DE3788044T2 - Massanalyse von 3-oxo-5-beta-Steroid und Reagens dafür. - Google Patents
Massanalyse von 3-oxo-5-beta-Steroid und Reagens dafür.Info
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf eine quantitative Analyse von 3-Oxo-5β-steroid mittels eines enzymatischen Verfahrens sowie ein Reagenz dafür.
- Von den Leberfunktionsprüfungen haben solche, die Gallensäuren benutzen, aufgrund einer weiten Annahme der quantitativen Bestimmung der Gesamt-Gallensäuren im Serum unter Verwendung von 3α-Hydroxysteroid-dehydrogenase in den vergangenen Jahren eine wichtige Position in der klinischen Diagnose von Leber- und/oder Gallentrakterkrankungen erreicht.
- Seit langem war als eine Leberfunktionsprüfung ein Belastungstest bekannte der die Messung der Metabolismusrate nach Verabreichung von Dehydrocholsäure, die ein typisches Beispiel für ein 3-Oxo-5β-steroid ist, an eine Person umfaßte [J. Japan Internal Medicine, 21 567 (1933)]. Die klinische Effiziens dieses Tests kann folgendermaßen erklärt werden. Dehydrocholsäure, die entweder oral oder in anderer Weise unter normalen oder gesunden Bedingungen einer Person verabreicht wird, wird teilweise zur Niere übertragen, ohne in der Leber festgehalten zu werden und unverändert im Urin ausgeschieden; der größte Teil der Dehydrocholsäure wird jedoch in der Leber festgehalten, zu reduzierter Dehydrocholsäure reduziert und in Galle ausgeschieden. Die reduzierte Dehydrocholsäure, die so in Galle ausgeschieden ist, wird im Darm absorbiert, in das Blut aufgenommen, zur Niere übertragen und dann in Urin ausgeschieden. Gibt es irgendwelche Störungen in der Leberfunktion der Person, dann mag die Teilreduktion der Dehydrocholsäure nur mangelhaft erfolgen, was Veranlassung zu einer erhöhten Ausscheidung von Dehydrocholsäure und zu einer verminderten Ausscheidung reduzierter Dehydrocholsäure im Urin gibt, verglichen mit einer Person mit einer normalen Leberfunktion. Gleichermaßen vermindert sich die Konzentration der Dehydrocholsäure im Blut rapid, wenn die Leber mit einer normalen hepatischen Reduktion arbeitet. Die Rate der Abnahme der Konzentration der Dehydrocholsäure im Blut verringert sich in dem Maße, in dem sich die Leberfunktion verschlechtert. Die Messung dieser Funktion ist wichtig, um die Reduktions-Entgiftung der Leber zu bestimmen.
- Die quantitative Analyse der Dehydrocholsäure ist seit den dreißiger Jahren untersucht worden. Die Analysenmethoden schließen solche ein, die Papierchromatografie, Dünnschichtchromatografie, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie und ähnliche anwenden [J. Yonago Physic, 3, 64 (1951); J. Biochem. 29, 271 (1934)]. Das Verfahren zum Verfolgen markiert er Dehydrocholsäure ist auch vorgeschlagen worden [J. Olin. Invest. 52, 715 (1973)]. Diese Verfahren werden gemäß den folgenden Prozeduren ausgeführt. Wird Serum- als Probe benutzt, dann werden 1 bis 2 ml einer Serumprobe mit dem 9-fachen des Volumens mit physiologischer Salzlösung mit 0,1 N NaOH verdünnt und durch eine Säule von Amberlite XAD-2 oder ähnlichen Füllstoff geschickt. Die Säule wird mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Ethanol eluiert, um eine Ethanollösung der Gallensäuren zu erhalten, die dann mittels eines Verdampfers konzentriert wird. Das so erhaltene Konzentrat wird zur Trennung mit Dünnschichtchromatografie oder Papierchromatografie entwickelt, wozu ein Entwicklungs-Lösungsmittel von z. B. Butanol/Essigsäure/- Wasser (10 : 1 : 1) benutzt wird. Die Nachweisgrenze dieses Verfahrens beträgt etwa 10 ug. Wird ein Isotop benutzt, dann schickt man eine 24-Stunden-Urinprobe z. B. durch die vorgenannte Säule, extrahiert mit Ethanol, konzentriert, entwickelt mittels Papierchromatografie zur Trennung und mißt dann die Menge des Radioisotops. Die Nachweisgrenze - liegt im Bereich von 1 ug bis 100 ng.
