DE3789507T2

DE3789507T2 - Temperaturabhängige kraft- und strukturentwicklung von elastin polytetrapeptiden und polypentapeptiden.

Info

Publication number: DE3789507T2
Application number: DE3789507T
Authority: DE
Inventors: Kari U. Birmingham Al 35209 Prasad; Dan W. Birmingham Al 35216 Urry
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 1986-08-27
Filing date: 1987-08-27
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2007-08-28
Also published as: EP0321496A4; WO1988001623A1; DE3789507D1; EP0321496B1; US4783523A; JPH01503714A; JP2726420B2; EP0321496A1

Description

Hintergrund der Erfindung:

Die Regierung der USA hat Rechte an der hier beschriebenen Erfindung, die ein Ergebnis von Arbeit ist, die teilweise von den National Institutes of Health unter Bewilligungsnummer HL-29578 unterstützt worden ist.

Feld der Erfindung:

Diese Erfindung bezieht sich auf Bioelastomere, insbesondere auf Bioelastomere, die als Ersatz für Elastin verwendet werden können, genauer gesagt, auf Bioelastomere, die eine steuerbare Elastomerkraftentwicklung als Funktion der Temperatur aufweisen.

Beschreibung des technischen Hintergrundes:

Das Bindegewebe von Gefäßwänden ist aus zwei Haupttypen von Protein gebildet. Collagen, im allgemeinen die Hauptproteinkomponente von Bindegewebe, bildet das Strukturelement, das dem Gewebe Festigkeit verleiht. An Stellen, wo große Elastizität verlangt ist, wie etwa im Aortabogen und in der absteigenden Brustaorta, findet sich doppelt so viel Elastin wie Collagen. In der Gefäßwand und insbesondere in ihrer inneren elastischen Schicht, ist Collagen assoziiert mit natürlichen elastischen Fasern, die aus einer anderen Art von Protein bestehen, das als Tropoelastin bekannt ist. In der entspannten Gefäßwand neigen Collagenfasern zur Faltung oder Kräuselung, und die elastischen Fasern sind in einem zusammengezogenen Zustand. Beim Ausziehen oder Dehnen werden die elastischen Fasern gestreckt, und bevor ihre Dehnungsgrenze erreicht wird, kommen die Collagenfasern unter Spannung, so daß sie die Last tragen. Wenn die Last abnimmt, ziehen die elastischen Fasern in die Wand zurück zu ihrem ursprünglichen Ausmaß und die Collagenfasern zurück in einen gefalteten Zustand.
Das oben Gesagte läßt sich auch experimentell demonstrieren, denn wenn die Collagenkomponente eines intakten Ligaments in vitro durch das Enzym Collagenase entfernt wird, zeigt die resultierende Lastverformungsbeziehung deutlich, daß Elastin, die elastische Komponente, hauptsächlich für das anfänglich nachgiebige Ansprechverhalten des intakten Ligaments verantwortlich ist. Im Gegensatz dazu bleibt bei Entfernung des Elastins durch das Enzym Elastase Collagen zurück, bei dem beobachtet wird, daß es nur für den Schlußbereich des Antwortverhaltens des intakten Ligaments verantwortlich ist. Siehe Introductory Biophysics, F.R. Hallett et al. (Halsted Press, 1977).
Gegenwärtig verfügbare synthetische Gefäßmaterialien wie Dacron unterscheiden sich deutlich dadurch von natürlichem Bindegewebe, daß das synthetische Gewebe zwar als strukturelles Analogon des gefalteten Collagens angesehen werden kann, daß es jedoch keine echte Elastomerkomponente enthält. Der Zentralbereich der elastischen Fasern von Gefäßwänden, Haut, Lunge und Ligamenten ist von einem einzigen Protein namens Tropoelastin abgeleitet. Elastin, die eigentliche Elastomerkomponente elastischer biologischer Fasern, besteht aus einem einzigen Protein und ist durch die Quervernetzung der Lysinreste von Tropoelastin gebildet. Die Sequenz von Elastin kann beschrieben werden als eine serielle Anordnung alaninreicher lysinhaltiger Quervernetzungssequenzen im Wechsel mit glycinreichen hydrophoben Sequenzen. Mehr als 80% der Elastinsequenz ist bekannt, und es ist gezeigt worden, daß das Tropoelastin der Gefäßwand ein sich wiederholendes Hexapeptid (Ala-Pro- Gly-Val-Gly-Val)n, ein sich wiederholendes Pentapeptid (Val-Pro-Gly-Val-Gly)n und sich wiederholendes Tetrapeptid (Val-Pro-Gly-Gly)n enthält, wobei Ala, Pro, Val und Gly jeweils Alanin-, Prolin-, Valin- bzw. Glycin-Aminosäurereste bezeichnen. Diese Reste können auch mit A, P, V bzw. G angegeben werden, da Aminosäuren durch standardisierte Dreibuchstaben- oder Einbuchstaben-Abkürzungen bezeichnet werden können. Siehe z. B. Organic Chemistry of Biological Compounds, Seiten 56-58 (Prentice-Hall, 1971). Ferner entsprechen in dieser Anmeldung alle Peptiddarstellungen der üblichen Praxis, den N-Terminus-Aminosäurerest auf der linken Seite der Formel und den COOH-Terminus-Aminosäurerest auf der rechten Seite zu schreiben. Ferner haben, soweit nicht anders angegeben, alle Aminosäuren L-Konfiguration, mit Ausnahme von Glycin, das optisch inaktiv ist.
Die Art der Aminosäuresequenz in der Nähe der Tropoelastin- Quervernetzungen ist auch bekannt. Außerdem ist ein hohes Polymer des Hexapeptids synthetisiert worden und es wurde festgestellt, daß es cellophanähnliche Blätter bildet. In Anbetracht dessen und seiner irreversiblen Assoziation beim Anheben der Temperatur in Wasser wird daher angenommen, daß das Hexapeptid in dem natürlichen Material eine strukturelle Funktion hat. Andererseits wurde festgestellt, daß synthetische hohe Polymere des Pentapeptids und des Tetrapeptids nach Quervernetzung elastomeres Verhalten zeigten und das Potential haben, zur Funktion der elastischen Faser beizutragen. Tatsächlich kann das chemisch quervernetzte Polypentapeptid in Abhängigkeit von seinem Wassergehalt und Quervernetzungsgrad denselben Elastizitätsmodul wie natives Aortaelastin aufweisen.
Kürzlich wurde ein auf der oben offenbarten Pentapeptid- Sequenz basierendes synthetisches Polypentapeptid im an Urry und Okamoto erteilten US-Patent 4 187 852 offenbart und beansprucht. Ferner wurde ein bioelastisches Compositmaterial auf Grundlage eines elastischen Polypentapeptids oder Polytetrapeptids und einer Festigkeit verleihenden Faser im an Urry erteilten US-Patent 4 474 851 offenbart und beansprucht. Darüber hinaus wurde ein bioelastisches Material mit erhöhtem Elastizitätsmodul, gebildet durch Ersetzen der dritten Aminosäure in einem Polypentapeptid durch eine Aminosäure entgegengesetzter Chiralität, im an Urry erteilten US-Patent 4 500 700 offenbart und beansprucht, sowie ein enzymatisch quervernetztes Polypentapeptid wie im US-Patent 4 589 882 offenbart und beansprucht. Schließlich wird darauf hingewiesen, daß zur Zeit Anmeldungen Nr. 533 670, gerichtet auf ein chemotaktisches Peptid und Nr. 793 225, gerichtet auf ein zweites chemotaktisches Peptid, anhängig sind. Ferner anhängig ist die Nr. 853 212, gerichtet auf ein segmentiertes Polypentapeptid Bioelastomer zur Modulierung des Elastizitätsmoduls.
CA 100 : 197695t beschreibt ein aus dem Tropoelastin-PPP- Analogon Ala³-PPP hergestelltes Elastomer, wobei Ala D-Alanin ist. Die Aminosäuren der vorliegenden Erfindung sind spezifisch definiert als die L-Isomere. D1 beschreibt zwar die Verwendung des Ala³-PPP-Analogons, bei dem Ala das L-Isomer ist, doch ergab dies kein Elastomer.
Gegenwärtig besteht sehr großer Bedarf nach neuen synthetischen Gefäßmaterialien und -prothesen. Daher resultiert Bedarf für neue bioelastische Materialien auf Grundlage der oben beschriebenen sich wiederholenden Polypentapeptid- und Polytetrapeptid-Sequenzen, die wünschenswerte, aber veränderte chemische und biologische Eigenschaften haben. Dieser Bedarf ist möglicherweise verursacht durch die Allgegenwart von Elastin im menschlichen Körper und die Folgen daraus. So ist z. B. in der extrazellulären Matrix der Gefäßwand die Elastinfaser die bevorzugte Stelle für Lipidablagerungen, die die Geißel Arteriosklerose hervorrufen. Beim Lungenemphysem werden Elastinfasern unterbrochen und in ihrer Funktion gestört. Zusätzlich ist festzustellen, daß viele Krankheitszustände Elastinfasern und Funktionsstörungen von diesen betreffen, z. B. Erbkrankheiten wie Pseudoxanthoma elasticum, Cutis laxa, endokardiale Fibroelastose, sowie die Buschke-Ollendorf-, Ehlers-Danlos-, Menkes- und Marfans-Syndrome. Elastinfaserfunktionsstörungen kommen auch bei erworbenen Krankheiten vor: Aktinoelastose, isolierte Elastome, Elastofibroma dorsi und Elastosis perforans serpiginosa. Auch vom kosmetischen Standpunkt her ist bekannt, daß Sonnenelastose der Haut zu Altersfalten beiträgt, und man stellt fest, daß unterhalb der Falten die Elastinfasern unterbrochen sind. Offensichtlich würde die Entwicklung neuer synthetischer Polypentapeptid- und Polytetrapeptid-Elastomere zum ersten Mal vielseitige Substitute für die beschädigten natürlichen Elastinfasern sowie neue Verfahren zur Behandlung dieser diversen Krankheiten liefern.
Jedoch war bis vor kurzem wenig bekannt über die Elastizitätseigenschaften der bioelastomeren Polytetrapeptide und Polypentapeptide. So war der rationelle Entwurf spezifischer Bioelastomere für spezielle strukturelle Anwendungen äußerst eingeschränkt. Z.B. ist es bis heute nicht möglich gewesen, den Temperaturbereich zu verändern, in dem die Elastomerkraftentwicklung synthetischer Bioelastomere auftritt. Die Kontrolle hierüber scheint aber zwingend notwendig, um ein passendes Bioelastomer-Material für einen gegebenen Zweck rationell entwerfen zu können. Um z. B. einen thermomechanischen Wandler für eine vorgegebene Temperatur zu entwerfen, müssen Materialien bereitgestellt werden, die Elastomerkraft in unterschiedlichen Temperaturbereichen entwickeln.
Die Bedeutung der Auswahl des richtigen Materials für eine spezielle biologische oder industrielle Funktion ist kaum zu unterschätzen. So wurde in Technology Review, Nov./Dez. 1984 (herausgegeben beim MIT) festgestellt, daß ein erhebliches Hindernis für die Entwicklung eines zuverlässigen künstlichen Herzens, sowie von prothetischen Vorrichtungen im allgemeinen, das Fehlen geeigneter synthetischer Biomaterialien war. Im Fall des künstlichen Herzens wurde festgestellt, daß, neben anderen Problemen, Kalzium in unakzeptablem Maße darin abgelagert wurde. Ganz zutreffend stellte Bronowski in seinem großen Werk "The Ascent of Man" fest:
In effect the modern problem is no longer to design a structure from the materials but to design materials for a structure.
(Tatsächlich ist das Problem der Gegenwart nicht mehr, ausgehend von einem Werkstoff eine Struktur zu entwerfen, sondern für eine Struktur die Werkstoffe zu entwerfen.)
Bevor jedoch bioelastische Materialien für spezielle biologische Zwecke, die veränderliche Elastizität erfordern, rationell entworfen werden können, ist es nötig, ein Mittel zu schaffen, mit dem die Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers rationell gesteuert werden kann. Es wäre daher äußerst wünschenswert, ein Mittel zum Steuern der Elastomerkraftentwicklung von Bioelastomeren in Abhängigkeit von der Temperatur zu schaffen. Dies würde die Vielfalt der Umgebungen, in denen solche Materialien funktionieren können, erheblich erweitern. Gegenwärtig ist keine solche Steuerung möglich.
Folglich besteht im allgemeinen nach wie vor großer Bedarf nach bioelastischen Materialien auf Grundlage sich wiederholender Polypentapeptid- und Polytetrapeptid-Sequenzen, die wünschenswerte chemische und biologische Eigenschaften aufweisen. Insbesondere besteht nach wie vor Bedarf für solche bioelastischen Materialien, bei denen die Elastomerkraftentwicklung als Funktion der Temperatur gesteuert und verändert werden kann.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Elastomer-Polymere zu schaffen, die eine als Funktion der Temperatur veränderliche Elastomerkraftentwicklung aufweisen. Zusätzlich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Elastomer-Polymeren anzugeben, die eine als Funktion der Temperatur veränderliche Elastomerkraftentwicklung aufweisen. Diese und andere Aufgaben der Erfindung, die nachfolgend noch deutlicher werden, wurden zum Teil gelöst durch Schaffung eines Bioelastomers, enthaltend Elastomereinheiten, die sich wiederholende Tetrapeptid- und Pentapeptid-Einheiten und Gemische von diesen, sowie wahlweise auch sich wiederholende Hexapeptid- Einheiten aufweisen, wobei die sich wiederholenden Einheiten Aminosäurereste aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus hydrophoben Aminosäure- und Glycinresten besteht, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die eine Polypentapeptid-Einheit mit der Formel:
X¹-(IPGVG)n-Y ¹umfaßt, wobei I ein peptidbildender Rest von L-Isoleucin;
P ein peptidbildender Rest von L-Prolin;
G ein peptidbildender Rest von Glycin;
V ein peptidbildender Rest von L-Valin ist;
und
wobei X¹ PGVG, GVG, VG, G oder eine kovalente Bindung ist; Y¹ IPGV, IPG, IP, I oder kovalente Bindung ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder 0 ist, mit der Maßgabe, daß X¹ und Y¹ zusammen eine sich wiederholende Polypentapeptid- Einheit bilden, in ausreichender Menge, um die Entwicklung von Elastomerkraft des Bioelastomers in eine vorgegebene Temperatur einzustellen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1

Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektren bei 25 MHz in Dimethylsulfoxid für A: Ile¹-PPP und B: PPP. Diese Spektren zeigen die Ersetzung von Val¹ durch Ile¹; insbesondere im Hochfeldbereich sind die Ersetzungen der β- und γ-Kohlenstoffresonanzen eines Valin-Restes durch die CH&sub2; und CH&sub3;-Resonanzen von Isoleucin deutlich. Das Fehlen fremder Peaks weist auf einen guten Reinheitsgrad hin, und die ähnlichen chemischen Verschiebungen der anderen vier Reste weisen auf ähnliche Konformationen in diesem Lösungsmittel hin.

Fig. 2

A) Koazervierungstemperaturprofile von Ile¹-PPP zeigen einen Ansatz von Aggregation an der oberen Konzentrationsgrenze bei ungefähr 8ºC und einen Mittenpunkt bei 9ºC. Bei Verdünnung verschieben sich die Profile zu höheren Temperaturen. Die Profile von Elastin-Polypentapeptid (PPP) sind zum Vergleich als gestrichelte Kurven gezeigt. Die Hinzufügung einer CH&sub2;-Gruppe bewirkt eine Verschiebung des Koazervierungsprozesses um 16ºC zu niedrigeren Temperaturen.
B) Die durchgezogene Kurve zeigt Elliptizitätsdaten bei 197 nm für 0,025 mg Ile¹-PPP pro ml. Die Betragsabnahme des negativen 197 nm-Bandes weist auf eine Zunahme der intramolekularen Ordnung bei Erhöhung der Temperatur hin, d. h. einen inversen Temperaturübergang. Die gestrichelte Kurve zeigt dieselben Daten für 2,3 mg PPP/ml. Die Ersetzung von Val¹ durch Ile¹ verschiebt den Übergang um 15ºC oder mehr zu tieferen Temperaturen.
C) Termoelastizitätsdaten (Temperaturabhängigkeit der Elastomerkraft) für durch 20 Mrad γ-Bestrahlung quervernetztes Ile¹-PPP-Koazervat ist in der durchgezogenen Kurve gezeigt. Es tritt eine dramatische Zunahme der Elastomerkraft auf, die mit dem in A und B charakterisierten Übergang korreliert ist. Entsprechende Daten für 20 Mrad-quervernetztes PPP-Koazervat sind als gestrichelte Kurve gegen die rechte Ordinate aufgetragen. Der Skalenunterschied ist bedingt durch die kleinere Querschnittsfläche und eine 40%ige Dehnung bei quervernetztem Ile¹-PPP, wohingegen eine größere Querschnittsfläche und eine 60%ige Dehnung für quervernetztes PPP benutzt wurden. Die Elastizitätsmodule sind für die beiden Elastomere ähnlich. Beim Vergleich der Daten in den Teilen A, B und C wird deutlich, daß die größere Hydrophobizität von Ile im Vergleich zu Val das Auftreten des inversen Temperaturüberganges bei niedrigeren Temperaturen verursacht und daß die Elastomerkraftentwicklung als Resultat erhöhter intramolekularer Ordnung auftritt.

