a wurde durch Klonierung des BamHI-Kanamycin-Genfragments aus pMB9- KanXXI in die BamHI-Stelle von pCGN148a hergestellt.
pMB9KanXXI ist eine pUC4K-Variante (Vieira und Messing, Gene (1982) 19: 259-268), die keine XhoI-Stelle aufweist, aber ein funktionales Kanamycingen aus Tn903 enthält, um eine wirkungsvolle Selektion in Agrobacterium zu ermöglichen.
pCGN149a wurde mit BgIII und SphI digeriert. Dieses kleine BgIII-SphI-Fragment von pCGN149a wurde durch das BamHI-SphI-Fragment aus MI (siehe unten) ersetzt, das durch Digestion mit BamHI und SphI isoliert worden war. Dadurch wird pCGN167 gebildet, ein Konstrukt, das einen CaMV-Promotor in voller Länge, 1ATG-Kanamycingen, ein 3'-Ende und das bakterielle Tn903-artige Kanamycingen enthält. MI ist ein EcoRI- Fragment aus pCGN546X (siehe Konstruktion von pCGN587) und wurde solcherart in die EcoRI-Klonierungsstelle von M13mp9 kloniert, daß sich die PstI-Stelle im 1ATG-Kanamycingen proximal zur Polylinkerregion von M13mp9 befand.
Das HindIII-BamHI-Fragment im pCGN167, das den CaMv-355-Promotor, 1ATG-Kanamycingen und das BamHI-Fragment 19 von pTiA6 enthielt, wurde in die BamHI-HindIII- Stellen von pUC19 kloniert, wodurch pCGN976 entstand. Der 355-Promotor und die 3'- Region aus Transkript 7 wurde durch Einfügen eines 0,7 kb HindIII-EcoRI-Fragments von pCGN976 (355 Promotor) und des 0,5 kb EcoRI-Saul-Fragments von pCGN709 (Transkript 7 : 3') in die HindIII-SaII-Stellen von pCGN566 entwickelt, wodurch pCGN766c entstand.
Das 0,7 kb HindIII-EcoRI-Fragment von pCGN766c (CaMV-355-Promotor) wurde mit dem 1,5 kb EcoRI-SaII-Fragment in pCGN726c ligiert (1ATG-KAN-3'-Region), bevor die Einfügung in die HindIII-SaII-Stellen von pUCh19 erfolgte, um pCGN778 herzustellen. Die 2,2 kb-Region von pCGN778, das HindIII-SaII-Fragment, das den CaMV-355-Promotor enthielt und IATG-KAN-3'Region wurde verwendet, um die HindIII-SaII-Linkerregion von pCGN739 zu ersetzen, um pCGN783 herzustellen.

Transfer des Binärvektors pCGN948 in Agrobacterium

pCGN948 wurde in Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al J. Bacteriol. (1986) 168: 1291-1301) durch Transformationen eingeführt. Eine 2 ml-Übernachtkultur von EHA101 wurde in MG/L-Brühe bei 30ºC gezüchtet. 0,5 ml wurde in 100 ml MG/L Brühe eingeimpft (Garfinkel und Nester, J. Bacteriol. (1980) 144: 732-743) und 5 Stunden lang bei 30ºC in einem Schüttelinkubator gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 7K pelletiert, in 1 ml MG/L-Brühe erneut suspendiert und auf Eis gelegt. Etwa 1 ug pCGN948 DNA wurde in 100 ul MG/L-Brühe eingebracht, zu der 200 ul der EHA- 101-Suspension hinzugefügt wurden; das die DNA-Zellmischung enthaltende Röhrchen wurde sofort 5 Minuten lang in ein Trockeneis/Ethanolbad gelegt. Das Röhrchen wurde durch 5 Minuten in einem Wasserbad mit 30ºC rasch aufgetaut und anschließend zwei Stunden lang bei 30ºC geschüttelt, nachdem 1 ml frisches MG/L-Medium hinzugefügt worden war. Die Zellen wurden pelletiert und auf MG/L-Platten ausgebreitet (1,5% Agar), die 100 mg/l, Gentamicin enthielten. Plasmid-DNA wurde aus einzelnen Gentamicin-resistenten Kolonien isoliert, zurück in E.coli transformiert und durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert, um zu verifizieren, daß das EHA101 intakte Kopien von pCGN948 enthielt. Einzelne Kolonien werden ausgewählt und durch zwei weitere Abstreichvorgänge auf 100 mg/l, Gentamicin enthaltenden MG/L-Platten gereinigt.