- Diese Verfahren werden jedoch wegen der Anforderungen hinsichtlich komplizierter Vorbehandlungsprozeduren zur Extraktion, Konzentrierung usw. sowie wegen der teuren Ausrüstung und Materialien nicht bei einer Routineuntersuchung benutzt. Im besonderen stellt die dürftige Meßempfindlichkeit bei diesen Verfahren die folgenden Probleme. So enthält Urin nicht die für eine zuverlässige Untersuchung genügende Menge der Anzeigesubstanz. Im Falle der Benutzung von Serum als Probe ist üblicherweise eine große Menge der Probe erforderlich, weil die Menge von Dehydrocholsäure im Blut nach Verabreichung dieser Substanz nicht immer genügend hoch ist. Darüber hinaus kann die Bestimmung manchmal durch andere Komponenten in der Serumprobe behindert werden. Die Bestimmung unter Verwendung eines Isotops ist nicht notwendigerweise ein bevorzugtes Verfahren, weil spezielle Ausrüstung und Geräte erforderlich sind. Es bestand daher eine starke Notwendigkeit, eine bequeme und genaue quantitative Analyse von 3-Oxo-5β-steroid zu entwickeln.
- Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen zur Lösung der vorgenannten Probleme im Stande der Technik ausgeführt. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, daß bei der Einwirkung von 3-Oxo-5β-steroidΔ&sup4;-dehydrogenase auf 3-Oxo-5β-steroid in Gegenwart eines reduzierenden chromophoren Mittels 3-Oxo-5β-steroid in 3-Oxo-5β-Δ&sup4;-steroid oxidiert und gleichzeitig das reduzierte chromophore Mittel gefärbt wird und bequem einer empfindlichen quantitativen Bestimmung unterworfen werden kann (vergleiche die nicht vorveröffentlichte frühere Anmeldung EP-A-0 245 528). Diese Feststellung hat zur Fertigstellung dieser Erfindung geführte.
- Diese Erfindung schafft die Anwendung einer quantitativen Analyse von 3-Oxo-5β-steroid, umfassend die Einwirkung von 3-Oxo-5β-steroidΔ&sup4;-dehydrogenase auf eine Probe in Gegenwart eines reduzierenden chromophoren Mittels und Messen der optischen Dichte der dadurch erzeugten chromophoren Substanz in einem Belastungstest, in dem ein Metabolismus von Dehydrocholsäure, die einem Körper verabreicht wurde, gemessen wird, um Leberfunktionen zu bestimmen.
- Die Reaktion, auf der die quantitative- Analyse dieser Erfindung beruht, ist in dem folgenden Schema dargestellt: 3-Oxo-5β-steroid 3-Oxo-5β-steroid-Δ&sup4;-steroid reduzierendes chromophores Mittel Δ&sup4;DH gefärbte Substanz
- Die quantitative Analyse dieser Erfindung kann ausgeführt werden, indem man zuerst 3-Oxo-5β-steroid unter Verwendung von 3-Oxo-5β-steroidΔ&sup4;-dehydrogenase (im folgenden abgekürzt als "Δ&sup4;DH") in Gegenwart eines reduzierenden chromophoren Mittels zu 3-Oxo-5β-Δ&sup4;-steroid oxidiert und gleichzeitig das reduzierende chromophore Mittel zu einer gefärbte Substanz reduziert und dann die optische Dichte der gefärbten Substanz mißt.
- Ein vollständigere Einschätzung der Erfindung und vieler von deren Vorteilen ist leicht aus der folgenden Beschreibung erhältlich.
- Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Änderungen der Hydrocholsäure-Konzentration im Serum im Verlauf der Zeit wiedergibt, bei dem die Konzentration der Dehydrocholsäure im Serum (umol/l) entlang der Ordinate und die Zeit nach der Verabreichung von Dehydrocholsäure (min) entlang der Abszisse aufgetragen sind.
- Δ&sup4;DH (EC.1. 3. 99. 6), die brauchbar bei der Durchführung dieser Erfindung ist, ist eine Dehydrogenase, die spezifisch für 3-Oxo-5β-steroid ist und weit verteilt in Mikroorganismen gefunden wird, wie solchen, die zu der Gattung Pseudomcnas [J. Chem. Soc.; Chem. Comm. 3, 115 (1974); J. Biol. Chem. 218, 675 (1956), a.a.O. 234, 2014 (1959); Biochem. Biophy. Acta 56, 584 (1962)], der Gattung von Arthrobactor [Eur. J. Biochem. 47, 555 (1974)]; der Gattung von Nocardia [Chemical and Pharmaceutical Bulletin 21, 2794 (1973), a.a.O. 23, 2164 (1975); Dissertation Abstracts 35, 3839 (1975)]; der Gattung von Corynebacterium (US-PS 3,639,212) usw. gehören. Es gibt keine Begrenzung hinsichtlich der Quelle des Enzyms.