Fig. 3

Zirkulardichroimus-Spektren für 0,025 mg Ile¹-PPP pro ml Wasser bei 2ºC (Kurve a) vor dem in Fig. 2 B zu sehenden Übergang und bei 35ºC (Kurve b) nach dem Übergang. Da die große negative Bande bei 195 nm auf verringerte Polypentapeptid-Ordnung hinweist, zeigt der verringerte Betrag der großen negativen Bande bei Zunahme der Temperatur auf eine mit zunehmender Temperatur zunehmende Ordnung hin. Das Spektrum bei erhöhter Temperatur weist auf Typ II- β-Schleifenbildung hin. Zum Vergleich sind Daten für PPP bei 0,023 mg/ml bei 15ºC vor und bei 47ºC nach dem in Fig. 2 C gezeigten Übergang dargestellt. Es ist klar, daß Ile¹- PPP und PPP dieselbe Konformation haben.

Fig. 4

Für das Elastin-Polypentapeptid (PPP) vorgeschlagene Molekularstruktur.
A) Die Typ II-Pro2-Gly³-β-Schleife, wie durch die Struktur des zyklischen Konformationskorrelats bestätigt.
B) Schematische Darstellung einer Helix mit den Ausmaßen der PPP-β-Spirale.
C) Schematische Darstellung der PPP-β-Spirale, die die β-Schleifen zeigt, die als Abstandhalter zwischen Windungen der Spirale dienen.
D) Detaillierte Stereopaar-Axialansicht der PPP-β-Spirale, die den Raum innerhalb der Spirale für Wasser und das suspendierte Val&sup4;-Gly&sup5;-Val¹-Segment zeigt.
E) Stereopaar-Seitenansicht der β-Spirale von PPP, die die als Abstandhalter zwischen den Spiralbindungen wirkenden β-Schleifen zeigt, die Freiräume an der Oberfläche der β-Spirale zeigt, an denen Wasser zwischen innerhalb und außerhalb der Spirale ausgetauscht werden kann, und die das suspendierte Val&sup4;-Gly&sup5;-Val¹-Segment zeigt.

Fig. 5

Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum bei 25 MHz in Dimethylsulfoxid des Elastin-Polytetrapeptids, das durch Polymerisation der GGVP-Permutation hergestellt wurde. Alle Kohlenstoffresonanzen werden mit den richtigen chemischen Verschiebungen beobachtet, und es treten keine fremden Peaks auf.

Fig. 6

Koazervierungstemperaturprofile des Elastin- Polytetrapeptids (PTP) für eine Reihe von Konzentrationen (durchgezogene Kurven). Zum Vergleich Daten für das Elastin-Polypentapeptid (PPP) (gestrichelte Kurven). Die verringerte Hydrophobizität des Tetramers (VPGG) im Vergleich zum Pentamer (VPGVG) führt zu einer Verschiebung des Aggregationsprozesses, der zu Koazervatbildung führt, um ca. 25ºC zu höheren Temperaturen.

Fig. 7

Zirkulardichroismus-Spektren für Elastin-Polytetrapeptid (durchgezogene Kurven) bei niedriger Temperatur von 40ºC (Kurve a) und bei höherer Temperatur von 65ºC (Kurve b). Der Strukturübergang, der zum Unterschied im 195 bis 200 nm-Bereich führt, ist in Fig. 4 A als Funktion der Temperatur charakterisiert. Zum Vergleich sind Daten für PPP (gestrichelte Kurven) vor und nach dem in Fig. 4 A gezeigten Übergang aufgetragen.

Fig. 8

A) Elliptizität von Elastin-PTP als Funktion der Temperatur (durchgezogene Kurve), aufgetragen gegen die linke Ordinate. Zum Vergleich sind Daten für PPP (gestrichelte Kurve) gegen die rechte Ordinate aufgetragen. Es ist zu sehen, daß der Strukturübergang bei PTP bei einer um 20º-25º höheren Temperatur auftritt. Die Mitte des Übergangs entspricht dem Aggregationsprozeß in Fig. 2, d. h. die intramolekulare Konformationsänderung geht der zur Koazervierung führenden Assoziation voraus. Im Vergleich mit Teil B ist zu sehen, daß die Charakterisierung des intramolekularen Strukturübergangs durch [R]&sub2;&sub0;&sub0; zur Entwicklung der Elastomerkraft eng parallel ist.
B) Thermoelastizitätsdaten (Temperaturabhängigkeit der Elastomerkraft) für das 20 Mrad-quervernetzte PTP (durchgezogene Kurve), aufgetragen gegen die linke Ordinate und zum Vergleich für das 20 Mrad-quervernetzte PPP (gestrichelte Kurve), aufgetragen gegen die rechte Ordinate. Der Übergang der Elastomerkraft entspricht sichtbar dem inversen Temperaturübergang der intramolekularen Ordnung, wie oben in A durch die Elliptizität charakterisiert.

Fig. 9

Skalendarstellungen der Hydrophobizitäten der sich wiederholenden Einheiten (IPGVG), (VPGVG) und (VGPP), dargestellt zusammen mit den Mittenpunkttemperaturen der Übergänge, wie aus den Elliptizitätsdaten (Mittenpunkt des [R]&sub2;&sub0;&sub0;-Übergangs und den Elastomerkraftdaten (Mittenpunkt des f-Übergangs) aus Fig. 2 und 8 angenähert. Dies zeigt, daß mit abnehmender Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit die Temperatur des Überganges sich proportional zu höheren Temperaturen verschiebt. Da ein inverser Temperaturübergang in Wasser auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, bestätigt dies, daß die Übergangstemperatur sehr eng mit der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit korreliert ist.

Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen

Wie oben gesagt, besteht Elastin aus einem einzigen Protein. Die Elastinsequenz kann als serielle Anordnung alaninreicher, lysinhaltiger Quervernetzungssequenzen im Wechsel mit glycinreichen hydrophoben Sequenzen beschrieben werden. Unter den bekannten mehr als 80% der Sequenz sind die auffälligsten hydrophoben Sequenzen, sowohl von der Länge als auch von der Zusammensetzung her, eine, die ein Polypentapeptid (PPP) und eine, die ein Polyhexapeptid (PHP) enthält. Elast,in enthält auch ein sich wiederholendes Polytetrapeptid (PTP). Als ein Ergebnis der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführten Arbeit stellte sich heraus, daß das Elastin-Polypentapeptid nach Quervernetzung Elastomerverhalten zeigt und daß sein Polyhexapeptid kein Elastomerverhalten zeigt und offenbar ein Mittel zum Ausrichten und Verknüpfen der Ketten während der Elastogenese darstellt. Bei der vorliegenden Arbeit wurde herausgefunden, daß das Polypentapeptid und das Polytetrapeptid des Elastomers beide konformationsbasierende Elastomere sind, die entropische Elastizität durch einen inversen Temperaturübergang entwickeln, bei dem sie eine regelmäßige β-schleifenhaltige dynamische Struktur ausbilden.
Eine typische biologische elastische Faser besteht aus
einem starken Elastinkern, der mit einer dünnen Oberflächenschicht aus mikrofibrillarem Protein bedeckt ist. Wie bereits angemerkt, entsteht Elastin durch Quervernetzung der Lysinreste von Tropoelastin. Das sich wiederholende Elastin-Pentapeptid hat die Formel (VPGVG)n, wohingegen das sich wiederholende Hexapeptid die Formel (VAPGVG)n hat, wobei n je nach Art unterschiedlich ist. Die sich wiederholende Tetrapeptid-Einheit hat die Formel (VPGG)n. Bei diesen Sequenzen wird natürlich die standardmäßige Einbuchstabenabkürzung für die Aminosäurebestandteile benutzt.
Es wurde festgestellt, daß die Polypeptide in Wasser unter 25ºC löslich sind, daß sie aber bei Steigerung der Temperatur in den Fällen des Polypentapeptid (PPP) und des Polytetrapeptid (PTP) reversibel unter Ausbildung einer viskoelastischen Phase und im Fall des Polyhexapeptids (PHP) irreversibel unter Bildung eines Präzipitats assoziieren. Es wurde festgestellt, daß erstere (PPP) und (PTP) bei Quervernetzung Elastomere sind.
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, daß bei Temperaturen oberhalb 25º in Wasser PTP und PPP aggregieren und eine wasserhaltige viskoelastische Phase bilden, die bei Quervernetzung durch Gammabestrahlung ein Elastomer bildet. Im Gegensatz dazu bildet PHP ein körniges Präzipitat, das kein Elastomerverhalten zeigt. Es wurde festgestellt, daß bei potentiellen Elastomeren diese Aggregation leicht reversibel ist, wohingegen bei Nichtelastomer-Proben wie PHP die temperaturbewirkte Aggregation irreversibel ist und die Wiederauflösung normalerweise den Zusatz von Trifluorethanol zum Aggregat erfordert.
Zur Klarstellung wird darauf hingewiesen, daß die reversible temperaturverursachte Aggregation, die beim Stehenlassen zu einer viskoelastischen Phase führt, als Koazervierung bezeichnet wird. Die viskoelastische Phase wird Koazervat genannt und die Lösung über dem Koazervat wird als Gleichgewichtslösung bezeichnet.
Von größter Wichtigkeit ist, daß nun nach der vorliegenden Erfindung festgestellt wurde, daß quervernetztes PPP, PTP und Analoga von diesen Elastomerkraftentwicklung bei unterschiedlichen Temperaturen, die einen Bereich von bis zu 75ºC überdecken, in Abhängigkeit von mehreren steuerbaren Variablen aufweisen. Außerdem wurde herausgefunden, daß bei diesen quervernetzten Elastomeren die Entwicklung nahezu maximaler Elastomerkraft in einem sehr engen Temperaturbereich auftreten kann. Somit kann nun durch Synthese von Bioelastomermaterialien mit unterschiedlichen molaren Anteilen der Pentamer- und Tetramer-Bestandteile, zusammen mit durch sich wiederholende Hexamer-Einheiten modifizierten Einheiten und durch Wahl eines bestimmten Lösungsmittels zur Unterstützung der anfänglichen viskoelastischen Phase die Temperatur genau gesteuert werden, bei der das erhaltene Bioelastomer Elastomerkraft entwickelt.
Allgemein wurde festgestellt, daß der Prozeß des Anhebens der Temperatur zum Bilden des genannten Elastomerzustands ein inverser Temperaturübergang ist, der anders als bei typischen Gummis zur Entwicklung einer regelmäßigen, nicht zufälligen Struktur führt, bei der als charakteristische Komponente hydrophobe molekulare Wechselwirkungen eingesetzt werden. Als regelmäßige Struktur wird eine β-Spirale vorgeschlagen, eine lockere wasserhaltige Helixstruktur mit β-Schleifen als Abstandhalter zwischen Schleifen der Helix, die hydrophobe Kontakte zwischen Helixschleifen bildet und suspendierte Peptidsegmente hat. Diese Peptidsegmente können als Librationen bezeichnete niederfrequente Schaukelbewegungen großer Amplitude durchführen. Somit ist ein neuer Mechanismus der Elastizität entwickelt worden, der als Librationsentropiemechanismus der Elastizität bezeichnet wird.
Es wurde festgestellt, daß die Elastomerkraft dieser unterschiedlichen Bioelastomere sich zusammen mit deren regelmäßiger Struktur entwickelt. Ferner wurde festgestellt, daß eine Zerstörung der regelmäßigen Struktur durch Denaturierung bei hoher Temperatur zur Zerstörung der Elastomerkraft führt. Interessanterweise ist diese Situation das genaue Gegenteil der Zufallsketten-Netzwerktheorie der Elastizität: Je zufälliger das Polypentapeptid, desto geringer ist die Elastomerkraft, und je ausgebildeter die β-schleifenhaltige Struktur ist, desto größer ist die Elastomerkraft.
Im weitesten Sinne gehört die vorliegende Erfindung zur Entwicklung eines neuen, auf Entropie basierenden Elastizitätsmechanismus. Der Mechanismus dafür scheint abgeleitet zu sein von einer neuen Klasse von Polypeptid-Konformationen, die als β-Spiralen bezeichnet werden, in denen β-Schleifen sich in einer lockeren wasserhaltigen Helix regelmäßig wiederholen. Die β-Spirale ist das Ergebnis hydrophober intramolekularer Interschleifenwechselwirkungen, die sich bei Erhöhung der Temperatur im Wasser ausbilden. Bei der β-Spirale des elastomeren Elastin-Polypentapeptids (Val¹-Pro²-Gly³-Val&sup4;-Gly&sup5;)n wirken die Typ II-Pro²- Gly³-β-Schleifen als Abstandshalter mit hydrophoben Kontakten zwischen den Schleifen der Helix, was zur Suspendierung der Val&sup4;-Gly&sup5;-Val¹-Segmente führt. Da sie im wesentlichen von Wasser umgeben sind, können die Peptidgruppen der suspendierten Segmente als Librationen bezeichnete große Schaukelbewegungen durchführen, die bei Streckung gedämpft werden. Die Abnahme der Librationsamplitude bei Streckung führt zur einer Entropieabnahme, und scheint, daß die Abnahme der freien Energie aufgrund der Entropiezunahme bei Rückkehr in den entspannten Zustand die Antriebskraft für die Elastomerzusammenziehung ist.
Nach der vorliegenden Erfindung sind bei Erhöhung der Temperatur des Polypeptid-Lösungsmittel-Systems wie z. B. PPP- Wasser die hydrophoben Seitenketten wie jene von Pro und Val im in Wasser dispergierten Zustand umgeben von Wasser mit einer Clathrat-ähnlichen Struktur, d. h. von Wasser, das stärker geordnet ist als normales Volumenwasser. Bei Anhebung der Temperatur wird ein Teil dieses stärker geordneten Clathrat-artigen Wassers, das die hydrophoben Gruppen umgibt, zu weniger geordnetem Volumenwasser, da die hydrophoben Ketten zur Bildung eines stärker geordneten Polypeptids assoziieren. Anscheinend unterstützt die Optimierung des intramolekularen hydrophoben Kontaktes das Aufwickeln des Polypeptids zu einer lockeren Helix. Die Einhaltung des zweiten Gesetzes der Thermodynamik scheint durch die Anforderung bewirkt zu werden, daß die Entropieabnahme des Polypeptid-Bereiches des Systems geringer ist als die Entropiezunahme des Wassers im System. Da ΔG = 0 am Mittenpunkt (Tmp) der Temperatur eines Strukturüberganges zwischen einem Paar von Zuständen ist, folgt Tmp = ΔH/ΔS. Wenn die Entropieänderung ΔS aus der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit resultiert, wie beim Mechanismus des Clathrat-artigen Wassers der Fall wäre, dann kann durch eine Zunahme der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit die Abnahme von Tmp, dem Mittenpunkt des inversen Temperaturüberganges, erklärt werden. Tatsächlich wurde nach der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß eine Abnahme der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit zu einer Zunahme von Tmp führt. Umgekehrt führt eine Zunahme der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheiten zu einer Abnahme von Tmp.
Dieses Prinzip kann demonstriert werden, indem das stärker hydrophobe Isoleucin (Ile) anstelle von Valin (Val) im Elastin-Polypentapeptid (Ile¹-Pro²-Gly³-Val&sup4;-Gly&sup5;)n, d. h. Ile¹- PPP, eingesetzt wird), um ein substituiertes Polypentapeptid herzustellen, das PPP-ähnliche Eigenschaften hat, mit der Ausnahme, daß der beschriebene Übergang bei einer tieferen Temperatur auftritt. Siehe Fig. 1-3.
Zur Klarstellung wird angemerkt, daß bei der oben durchnumerierten Sequenz und allen nachfolgenden Sequenzen das Hochindex-Numerierungssystem eine Sequenznumerierung ist, die auf dem dominanten sekundären Strukturmerkmal dieser sich wiederholenden Sequenzen basiert, nämlich der Typ-II- Pro²-Gly³-β-Schleife, einem zehnatomigen, durch Wasserstoffbrückenbindungen verbundenen Ring, der das C=O des Restes 1 und das NH des Restes 4 umfaßt.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf das Elastin-Polytetrapeptid. Es wird daran erinnert, daß diese sich wiederholende Einheit die Formel (Val¹-Pro²-Gly³-Gly&sup4;)n hat, die ebenfalls eine PPP-ähnliche β-Spirale bildet. Die Aggregationstemperatur für PTP liegt allerdings höher als für PPP. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß sowohl für die sich wiederholenden Polypentapeptid- als auch Polytetrapeptid-Einheiten von Elastin die Übergangstemperatur für die Entwicklung der Elastomerkraft der Hydrophobizität der sich wiederholenden. Einheit proportional ist. Dies ist in Fig. 9 graphisch dargestellt. Daher können zwei von der vorliegenden Erfindung ans Licht gebrachte wichtige Prinzipien hier festgehalten werden. Das erste ist, daß die Elastomerkraftentwicklung aufgrund eines inversen Temperaturüberganges auftritt, der zu einer erhöhten Polypeptid-Ordnung durch Anheben der Temperatur führt. Zweitens ist die Temperatur dieses Überganges zur Entwicklung der Elastomerkraft proportional zur Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit in dem Bioelastomer.
Nach der vorliegenden Erfindung werden Analoga sowohl des Elastin-Polypentapeptids (PPP) als auch des Polytetrapeptids (PTP) sowie Kombinationen von diesen betrachtet. Z.B. wurde festgestellt, daß die Übergangstemperatur für Ile¹- PPP um einen Betrag zu niedrigeren Temperaturen verschoben ist, der aus der Zunahme der Hydrophobizität relativ zu PPP unter Verwendung der in Fig. 9 gezeigten Hydrophobizitätsskalen berechnet werden kann. So kann durch sorgfältige Auswatil eines neuen Analogons mit einer anderen Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit die Übergangstemperatur für die Entwicklung der Elastomerkraft vorhersagbar zu einer anderen Temperatur verschoben werden. Tatsächlich ist es nun möglich, durch geschickte Auswahl unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten und Kombinationen von diesen zusammen mit unterschiedlichen Lösungsmittelgemischen eine Übergangstemperatur aus einem Bereich von ca. 75ºC Breite, von ca. -25ºC bis ca. +50ºC auszuwählen.
Wie bereits angemerkt, ist die auffälligste sich wiederholende Sequenz des Elastin-Polypentapeptids (Val¹-Pro²-Gly³- Val&sup4;-Gly&sup5;)n, wobei z. B. n für Hühner 13 und für Schweine 11 ist. Das Polypentapeptid ist unterhalb 25ºC in allen Proportionen in Wasser löslich. Bei Anhebung der Temperatur über 25ºC tritt Aggregation auf und das Aggregat setzt sich unter Ausbildung einer dichten viskoelastischen Koazervatphase ab, die bei 40ºC zu ca. 38 Gewichtsprozent aus Peptid und 62 Gewichtsprozent aus Wasser besteht. Der Prozeß der PPP-Koazervierung ist wie gesagt vollständig reversibel. Bei Quervernetzung zeigt das PPP-Koazervat Elastomerverhalten. Die Koazervat-Konzentration von PPP sowie das elastomere, durch γ-Strahlung quervernetzte PPP-Koazervat durchlaufen einen inversen Temperaturübergang, der bei 25ºC beginnt und nahe bei 37ºC vollendet ist. In demselben Temperaturbereich nimmt die Elastomerkraft des quervernetzten PPP-Koazervats von nahe 0 bei 20ºC zur vollen Kraft nahe 40ºC dramatisch zu. Oberhalb 40ºC wird die Elastomerkraft dividiert durch die Temperatur (ºK) ungefähr konstant.
Dies ist ein Hinweis darauf, daß das quervernetzte PPP ein im wesentlichen entropisches Elastomer ist. D.h. die entropische Komponente der Elastomerkraft hängt von der Abnahme der Zahl niederenergetischer Zustände ab, die dem Polymer bei Streckung zugänglich sind, wohingegen die innere Energie-Komponente der Elastomerkraft aus der Belastung von Bindungen resultiert, die die Bruchwahrscheinlichkeit des Elastomers erhöht. Interessanterweise scheint das Elastin- Polypentapeptid, das ungefähr maximale entropische Elastomerkraft bei Anhebung der Temperatur von 25ºC auf 37ºC entwickelt, spezifisch für warmblütige Tiere evolviert zu sein. Diese Evolution scheint in einem relativ frühen Stadium der Säugetierentwicklung stattgefunden zu haben, denn es scheint, daß diese sich wiederholenden Peptidsequenzen in den letzten 200 Mio. Jahren der Säugetierentwicklung unverändert geblieben sind.
Somit beruht die vorliegende Erfindung teilweise auf der Feststellung, daß die Übergangstemperatur geändert werden kann, indem das PPP modifiziert wird. Insbesondere wurde festgestellt, daß durch Steigerung der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit des PPP der viskoelastische Phasenübergang bei niedrigeren Temperaturen auftreten kann, wohingegen durch Verringerung der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit dieser Übergang zu höheren Temperaturen verschoben wird. Wenn die Hydrophobizität modizifiert wird, muß dies natürlich so getan werden, daß die Elastizität bestehen bleibt.
So sind z. B. Modifikationen der sich wiederholenden Pentamere durchgeführt worden, die die für Elastizität erforderliche Molekülstruktur zerstören, wie etwa die Ala¹- und Ala&sup5;-Analoga. Die Ala¹- und Ala&sup5;-Analoga, von denen ersteres die Hydrophobizität des Pentamers verringert und letzteres sie erhöht, führen bei Steigerung der Temperatur wäßriger Lösungen anstatt zur Bildung viskoelastischer Koazervate zur Bildung körniger Präzipitate, und Quervernetzungen des Ala&sup5;-PPP-Präzipitates durch γ-Strahlung führt zu einem harten Material, das bei Dehnung einfach bricht. Nach der vorliegenden Entdeckung wird angenommen, daß diese Analoga aus unterschiedlichen aber konsistenten Gründen keine Elastomer-Polymere hervorbringen. Erstens scheint das Ala¹-Analogon nicht die wichtigen intramolekularen hydrophoben Kontakte Val¹-γ-CH&sub3;- . . . Pro² δCH&sub2; zu ermöglichen, die zur Bildung eines viskoelastischen Koazervates erforderlich sind. Das Ala&sup5;-Analogon scheint mit den Librationsbewegungen des suspendierten Val&sup4;-Gly&sup5;-Val¹-Segments der vorgeschlagenen PPP- Molekülstruktur zu interferieren. Wie gesagt sind die Librationen wesentlich für den vorgeschlagenen Librationsentropiemechanismus der Elastizität.
Im Gegensatz dazu kann die Hydrophobizität des sich wiederholenden Pentamers einfach erhöht werden, indem eine CH&sub2;- Gruppe z. B. zum Rest 2 hinzugefügt wird, unter Aufrechterhaltung der β-Verzweigung, d. h., indem das Ile¹-Analogon von PPP, d. h. (Ile¹-Pro²-Gly³-Val&sup4;-Gly&sup5;)n verwendet wird. Mit einem Molekülgewicht von über 50.000 bildet Ile¹-PPP reversibel ein viskoelastisches Koazervat, wobei die Koazervierung bei 8ºC einsetzt, anstelle von 24ºC, wie bei unsubstituiertem PPP. Zirkulardichroismus-Daten weisen darauf hin, daß Ile¹-PPP und PPP sowohl vor als auch nach den Übergängen identische Konformationen haben, und daß der Übergang zu erhöhter intramolekularer Ordnung bei Erhöhung der Temperatur ebenfalls um 15ºC oder mehr zu tieferen Temperaturen verschoben ist. Auch die dramatische Zunahme der Elastomerkraft des durch Gammastrahlung quervernetzten Koazervats bei Erhöhung der Temperatur ist beim Ile¹-PPP-Analogon ähnlich zu einer niedrigeren Temperatur verschoben. So ist an diesem Analogon ein Zusammenhang zwischen der temperaturabhängigen Elastomerkraftentwicklung und der Molekularstruktur demonstriert. Dies bedeutet natürlich, daß nun Polypeptid-Elastomere rationell entworfen werden können, die Übergänge bei unterschiedlichen Temperaturen durchlaufen und die als entropische Elastomere in unterschiedlichen Temperaturbereichen funktionieren.
Wie oben festgestellt, können nun durch Erhöhen der Hydrophobizität des PPP, wie etwa durch Substituieren von Val¹ durch Ile¹ in der Pentamersequenz von -(VPGVG)n zur Bildung von -(IPGVG)n wenigstens zwei unterschiedliche Ziele erreicht werden.
Erstens kann nun z. B. das "homopolymere" Polypentapeptid von -(IPGVG) , d. h. Ile¹-PPP hergestellt werden, das wie gesagt in Wasser bei 4ºC löslich ist und bei Erhöhung der Temperatur auf 8ºC Aggregation zeigt. Nach Quervernetzung des Koazervats durch γ-Bestrahlung wird beobachtet, daß im wesentlichen volle Elastomerkraft bei ungefähr 25ºC beim quervernetzten Ile¹-PPP auftritt, im Gegensatz zu den für unsubstituiertes PPP erforderlichen 40ºC. Somit tritt der inverse Temperaturübergang bei Ile¹-PPP bei einer ungefähr 15ºC tieferen Temperatur auf als bei PPP.
Zweitens können nun auch gemischte "Copolymere" hergestellt werden, z. B. aus den Polypentapeptiden -X¹-(IPGVG)n-Y¹- und -X¹-(VPGVG)n-Y², die variable und steuerbare Übergangstemperaturen aufweisen, die zwischen den unterschiedlichen Übergangstemperaturen von PPP und Ile¹-PPP liegen. Dabei ist ein hohes Maß von Steuerung möglich, da die erhaltene Übergangstemperatur direkt den molaren Verhältnissen der jeweiligen enthaltenen Pentapeptide proportional ist.
Vielleicht das auffälligste Merkmal der quervernetzten PPP- Analoga mit erhöhter Hydrophobizität ist, daß nahezu volle Elastomerkraft in einem sehr engen Temperaturbereich erreicht werden kann. So wird z. B. bei quervernetztem Ile¹- PPP festgestellt, daß dessen Elastomerkraft eine abrupte Zunahme von im wesentlichen 0 bei 8ºC zu drei Vierteln der vollen Kraft bei 10ºC und im wesentlichen der vollen Kraft bei 20º-25ºC aufweist. Einen solche Zunahme der Elastomerkraft über eine Temperaturdifferenz von nur 2ºC ist in der Tat ohne Vorbild und kann gesteuert werden durch die prozentuale Dehnung in Zusammenhang mit dem Quellen des Elastomers bei Senkung der Temperatur.
Obwohl Ile¹-PPP ein ausgezeichnetes Beispiel für ein PPP- Analogon mit erhöhter Hydrophobizität ist, fällt auch jedes PPP-Analogon in den Rahmen der vorliegenden Erfindung, bei dem die Hydrophobizität der sich wiederholenden Pentamereinheiten unter Aufrechterhaltung der Elastizität des Polypentapeptids und ohne Störung der Ausbildung des viskoelastischen Koazervats oder der Librationsbewegung verringert ist.
Z.B. können zusätzlich zu sich wiederholenden Einheitssequenzen aus -(IPGVG)n- unter Verwendung von Ile¹ eine Vielzahl anderer Substitutionen durchgeführt werden. Allgemein liegt eine sich wiederholende Pentapeptid-Einheit mit der Formel
-(R&sub1;PR&sub2;R&sub3;G)nim Rahmen der vorliegenden Erfindung, wobei R&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Phe, Leu, Ile und Val besteht; R&sub2; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ala und Gly besteht; R³ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Phe, Leu, Ile und Val besteht; und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist und P L-Prolin und G Glycin ist.
Obige Substitutionen modifizieren die Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit, so daß die Übergangstemperatur für nahezu maximale Elastomerkraftentwicklung verringert wird, natürlich ohne die Elastizität des Bioelastomers zu zerstören.
Die Aminosäure Leu in der obigen Formel ist natürlich Leucin. R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; entsprechen den Positionen 1, 3 und 4 in der hier beschriebenen numerierten Sequenz.
Interessanterweise dann mit Phe¹-PPP in Wasser die Übergangs-Anfangstemperatur von 25ºC für PPP auf ungefähr 0ºC verschoben werden. Diese Verschiebung kann zu noch tieferen Temperaturen getrieben werden, indem gemischte Lösungsmittelsysteme aus Wasser/Ethylenglykol oder Wasser/Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet werden. Z.B. kann bei Verwendung des Systems Phe¹-PPP/Wasser-Ethylenglykol eine Übergangstemperatur von -24ºC erreicht werden. Natürlich kann ein Bereich von Übergangstemperaturen zwischen 0ºC und ungefähr -25ºC für das Phe¹-PPP/Wasser-Ethylenglykol-System erreicht werden, je nach Menge des zugefügten Ethylenglykols. Sehr tiefe Übergangstemperaturen werden durch Verwendung ungefähr gleichteiliger Gemische von Wasser und Ethylenglykol erreicht.
Die maximale Verschiebung zu höheren Übergangstemperaturen ist hingegen durch die Denaturierung des Polypeptids begrenzt. Bei den gegenwärtigen Elastomer-Polypeptiden scheint diese obere Grenze bei ungefähr 50ºC zu liegen, wobei die Denaturierung bei oberhalb 60ºC beginnt.
Wie oben festgestellt, umfaßt die vorliegende Erfindung nicht nur PPP-Analoga wie Ile¹-PPP, Phe¹-PPP oder Ala³-PPP, sondern alle PPP-Analoga und Bioelastomere, die diese enthalten, die Übergangstemperaturen und somit Temperaturen nahezu maximaler Elastomerkraftentwicklung aufweisen, die sich von PPP unterscheiden, und bei denen die Elastizität erhalten ist. Anhand der vorliegenden Offenbarung kann ein Fachmann sicherlich weitere PPP-Analoga und Bioelastomere, die diese enthalten, finden, die den obigen Kriterien genügen.
Wie oben angegeben, kann das Analogon mit erhöhter Hydrophobizität, wie etwa Ile¹-PPP, als "Homopolymer" synthetisiert werden, oder ein "Copolymer" von X²-(VPGVG-)n-Y²- und -X¹-(IPGVG-)n-Y¹- kann synthetisiert werden, wobei das molare Verhältnis der Pentamerbestandteile von der für die Entwicklung der Elastomerkraft gewünschten Temperatur abhängt. Im allgemeinen ist in solchen "Copolymeren" die Pentamer-Komponente -X¹-(IPGVG-)n-Y¹- mit 1 bis 99 Prozent des gesamten Pentamer-Molgehalts vorhanden und die Pentamer-Komponente -X²-(VPGVG-)n-Y²- ist in einem Anteil von etwa 99 bis 1 Prozent des gesamten Pentamer-Molgehalts vorhanden. Bevorzugterweise ist die Komponente -X¹-(IPGVG-)n-Y¹- mit ungefähr 5 bis 95 Prozent des gesamten Pentamer-Molgehalts vorhanden, und die Komponente -X²-(VPGVG-)n-Y²- ist mit 95 bis 5 Prozent des gesamten Pentamer-Molgehalts vorhanden. Jedoch kann jede beliebige Kombination relativer Molanteile verwendet werden, so wie für die gewünschte Übergangstemperatur erforderlich.
So können nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Bioelastomere hergestellt werden, die Elastomereinheiten enthalten, die Tetrapeptid- oder Pentapeptid-Einheiten oder durch sich wiederholende Hexapeptid-Einheiten modifizierte Einheiten von diesen sowie Gemische von diesen umfassen, wobei die sich wiederholenden Einheiten Aminosäurereste umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus hydrophoben Aminosäure- und Glycin-Resten besteht, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die eine Polypentapeptid-Einheit mit der Formel
-X¹-(IPGVG-)n-Y ¹umfaßt,
wobei I ein peptidbildender Rest von L-Isoleucin ist;
P ein peptidbildender Rest von L-Prolin ist;
G ein peptidbildender Rest von Glycin ist;
V ein peptidbildender Rest von L-Valin ist; und
wobei X PGVG, GVG, VG, G oder eine kovalente Bindung ist; Y IPGV, IPG, IP oder I oder eine kovalente Bindung ist; und n in beiden Formeln eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder 0 ist, mit der Maßgabe, daß X¹ und Y¹ zusammen eine sich wiederholende Pentapeptid-Einheit in ausreichender Menge bilden, um die Entwicklung von Elastomerkraft des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch auch, wie oben gesagt, Bioelastomere, die Elastomer-Einheiten enthalten, die Tetrapeptid oder Pentapeptid oder durch sich wiederholende Hexapeptid-Einheiten modifizierte Einheiten von diesen sowie Gemische von diesen enthalten, wobei die sich wiederholenden Einheiten Aminosäurereste enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus hydrophoben Aminosäure- und Glycinresten besteht, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die A) eine Polypentapeptid-Einheit mit der Formel
-X¹-(IPGVG-)n-Y¹- und B) eine Polypentapeptid-Einheit mit der Formel
-X²-(VPGVG-)n-Y²umfaßt, wobei in den obigen Formeln
I ein peptidbildender Rest von L-Leucin ist;
P ein peptidbildender Rest von L-Prolin ist;
G ein peptidbildender Rest von Glycin ist;
V ein peptidbildender Rest von L-Valin ist; und
wobei X¹ und X² jeweils PGVG, GVG, VG, G oder eine kovalente Bindung sind; Y¹ IPGV, IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung und Y² VPGV, VPG, VP, V oder eine kovalente Bindung ist und n in beiden Formeln eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder in beiden Formeln 0 ist, mit der Maßgabe, daß X¹ und Y¹ zusammen und X² und Y² zusammen eine sich wiederholende Pentapeptid-Einheit in ausreichenden relativen Mengen bilden, um die Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen.
Es sollte beachtet werden, daß Bioelastomer-Polypeptidketten, die eine oder beide der obigen sich wiederholenden Pentapeptid-Einheiten enthalten, unter Verwendung eines beliebigen der Pentapeptid-"Monomere" synthetisiert werden kann, die Permutationen der Basissequenz sind. Wenn das Polymer jedoch nicht unter Verwendung der Pentapeptid-"Monomere", sondern durch sequentielles Hinzufügen von Aminosäuren an ein wachsendes Peptid synthetisiert wird, wie im Falle eines automatischen Peptidsynthetisierers, ist die Bezeichnung der sich wiederholenden Einheit etwas willkürlich. Z.B. kann das Peptid H-V(PGVGVPGVGVPGVGVPGVGV)P-OH angesehen werden als aus einer beliebigen der folgenden sich wiederholenden Einheiten und Endgruppen bestehend:
H-(VPGVG)&sub4;-VP-OH, H-V(PGVGV)&sub4;-P-OH, H-VP-(GVGVP)&sub4;-OH, H-VPG-(VGVPG)&sub3;-VGVP-OH oder H-VPGV-(GVPGV)&sub3;-GVP-OH, als Beispiele.
Ferner ist es durchaus möglich und liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß gemischte sich wiederholende Einheiten wie solche mit der Formel -(VPGVGIPGVG-)n in die Bioelastomere der vorliegenden Erfindung einbezogen werden können.
Die Synthese der elastizitätsfördernden und -modifizierenden Segmente, die in das letztliche Elastomer-Polypeptid einbezogen sind, ist unkompliziert und für einen Peptid- Chemiker leicht zu bewerkstelligen. Die resultierenden intermediären Peptide haben die allgemeine Struktur B¹-(sich wiederholende Einheit)n-B², wobei B¹ und B² eine beliebige chemisch kompatible Endgruppe an den Amino- bzw. Carboxylenden des Moleküls darstellen, und wobei n eine ganze Zahl von 2 bis ca. 200 ist. Wenn B¹ = -H und B² = -OH ist, und wenn n = 1 ist, ist die Verbindung entweder das Pentapeptid H-VPGVG-OH oder H-IPGVG-OH. Wenn n > 1 ist, ist die intermediäre Verbindung ein Polypentapeptid. Dasselbe gilt, wenn sich wiederholende Tetramer-Einheiten bei den vorliegenden Elastomeren verwendet werden.
Es ist zu beachten, daß der Ausdruck "hydrophobe" Aminosäuren sich auf Aminosäuren bezieht, die, gemessen auf einer Hydrophobizitätsskala, die durch Messen der relativen Löslichkeiten der Aminosäuren in organischen Lösungsmitteln generiert wird, erkennbar hydrophobe R-Gruppen haben. Diesbezüglich siehe Arch. Biochem. Biophy., Bull and Breese, Band 161, 665-670 (1974). Nach diesem Verfahren können alle Aminosäuren verwendet werden, die hydrophober als Glycin sind. Genauer gesagt sind bevorzugte hydrophobe Aminosäuren Ala, Val, Leu, Ile und Pro.
Es ist zu beachten, daß es durchaus möglich ist, daß ein oder mehrere Aminosäurereste oder Segmente von Aminosäureresten, die in der normalen Pentapeptid- oder Tetrapeptid- Sequenz nicht auftreten, in einem Polypentapeptid- oder Polytetrapeptid-Bereich einer Elastomer-Polypeptid-Kette eingestreut sind.
Die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung können unabhängig von der spezifischen, darin einbezogenen, sich wiederholenden funktionellen Einheit diese darin einbezogenen sich wiederholenden Einheiten in Form von Block- oder Zufalls-Copolymeren aufweisen, sofern die erwünschte Verschiebung der Temperatur der Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers erhalten wird. Wie oben angegeben kann unter Berücksichtigung der Übergangstemperaturen und Temperaturen der Elastomerkraftentwicklung für zwei PPP- oder PTP-Analoga oder auch für ein PPP-Analogon und ein PTP-Analogon eine erwünschte intermediäre Übergangstemperatur und Temperatur der Elastomerkraftentwicklung erreicht werden, indem die molaren Anteile einer jeden analogen Komponente direkt damit korreliert werden. Z.B. würde ein Molverhältnis von 50/50 von zwei analogen Komponenten zu einem bioelastomeren "Copolymer" mit einer Übergangstemperatur und einer Temperatur der Elastomerkraftentwicklung ungefähr mitten zwischen jenen der analogen Komponenten führen.
Außerdem ist zu beachten, daß die in Verbindung mit allen Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendeten Elastomer- Einheiten, ob die sich wiederholende Einheit nun PPP, PTP oder ein Analogon von diesen ist, auch die in den US-Patenten 4 187 852, 4 474 851, 4 500 700 und 4 589 882 sowie den US-Patentanmeldungen 533 670, 793 225 und 853 212 beschriebenen umfassen kann, welche Patente und Patentanmeldungen hierin zur Gänze einbezogen sind.
Der auf PPP und Analoga bezogene Aspekt der Erfindung wird nun anhand von Beispielen verdeutlicht, die allein der Verdeutlichung dienen und nicht die vorliegende Erfindung einschränken sollen.