Transformation und Regeneration von B.napus

Samen von Brassica napus cv Westar wurden 4 Minuten lang in 95% Ethanol gelagert. Sie wurden in 1% Natriumhypochlorit-Lösung mit 50 ul "Tween 20" als oberflächenaktivem Stoff pro 100 ml Sterilisierungsmittellösung sterilisiert. Nach 45-minütigem Lagern in der Lösung wurden die Samen viermal mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Sie wurden in sterile Kunststoffschachteln gelegt, die 7 cm breit, 7 cm lang und 10 cm hoch waren (Magenta) und 50 ml von einer 1/10-Konzentration von MS (Murashige Minimalorganik-Medium, Gibco) mit hinzugefügtem Pyridoxin (500ug/l), Nikotinsäure (50ug/l), Glycin (200 ug/l) enthielten und mit 0,6% Agar verfestigt. Die Samen keimten und wurden bei 22ºC in einem 16 h-8 h Hell-Dunkel-Zyklus mit einer Lichtintensität von etwa 65 uEm&supmin;²s&supmin;¹ gezüchtet. Nach 5 Tagen wurden die Sämlinge unter sterile Bedingungen gestellt, die Hypocotylen herausgeschnitten und in Stücke von etwa 4 mm Länge geschnitten. Die Hypocotylsegmente wurden auf eine Nährplatte oder ohne Nährschicht auf ein Filterpapier auf dem verfestigten B5 0/1/1 oder B5 0/1/0 Medium gelegt. B5 0/1/0 Medium enthält B5 Salze und Vitamine (Gamsborg, Miller und Ojima, Experimental Cell Res. (1968) 50: 151-158, 3% Saccharose, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (1,0 mg/l,), pH- Wert eingestellt auf 5,8, und das Medium wird mit 0,6% Phytagar verfestigt; B5 0/1/1 ist dasselbe mit der Zugabe von 1,0 mg/l Kinetin. Nährplatten wurden durch Pipettieren von 1,0 ml einer Stationärphasen-Tabaksuspensionskultur (aufrechterhalten wie bei Fillatti et al., Molecular General Genetics (1987) 206: 192-199) auf das B5 0/1/0 oder B5 0/1/1 Medium 24 Stunden im vorhinein hergestellt. Hypocotylsegmente wurden herausgeschnitten und 24 Stunden vor der Agrobacterium-Behandlung auf Nährplatten gelegt.
Agrobacterium tumefaciens (Stamm EHA101 · 948) wurde durch Inkubieren einer Einzelkolonie Agrobacterium in MG/L-Brühe bei 30ºC hergestellt. Bakterien wurden 16 Stunden später geerntet und Verdünnungen von 10&sup8; Bakterien pro ml in MG/L-Brühe hergestellt. Hypocotyl-Segmente wurden durch das Einlegen der Segmente in eine Agrobacterium-Suspension, durch ihr 30-60-minütiges Absetzenlassen sowie anschließendes Entfernen und Übertragen auf Petri-Platten geimpft, die B5 0/1/1- oder 0/1/0-Medium enthielten (0/1/1 bedeutet 1 mg/l, 2,4-D und 1 mg/l, Kinetin und 0/1/0 bedeutet kein Kinetin). Die Platten wurden bei schwachem Licht bei 22ºC inkubiert. Die Co-Inkubation von Bakterien mit den Hypocotylsegmenten erfolgte über einen Zeitraum von 24-48 Stunden. Die Hypocotylsegmente wurden. entfernt und auf B5 0/1/1 oder 0/1/0 gelegt, die 500 mg/l Carbenicillin enthielten (Kanamycinsulfat bei 10, 25 oder 50 mg/l, wurde manchmal zu diesem Zeitpunkt hinzugefügt), wo sie 7 Tage lang bei kontinuierlicher Lichtintensität (etwa 65 uEm&supmin;²s&supmin;¹) und bei 22ºC verblieben. Die Segmente wurden auf ein B5 Salzmedium übertragen, das 1% Saccharose, 3 mg/l, Benzylaminopurin (BAP) und 1 mg/l Zeatin enthielt. Es wurde 10, 25 oder 50 mg/l, Kanamycinsulfat hinzugefügt und mit 0,6% Phytagar (Gibco) erhärtet. Danach wurden alle zwei Wochen Explantate auf ein frisches Medium übertragen.
Nach einem Monat entwickelten sich aus grünem Kallus grüne Schößlinge, die auf Kanamycin enthaltenden Medien selektiert wurden. Drei Monate lang entwickelten sich Schößlinge weiter. Die Schößlinge wurden aus dem Kallus herausgeschnitten, als sie eine Höhe von zumindest 1 cm aufwiesen und auf ein B5 Medium mit 1% Saccharose, keinen hinzugefügten Wachstumssubstanzen, 300 mg/l, Carbenicillin gelegt und mit 0,6% Phytagar verfestigt. Die Schößlinge wuchsen weiter und mehrere Blätter wurden entfernt, um einen Test hinsichtlich Neomycin-Phosphotransferase II- (NPTII-) Aktivität durchzuführen. Schößlinge, die hinsichtlich NPTII-Aktivität ein positives Ergebnis zeigten, wurden in Magenta-Schachteln gelegt, die ein B5 0/1/1 Medium mit 1% Saccharose, 2 mg/l, Indolbuttersäure, 200 mg/l Carbenicillin enthielten und mit 0,6% Phytagar verfestigt. Nach einigen Wochen entwickelten die Schößlinge Wurzeln und wurden in den Boden gesetzt. Die Pflanzen wurden bei 22ºC in einem 16-8 Stunden Hell-Dunkel- Zyklus mit einer Lichtintensitat von 220 uEm&supmin;²s&supmin;¹ in einer Wachstumskammer gezüchtet und mehrere Wochen später in ein Treibhaus gebracht.