- Die Menge von Δ&sup4;DH, die einzusetzen ist, kann hinsichtlich der Reaktionskonzentration von 50 bis 10.000 Einheiten/l, vorzugsweise 300 bis 3.000 Einheiten/l, betragen - Irgendein reduzierendes chromophores Mittel kann für den Zweck dieser Erfindung benutzt werden-, solange sich sein intramolekulares Potential durch Aufnahme von Elektronen ändern kann, dadurch ein Chromophor erzeugt, das nur Strahlung mit einer spezifischen Wellenlänge zu absorbieren in der Lage ist. Im einzelnen können die chromophoren Mittel Tetrazoliumverbindungen sein, die Nitroblautetrazolium (im-folgenden abgekürzt als "NTB"), 3-(p-Indophenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (im folgenden abgekürzt als "INT"), 3-(-4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (nachfolgend abgekürzt als "MTT"-) und 1,1'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis{5-(4-nitrophenyl)-3-[4-(2-hydroxy-3-(2-hydroxyethyldiethylamino)-propoxy)phenyl]}-2H-tetrazoliumchlorid (nachfolgend abgekürzt als "W.S.NTB") einschließen, auf diese aber nicht beschränkt sind. Die -Konzentration der Tetrazoliumverbindung kann im Bereich von 50 bis 2.000 umol/l, vorzugsweise 100 bis 1.000 umol/l liegen.
- Als 3-Oxo-5β-steroid, auf das die quantitative Analyse dieser Erfindung anwendbar ist, können neben Dehydrocholsäure, 5β-Androstan-3,17-dion, Δ¹-5β-Androsten- 3,17-dion, 5β-Pregnan-3, 20-dion, 21-Hydroxy-5β-pregnan- 3,20-dion usw. sein. ,Proben, die für die Analyse brauchbar sind, können daher Serum, Plasma, Urin und ähnliche sein.
- Bei der Ausführung der quantitativen Analyse dieser Erfindung können die Probe, das reduzierende chromophore Mittel und Δ&sup4;DH in einer willkürlichen Reihenfolge zu einem Puffer hinzugegeben werden und nach der Reaktion wird die optische Dichte der Reaktionslösung gemessen.
- Irgendwelche konventionellen Puffer können für die quantitative Analyse dieser Erfindung benutzt werden, die, z. B., Phosphatpuffer, Trispuffer, Good-Puffer mit einem pH-Bereich von 6 bis 10 einschließen. Es gibt keine spezielle Begrenzung hinsichtlich der Temperatur, bei der die Reaktion ausgeführt wird, doch darf die Δ&sup4;DH nicht deaktiviert werden. Üblicherweise kann eine Temperatur von 20 bis 40ºC, vorzugsweise eine solche nahe 37ºC, benutzt werden.
- Die quantitative Bestimmung von 3-Oxo-5β-steroid kann nach Beendigung der Reaktion durch die Zugabe einer Abbruchslösung zu der Reaktionsmischung durch Messen der optischen Dichte der gefärbten Substanz in der Mischung oder, alternativ, durch Messen der Zunahme der optischen Dichte der gefärbten Substanz in einer vorgeschriebenen Zeitdauer erfolgen. Anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure oder organische Säuren, wie Zitronensäure und Essigsäure, können als eine Abbruchslösung benutzt werden.
- Das Reagenz für die quantitative Analyse dieser Erfindung kann aus einer Pufferlösung bestehen, der 60 bis 2.400 umol/l des reduzierenden chromophoren Mittels und 60 bis 12.000 Einheiten/l von Δ&sup4;DH hinzugegeben worden sind. Es ist möglich, eine Pufferlösung herzustellen, zu der vorher entweder das reduzierende chromophore Mittel oder Δ&sup4;DH hinzugegeben worden ist und die andere Substanz dann zuzugeben, wenn das Reagenz benutzt wird.