Beispiele

Peptidsynthese

Die Synthese von Ile¹-PPP wurde nach den klassischen Lösungsverfahren wie in Schema I gezeigt durchgeführt.
Bei den folgenden Beispielen werden folgende Abkürzungen benutzt:
Boc: Tert-Butyloxycarbonyl;
Bzl: Benzyl;
DMF: Dimethylformamid;
DMSO: Dimethylsulfoxid;
EDCI: 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethylcarbodiimid;
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol;
IBCF: Isobutylchloroformat;
NMM: N-Methylmorpholin;
Onp: p-Nitrophenylester;
TFA: Trifluoressigsäure;
PPP: (VPGVG)n;
Ile¹-PPP: (IPGVG)n;
V: Valin;
I: Isoleucin;
P: Prolin;
G: Glycin.

Schema I

Synthese von H-(Gly-Val-Gly-Ile-Pro)n-OH

i) IBCF/HOBt;
ii) HCl/Dioxan;
iii) EDCI/HOBt;
iv) H&sub2;-Pd/C;
v) Bis(p-Nitrophenyl)carbonat;
vi) TFA;
vii) DMSO-NMM.
Als Sequenz des Anfangspentamers für die Polymerisation ist Gly-Val-Gly-Ile-Pro gegenüber Ile-Pro-Gly-Val-Gly bevorzugt, da die Permutation mit Pro als C-Terminus-Aminosäure Polymere mit hohem Molekulargewicht in besseren Ausbeuten liefert. Der Syntheseansatz erforderte ein Koppeln des Tripeptids Boc-GVG-OH (II) mit H-IP-OBzl, die jeweils nach der Anhydridgemisch-Methodik von J.R. Vaughan et al., J. Am. Chem. Soc., 89, 5012 (1967) synthetisiert wurden. Die mögliche Erzeugung von Urethan als Nebenprodukt während der Reaktion von Boc-Ile-OH mit H-Pro-OBzl nach dem Anhydridgemisch-Verfahren wurde vermieden, indem die Reaktion in Gegenwart von HOBt ausgeführt wurde. Das Dipeptid wurde auch unter Verwendung von EDCI zur Bestätigung des Produkts hergestellt. Der Pentapeptid-Benzylester (III) wurde zur freien Säure (IV) hydriert, die weiter durch Reaktion mit bis (p-Nitrophenyl)carbonat zu p-Nitrophenylester (V) umgesetzt wurde. Beim Entfernen der Boc-Gruppe wurde eine 1-molare Lösung des aktiven Esters in DMSO in Gegenwart von 1,6 Äquivalenten NMM polymerisiert. Das Polypentapeptid wurde unter Verwendung einer Dialyseleitung mit Sperre bei 50.000 Dalton dialysiert und lyophilisiert. Die Reinheit der Zwischen- und Endprodukte wurde durch Kohlenstoff-13- Kernspinresonanz, Elementaranalysen und Dünnschichtchromatographie (TLC) überprüft.
Elementaranalysen wurden durchgeführt von Mic Anal, Tucson, Arizona. Alle Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin sind L-konfiguriert. Boc-Aminosäuren wurden gekauft bei Bachem, Inc., Torrance, Kalifornien. HOBt wurde beschafft bei Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin. Dünnschichtchromatographie wurde auf Silicagel-Platten von Whatman, Inc., Clifton, New Jersey in den folgenden Lösungsmittel- Systemen durchgeführt:
R¹f, CHCl&sub3; (C):CH&sub3;OH(M):CH&sub3;COOH(A), 95 : 5 : 3;
R²f, CMA (85 : 15 : 3);
R³f, CMA (75 : 25 : 3);
R&sup4;f, CM (5 : 1).
Schmelzpunkte wurden ermittelt mit einem Thomas-Hoover- Schmelzpunkt-Gerät und sind unkorrigiert.

Boc-Ile-Pro-OBzl (Anhydridgemisch-Verfahren) (I):

Boc-Ile-OH (12,01 g, 0,05 Mol) in DMF (50 ml) wurde auf 0ºC abgekühlt und NMM (5,49 ml) wurde zugefügt. Nach Abkühlen der Lösung auf -15ºC wurde unter Halten der Temperatur bei -15ºC Isobutylchloroformat (6,48 ml) langsam zugefügt und 10 Minuten gerührt, HOBt (7,65 g) wurde zugefügt und es wurde weitere 10 Minuten gerührt. Eine vorgekühlte Lösung von HCl-H-Pro-OBzl (12,09 g, 0,05 Mol) in DMF (50 ml) und NMM (5,49 ml) wurde der obigen Lösung zugesetzt und die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch TLC verfolgt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine kalte gesättigte NaHCO&sub3;- Lösung gegossen und eine Stunde gerührt. Das Peptid wurde in CHCl&sub3; extrahiert und mit Säure und Base gewaschen (0,5 N NaOH, um HOBt zu entfernen), und nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt als Öl mit 92% Ausbeute erhalten. R¹f, 0,65. Berechnete Analyse für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub4;N&sub2;O&sub5;: C 66,00; H 9,19; N 6,69%. Gemessen: C 65,58; H 8,28; N 7,13%.

Boc-Ile-Pro-OBzl (unter Verwendung von EDCI):

Boc-Ile-OH (7,20 g, 0,03 Mol) und HOBt (5,05 g, 0,033 Mol) in DMF (30 ml) wurde auf -15ºC abgekühlt und EDCI (6,32 g, 0,033 Mol) wurde zugefügt. Nach 20minütigem Rühren wurde eine vorgekühlte Lösung von HCl-H-Pro-OBzl (7,25 g, 0,103 Mol) in DMF (30 ml) und NMM (3,3 ml) zugefügt und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Verdampfen des DMF wurde der Rückstand in CHCl&sub3; eingebracht und mit 20%iger Zitronensäure und 0,5 N NaOH extrahiert. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Produkt wurde als ein Öl in nahezu quantitativer Ausbeute erhalten, identisch dem durch das Anhydridgemisch-Verfahren erhaltenen Produkt.

Boc-Gly-Val-Gly-Ile-Pro-OBzl (III):

Boc-GVG-OH (II) (20) (5,6 g, 0,017 Mol) wurde mit H-Ile-Pro-OBzl (6,7 g, 0,019 Mol) (erhalten durch Entblocken von I mit HCl/Dioxan) in Gegenwart von EDCI (3,65 g, 0,019 Mol) und HOBt (2,0 g, 0,019 Mol) verbunden und das Produkt wurde wie oben beschrieben aufbereitet, um 8,8 g von 111 zu ergeben (Ausbeute: 82,4%). Schmelzpunkt 107º- 108ºC (Zersetzung) R¹f, 0,44; R²f 0,75. Berechnete Analyse für C&sub3;&sub2;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub1;&sub0;: C 60,83; H 7,81; N 11,08%. Gemessen: C 61,12; H 8,06; N 11,06%.

Boc-Gly-Val-Gly-Ile Pro-OH (IV):

111 (7,8 g, 0,0123 Mol) wurde in Essigsäure (80 ml) eingebracht und in Anwesenheit von 10% Pd-C (1 g) bei 40 Psi hydriert. Nach Abfiltern des Katalysators mit Hilfe von Kieselgur wurde das Lösungsmittel unter Unterdruck entfernt, mit Ether zerkleinert, gefiltert, mit Ether, dann mit Petrolether gewaschen und getrocknet, um 6,5 g des Produkts zu erhalten (Ausbeute 97,3%), Schmelzpunkt: Schrumpft bei 127ºC und zersetzt sich bei 145ºC. R³f, 0,24; R&sup4;f, 0,11. Berechnete Analyse für C&sub2;&sub5;H&sub4;&sub3;N&sub5;O&sub1;&sub0;· H&sub2;O: C 54,52; H 8,05; N 12,71%. Gemessen: C 54,32; H 8,02; N 12,59%.

Boc-Gly-Val-Gly-Ile-Pro-ONp (V):

IV (5,41 g, 0,01 Mol) in Pyridin (40 ml) wurde mit bis (p-Nitrophenyl)carbonat (4,56 g, 0,015 Mol) zur Reaktion gebracht, die Vollständigkeit der Reaktion durch TLC verfolgt. Pyridin wurde beseitigt, der Rückstand wurde in CHCl&sub3; eingebracht und mit Säure und Base extrahiert. Der erhaltene p-Nitrophenylester wurde auf einer Silicagel- Säule (200-400 mesh) chromatographiert. Nach anfänglichem Auswaschen mit CHCl&sub3; wurden durch Elution mit 35% Aceton in CHCl&sub3; 4,8 g von V erhalten (Ausbeute: 71,4%), Schmelzpunkt: 97º-100ºC. R²f 0,72; R&sup4;f 0,75; berechnete Analyse für C&sub3;&sub1;H&sub4;&sub6;N&sub6;O&sub1;&sub2;·2H&sub2;O: C 53,28; H 7,21; N 12,02%. Gemessen: C 53,76; H 6,83; N 12,01%.

H- (Gly-Val-Gly-Ile-Pro)n-OH(IV):

Die Boc-Gruppe wurde von V (3,8 g, 0,0057 Mol) durch 45minütiges Reagieren mit TFA (35 ml) entfernt. TFA wurde unter Unterdruck entfernt, mit Ether zerkleinert, gefiltert, mit Ether und Petrolether gewaschen und getrocknet. Das TFA-Salz (3,38 g, 0,0049 Mol) in DMSO (4,9 ml) wurde 14 Tage lang in Gegenwart von NMM (0,86 ml, 0,0078 Mol) gerührt. Nach Verdünnen mit Wasser in kaltem Zustand wurde das Polypeptid unter Verwendung einer Dialyseleitung mit 50 kD-Sperre bei täglichem Wasserwechsel 15 Tage lang dialysiert. Das Retentat wurde lyophylisiert, um 1,18 g des Ile¹-Polypentapeptids zu liefern. (Ausbeute 88%). Das Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum ist in Fig. 1 zusammen mit dem des gewöhnlichen Polypentapeptids zum Vergleich dargestellt.

Koazervierungstemperaturprofile

Die Temperaturabhängigkeit der Aggregation des Polypentapeptids wird verfolgt über die Entwicklung der Trübung bei 300 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers vom Typ Cary 14. Die Probenzelle wird in einer mit 300 Hz schwingenden Kammer angebracht, um das Gleichgewicht zu erleichtern und um zu vermeiden, daß die Aggregate sich setzen. Die Abtastrate beträgt 30ºC pro Stunde und die Temperatur wurde gesteuert durch eine Programmsteuerung vom Typ Neslab ETP-3 und überwacht mit einem an der Zelle angebrachten Thermoelement-Monitor vom Typ Omega 199A. Die temperaturabhängige Trübung liefert ein Koazervierungstemperaturprofil, das sich als konzentrationsabhängig herausstellt. Wenn die Konzentration erhöht wird, verschiebt sich das Profil zu tieferen Temperaturen, bis weitere Erhöhungen der Konzentration zu keiner weiteren Abnahme der Aggregationstemperatur führen. Hierdurch ist die obere Konzentrationsgrenze definiert. Die Temperatur, bei der an der oberen Konzentrationsgrenze Koazervierung einsetzt, fällt zusammen mit der Temperatur, bei der der Übergang im Koazervat selber einsetzt, auch wenn keine merkliche Veränderung des Wassergehalts des Koazervats vorhanden ist. Es wurde gezeigt, daß die Temperatur des Mittenpunkts des Temperaturprofils bei der oberen Konzentrationsgrenze mit dem Molekulargewicht dem Polypentapeptids korreliert ist. Wenn bei PPP der Mittenpunkt bei 25ºC liegt, ist das Molekulargewicht nahe bei 100.000 Dalton, nach Dialyseeichung. Bei Ile¹-PPP ist bei einem Mittenpunkt von 9ºC das Molekulargewicht größer als 50.000 Dalton, da das synthetische Polypeptid von einer 50.000 Dalton-Dialysemembran zurückgehalten wurde. Diese Dialyse wurde durchgeführt bei 4ºC, wo Ile¹-PPP sich in Lösung befindet.

Messungen des Zirkulardichroismus

Zirkulardichroismus-Untersuchungen wurden mit einem Spektropolarimeter vom Typ Cary 60 durchgeführt, das mit einem für die Modulation des links und rechts polarisierten Lichtes mit 330 Hz modifizierten Zusatzgerät Modell 6001 CD ausgerüstet war. Eine Konzentration von 0,025 mg Ile¹-PPP pro ml doppelt destillierten Wassers wurde in einer Zelle mit 10 ml Weglänge charakterisiert. Die niedrige Konzentration wurde verwendet, um die Größe des Aggregats so klein zu halten, daß keine Verzerrungen der CD-Spektren durch Lichtstreuung auftraten. Selbst bei dieser niedrigen Konzentration war bei diesem stärker hydrophoben Polypentapeptid oberhalb von 35ºC die Größe der Aggregate ausreichend, um Teilchenverzerrungen zu verursachen, wie durch die Rotverschiebung und Dämpfung der langwelligen negativen Bande deutlich wurde. Die Temperatur der Zelle wurde gesteuert und überwacht wie bei den Koazervierungstemperaturprofilen.