Southern-Daten

Regenerierte B.napus-Pflanzen aus Co-Kultivierungen von Agrobacterium tumefaciens EHA101, das pCGN948 enthält, und B.napus-Hypocotyle wurden hinsichtlich korrekter Integration und embryospezifischer Expression des Spinatblatt-ACP-Gens untersucht. Es erfolgte eine Southern-Analyse unter Verwendung von DNA, die aus Blättern regenerierter Pflanzen mittels des Verfahrens von Dellaporta et al. (Plant Mol. Biol. Rep. (1983) 1: 19-21) isoliert und einmal durch Banding in CsCl gereinigt wurde. DNA (10 ug) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI digeriert, auf 0,7% Agarosegel elektrophoresiert und auf Nitrozellulose geblottet (siehe Maniatis et al., (1982), weiter oben). Blots wurden mit pCGN945-DNA, die 1,8 kb der Spinat ACP-Sequenz enthielt, oder mit dem EcoRI/- HindIII-Fragment sondiert, das aus pCGN936c isoliert wurde (hergestellt durch Transferieren des HindIII/EcoRI-Fragments von pCGN930 in pCGN566), das die Napin-5'-Sequenzen enthielt, die durch Nick-Translation mit ³²P-dCTP markiert wurden (durch den Hersteller beschrieben, BRL Nick Translation Reagent Kit, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA). Blots wurden in 50% Formamid, 10 · Denhardtscher Lösung, 5 · SSC, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 100 ug/ml Kalbsthymusdrüsen-DNA und 10% Dextransulfat (nur Hybridisierung) bei 42ºC) prähybridisiert und hybridisiert. (Reagentien beschrieben in Maniatis et al., (1982), siehe oben) Waschungen erfolgten in 1 · SSC, 0,1% SDS, 30 Minuten lang und zweimal in 0,1 · SSC, 0,1% SDS bei 55ºC.
Autoradiogramme zeigten zwei Banden von etwa 3,3 und 3,2 kb, die in den EcoRI-Digesten von DNA aus vier Pflanzen hybridisiert waren, wenn sie mit dem ACP-Gen (pCGN945) sondiert wurden, was eine korrekte Integration des Spinatblatt-ACP-Konstrukts im Pflanzengenom aufzeigt, da 3,3 und 3,2 kb EcoRI-Fragmente in der T-DNA- Region von pCGN948 vorhanden sind. Das Genkonstrukt war in einzelnen oder Mehrfach-Stellen in den verschiedenen Pflanzen vorhanden, wie dies anhand der Anzahl an Pflanzen-DNA-Konstrukt-DNA-Randbereichfragmenten ermittelt wird, die beim Sondieren mit Napin-5'-Sequenzen nachgewiesen werden.