- Diese Erfindung macht Gebrauch von den Enzymen, die in der Lage sind, spezifisch die Struktur von 3-Oxo-5βsteroid zu erkennen und von der Kolorimetrie der gefärbten Substanz. Die Erfindung beseitigt so die Notwendigkeit für die an den Proben auszuführenden Prozeduren, wie Wärmebehandlung, Entproteinisierung und Extraktion, so daß nur eine geringe Menge der Proben, wie von 50 bis 200 ul, bei einer quantitativen Bestimmung benötigt wird und doch eine ausgezeichnete Empfindlichkeit ergibt.
- Die quantitative Analyse dieser Erfindung kann auf einen Belastungstest angewendet werden, bei dem ein Metabolismus von Dehydrocholsäure, die einem Körper verabreicht wurde, gemessen wird, so daß ein sehr einfacher und genauer Leberfunktionstest geschaffen wird.
- Andere Merkmale-der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der beispielhaften Ausführungsformen, die nur zur Veranschaulichung der Erfindung gegeben werden und diese nicht beschränken sollen.
- 0,5 ml einer Phosphatpufferlösung (pH 8) von 50 mmol/l, enthaltend 500 umol/l NTB und 1.500 Einheiten/lΔ&sup4;DH (im folgenden als "Reagenz" bezeichnet) wurden mit 100 ul der Proben versehen und genau 10 Minuten bei 37ºC umgesetzt, woraufhin 0,5 ml der Abbruchslösung (0,1 N HCl) hinzugegeben werde. Nachdem man die sich ergebende Flüssigkeit 5 Minuten lang hatte stehen lassen, wurde ihre optische Dichte bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen. Die gleichen Proben wurden zu dem Reagenz hinzugegeben, das Δ&sup4;DH nicht enthielt, und die obigen Prozeduren wurden als ein Vergleichstest genau wiederholt. Die benutzten Proben waren Serum, denen Dehydrocholsäure hinzugegeben wurde und das mit dem gleichen Serum, das aber keine Dehydrocholsäure enthielt, zu verschiedenen Konzentrationen verdünnt waren. Die benutzte Δ&sup4;DH war aus Pseudomonas testosteroni abgetrennt, der gemäß dem von Levy et al [J. Biol. Chem. 234, 2014 (1959)] angegebenen Verfahren kultiviert und gereinigt worden war. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
- Konzentration von Dehydrocholsäure (umol/l) Optische Dichte bei 540 nm
- 20 0,022
- 40 0,046
- 60 0,077
- 80 0,101
- 100 0,122
- 140 0,172
- 180 0,226
- Die gleichen Prozeduren wurden an Serumproben wiederholt, denen das Reagenz des Beispiels 1 in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben worden war, das jedoch statt Dehydrocholsäure 5β-Androstan-3,17-dion (eine Methanollösung) enthielt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
- Konzentration von 5β-Androstan-3,17-dion bei 540 nm Optische Dichte bei 540 nm
- 20 0,065
- 40 0,132
- 60 0,201
- 80 0,270
- 100 0,332
- 120 0,403
- Einem Leberzirrhose-Patienten und einer gesunden Person wurden jeweils 1 g Dehydrocholsäure intravenös verabreicht. Die Änderungen der Dehydrocholsäure-Konzentration im Serum nach der Verabreichung wurden nach der gleichen Prozedur wie in Beispiel 1 und unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der beigefügten Fig. 1 gezeigt. Die Beseitigungs-Konstante (kel), die Halbwertsdauer (T ½) und die Fläche unter der Konzentrationskurve der Verbindung im Blut (AUC) sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Parameter Gesunde Person Leberzirrhose-Patient
- Offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Lichte der obigen Lehren möglich. Es sollte daher klar sein, daß im Rahmen der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders ausgeführt werden kann, als hier spezifisch beschrieben.
Claims (2)
1. Anwendung einer quantitativen Analyse von
3-Oxo-5βsteroid, umfassend die Einwirkung von
3-Oxo-5β-steroidΔ&sup4;dehydrogenase auf eine Probe in Gegenwart eines
reduzierenden chromophoren Mittels und Messen der optischen
Dichte der chromophoren Substanz, die dadurch in einem
Belastungstest erzeugt wird, bei dem ein Metabolismus von
Dehydrocholsäure, die einem Körper verabreicht wurde, zur
Bestimmung von Leberfunktionen gemessen wird.
2. Eine Anwendung nach Anspruch 1, worin das genannte
reduzierende chromophore Mittel eine
Tetrazolium-Verbindung ist.
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