Bildung der Elastomer-Matrix

Bei der Vorbereitung der Quervernetzung durch γ-Bestrahlung (dem Mittel zum Bilden der Elastomer-Matrix) wurden 130 mg des Peptids Ile¹-PPP in 220 mg Wasser in einem Kryoröhrchen (cryotube) gelöst. Die Probe wurde dann bei 0ºC in einer zuvor beschriebenen Anordnung aus Stampfer und Kryoröhrchen scherungsorientiert. Die γ-Bestrahlung wurde durchgeführt beim Auburn University Nuclear Science Center mit einer Dosisrate von ca. 8.000 Röntgen/Min. und mit einer ausreichenden Dauer, um eine absorbierte Strahlungsdosis von 20· 10&sup6; (20 Mrad) zu erreichen.

Thermoelastizitätsuntersuchungen

Thermoelastitzitätsuntersuchungen wurden mit einem in diesem Labor gebauten Lastverformungsinstrument durchgeführt. Die Probe wurde in zwei Delrin-Klammern montiert. Die obere Klammer ist an einem Dehnungsmeßgerät von Typ Statham UTC angebracht und die Anordnung ist fixiert. Die untere Klammer ist an einer beweglichen Plattform angebracht, die von einem Motor mit veränderlicher Geschwindigkeit angetrieben wird. Beide Klammern sind von einer thermostatierten Wasserhülle umgeben. Eine innere Kammer enthält das Lösungsmittel, in dem das Elastomer eingetaucht ist, und das in diesem Fall doppelt destilliertes Wasser ist. Die Probe wurde in der oberen Klammer befestigt und in Wasser bei 60ºC ca. eine Stunde ins Gleichgewicht kommen gelassen. Die Signalanpassungsvorrichtung des Dehnungsmeßgerätes wurde auf Nullkraft abgeglichen und die untere Klammer wurde an der Probe befestigt. Über Nacht ließ man die Probe bei Zimmertemperatur zur Ruhe kommen. Dann wurde die untere Klammer auf Nullkraft eingestellt und der Abstand zwischen den Klammern wurde gemessen. Das Elastomer wurde bei 5ºC auf 40% Dehnung gestreckt und die Elastomerkraft wurde dann als Funktion der Temperatur gemessen. Die Gleichgewichtszeit zum Erzielen einer konstanten Kraft bei einer gegebenen Temperatur betrug typischerweise 24 Stunden. Kraftmessungen wurden in 2ºC-Schritten im Bereich des starken Kraftanstiegs und in 5ºC-Schritten bei höheren Temperaturen durchgeführt.

Ergebnisse

Koazervierungstemperaturprofile

Ile¹-PPP kann in stehendem Wasser unterhalb 8ºC gelöst werden. Beim Anheben der Temperatur der Lösung auf über 8ºC wird die Lösung wolkig; beim Stehen bei der erhöhten Temperatur tritt eine Absetzung auf und eine viskoelastische Phase bildet sich am Boden des Gefäßes; wenn das Gefäß in ein Eisbad gesetzt wird, klärt die Trübung sofort auf und die viskoelastische Phase löst sich bereitwillig auf. Somit koazerviert in Wasser gelöstes Ile¹-PPP. Die Koazervierungstemperaturprofile (Trübungsprofile) sind in Fig. 2 A für unterschiedliche Konzentrationen gezeigt. Bei Erhöhung der Konzentration verschiebt sich das Temperaturprofil zu einer tieferen Temperatur. Bei 40 mg/ml, der oberen Konzentrationsgrenze (d. h. der niedrigsten Konzentration, bei der weitere Konzentrationssteigerungen keine weitere Absenkung der Temperatur des Aggregationsansatzes bewirkt), liegt der Mittenpunkt des Koazervierungstemperaturprofils von Ile¹- PPP bei 9ºC.
In Fig. 2 A sind zum Vergleich die Daten von Elastin-PPP enthalten, die zeigen, daß der Mittenpunkt des Temperaturprofils an der oberen Konzentrationsgrenze bei 25ºC liegt. Die einfache Zufügung einer CH&sub2;-Gruppe zu der 409 Dalton schweren sich wiederholenden Einheit verursacht, daß der Ansatz der Aggregation sich um 16ºC zu tieferen Temperaturen verschiebt. Die Beobachtung, daß Kurve f (0,1 mg Ile¹- PPP/ml) und Kurve k (1,0 mg PPP/ml) bezüglich der oberen Konzentrationsgrenzen für jedes Polymer mit hohem Molekulargewicht vergleichbar sind, liegt die Erklärung nahe, daß die Größe des Aggregats bei Ile¹-PPP für eine gegebene Konzentration größer ist als für eine vergleichbare Konzentration von PPP. Dies ist relevant für Vergleiche der Zirkulardichroismusdaten.

Zirkulardichroismus

Fig. 3 zeigt Zirkulardichroismuskurven für Ile¹-PPP in Wasser (0,025 mg/ml) bei 2ºC und bei 35ºC. Die niedrige Konzentration wurde gewählt, damit die Größe des durch Assoziation bei 35ºC gebildeten Aggregats zu begrenzten Teilchenverzerrungen im CD-Spektrum führte. Bei niedrigerer Temperatur tritt eine starke negative Bande bei 195 nm auf. Eine solche negative Bande ist charakteristisch für ungeordnete Proteine und Polypeptide, obwohl ein Standardwert für vollständige Unordnung eher bei -4·10&sup4; als beim beobachteten Wert von -1,2·10&sup4; liegt. Auch die negative Bande bei 220 nm, anstelle verschwindender Elliptizität oder einer positiven Bande, die als Hinweise auf vollständige Unordnung gesehen werden, weist auf Ordnungselemente bei niederer Temperatur hin. Die Intensitätsabnahme der negativen CD-Bande bei 195 nm bei Erhöhung der Temperatur von Ile¹-PPP in Wasser weist hin auf eine Zunahme der intramolekularen Ordnung mit Erhöhung der Temperatur, d. h. es tritt ein inverser Temperaturübergang in einem wäßrigen System auf. Dies weist darauf hin, daß bei Ausbildung des geordneten Zustandes hydrophobe Wechselwirkungen sich entwickeln. Die Zunahme der intramolekularen Ordnung beginnt knapp oberhalb 0ºC und ist bei einer Konzentration von 0,025 mg/ml bei ca. 30ºC beendet. Wie aus den Daten in Fig. 2 A deutlich wird, wäre der Übergang bei einer tieferen Temperatur beendet gewesen (der Übergang wäre schärfer gewesen), wenn die CD-Daten bei einer höheren Konzentration ohne signifikante Teilchenverzerrung hätten aufgenommen werden können. Zum Vergleich ist in Fig. 2 B der Wert von [R]&sub1;&sub9;&sub7; als Funktion der Temperatur für PPP in Wasser (2,3 mg/ml) gezeigt, wo zu sehen ist, daß der Übergang um etwa 15ºC zu höheren Temperaturen verschoben ist. Fig. 3 zeigt wiederum zum Vergleich die CD-Spektren für PPP (0,023 mg/ml) bei 15ºC unterhalb der Einsatztemperatur des Übergangs und bei 47ºC, wo der Übergang bei dieser niedrigen Konzentration weitgehend beendet ist. Es wird deutlich, daß Ile¹-PPP und PPP im wesentlichen identische Konformationen unterhalb der Einsatztemperatur des Übergangs haben, und daß sie im wesentlichen identische Konformationen haben, nachdem der Übergang im wesentlichen beendet ist. Während also im wesentlichen identische Konformationen erhalten bleiben, was auch durch die Aufrechterhaltung der β-Verzweigung unterstützt wird, verschiebt die Hinzufügung einer CH&sub2;-Gruppe den Übergang zu erhöhter Ordnung um ungefähr 15ºC nach unten.

Charakterisierung der Elastizität

Der für mit 20 Mrad quervernetztes Ile¹-PPP-Koazervat bestimmte (Young'sche) Elastizitätsmodul betrug 4·10&sup5; Dyn/cm², was im Bereich der für mit 20 Mrad quervernetztes PPP erhaltenen Werte liegt. Der Wertebereich ist verursacht durch variable Vakuolenbildung, die während der γ-Bestrahlung auftritt, und die eine genaue Messung der Querschnittsfläche erschwert. Es sollte allerdings beachtet werden, daß die γ-Bestrahlung keine durch Kohlenstoff-13- oder Stickstoff- 15 -Kernresonanzspektroskopie meßbare Polymerzerlegung bewirkt.
Die Temperaturabhängigkeit der Elastomerkraft ist in Fig. 2 C für ein Elastomerband aus Ile¹-PPP bei 40% Dehnung angegeben. Eine nahezu verschwindende Elastomerkraft wird bei 8ºC gemessen; beim Erhöhen der Temperatur tritt eine dramatische, abrupte Steigerung der Elastomerkraft auf. Volle Kraft wird bei 25ºC erreicht und wird bei weiterer Temperaturzunahme im wesentlichen konstant. Fig. 2 C enthält wiederum zum Vergleich Daten für mit 20 Mrad quervernetztes PPP-Koazervat bei 60% Dehnung. Es tritt in ähnlicher Weise ein dramatischer Anstieg der Elastomerkraft bei Temperaturerhöhung auf, doch ist diese Kurve um ca. 15ºC zu höheren Temperaturen verschoben. So zeigen die in Fig. 2 enthaltenen Ergebnisse anhand dreier physikalischer Verfahren, daß die Hinzufügung einer CH&sub2;-Gruppe (die Ersetzung von Val durch Ile) den Übergang um 15ºC zu niedrigeren Temperaturen verschiebt, ohne die Konformation des Polypentapeptids vor und nach dem Übergang zu verändern. Während die früher berichteten Daten über das natürlich auftretende Elastin-PPP eine Korrelation von erhöhter struktureller Ordnung und erhöhter Elastomerkraft demonstrierten, scheinen die Daten von Ile¹-PPP mit dem um 15ºC verschobenen Übergang eine zwangsläufige Kopplung von erhöhter Ordnung und erhöhter Elastomerkraft zu bestätigen.
Tatsächlich wird die Korrelation von erhöhter Ordnung und erhöhter Elastomerkraft bei dem PPP beobachtet. Wenn der Übergang zu niedrigeren Temperaturen verschoben ist, wie bei Ile¹-PPP, dann verschiebt sich dementsprechend auch die Entwicklung der Elastomerkraft zu tieferen Temperaturen. Es scheint bei solchen elastomeren Polypeptiden eine strikte Kopplung zwischen zunehmender Ordnung und zunehmender Elastomerkraft zu bestehen; und anhand der Molekularstruktur kann verstanden werden, wie dies auftreten kann. Die ähnlichen Konformationen von PPP und Ile¹-PPP (siehe Fig. 3) und die ähnlichen Elastizitätsmodule der zwei Polymere weisen darauf hin, daß diese offenbar keine Faktoren für die evolutionäre Beibehaltung von (VPGVG)n sind. Was nun deutlich wird, ist, daß sogar die subtile Hinzufügung z. B. einer CH&sub2;-Gruppe, obwohl sie wenig Auswirkungen auf die Stereochemie recht ungenauer und wenig einschränkender hydrophober Assoziationen hat, eine signifikante Wirkung auf die Thermodynamik hat. Der größere Clathtrat-artige Käfig aus Wasser, der die Ile¹-Seitenkette umgibt, liefert ein größeres ΔS, wenn das die Seitenkette umgebende stärker geordnete Wasser zu weniger geordnetem Volumenwasser wird, so daß bei dem Übergang ΔH = TΔS bei einer tieferen Temperatur gilt. Durch kalorimetrische Mittel ist ΔH bei PPP auf 5 bis 6 Kalorien pro g abgeschätzt worden, was ungefähr 2 kcal pro Mol Pentamer entspricht. Somit braucht die Zunahme der Entropieänderung nur ca. 5% zu betragen, um eine Absenkung der Übergangstemperatur um 15ºC von 298 K auf 283 K zu bewirken. Bei Verwendung bekannter Hydrophobizitätsskalen für Aminosäuren betragen die Hydrophobizitäten, angegeben als freie Energie, skaliert in Kcal/Mol, -4,10 bei VPGVG und -5,38 bei IPGVG. Zwar ist zu erwarten, daß das Ausmaß der verwendeten Hydrophobizität von der Stereochemie des stärker geordneten Polypeptidzustands abhängt, doch es scheint, daß nicht der ganze mögliche Effekt tatsächlich verwirklicht wird.
Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist nun herausgefunden worden, daß der oben beschriebene Hydrophobieeffekt bei Übergangstemperaturen auch beim Elastin- Polytetrapeptid (Val¹-Pro²-Gly³-Gly&sup4;)n auftritt. Das bedeutet, es ist entdeckt worden, daß auch PTP mit hohem Molekulargewicht eine reversible temperaturgesteuerte Aggregation erfährt, wobei die Aggregation bei 48ºC anstelle von 24ºC, wie bei PPP mit hohem Molekulargewicht, einsetzt.
Es ist jedoch auch festgestellt worden, daß der inverse Temperaturübergang bei PTP erst bei 70ºC vollständig ist. Diese hohe Übergangstemperatur läßt sich offenbar erklären, wenn die niedrigere Hydrophobizität von PTP im Vergleich zu PPP berücksichtigt wird.
Z. B. betrüge bei Verwendung von Bull-Breese-Hydrophobizitätsskalen, bei denen die Hydrophobizität des Gly-Restes zu Null gesetzt ist, die freie Transferenergie des Pentamers VPGVG -4100 cal/Mol, wohingegen die des Tetramers VPGG -2540 cal/Mol betrüge. Wenn also die Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit der bestimmende Faktor ist, dann läge der inverse Temperaturübergang für PTP bei einer höheren Temperatur als bei PPP. Wenn außerdem der inverse Temperaturübergang (die Zunahme der intramolekularen Ordnung) für die Entwicklung der Elastomerkraft erforderlich ist, dann würde man erwarten, daß die Temperaturabhängigkeit der Elastomerkraft der PTP-Matrix eine ähnliche Verschiebung zu höheren Temperaturen im Vergleich zu derjenigen der PPP-Matrix zeigt.
Dieser inverse Temperaturübergang ist tatsächlich bei PTP in der Nähe von 50ºC zentriert, um ca. 25ºC höher als der von PPP. Bei Ile¹-PTP ist er zu einer etwa 30ºC niedrigeren Temperatur verschoben als bei PTP. Außerdem wurde festgestellt, daß die Entwicklung von Elastomerkraft bei Erhöhung der Temperatur in ähnlicher Weise bei der PTP-Matrix (20 Mrad quervernetzt) im Vergleich zur PPP-Matrix (20 Mrad quervernetzt) um ca. 25ºC nach oben verschoben ist.
Angesichts des oben gesagten ist es nun möglich, durch Auswahl der geeigneten Kombination von PTP- und PPP-Matrizen oder Analoga von diesen nach der vorliegenden Erfindung die Übergangstemperatur eines Bioelastomers, das Elastin-PTP, -PPP und Analoga von diesen sowie PHP enthält, über einen Bereich von ca. 75ºC zu verschieben. Unabhängig davon, wo dieser Übergang im Bereich beispielsweise von -25ºC bei Phe¹-PPP in Wasser/Ethylenglykol bis ca. 50ºC bei PTP in Wasser auftritt, tritt eine starke Änderung der Elastomerkraft in Verbindung mit einer relativ geringen Temperaturänderung auf.
Somit können nun Bioelastomere geschaffen werden, in denen sich wiederholende Einheiten mit verringert er Hydrophobizität, wie etwa -(VPGG)n- einbezogen sind.
Insbesondere wird nach der vorliegenden Erfindung ein Bioelastomer geschaffen, das Elastomereinheiten enthält, die Tetrapeptid- oder Pentapeptid- oder durch sich wiederholende Hexapeptid-Einheiten modifizierte Einheiten von diesen sowie Gemische von diesen umfassen, wobei die sich wiederholenden Einheiten Aminosäurereste umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus hydrophoben Aminosäure- und Glycinresten besteht, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die ein Tetrapeptid mit der Formel:
-X³-(VPGG)n-Y³3umfaßt,
wobei X³ PGG, GG, G oder eine kovalente Bindung ist;
Y³ VPG, VP, V oder eine kovalente Bindung ist; und
V ein peptidbildender Rest von L-Valin ist;
P ein peptidbildender Rest von L-Prolin ist; und
G ein peptidbildender Rest von Glycin ist; und
n eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder 0 ist, mit der Maßgabe, daß X³ und Y³ zusammen eine sich wiederholende Tetramereinheit in ausreichender Menge bilden, um die Entwicklung von Elastomerkraft des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen.
Ferner wird der vorliegenden Erfindung auch ein Bioelastomer geschaffen, das Elastomereinheiten enthält, die Tetrapeptid- oder Pentapeptid- oder durch sich wiederholende Hexapeptid-Einheiten modifizierte Einheiten von diesen sowie Gemische von diesen enthalten, wobei die sich wiederholende Einheit Aminosäurereste umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus hydrophoben Aminosäure- und Glycinresten besteht, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die umfaßt:
A) ein Polypentapeptid mit der Formel:
-X¹-(IPGVG)n-Y ¹wobei X¹, Y¹, P, G, I, V und n wie oben definiert sind; und
B) ein Polypentapeptid mit der Formel:
-X²-(VPGVG)n-Y²wobei X², Y², P, G, V und n wie oben definiert sind; oder
C) ein Polytetrapeptid mit der Formel:
-X³-(VPGG)n-Y³wobei X³, Y³, P, G, V und n wie oben definiert sind, in ausreichenden Mengen, um die Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen.
Nach der vorliegenden Erfindung werden auch PTP-Analoga wie etwa Ile¹-PTP geschaffen, die zu den oben beschriebenen diversen PPP-Analoga analog sind. Dabei kann zur Herstellung der vorliegenden Bioelastomere jedes PTP-Analogon benutzt werden, das genügt, um die Hydrophobizität der sich wiederholenden Funktionseinheit wie etwa -(IPGG)n- abzuschwächen und dabei die Elastizität des Bioelastomers aufrechtzuerhalten. Demzufolge könnte angesichts der oben erläuterten Prinzipien ein Fachmann anhand dieser Offenbarung andere PTP-Analoga ausfindig machen, die in vorteilhafter Weise nach der vorliegenden Erfindung benutzt werden können.
Nach der vorliegenden Erfindung wird auch ein Bioelastomer geschaffen, das Elastomereinheiten enthält, die Tetrapeptid- oder Pentapeptid- oder durch sich wiederholende Hexapeptid-Einheiten modizifierte Einheiten von diesen sowie Gemische von diesen umfassen, wobei die sich wiederholenden Einheiten hydrophobe Aminosäure- und Glycinreste umfassen, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die ein Tetrapeptid mit der Formel:
-X&sup4;-(IPGG)n-Y&sup4;umfaßt,
wobei X&sup4;, PGG, GG, G oder eine kovalente Bindung ist;
Y&sup4;, IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung ist;
I ein peptidbildender Rest von L-Isoleucin ist,
P ein peptidbildender Rest von L-Prolin ist; und
G ein peptidbildender Rest von Glycin ist; und
n eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder 0 ist, mit der Maßgabe, daß X&sup4; und Y&sup4; zusammen eine sich wiederholende Tetramereinheit in ausreichender Menge bilden, um die Temperatur einzustellen, an der die Elastomerkraft des Bioelastomers sich entwickelt.
Natürlich liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Bioelastomere mit den oben genannten Strukturmerkmalen, die aber eine beliebige Kombination der sich wiederholenden Einheiten (IPGVG)n, -(VPGVG)-n, -(VPGG)-n, -(IPGG)-n oder andere Analoga von diesen aufweisen, wie etwa Ala³-PPP oder Phe¹-PPP.
Allgemein schließt die vorliegende Erfindung alle Bioelastomere ein, die Elastomereinheiten enthalten, die Tetrapeptid- oder Pentapeptid- oder durch sich wiederholende Hexapeptid-Einheiten modifizierte Einheiten von diesen sowie Gemische von diesen umfassen, wobei die sich wiederholenden Einheiten hydrophobe Aminosäure- und Glycinreste umfassen, wobei die sich wiederholenden Einheiten in einer Konformation mit einer β-Schleife vorliegen, die eine Tetrapeptid- oder Pentapeptid-Einheit oder eine sich wiederholende Einheit von diesen in ausreichender Menge umfassen, um die Entwicklung von Elastomerkraft des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen, mit der Maßgabe, daß die Elastizität des Bioelastomers erhalten bleibt.
Um jedoch die unterschiedlichen Aspekte der vorliegenden Erfindung bezüglich PTP klarzustellen, werden die nachfolgenden Beispiele und Diskussion geliefert. Natürlich dienen die Beispiele nur der Verdeutlichung und sollen die vorliegende Erfindung nicht einschränken.