Northern-Daten

Expression des integrierten Spinatblatt-ACP-Gens aus dem Napin-Promotor wurde durch die Northern-Analyse in Samen aber nicht in Blättern einer der transformierten Pflanzen nachgewiesen, bei denen gezeigt wurde, daß sie die Konstrukt-DNA enthielten. Entwickelnde Samen wurden 21 Tage nach der Anthese aus den transformierten Pflanzen gesammelt. Embryonen wurden aus den Samen herausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff gefroren. Gesamt-RNA wurde aus den Samenembryonen und aus Blättern der transformierten Pflanze durch das Verfahren von Crouch et al., 1983, siehe oben, isoliert, auf formaldehydhaltigen 1,5% Agarosegel wie bereits beschrieben elektrophoresiert (Shewmaker et al., Virology (1985) 140: 281-288) und auf Nitrozellulose geblottet (Thomas; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 5201-5205). Blots wurden prähybridisiert, hybridisiert und wie oben beschrieben gewaschen. Die Sonde war ein isoliertes PstI/BamHI- Fragment aus pCGN945, das nur Spinatblatt-ACP-Sequenzen enthält, die durch Nick- Translation markiert waren.
Es wurde eine RNA-Bande mit etwa 0,8 kb in Embryonen, jedoch nicht den Blättern der transformierten Pflanze nachgewiesen, was eine samenspezifische Expression des Spinatblatt-ACP-Gens aufzeigt.

Beispiel II

Konstruktion einer B.campestris Napin-Promotor-Kassette

Eine BgIII-Teilgenomsammlung von B.campestris DNA wurde im Lambdavektor Charon 35 unter Verwendung festgelegter Protokolle hergestellt (Maniatis et al., 1982, siehe oben). Der Titer der verstärkten Sammlung war etwa 1,2 · 10&sup9; Phagen/ml. 400.000 rekombinante Bateriophagen wurden in einer Dichte von 10&sup5; pro 9 · 9 Zoll einer NZY- Platte (NYZM beschrieben wie in Maniatis et al., 1982, siehe oben) in NZY + 10 mM MgSO&sub4; + 0,9% Agarose nach der Adsorption an DH1-E.coli-Zellen (Hanahan, Mol. Bio. (1983) 166: 557) 20 Minuten lang bei 37ºC plattiert. Die Platten wurden bei 37ºC 13 Stunden lang inkubiert, bei 4ºC 2,5 Stunden lang abgekühlt und die Phagen auf Gene Screen Plus (New England Nuclear) gehoben, indem vorgeschnittene Filter etwa 1 Minute lang über die Platten gelegt und sie abgezogen wurden. Die adsorbierte Phagen- DNA wurde durch einminütiges Schwimmenlassen des Filters auf 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH, zweiminütiges Neutralisieren in 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0 und durch dreiminütiges auf 2 · SSC immobilisiert. Die Filter wurden luftgetrocknet, bis sie nur mehr feucht waren und bei 42ºC) prähybridisiert und hybridisiert, wie dies für die Southern-Analyse beschrieben ist. Die Filter wurden hinsichtlich Napin-hältiger Klone unter Verwendung eines XhoI/SaII-Fragments des cDNA-Klons BE5 sondiert, das mittels der Sonde pN1 aus der beschriebenen B. campestris Samen cDNA-Sammlung isoliert wurde (Crouch et af. 1983, siehe oben). Drei Plaques wurden auf Duplikatfiltern stark hybridisiert und wie beschrieben plaque-gereinigt (Maniatis et al., 1982, siehe oben).
Einer der Klone mit der Bezeichnung λCGN1-2 wurde restriktionskartiert und das Napingen zu überlappenden 2,7 kb XhoI- und 2,1 kb SaII-Restriktionsfragmenten lokalisiert. Die zwei Fragmente wurden aus λCGN-2 DNA in pCGN789 subkloniert (ein pUC- basierender Vektor, derselbe wie pUC119, wobei der normale Polylinker durch den synthetischen Linker - 5' CGAATTCGTCGACAGATCTCTGCAGCTCGAGGGATCCAA- GCTT 3' - ersetzt ist (stellt den Polylinker EcoRI, SaII, BgIII, PstI, XhoI, BamHI, HindIII dar). Die Identität der Subklone als Napin wurde durch Sequenzieren bestätigt. Die gesamte Kodierungsregionssequenz wurden ebenso wie ausgedehnte 5'-stromauf und 3'- stromab befindliche Sequenzen bestimmt (Fig. 2). Das λCGN1-2 Napingen ist jenes, das für die mRNA kodiert, die der BES cDNA entspricht, wie dies aus der genauen Übereinstimmung ihrer Nukleotidsequenzen hervorgeht.
Eine Expressionskassette wurde aus dem 5'-Ende und dem 3-Ende des λCGN1-2-Napingens wie folgt in analoger Weise zur Konstruktion von pCGN944 konstruiert. Der Großteil der Napinkodierungsregion von pCGN940 wurde durch Digestion mit SaII und erneuter Ligierung gelöscht, um pCGN1800 zu bilden. Einzelstrang-DNA aus pCGN1800 wurde in einer in vitro Mutagenesereaktion (Adelman et al., DNA (1983) 2: 183-193) unter Verwendung des synthetischen Oligonukleotids 5' GCTTGTTCGCCATGGATA- TCTTCTGTATGTTC 3' verwendet. Dieses Oligonukleotid fügte eine EcoRV- und eine Nco1-Restriktionsstelle an der Verbindung der Promotorregion und des ATG-Startcodons des Napingens ein. Ein geeigneter Mutant wurde durch Hybridisierung an das für die Mutagenese und Sequenzynalyse verwendete Oligonukleotid identifiziert und als pCGN 1801 bezeichnet.
Ein Promotorfragment von 1,7 kb wurde durch Teildigestion mit EcoRV und Ligierung an pCGN786 (einem pCGN566 Chloramphenicol-basierten Vektor, bei dem der oben beschriebene synthetische Linker an der Stelle des normalen Polylinkers vorliegt) aus pCGN1801 subkloniert, mit EcoRI geschnitten und durch... resultierende Expressionskassette abgestumpft, wobei pCGN1803 1.725 kb Napinpromotorsequenz und 1.265 kb Napin 3'-Sequenzen mit den einzelnen Klonierungsstellen SaII, Bg/I, PstI und Xho dazwischen enthält. Jede Sequenz, die eine samenspezifische Transkription oder Expression in Brassica erfordert, d. h. ein Fettsäure-Gen, könnte in diese Kassette in analoger Weise zum Spinatblatt-ACP und der B.napus Napinkassette in Beispiel 1 eingesetzt werden.