Beispiele

Peptidsynthese

Allgemeiner Ansatz: Die Synthese von Polytetrapeptid, (VPGG)n, kann unter Verwendung einer beliebigen der folgenden Permutationen als Anfangs-Tetramereinheit durchgeführt werden: Val-Pro-Gly-Gly, Gly-Val-Pro-Gly, Gly-Gly-Val-Pro oder Pro-Gly-Gly-Val. Die erste Sequenz (VPGG) wurde in diesem Labor sowohl mit dem Aktivierungsverfahren durch Pentachlorphenylester (OPcp) als auch durch p-Nitrophenylester (ONp) verwendet, wobei letzteres Verfahren Polymer mit signifikant höherem Molekulargewicht ergab. Die Sequenz (GVPG) wurde mit OPcp-Aktivierung benutzt, doch wurde die Größe des Polymers nicht genannt. Bei der Synthese des Polypentapeptids (VPGVG)n unter Verwendung unterschiedlicher Permutationen der Pentamereinheit mit unterschiedlichen Aktivierungsgruppen für die Polymerisierung wurde beobachtet, daß das Pentamer mit Pro als C-Terminus- Aminosäure und -Onp zur Aktivierung Polymere mit hohem Molekulargewicht ergab. Ähnliche Resultate wurde im Fall der Herstellung des Polyhexapeptids (VAPGVG)n festgestellt. Daher wurde ein ähnlicher Ansatz auch im Fall von PTP als sinnvoll angesehen, d. h. eine Sequenz (GGVP) mit -ONp-Aktivierung. Zum Vergleich wurde die Polymerisierung auch mit H-VPGG-ONp, H-GVPG-ONp und H-GGVP-ONp versucht. Wie erwartet, ergab letztere Tetramersequenz ein mit TPT- Untersuchungen bestimmtes sehr hohes Molekulargewicht, und hier wird die Synthese dieses letzteren Materials, wie in Schema II gezeigt, beschrieben. Die Sequenz (PGGV) wurde nicht ausprobiert, da sie an ihrem C-Terminus eine optisch aktive und sperrige Aminosäure, nämlich Val hat.

Schema II

Synthese von H-(Gly-Gly-Val-Pro)n-OH

i) EDCI/HOBt;
ii) H&sub2;-Pd/C;
iii) IBCF/HOBt;
iv) HCl/Dioxan;
v) Bis(p-Nitrophenyl)carbonat;
vi) TFA;
vii) DMSO-NMM.
Boc-GG-OBzl (I) wurde unter Verwendung von EDCI zur Koppelung hergestellt und wurde hydriert um die Säure (II) zu liefern. Boc-VP-OBzl (III) wurde nach dem Anhydridgemisch- Verfahren in Gegenwart von HOBt synthetisiert, entblockiert und mit II unter Verwendung von EDCI-HOBt gekoppelt, um Boc-GGVP-OBzl (IV) zu erhalten. Nach Hydrieren zur Säure (V) wurde es zu -ONp (VI) durch Reaktion mit bis(p-Nitrophenyl)Carbonat umgewandelt. Nach Entfernung der Boc-Gruppe wurde der aktive Ester polymerisiert, gegen Wasser mit einem Dialyserohr mit Sperre bei Molekulargewicht 50.000 dialysiert und lyophilisiert. Zwischen- und Endprodukte wurden durch Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektroskopie, Dünnschichtchromatographie (TLC) und Elementaranalyse überprüft. Einzelheiten der Synthesen: Valin und Prolin haben L-Konfiguration. Boc-Aminosäuren wurden erworben bei Bachem Inc., Torrance, Kalifornien. HOBt wurde erworben bei Aldrich Chemical Co. Milwaukee, Wisconsin und Silikagel (Bio-sil) (200-400 mesh) wurde gekauft bei Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien. Dünnschichtchromatographieplatten kamen von Whatman Inc., Clifton, New Jersey, und die folgenden Lösungsmittelsysteme wurden zur Bestimmung der Homogenität der Produkte benutzt R¹f, CHCl&sub3;(C):MeOH (M):CH&sub3;COOH (A), 95 : 5 : 3; R²f, CMA (85 : 15 : 3); R³f, CMA (75 : 25 : 3); R&sup4;f, CM (5 : 1). Elementaranalysen wurden durchgeführt von Mic Anal, Tuscon, Arizona. Schmelzpunkte wurden bestimmt mit einem Thomas-Hoover-Schmelzpunktgerät und sind unkorrigiert.

Boc-Gly-Gly-OBzl (I):

Boc-Gly-OH (17,52 g, 0,1 Mol) in einem Gemisch aus CHCl&sub3; (50 ml) und Acetonitril (50 ml) wurde auf -15ºC gekühlt, EDCI (19,7 g, 0,1 Mol) wurde hinzugefügt und 20 Minuten lang gerührt. Diesem wurde eine vorgekühlte Lösung von H-Gly-OBzl-tosylat (37,1 g, 0,11 Mol), NMM (12,9 ml, 0,11 Mol) in CHCl&sub3; (100 ml) hinzugefügt und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in CHCl&sub3; eingebracht und mit Säure und Base extrahiert. Chloroform wurde unter Unterdruck entfernt, mit Petrolether zerkleinert, gefiltert, mit Petrolether gewaschen und getrocknet, um 30,2 g von I (Ausbeute 93,7%) zu erhalten, Schmelzpunkt 82-83ºC. R²f, 0,52; R&sup4;f, 0,82. Berechnete Analyse für C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub5;: C 59,61; H 6,88; N 8,69%. Gemessen: C 59,43; H 6,88; N 8,35%.

Boc-Gly-Gly-OH (II):

I (10 g, 0,31 Mol) in Essigsäure (100 ml) wurde bei 40 Psi in Gegenwart von 10% Pd-C-Katalysator (1 g) filtriert. Der Katalysator wurde mit Hilfe von Kieselgur abgefiltert und das Lösungsmittel unter Unterdruck entfernt. Der Rückstand wurde mit EtOAC zerkleinert, gefiltert und mit EtOAC, Petrolether gewaschen und getrocknet um 6,3 g von II (Ausbeute: 87,5%) zu ergeben. Schmelzpunkt 118º-120ºC (Zersetzung). R²f, 0,28; R³f, 0,44. Berechnete Analyse für C&sub9;H&sub1;&sub6;N&sub2;O·H&sub2;O: C 43,19; H 7,25; N 11,19%. Gemessen: C 43,53; H 7,40; N 10,90%.

Boc-Gly-Gly-Val-Pro-OBzl (IV):

III (6,0 g, 0,0148 Mol) (39) wurde mit HCl/Dioxan entblockiert und das Lösungsmittel unter Unterdruck entfernt. Der Rückstand wurde mit Ether zerkleinert, gefiltert mit Ether, dann mit Petrolether, und getrocknet. Ein sehr hygroskopisches Material wurde erhalten (4,2 g, 0,0123 Mol), das im DMF mit II (2,86 g, 0,0123 Mol) in Gegenwart von 10% Überschuß an EDCI (2,60 g) und HOBt (2,07 g) verbunden wurde. Die Reaktion wurde, wie bei I beschrieben, nachgearbeitet, um IV als weißen Schaum in quantitativer Ausbeute zu erhalten, kein scharfer Schmelzpunkt 540
62ºC. R²f, 0,42; R³f, 0,74. Berechnete Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub8;N&sub4;O&sub7;: C 60,21; H 7,38; N 10,80%. Gemessen: C 60,0; H 7,46, N 10,81%.

Boc-Gly-Gly-Val-Pro-OH (V):

IV (6,2 g, 0,120 Mol) in Essigsäure wurde hydriert und wie bei II aufbereitet, um V quantitativ zu erhalten, kein scharfer Schmelzpunkt 74º-83ºC. R³f, 0,25; R&sup4;f, 0,15. Berechnete Analyse für C&sub1;&sub9;H&sub3;&sub2;N&sub4;O&sub7;: C 51,10; H 7,67, N 12,54%. Gemessen: C. 51,28; H 7,50; N 12,38%.

Boc-Gly-Gly-Val-Pro-ONp (VI):

V (5,3 g, 0,0123 Mol) in Pyridin (30 ml) wurde mit bis(p-Nitrophenyl)Carbonat (5,64 g, 0,0185 Mol) zur Reaktion gebracht. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in CHCl&sub3; eingebracht und mit Säure und Base extrahiert. Das Peptid wurde über eine Silicagel-Säule chromatographiert und mit 35% Aceton in CHCl&sub3; eluiert, nachdem anfangs mit CHCl&sub3; eluiert worden war, um 4,7 g von VI (Ausbeute: 69,2%) zu erhalten, kein scharfer Schmelzpunkt 74º-79ºC. R²f, 0,76; R&sup4;f, 0,75. Berechnete Analyse für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub5;N&sub5;O&sub9;· H&sub2;O: C 53,75; H 6,49; N 12,53%. Gemessen: C 53,69; H 6,44;K N 12,34%.

H-(Gly-Gly-Val-Pro)n-OH (VII):

VI (4,5 g, 0,0082 Mol) in CHCl&sub3; (20 ml) wurde mit TFA (35 ml) 30 Minuten lang behandelt und das Lösungsmittel unter Unterdruck entfernt. Der Rückstand wurde mit Ether zerkleinert, gefiltert, gewaschen mit Ether, dann mit Petrolether, und getrocknet. Das TFA-Salz (3,9 g, 0,0069 Mol) wurde in DMSO (7,6 ml) und NMM (1,22 ml, 1,6 Äquivalent) 14. Tage lang gerührt. Nach Verdünnung mit kaltem Wasser wurde das Polyiner in einer Dialyseröhre mit 50 kD-Sperre dialysiert, wobei 15 Tage lang das Wasser täglich gewechselt wurde und das Retentat wurde lyophilysiert, um 1,65 g des Polytetrapeptids zu ergeben (Ausbeute: 77%). Das Kohlenstoff-13- Kernresonanzspektrum des Polymers ist in Fig. 5 gegeben. Die Zuordnungen sind alle angegeben, und es treten keine Fremdpeaks auf, wodurch die Synthese verifiziert ist.

Koazervierungstemperaturprofile

Die Polypeptid-Koazervierung in Wasser ist eine reversible Aggregation, bei der eine neue Phase mit einer unterschiedlichen Zusammensetzung gebildet wird. Die Assoziation tritt auf bei Erhöhen der Temperatur, und die Dissoziation beim Absenken. Der Koazervierungsprozeß wurde verfolgt durch Überwachung der Trübung als Funktion der Temperatur, unter Verwendung eines Spektrophotometers vom Typ Cary 14, eingestellt auf 300 nm, einem Temperaturprogrammiergerät Neslab ETP-3 mit einer Abtastrate von 30ºC/Std. und einem Thermoelement-Monitor Omega 199A. Die Probenzelle wurde in einer vibrierenden Kammer (300 Hz) angebracht, um die Aggregate am Absetzen zu hindern und das Gleichgewicht zu erleichtern. Die Koazervierungstemperaturprofile sind temperaturabhängig. Verdünnen einer hohen Konzentration führt, nachdem die obere Konzentrationsgrenze erreicht ist (ca. 40 mg/ml für elastomere Polypeptide mit hohem Molekulargewicht) zu einer Verschiebung des Trübungsprofils zu höherer Temperatur.

Zirkulardichroismusmessungen

Ein Spektropolarimeter vom Typ Cary 60 mit einem Zirkulardichroismus-Zusatzgerät Modell 6001 mit Modulation des links- und des rechtszirkular polarisierten Strahls von 330 Hz wurde benutzt, um die Zirkulardichroismusmuster von 5 mg PTP in 1 ml entionisiertem, destilliertem Wasser (Quarz- Tauchheizung) zu bestimmen. Wegen der geringeren Größe oder der relativen Transparenz der PTP-Aggregate (wie bei der quervernetzten PTP-Matrix mit einer relativ kleinen Brechungs-Index-Änderung zwischen Lösung und Matrix) im Vergleich zum PPP-System konnte die Konzentration von 5 mg/ml für die CD-Untersuchungen ohne Beeinträchtigungen durch (Teilchen-)Verzerrungen der CD-Sprektren durch Lichtstreuung verwendet werden. Dies wird deutlich aus der Überwachung der negativen Bande bei 220 nm, die gedämpft und rotverschoben wird, wenn die Teilchen-Verzerrungen signifikant werden.

Herstellung der quervernetzten PTP-Matrix

Das PTP wurde für die Quervernetzung durch γ-Bestrahlung vorbereitet, indem 130 mg des Peptids in 220 mg Wasser in einem Kryoröhrchen gelöst wurden. Das Material wurde in einer zuvor beschriebenen Stampfer-Kryoröhrchen-Anordnung über Nacht bei 40ºC scherungsorientiert. Die Probe wurde am Auburn University Nuclear Science Center γ-Strahlung mit ca. 8.000 Röntgen/Min. ausgesetzt. Die Bestrahlung war ausreichend lang, um eine absorbierte Strahlungsdosis von 20 x 106 (20 Mrad) zu erreichen.

Thermoelastizitätsmessungen

Thermoelastizitätsuntersuchungen wurden mit einem Lastverformungsgerät durchgeführt. Die Verklammerung der Probeinhalte geschah in zwei Stufen, um eine Beschädigung des Materials an der Klammerkante zu vermeiden. Die Probe wurde zunächst mit der oberen Klammer leicht gefaßt, innerhalb des Heizmantels in Wasser eingetaucht, auf 60ºC aufgeheizt und zwei Stunden ins Gleichgewicht kommen gelassen. Die aus dem Gewicht der Probe und der Klammern im Wasser zusammengesetzte gemessene kraft wurde auf 0 gesetzt. Die untere Klammer wurde dann an der Probe befestigt und beide Klammern angezogen, um die Probe festzuhalten. Die untere Klammer wurde wie bei einer Lastverformungsmessung angetrieben und bei 40% Dehnung angehalten. Kraftdaten wurden in 5ºC- Schritten aufgezeichnet, beginnend bei 70ºC und fortlaufend bis 40ºC, wo die Kraft gegen Null ging.