Beispiel III

Andere samenspezifische Promotor können aus Genen isoliert werden, die für Proteine kodieren, die bei der Samen-Triacylglyzerin-Synthese beteiligt sind, z. B. das Acylträgerprotein aus Brassica-Samen. Unreife Samen wurden aus Brassica campestris CV. "R- 500", einer selbstverträglichen Varietät von Rübenraps gesammelt. Ganze Samen wurden in Stadien gesammelt, die etwa 14 bis 28 Tagen nach dem Blühen entsprechen. RNA-Isolation und Herstellung einer cDNA-Bank erfolgte wie für die Isolation einer Spinat-ACP cDNA, mit der Ausnahme, daß der verwendete Vektor pCGN565 war. Zum Sondieren der cDNA-Bank wurde das Oligonukleotid (5')-ACTTTCTCAACTGTCTCT- GGTTTAGCAGC-(3') unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA Synthesizers, Modell 380A, gemäß der Empfehlungen des Erzeugers synthetisiert. Dieses synthetische DNA-Molekül hybridisiert bei wenig strengen Bedingungen mit DNA- oder RNA-Sequenzen, die für die Aminosäuresequenz (ala-ala-lys-pro-glu-thr-val-glu-lys-val) kodieren. Es wurde von dieser Aminosäuresequenz für ACP berichtet, das aus Samen von Brassica napus isoliert wird (Slabas et al., 7th International Symposium of the Structure and Function of Plant Lipids, University of California, Davis, CA, 1986); ACP aus B.campestris ist in hohem Maße homolog. Etwa 2200 verschiedene cDNA-Klone wurden unter Verwendung eines Koloniehybridisierungsverfahrens (Taub und Thompson, Anal. Biochem. (1982) 126: 222-230) und bei Hybridisierungsbedingungen analysiert, die Wood et al. entsprachen (Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1585-1588). Die DNA-Sequenzanalyse der zwei cDNA-Klone, die eine offenkundige Hybridisierung mit der Oligonukleotidsonde zeigten, zeigte, daß ein als pCGN1Bcs bezeichnender Klon tatsächlich für ein ACP-Vorläuferprotein durch die beträchtliche Homologie der kodierten Aminosäuresequenz mit bereits angeführten ACP-Proteinen aus Brassica Napus kodierte (Slabas et al., 1980, siehe oben). Ähnlich wie in Beispiel II kann der ACP cDNA-Klon verwendet werden, um einen genomischen Klon zu isolieren, aus dem eine Expressionskassette in einer zur B.campestris-Napinkassette direkt analogen Weise gebildet werden kann.

Andere Beispiele

96 Klone aus der 14-28 Tage-Postanthese-B.campestris-Samen cDNA-Sammlung (im vorhergehenden Beispiel beschrieben) wurden durch Dot-Blot-Hybridisierung von miniprep-DNA auf Gene Screen Plus Nylonfiltern gescreent. Die verwendeten Sonden waren radioaktiv markierte synthetische cDNAs des ersten Strangs, die aus der 14-28-Tage- Postanthese-mRNA oder aus B.campestris-Blatt-mRNA bestand. Klone, die stark mit Samen-cDNA und wenig oder gar nicht mit Blatt-cDNA hybridisierten, wurden katalogisiert. Eine Anzahl an Klonen wurde identifiziert, die das Samenlagerungsprotein Napin durch Kreuzhybridisierung mit einem XhoI/SaII-Fragment von pNI, einer B.napus-cDNA, darstellen (Crouch et al., 1983, siehe oben). BE5 wurde wie oben verwendet, um einen B.campestris-Genom-Klon als Quelle eines embryospezifischen Promotors zu identifizieren.
Andere samenspezifische Gene können auch als nützliche Promotorquellen dienen. cDNA-Klone von Cruciferin, dem anderen wichtigen Samenlagerungsprotein von B. napus, wurden identifiziert (Simon et al., 1985, siehe oben) und können zum Screenen einer Genomsammlung nach Promotorn verwendet werden.
Ohne ihre spezifischen Funktionen zu kennen, kann man auch andere cDNA-Klone hinsichtlich ihres Expressionsausmaßes in Samengeweben, ihres Expressionstimings (d. h. wann sie in der Postanthese exprimiert werden) und hinsichtlich ihres ungefähren Vertretenseins (Kopienanzahl) im B.campestris-Genom klassifizieren. Klone, welche die zum Exprimieren von Genen notwendigen Kriterien erfüllen, die mit der Fettsäuresynthese oder anderen Samenfunktionen in Zusammenhang stehen, können zum Screenen einer Genomsammlung für genomische Klone verwendet werden, welche die zur Expression erforderlichen 5'- und 3'-Regulierungsregionen enthalten. Die nichtkodierenden Regulierungsregionen können manipuliert werden, um eine gewebespezifische Expressionskassette in der allgemeinen Weise herzustellen, wie für die Napingene im vorhergenden Beispiel beschrieben ist.
Ein Beispiel eines cDNA-Klons ist EA9. Er wird in Samen, aber nicht den Blättern von B. campestris in hohem Maße exprimiert. Er stellt eine äußerst verfügbare mRNA dar, wie I dies durch Kreuzhybridisierung sieben anderer cDNAs aus der Sammlung mittels Dot- Blot-Hybridisierung gezeigt wird. Die Northern Blot-Analyse der aus dem Samen von an Tag 14 isolierter mRNA und der Postanthese-Embryonen von Tag 21 und Tag 28 unter Verwendung eines 700 bp EcoRI-Fragments von EA9 als Sonde zeigt, daß EA9 am Tag 14 in hohem Maße und am Tag 21 und Tag 28 in viel weniger hohem Maß exprimiert wird. Die Restriktionskarte von EA9 wurde ermittelt und der Klon sequenziert. Die Identifizierung eines Polyadenylierungssignals und von polyA-Schwänzen am 3-Ende von EA9 bestätigt die Ausrichtung des cDNA-Klons und die Transkriptionsrichtung der mRNA. Die hierin für Klone EA9 angeführte Teilsequenz (Fig. 3) kann verwendet werden, um eine Sonde zu synthetisieren, die eine einzelne Klasse von Brassica-Samen-spezifischen Promotors identifiziert.
Aus den obigen Ergebnissen ist offenkundig, daß Transkription oder Expression in Samen spezifisch erzielt werden können, um die Modulierung des Phenotyps oder eine Veränderung der Eigenschaften eines Samenprodukts, insbesondere eines Embryos, zu ermöglichen. Es stellt sich heraus, daß man mit der Transkription von Sequenzen in Samen assoziierte Transkriptionsinitiationsregionen in Verbindung mit anderen Sequenzen als der normalen Sequenz verwenden kann, um endogene oder exogene Proteine herzustellen oder die Transkription oder Expression von Nukleinsäuresequenzen zu modulieren. Auf diese Weise können Samen zur Herstellung neuartiger Produkte, zum Vorsehen verbesserter Proteinzusammensetzungen, zum Modifizieren der Verteilung von Fettsäuren u. ä. verwendet werden.
Alle in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über die Kompetenz der Fachleute auf dem erfindungsgemäßen Gebiet ab. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin in gleichem Ausmaß durch Verweis so aufgenommen, als ob jeder einzelne dieser Verweise für Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch gemacht worden wäre.