Ergebnisse

Koazervierungstemperaturprofile

Das Polypeptid ist in Wasser in allen Verhältnissen unterhalb 40ºC löslich. Bei Erhöhung der Temperatur über 40ºC wird die Lösung trübe, beim Stehenlassen tritt eine Setzung ein, bei der eine als Koazervat bezeichnete dichte viskoelastische Phase gebildet wird. Der Prozeß ist leicht umkehrbar; beim Absenken der Temperatur verschwindet die Trübung und das Koazervat löst sich bereitwillig wieder auf. Durch Verfolgen der Trübung als Funktion der Temperatur werden Koazervierungstemperaturprofile erhalten, die konzentrationsabhängig sind. Wenn stärker konzentrierte Lösungen verwendet werden, tritt der Einsatz der Trübung bei niedrigeren Temperaturen auf, bis weitere Konzentrationszunahme keine weitere Absenkung der Trübungseinsatztemperatur bewirkt. Die untere Konzentration, oberhalb derer die Konzentration die Trübungseinsatztemperatur nicht weiter verringert, wird obere Konzentrationsgrenze genannt. Für dieses PTP mit hohem Molekulargewicht ist die obere Konzentrationsgrenze 50 mg/ml, da 100 mg/ml dasselbe Profil ergibt. Verdünnung von 40 mg/ml bewirkt eine Verschiebung des Einsatzes zu höherer Temperatur. Diese Daten sind in Fig. 6 dargestellt, wo sie mit ähnlichen Daten für das PPP verglichen werden. Der Mittenpunkt bei der oberen Konzentrationsgrenze von PTP ist 49ºC, wohingegen der Wert für die obere Konzentrationsgrenze von PPP 25ºC beträgt. Die verringerte Hydrophobizität des Tetramers führt zu einer Steigerung der für die mit der Aggregation verknüpften hydrophoben Wechselwirkung erforderlichen Temperatur um 24ºC.

Zirkulardichroismus

Die CD-Spektren sind in Fig. 4 bei 40ºC (Kurve a) und 65ºC (Kurve b) für 5 mg/ml PTP in Wasser gezeigt. Bei der niedrigeren Temperatur tritt ein negatives Band bei 220 nm und ein zweites negatives Band im Bereich 195-200 nm auf. Letzteres Band wird als Hinweis auf Polypeptide mit begrenzter Ordnung angesehen, da angenommen wird, daß völlig ungeordnete Polypeptide ein negatives Band bei 195 nm mit einer Elliptizität von -4·10&sup4; haben. Der geringere Betrag der kurzwelligen negativen Bande bei PTP und der negativen Bande bei 220 nm zeigen eine gewisse Ordnung in PTP bei 35ºC an. Beim Erhöhen der Temperatur nimmt der Betrag der kurzwelligen negativen Bande ab, was auf einen Übergang zu größerer intramolekularer Ordnung hinweist. Dieser Übergang ist in Fig. 8 A gezeigt. Interessanter Weise entspricht sein Mittenpunkt ungefähr dem Mittenpunkt des Koazervierungstemperaturprofils (siehe Fig. 6, Kurve c) für eine vergleichbare Konzentration. Es ist wichtig, zu bemerken, daß die Änderung der intramolekularen Ordnung bei PTP den intermolekularen Wechselwirkungen vorangeht, d. h., daß er bei einer deutlich niedrigeren Temperatur beginnt als der in Fig. 6 verfolgte Aggregationsprozeß. Zum Vergleich zeigt Fig. 7 die CD-Spektren von PPP, wo eine analoge Änderung der Spektren beobachtet wird. In diesem Fall ist jedoch die negative Bande bei 195 nm wesentlich intensiver, was der Übergang zu größerer Ordnung bei Temperaturerhöhung deutlicher macht. In Fig. 8 A ist der inverse Temperaturübergang von PPP zum Vergleich mit dem PTP-Übergang aufgetragen. Wie bei den Aggregationsdaten (siehe Fig. 6) ist der Mittenpunkt der Temperatur für den intrarnolekularen Übergang bei PTP um ca. 25º zu höheren Temperaturen im Vergleich zu dem von PTP verschoben. Somit ist der intramolekulare Ordnungsvorgang bei PTP aufgrund der im Vergleich zum Pentamer verringerten Hydrophobizität des Tetramers zu höheren Temperaturen verschoben. Thermoelastizitätsdaten
Die Temperaturabhängigkeit der Elastomerkraft (Thermoelastizitätsdaten) ist in Fig. 8 B für mit 20 Mrad quervernetztes PTP bei einer Dehnung von 40% aufgetragen. Diese Matrix weist unterhalb 40ºC sehr geringe Elastomerkraft auf. Wenn die Temperatur über 40ºC angehoben wird, erreicht die Elastomerkraft einen Maximalwert nahe bei 70ºC. Fig. 8 B enthält zum Vergleich auch die Thermoelastizitätsdaten für mit 20 Mrad quervernetzte PPP-Matrix, die einen ähnlichen Übergang zeigen, der aber um 20º-25ºC zu niedrigeren Temperaturen verschoben ist. Die Entwicklung der Elastomerkraft ist genau wie die Temperaturabhängigkeit der Koazervierung (siehe Fig. 6) und der Elliptizität bei PTP um 25ºC gegen die Werte von PPP verschoben. Diese Eigenschaften sind eine Funktion der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit. Von besonderem Interesse ist der Vergleich der Elliptizitätsdaten von PTP mit den Thermoelastizitätsdaten von PTP in Fig. 8. Der über die Elliptizität, ein Maß für intramolekulare Ordnung, verfolgte Übergang beginnt im Bereich 35º-40ºC, und ähnlich beginnt die Elastomerkraft knapp unterhalb 40ºC, sich zu entwickeln. Bei beiden physikalischen Messungen ist der Übergang bei 70ºC im wesentlichen vollständig. Es besteht eine enge Parallelität zwischen der Zunahme der intramolekularen Ordnung und der Zunahme der Elastomerkraft. Da die intermolekularen Aggregationsprozesse, verfolgt über die Trübung, bis nahezu 50ºC nicht signifikant werden, scheint es, daß die PTP-Matrix eine Abgrenzung zwischen intramolekularen und intermolekularen Prozessen hinsichtlich des Ursprungs der Elastomerkraft zuläßt.
Die Strukturmerkmale von PTP scheinen denen von PPP sehr ähnlich zu sein. Z.B. ist offensichtlich, daß dieselben Prinzipien wie für PPP wirksam sind. Die Typ II-Pro²-Gly³ β-Schleife ist das dominante sekundäre Strukturmerkmal und der Ordnungsprozeß ist der eines inversen Temperaturübergangs mit Optimierung intramolekularer hydrophober Wechselwirkungen bei Erhöhung der Temperatur. Die Perspektive zeigt wieder eine offene Helix mit β-Schleifen- Abstandhaltern zwischen Schleifen der Spirale und mit Val- und Pro-Seitenketten, die die intramolekularen hydrophoben Kontakte herstellen. Das suspendierte Segment ist zwangsläufig kürzer und die Librationsbewegung ist konzentriert auf die Gly&sup4;-Val¹-Peptidgruppe. Basierend auf dem zyklischen Konformationskorrelat wird es etwa vier Tetramere pro Schleife der PTP-β-Spirale geben, im Gegensatz zu den ca. drei Pentameren pro Schleife der PPP-β-Spirale.

Wirkung der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit

Daß die Übergänge zu erhöhter Elastomerkraft tatsächlich von der Hydrophobizität des aufbauenden Peptids abhängige inverse Temperaturübergänge sind, wird deutlich aus der Richtung der Verschiebung des Übergangs bei Änderung der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit. Wenn die hydrophobe Einheit stärker hydrophob wird, verschiebt sich die Übergangstemperatur zu niedrigeren Werten. Bei Verwendung der Nozaki-Tanford-Bull-Breese-Hydrophobizitätsskala hätte das Pentamer (VPGVG) eine freie Transferenergie von -4100 cal/Mol, wohingegen die des Tetramers (VPGG) -2540 cal/Mol betrüge. Beim Übergang ist ΔH = TΔS, und bei gegebenen All wäre eine höhere Temperatur erforderlich, wenn die ΔS erzeugende Hydrophibizität geringer wäre. Die Daten in Fig. 7 und 8 zeigen, daß die verringerte Hydrophobizität des Tetramers eine höhere Temperatur für den Übergang erfordert als bei dem stärker hydrophoben Pentamer. Diese Feststellung steht in Einklang mit den oben erwähnten mit Ile¹-PPP-erhaltenen Ergebnissen. Wenn (IPGVG)n oder Ile¹-PPP hergestellt wird, koazerviert das Ile¹-PPP, die intramolekulare Ordnung nimmt bei Erhöhung der Temperatur zu und die Ile¹-PPP-Matrix erhöht ihre Elastomerkraft bei Erhöhung der Temperatur, doch der Übergang ist auf 9ºC verschoben. Die Hydrophobizität dieses Pentamers (IPGVG) beträgt -5380 cal/Mol. Die in Fig. 9 aufgetragene Skala ermöglicht den Vergleich der Übergangstemperatur für die drei Polypeptidelastomere und der Hydrophobizitäten der sich wiederholenden Einheit. Nicht nur die Richtung der Verschiebung ist korrekt, sondern auch das Ausmaß der Verschiebung stimmt ungefähr. Offensichtlich ist der inverse Temperaturübergang, der zu intramolekularer Ordnung und Elastomerkraft führt, der Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit proportional, und der genaue Vergleich der Übergänge in Fig. 7 und 8 zeigt, daß der intramolekulare Prozeß unter Verwendung hydrophober Wechselwirkungen für die Entwicklung der Elastomerkraft verantwortlich ist. Die Elastomere nach der vorliegenden Erfindung können eine große Vielfalt funktioneller sich wiederholender Einheiten umfassen, um eine große Variationsbreite der Temperatur des Elastomerkraftaufbaus zu ermöglichen.
Z.B. gehören zu den vorliegenden Bioelastomeren solche mit irgendeiner der folgenden sich wiederholenden Einheiten, wie oben definiert:
-X¹-(IPGVG)n-Y¹
-X²-(VPGVG)n-Y²2-X³-(VPGG)n-Y³-X&sup4;-(IPGG)n-Y&sup4;-,
allein oder in Kombination miteinander, um dem Bioelastomer die Fähigkeit zu verleihen, bei einer vorgegebenen Temperatur nahezu maximale Elastomerkraft zu entwickeln.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen alle Analoga von PPP und PTP und Kombinationen von diesen, die die Hydrophobizität der sich wiederholenden PPP- und PTP-Einheit oder -Einheiten modulieren, ohne in unpassender Weise die Bildung der viskoelastischen Phase oder die Librationsbewegung des Polypeptids, d. h. die Elastizität zu beeinträchtigen. Andere Beispiele solcher Analoga und Kombinationen von diesen sind Sequenzen wie:
-(IPGVG-Q-VPGVG)-n
-(VPGVG-Q-VPGG)-n
-(IPGVG-Q-VPGG)-n
-(VPGVG-Q-IPGG)-n
-(IPGVG-Q-IPGG)-n
-(VPGG-Q-IPGG)-n,
wobei Q entweder eine direkte kovalente Bindung oder ein oder mehrere eingestreute Aminosäurereste ist, die beliebige Reste sein können, die die Elastizität des Polypeptids nicht beeinträchtigen.
Natürlich kann die sich wiederholende Pentapeptid-Sequenz sowie die sich wiederholende Tetrapeptid-Sequenz weitgehend substituiert werden, um die Hydrophobizität der sich wiederholenden Einheit zu modifizieren, so lange die Elastizität des Bioelastomers erhalten bleibt. Z.B. kann die einbezogene sich wiederholende Pentapeptid-Einheit die allgemeine Formel:
-(R&sub1;PR&sub2;R&sub3;)-n
haben, wobei R&sub1; ein peptibildender Rest, ausgewählt aus der Gruppe von Phe, Leu, Ile und Val ist; R&sub2; ein solcher aus der Gruppe von Ala und Gly ausgewählter Rest ist; und R&sub3; ein aus der Gruppe bestehend aus Phe, Leu, Ile und Val ausgewählter Rest ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis ca. 200 ist; und wobei P ein L-Prolin-erzeugender Rest und G ein Glycin-erzeugender Rest ist. Es können im Rahmen der Erfindung "Homopolymere" der obigen Pentamersequenz oder "Copolymere" der obigen Sequenz in Verbindung mit anderen sich wiederholenden Einheiten verwendet werden.
Allgemein können auch sich wiederholende Tetrapeptid-Einheiten mit der Formel:
-(R&sub1;PGG)-n
verwendet werden, wobei R&sub1; und n wie oben für die Pentamer- Sequenzen definierte sind. Diese Einheiten können in die vorliegenden Bioelastomere in ausreichender Menge einbezogen sein, um die Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen.
Allgemein können Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung ein "Homopolymer" einer funktionellen sich wiederholenden Einheit wie etwa Phe¹-PPP, Ala³-PPP, Ile¹-PPP oder Ile¹-PTP sein, oder sie können ein "Copolymer" mit der allgemeinen Formel -(Sa-Tb)-n sein, wobei entweder S oder T eine funktionelle sich wiederholende Einheit darstellt, die entworfen ist, um die Temperatur der Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers zu modifizieren oder zu verschieben, wohingegen die jeweils andere von S oder T eine andere sich wiederholende Einheit des Bioelastomers darstellt. Wie gesagt, können solche "Copolymere" vom Block- oder vom Zufallstyp sein, was bedeutet, daß a und b jeweils 1 oder eine größere ganze Zahl sein können.
Ferner kann bei diesen "Copolymeren" mehr als eine funktionelle sich wiederholende Einheit verwendet werden, um die Temperatur der Elastomerkraftentwicklung zu modifizieren. Es können also beide Einheiten -S und -T in der obigen Formel solche sich wiederholenden Einheiten sein, z. B. -(IPGVG)- und -(VPGVG)-.
Natürlich können sowohl S als auch T aus einer Untergruppe sich wiederholender Einheiten Si, Sii und Siii bestehen. Z.B. könnten drei S-Untergruppen PPP-Analoga wie (IPGVG), (FPGVG), wobei F die Einbuchstabenabkürzung für Phe ist, oder (VPAVG) sein.
Jede der sich wiederholenden S- oder T-Einheiten ist vorzugsweise im Molbereich von 1 bis 99% enthalten. Weiter bevorzugt ist ein Gehalt an diesen Einheiten im Molbereich von 5-95%. Der tatsächliche molare Gehalt an einer beliebigen Zahl unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten ist direkt proportional zu den gewünschten Übergangstemperaturen unter Verwendung der Hydrophobizitätsskalen wie in Fig. 9.
Die vorliegenden Bioelastomere können auf eine Vielzahl unterschiedlicher Weisen vorteilhaft genutzt werden, die nun beschrieben werden.
Erstens können die vorliegenden Bioelastomere für die Herstellung synthetischen Gefäßgewebes oder von Gefäßprothesen benutzt werden. Allgemein können solche synthetischen Materialien nach den Verfahren der US-Patente 4 485 227 und 4 550 447 gebaut werden, die beide zur Gänze hier einbezogen sind.
Außerdem können die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung offenbar zur Bildung piezoelektrischer Hochfrequenzvorrichtungen verwendet werden, unter Verwendung der Kombination aus einer dielektrischen Relaxationszelle, einer Frequenzquelle und einer Kraftmeßvorrichtung.
Im wesentlichen kann eine dielektrische Relaxationszelle nach herkömmlicher Technik konstruiert werden, mit der Ausnahme, daß bei Verwendung der vorliegenden Bioelastomere ein durchgehender rechteckiger Schlitz durch die Zelle verläuft. Das durch γ-Bestrahlung quervernetzte Elastomer verläuft durch den Schlitz und ist an jedem Ende zur Kraftmessung befestigt.
Zusätzlich wurde festgestellt, daß die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung für die Bildung piezoelektrischer Hochfrequenzvorrichtungen benutzt werden können. Insbesondere bei Frequenzen von ca. 10 MHz können die vorliegenden Bioelastomer-Peptide einem elektrischen Wechselfeld folgen, wodurch Sättigung und Synchronisierung der Librationsbewegung der Elastomere, die als verantwortlich für die Elastomerkraft angesehen wird, eine starke Auswirkung auf das Ausmaß der Elastomerkraft hätte. Dies ist im Grunde ein hochfrequenz-piezoelektrischer Effekt. Ferner haben die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung die erforderlichen Eigenschaften Elastizität und hohe Dielektrizitätskonstante und hätten bei Dehnung eine axiale Orientierung, auch ohne Strömungsorientierung vor der Quervernetzung, wie sie auch für den piezoelektrischen Effekt erforderlich ist.
Folglich können die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung auch zur Bildung einer piezoelektrischen Vorrichtung nach den Verfahren des US-Patents 4 565 943 verwendet werden, das hierin zur Gänze einbezogen ist.
Interessanterweise wurde festgestellt, daß die vorliegenden Bioelastomere Radarabsorptionseigenschaften haben. Im Einklang damit können die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung zur Bildung radarabsorbierender Oberflächen nach dem US-Patent 4 034 375 verwendet werden, das hierin zur Gänze einbezogen ist.
Schließlich können, wie oben gesagt, die vorliegenden Bioelastomere zur Herstellung von synthetischem Gefäßgewebe verwendet werden. Die Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung liefern allerdings synthetische Gefäßmaterialien mit außergewöhnlichen Eigenschaften.
Insbesondere ist gezeigt worden, daß bestimmte sich wiederholende Elastin-Sequenzen chemotaktisch für Fibroblastenzellen sind, die die Fähigkeit haben, Elastin zu synthetisieren. So zeigen
Fibroblasten aus dem Ligamentum nuchae Chemotaxie gegenüber der sich wiederholenden Hexapeptid- Sequenz -(VGVAPG)- des Elastins, wobei die stärkste Reaktion bei einer Hexapeptid-Konzentration in Lösung von ungefähr 10&supmin;&sup9;M festgestellt wurde. In ähnlicher Weise sind auch die sich wiederholende Nonapeptid-Sequenz -(AGVPGFGVG)- und ihre Permutation -(GFGVGAGVP)- Chemoattraktoren für Fibroblasten des Ligamentum nuchae, wobei maximale Reaktionen bei jeder Sequenz bei Nonapeptid-Konzentrationen von ca. 10&supmin;&sup9;M in Lösung auftreten.
In Anbetracht dessen wird speziell die Möglichkeit betrachtet, daß die vorliegenden Bioelastomere ausreichende Mengen der genannten sich wiederholenden Hexapeptid- und Nonapeptid-Sequenzen aufweisen können, um das synthetische Gefäßgewebe für Fibroblasten-Zellen chemotaktisch zu machen. Diese sich wiederholenden Hexapeptid-Sequenzen können in die vorliegenden Bioelastomere mit herkömmlichen Peptid-Synthesereaktionen einbezogen werden, die Peptid- Chemikern wohlbekannt sind, so wie oben für die PPP- und PTP-Analoga beispielhaft beschrieben. Natürlich können diese Sequenzen, wie oben gesagt, als intakte Hexapeptid- oder Nonapeptid-Sequenzen den Bioelastomeren zugefügt werden, oder sie können durch schrittweise Anfügung jeweils eines einzelnen Aminosäurerestes durch automatisierte Festphasensynthese erzeugt werden.
Die genaue Menge von in das Bioelastomer einbezogenen chemotaktischen Sequenzen hängt natürlich von der gewünschten Reaktionsintensität ab. Damit das synthetische Gefäßgewebe ausreichende Fibroblasten-Chemotaxie aufweist, ist im allgemeinen wünschenswert, daß die gesamte Peptid-Sequenz des Bioelastomers mindestens 10&supmin;¹¹ Mol% chemotaktischer Sequenzen enthält. Andererseits wird es normalerweise nicht notwendig sein, ca. 1 Mol% chemotaktischer Sequenzen, bezogen auf den gesamten Peptidgehalt zu überschreiten. Diese Menge kann allerdings leicht durch Experimente angepaßt werden, um so die optimale erforderliche Menge zu ermitteln.
Es wird auch darauf hingewiesen, daß der Ausdruck "und durch Hexapeptid-Einheiten modifizierte Einheiten von diesen" sich auf die Tatsache bezieht, daß die sich wiederholenden Tetrapeptid- und Pentapeptid-Einheiten der vorliegenden Bioelastomere durch Hinzufügung sich wiederholender Hexapeptid-Einheiten zu diesen modifiziert werden können, mit dem Zweck, die mechanische Festigkeit des Bioelastomers zu steigern. Ein Beispiel für solch eine zugefügte Hexamereinheit ist natürlich die Sequenz -(APGVGV)-n, wobei A, P, V und G wie überall in dieser Offenbarung definiert sind, und n eine ganze Zahl von ca. 1 bis 50 ist, und die sich je nach gewünschten Eigenschaften ändert.
Schließlich wird darauf hingewiesen, daß für alle Bioelastomere nach der vorliegenden Erfindung, in denen eine oder mehrere funktionelle sich wiederholende Einheiten mit der Formel:
-Xc-(sich wiederholende Einheit)-n-Ycenthalten sind, wobei c wie überall in dieser Offenbarung eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, und, wenn verwendet, denselben Wert für X und Y hat, n eine ganze Zahl von 1 bis ca. 200 ist, aber auch den Wert 0 haben kann, wenn Xc und Yc zusammen ihrerseits wenigstens eine sich wiederholende Einheit bilden.
Die vorliegenden Bioelastomere enthalten Elastomer-Einheiten zusätzlich zu den Einheiten, die einbezogen sind, um die Übergangstemperatur zu modifizieren, die ein Copolymer aus Pentapeptid-"Monomer"-Einheiten und modifizierenden Hexapeptid-"Monomer"-Einheiten; Tetrapeptid-"Monomer"-Einheiten und modifizierenden Hexapeptid-"Monomer"-Einheiten oder Pentapeptid-, Tetrapeptid- und durch Hexapeptid-"Monomer"-Einheiten modifizierten "Monomer"-Einheiten sein können.
Zusätzlich können, wie gesagt, die Elastomer-Einheiten dieser Bioelastomere andere Hexapeptid- und Nonapeptid-Sequenzen aufweisen, die fibroblastische Chemotaxie aufweisen, um das gesamte Bioelastomer und daraus hergestelltes synthetisches Gefäßgewebe oder -prothesen für Fibroblasten chemotaktisch zu machen. Schließlich kann, obwohl der Wert von n in den obigen Formeln im allgemeinen 1 bis 200 ist, n auch den Wert 0 haben, mit der Maßgabe, daß die an der funktionellen sich wiederholenden Einheit angebrachten Einheiten Xc und Yc ihrerseits wenigstens eine solche sich wiederholende Einheit in ausreichender Menge bilden, um die Elastomerkraftentwicklung des Bioelastomers auf eine vorgegebene Temperatur einzustellen.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben ist, wird dem gewöhnlichen Fachmann offensichtlich sein, daß viele Änderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können, ohne die Idee oder den Umfang der Erfindung, wie hier beschrieben, zu verlassen.

Claims

1. Bioelastomer, enthaltend elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus aufweisen, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle enthalten, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer β-Reihe, die ein Polypentapeptidmolekül enthält, aus folgender Formel vorhanden sind:

-X¹-(IPGVG)n-Y ¹worin

I ein Peptid-bildender Rest aus L-Isoleucin,

P ein Peptid-bildender Rest aus L-Prolin,

G ein Peptid-bildender Rest aus Glycin,

V ein Peptid-bildender Rest aus L-Valin sind;

und worin X¹ PGVG, GVG, VG, G oder eine kovalente Bindung ist; Y¹ IPGV, IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis 200, oder n 0 unter dem Vorbehalt ist, daß X¹ und Y¹ zusammen mindestens ein pentameres Molekül in einer Menge strukturieren, die zur Abstimmung des Aufbaus elastomerer Kraft des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.

2. Verfahren zum Temperaturrückgang des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer β-Reihe vorhanden sind, die, bei Zugabe eines Pentapeptidmoleküls in das Bioelastomer, aus folgender Formel besteht:

-X¹-(IPGVG)n-Y¹

worin

I ein Peptid-bildender Rest aus L-Isoleucin,

P ein Peptid-bildender Rest aus L-Prolin,

G ein Peptid-bildender Rest aus Glycin,

V ein Peptid-bildender Rest aus L-Valin sind;

3. Bioelastomer, enthaltend elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus aufweisen, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle enthalten, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer β-Reihe vorhanden sind, die, mit Gehalt

A) eines Polypentapeptidmoleküls aus der Formel

-X¹-(IPGVG)n-Y¹- und

B) eines Polypentapeptidmoleküls aus der Formel

-X²-(VPGVG)n-Y²besteht, worin

I ein Peptid-bildender Rest aus L-Isoleucin,

P ein Peptid-bildender Rest aus L-Prolin,

G ein Peptid-bildender Rest aus Glycin,

V ein Peptid-bildender Rest aus L-Valin sind;

und worin X¹ und X² jeweils PGVG, GVG, VG, G oder eine kovalente Bindung sind; Y¹ IPGV, IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung ist; und n in beiden Formeln eine ganze Zahl von 1 bis 200, oder n 0 unter dem Vorbehalt ist, daß X¹ und Y¹, oder X² und Y² zusammen mindestens ein pentameres Molekül in relativen Mengen strukturieren, die zur Abstimmung des Aufbaus elastomerer Kraft des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreichen.

4. Verfahren zur Temperaturregelung des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die, bei Zugabe eines Polypentapeptidmoleküls in das Bioelastomer, aus der Formel

-X¹-(IPGVG)n-Y¹- oder eines Poylpentapeptidmoleküls aus der Formel

-X²-(IPGVG)n-Y²- oder einer Mischung daraus besteht, wobei in den obigen Formeln

I ein Peptid-bildender Rest aus L-Isoleucin,

P ein Peptid-bildender Rest aus L-Prolin,

G ein Peptid-bildender Rest aus Glycin,

V ein Peptid-bildender Rest aus L-Valin sind;

und worin X¹ und X² jeweils PGVG, GVG, VG, G oder eine kovalente Bindung sind; Y¹ IPGV, IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung ist; Y² VPGV, VPG, VP, V oder eine kovalente Bindung ist; und n in beiden Formeln eine ganze Zahl von 1 bis 200, oder n 0 unter dem Vorbehalt ist, daß X¹ und Y¹, oder X² und Y² zusammen mindestens ein pentameres Molekül in relativen Mengen strukturieren, die für die Abstimmung des Aufbaus elastomerer Kraft des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreichen.

5. Bioelastomer, enthaltend, elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus aufweisen, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle enthalten, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer ein Tetrapeptid enthaltenden b-Reihe vorhanden sind, die aus der Formel

-X³-(IPGVG)n-Y³besteht, in welcher X³ PGG, GG, G oder eine kovalente Bindung,

Y³ VPG, VP, V oder eine kovalente Bindung, und

V ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Valin,

P ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Prolin, und

G ein Peptid-erzeugender Rest aus Glycin sind;

und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder n 0 unter dem Vorbehalt ist, das X³ und Y³ zusammen mindesten ein tetrameres Molekül in einer Menge strukturieren, die zur Erhöhung der Temperatur, bei welcher sich die elastomere Kraft des Bioelastomers aufbaut, hinreicht.

6. Verfahren zur Temperaturregelung des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die, bei Zugabe eines Tetrapeptidmoleküls in das Bioelastomer aus der Formel

-X³-(VPGG)n-Y³besteht, in welcher

X³ PGG, GG, G oder eine kovalente Bindung,

Y³ VPG, VP, V oder eine kovalente Bindung, und

V ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Valin,

P ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Prolin, und

G ein Peptid-erzeugender Rest aus Glycin sind;

und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 oder n 0 unter dem Vorbehalt ist, das X³ und Y³ zusammen mindesten ein tetrameres Molekül in einer Menge strukturieren, die zur Abstimmung des Aufbaus elastomerer Kraft des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.

7. Bioelastomer, enthaltend elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus aufweisen, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle enthalten, worin die Grundmoleküle hydrophobe Aminosäurereste und Glycinreste aufweisen, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer ein Tetrapeptid enthaltenden b-Reihe vorhanden sind, die aus der Formel

-X&sup4;-(IPGG)n-Y&sup4;besteht, in welcher

X&sup4; PGG, GG, G oder eine kovalente Bindung,

Y&sup4; IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung, und

I ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Isoleucin,

P ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Prolin, und

G ein Peptin-erzeugender Rest aus Glycin sind;

und n eine ganze Zahl von 1 bis 200, oder n 0 unter dem Vorbehalt ist, das X&sup4; und Y&sup4; zusammen mindesten ein tetrameres Grundmolekül in einer Menge strukturieren, die zur Abstimmung des Aufbaus elastomerer Kraft des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.

8. Verfahren zur Temperaturregelung des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die, bei Zugabe eines Tetrapeptidmoleküls in das Bioelastomer aus der Formel

X&sup4;-(IPGG)n-Y&sup4;besteht, in welcher

X&sup4; PGG, GG, G oder eine kovalente Bindung,

Y&sup4; IPG, IP, I oder eine kovalente Bindung, und

I ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Isoleucin,

P ein Peptid-erzeugender Rest aus L-Prolin, und

G ein Peptid-erzeugender Rest aus Glycin sind;

9. Bioelastomer, enthaltend elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisen, worin die Grundmoleküle hydrophobe Aminosäurereste und Glycinreste enthalten, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die ein Tetrapeptid- oder Pentapeptidmolekül oder eine Mischung daraus oder Grundmoleküle daraus enthält, welche die Regelung der Temperatur ermöglicht, bei welcher sich die elastomere Kraft des Biolelastomers aufbaut, in einer Menge, die für den Aufbau der elastomeren Kraft des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur unter der Bedingung ausreicht, daß die Elastizität des Biolelastomers beibehalten wird.

10. Bioelastomer nach Anspruch 9, das außerdem ein fibroblastisches, chemotaktisches Hexapeptid- oder ein Nonapeptidmolekül oder Grundmoleküle in einer Menge enthält, die ausreicht, um dem Bioelastomer fibroblastische, chemotaktische Eigenschaften zu verleihen.

11. Bioelastomer nach Anspruch 10, worin das chemotaktische Hexapeptidmolekül (VGVAPG) ist, und die chemotaktischen Nonapeptidreihenfolgen (AGVPGFGVG) und (GFGVGAGVP) sind.

12. Bioelastomer, enthaltend elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus aufweisen, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle enthalten, worin die Grundmoleküle hydrophobe Aminosäurereste und Glycinreste aufweisen, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die ein Pentapeptidgrundmolekül aus der Formel

(R&sub1;PR&sub2;R&sub3;G)n

aufweist, worin

R&sub1; ein aus der aus Phe, Leu, Ils und Val bestehenden Gruppe gewählter Peptid-erzeugender Rest ist; R&sub2; ein solcher aus der aus Ala und Gly bestehenden Gruppe gewählter Rest ist; R&sub3; ein solcher aus der aus Phe, Leu, Ile und Val bestehenden Gruppe gewählter Rest ist; P ein L-Prolin-erzeugender Rest ist, und G ein Glycinerzeugender Rest ist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist, in einer Menge, die für die Abstimmung des elastomeren Kraftaufbaus des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.

13. Bioelastomer nach Anspruch 12, das außerdem ein fibroblastisches, chemotaktisches Hexapeptid- oder Nonapeptidmolekül oder Grundmoleküle in einer Menge enthält, die hinreicht, um den Bioelastomeren fibroblastische, chemotaktische Eigenschaften zu verleihen.

14. Verfahren zur Temperaturregelung des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe die, bei Zugabe eines Tetrapeptid- oder Pentapeptidmoleküls oder Mischungen daraus oder Grundmolekülen daraus in das Bioelastomer, die Regelung der Temperatur, bei welcher sich die elastomere Kraft des Bioelastomers aufbaut, ermöglicht, in einer Menge vorhanden sind, die für die Abstimmung der elastomeren Kraft des Bioelastomers unter der Bedingung, daß die Elastizität des Bioelastomers beibehalten wird, hinreicht.

15. Verfahren zur Temperaturregelung des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die, bei Zugabe eines Pentapeptidmoleküls in das Bioelastomer, aus der Formel

(R&sub1;PR&sub2;R&sub3;G)n

besteht, worin

R&sub1; ein aus der aus Phe, Leu, Ile und Val bestehenden Gruppe gewählter Peptid-erzeugender Rest ist; R&sub2; ein solcher aus der aus Ala und Gly bestehenden Gruppe gewählter Rest ist; R&sub3; ein solcher aus der aus Phe, Leu, Ile und Val bestehenden Gruppe gewählter Rest ist; P ein L-Prolin-erzeugender Rest ist, und G ein Glycinerzeugender Rest ist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist, in einer Menge, die für die Abstimmung des elastomeren Kraftaufbaus des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.

16. Bioelastomer, enthaltend elastomere Moleküle, die Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus aufweisen, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle enthalten, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe gewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer ein Tetrapeptidgrundmolekül enthaltenden b-Reihe vorhanden sind, die aus der Formel

(R&sub1;PGG)n

besteht, worin

R&sub1; ein aus der aus Phe, Leu, Ile und Val bestehenden Gruppe gewählter Peptid-erzeugender Rest ist; P ein L-Prolin-erzeugender Rest ist, und G ein Glycin-erzeugender Rest ist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist, in einer Menge, die für die Abstimmung des elastomeren Kraftaufbaus dem Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.

17. Verfahren zur Temperaturregelung des elastomeren Kraftaufbaus eines Bioelastomers, das elastomere, Tetrapeptid- oder Pentapeptidgrundmoleküle oder Mischungen daraus, und wahlweise auch Hexapeptidgrundmoleküle aufweisende Moleküle enthält, worin die Grundmoleküle Aminosäurereste aufweisen, die aus der aus hydrophober Aminosäure- und Glycinresten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und worin die Grundmoleküle in einer Konformation mit einer b-Reihe vorhanden sind, die, bei Zugabe eines Tetrapeptidmoleküls in das Bioelastomer, aus der Formel

(R&sub1;PGG)n

besteht, worin

R&sub1; ein aus der aus Phe, Leu, Ile und Val bestehenden Gruppe gewählter Peptid-erzeugender Rest ist; P ein L-Prolin-erzeugender Rest ist, und G ein Glycin-erzeugender Rest ist, und n eine ganze Zahl von I bis 200 ist, in einer Menge, die für die Abstimmung des elastomeren Kraftaufbaus des Bioelastomers auf eine vorbestimmte Temperatur hinreicht.