Claims

1. DNA-Konstrukt, umfassend in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung:

eine Napin-Transkriptionsinitiationsregion, gebunden an

eine DNA-Sequenz von Interesse, die eine andere ist als (i) eine DNA-Sequenz, die für Napin kodiert, oder (ii) eine DNA-Sequenz, die für ein Säugetierprotein oder -peptid oder virales Erreger-Säugetierpeptid oder -protein kodiert; und

eine Transkriptionsterminationsregion.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin das Konstrukt weiters eine Translationsinitiationsregion umfasst, die stromab von der Transkriptionsinitiationsregion in 5'-3'- Richtung positioniert ist.

3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein offener Leserahmen ist, der für eine Aminosäuresequenz kodiert.

4. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Sequenz der Transkriptionsinitiationsregion aus den Fig. 1 oder 2 ersichtlich ist, umfassend eine Region von etwa 300 Nukleotiden 5' vom ATG-Translationsstartcodon eines Napingens.

5. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Transkriptionsterminationsregion aus einem Gen stammt, das für die Transkriptionsinitiationsregion nativ ist.

6. DNA-Konstrukt, umfassend in 5'-3'-Richtung:

eine Napin-Transkriptionsinitiationsregion, worin die Napin-Transkriptionsinitiationsregion frei von der nativen DNA-Sequenz unter der regulatorischen Steuerung der Initiationsregion ist, gebunden an eine Klonierungsstelle, und eine Transkriptionsterminationsregion;

mit der Maßgabe, dass das Konstrukt keine DNA-Seuquenz umfasst, die für ein Säugetierpeptid oder -protein oder virales Erreger-Säugetierpeptid oder -protein kodiert, das mit der Napin-Transkriptionsinitiationsregion operabel verbunden ist.

7. DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, worin eine andere DNA-Sequenz von Interesse als die Nativsequenz in die Klonierungsstelle insertiert ist.

8. Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Pflanze, um Samen (zum Unterschied von anderen pflanzlichen Geweben) eine gewünschte Eigenschaft zu verleihen, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Transformieren einer Pflanzenzelle unter genomischen Integrationsbedingungen mit einem DNA-Konstrukt, das in 5'-3'-Transkriptionsrichtung Folgendes umfasst:

eine samenspezifische Napin-Transkriptionsinitiationsregion, gebunden an

eine DNA-Sequenz von Interesse, die eine andere ist als (a) eine DNA-Sequenz, die für ein Napin kodiert, oder (b) eine DNA-Sequenz, die für ein Säugetierpeptid oder -protein oder ein virales Erreger-Säugetierpeptid oder -protein kodiert; und

ein virales Erregerpeptid oder -protein; und

eine Transkriptionsterminationsregion; und

Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.

9. Verfahren zum spezifischen Modifizieren des Phenotyps von Samen (zum Unterschied von anderem Pflanzengewebe), welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Transformieren einer Wirtspflanzenzelle unter genomischen Integrationsbedingungen mit einem DNA-Konstrukt, das in 5'-3'-Transkriptionsrichtung Folgendes umfasst:

eine samenspezifische Napin-Transkriptionsinitiationsregion, gebunden an

eine DNA-Sequenz von Interesse, die eine andere ist als (a) eine für Napin kodierende DNA-Sequenz oder (b) eine DNA-Sequenz, die für ein Säugetierpeptid oder -protein oder ein virales Erreger-Säugetierpeptid oder -protein kodiert; und

eine Transkriptionsinitiationsregion; und

(ii) Züchten einer Pflanze unter Bedingungen zur Erzeugung von Samen, wobei die Pflanze aus Zellen besteht, die Samengewebe entwickeln können und in ihr Genom das DNA-Konstrukt integriert haben.

10. DNA-Konstrukt, umfassend in 5'-3'-Transkriptionsrichtung:

eine samenspezifische Transkriptionsinitiationsregion, die aus einem anderen als dem Bohnen-Phaseolin-Promotor stammt;

eine DNA-Sequenz, die eine andere als die natürliche Kodiersequenz ist, gebunden an die Initiationsregion, worin die Sequenz für ein Acyl-Trägerprotein kodiert; und

eine Transkriptionsterminationsregion.

11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, worin die Transkriptionsinitiationsregion aus einem Napingen stammt.

12. Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Pflanze, um Samen (zum Unterschied von anderen pflanzlichen Geweben) eine gewünschte Eigenschaft zu verleihen, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Transformieren einer Wirtspflanzenzelle unter genomischen Integrationsbedingungen mit einem DNA-Konstrukt, umfassend in 5'-3'-Transkriptionsrichtung:

eine samenspezifische Transkriptionsinitiationsregion;

eine DNA-Sequenz, die für ein Acyl-Trägerprotein kodiert, gebunden an die Initiationsregion; und

eine Transkriptionsterminationsregion; und

Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.

13. Verfahren zum spezifischen Modifizieren des Phenotyps von Samen (zum Unterschied von anderem Pflanzengewebe), welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

eine samenspezifische Transkriptionsinitiationsregion;

eine Transkriptionsterminationsregion; und

(ii) Züchten einer Pflanze unter Bedingungen, um Samen zu erzeugen, wobei die Pflanze aus Zellen besteht, die Samengewebe entwickeln können und in ihr Genom ein DNA-Konstrukt integriert haben.

14. Verfahren zum Modifizieren des Genotyps einer Pflanze, um Samen (zum Unterschied von anderem Pflanzengewebe) eine gewünschte Eigenschaft zu verleihen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

Transformieren einer Wirtspflanzenzelle unter genomischen Integrationsbedingungen mit einem DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 und 11;

Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.

15. Verfahren zum spezifischen Modifizieren des Phenotyps von Samen (zum Unterschied von anderem Pflanzengewebe), wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(i) Transformieren einer Pflanzenzelle unter genomischen Integrationsbedingungen mit einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 und 11; und

(ii) Züchten einer Pflanze unter Bedingungen, um Samen zu erzeugen, wobei die Pflanze aus Zellen besteht, die Samengewebe entwickeln können und in ihr Genom das DNA-Konstrukt integriert haben.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8, 9 und 12 bis 1 S. worin die Pflanze aus Brassica, Baumwolle, Sojabohnen, Safflor und Sonnenblume ausgewählt ist.

17. Vektor, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 und 11, ein prokaryotisches Replikationssystem und einen Marker für die Selektion transformierter Prokaryoten, die den Marker umfassen.

18. Pflanzenzelle, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 und 11.

19. Pflanzenzelle, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 und 11, worin die Zelle oder der Samen aus einer Pflanze stammt, die aus Brassica, Baumwolle, Sojabohnen, Safflor und Sonnenblume ausgewählt ist.

1. Verfahren zur Produktion eines DNA-Konstrukts, umfassend in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung:

eine Napin-Transkriptionsinitiationsregion, gebunden an

eine Transkriptionsterminationsregion.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Konstrukt weiters eine Translationsinitiationsregion umfasst, die stromab von der Transkriptionsinitiationsregion in 5'-3'-Richtung positioniert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein offener Leserahmen ist, der für eine Aminosäuresequenz kodiert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Sequenz der Transkriptionsinitiationsregion aus den Fig. 1 oder 2 ersichtlich ist, umfassend eine Region von etwa 300 Nukleotiden 5' vom ATG-Translationsstartcodon eines Napingens.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Transkriptionsterminationsregion aus einem Gen stammt das für die Transkriptionsinitiationsregion nativ ist.

6. Verfahren zur Produktion eines DNA-Konstrukts, umfassend in 5'-3'-Richtung:

mit der Maßgaue, dass das Konstrukt keine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Säugetierpeptid oder -protein oder virales Erreger-Säugetierpeptid oder -protein kodiert, das mit der Napin-Transkriptionsinitiationsregion operabel verbunden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin eine andere DNA-Sequenz von Interesse als die Nativsequenz in die Klonierungsstelle insertiert ist.

eine samenspezifische Napin-Transkriptionsinitiationsregion, gebunden an

ein virales Erregerpeptid oder -protein; und

eine Transkriptionsterminationsregion; und

Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.

eine samenspezifische Napin-Transkriptionsinitiationsregion, gebunden an

eine Transkriptionsterminationsregion; und

10. Verfahren zur Produktion eines DNA-Konstrukts, umfassend in 5'-3'-Transkriptionsrichtung:

eine Transkriptionsterminationsregion.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Transkriptionsinitiationsregion aus einem Napingen stammt.

eine samenspezifische Transkriptionsinitiationsregion;

eine Transkriptionsterminationsregion; und

Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.

eine samenspezifische Transkriptionsinitiationsregion;

eine Transkriptionsterminationsregion; und

Züchten der Pflanze, um Samen zu erzeugen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8, 9 und 12 bis 15, worin die Pflanze aus Brassica, Baumwolle, Sojabohnen, Safflor und Sonnenblume ausgewählt ist.

18. Verfahren zur Produktion einer Pflanzenzelle oder von Pflanzensamen, umfassend die Transformation mit einem DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 und 11.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin der Samen von einer Pflanze stammt, die aus Brassica, Baumwolle, Sojabohnen, Safflor und Sonnenblume ausgewählt ist.