DE3786391T2

DE3786391T2 - Qualitätsverbesserung von alkoholischen Getränken.

Info

Publication number: DE3786391T2
Application number: DE87309009T
Authority: DE
Inventors: Eiji Ichikawa; Satoshi Imayasu; Shigeya Kakimoto; Tetsuyoshi Suizu; Yasuhiro Sumino; Hideaki Yamada
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; Kirin Food Tech Co Ltd
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2007-10-14
Also published as: KR950006812B1; AU598305B2; EP0266088A1; KR880005252A; US4844911A; NZ222144A; ES2056826T3; CN1020471C; AU7933987A; CN87106909A; EP0266088B1; DE3786391D1; CA1311701C; MX169236B; BR8705459A

Description

Sämtliche Brauerzeugnisse, darunter raffinierter Sake, Bier, Wein und Samshu und die fertige Maische, das Material vor der Destillation zu Whisky, Branntwein, Shochu etc. enthalten Carbainid (Harnstoff), das die hauptsächliche Ursache für eine Qualitätsminderung alkoholischer Flüssigkeiten ist, indem es den alkoholischen Flüssigkeiten einen unerwünschten Beigeschmack verleiht und den Geschmack alkoholischer Flüssigkeiten verschlechtert, wenn diese pasteurisiert oder lange Zeit gelagert werden. Zur Entfernung des Carbamids ist ein Verfahren bekannt, bei dem ein Urease-Enzym-Präparat den alkoholischen Flüssigkeiten oder der fertigen Maische zugesetzt und bei einer niedrigen Temperatur von 10 ºC bis 20 ºC reagieren gelassen wird (Official Gazette of Japanese Patent No. 20830/1981).
Urease (E.C. 3.5.1.5.) ist ein Enzym, das Carbamid zu Ammoniak und Kohlenstoffdioxid-Gas zersetzt, und ist in der Natur weit verbreitet, z.B. in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen. Konventionell werden Urease aus Canavalia Adans. und Urease aus Bacillus pasteuri für den Praktischen Gebrauch industriell Produziert.
Die oben beschriebenen Urease-Produkte haben den optimalen pH-Wert im neutralen bis alkalischen Bereich, und bei einem pH-Wert im sauren Bereich ist es nicht nur sehr schwierig, die Reaktion ablaufen zu lassen, sondern es besteht auch die Gefahr, daß das Enzym desaktiviert wird, in bemerkenswertem Maße besonders dann, wenn die Reaktionstemperatur oberhalb der Raumtemperatur liegt oder wenn die Reaktion in einer organische Lösungsmittel wie Alkohole enthaltenden Reaktionsmischung durchgeführt wird. Aus diesem Grund hat beispielsweise die in der Official Gazette of Japanese Patent No. 20830/1981 beschriebene Verfahrensweise Nachteile, daß eine sehr große Menge der aus Canavalia Adans. oder aus Bakterien stammenden Urease (optimaler pH-Wert 6 bis 8) zugesetzt werden muß, um das in einem raffinierten Sake, der etwa 20 % Alkohol enthält, vorhandene Carbamid zu entfernen, und daß die Reaktion nur bei einer Temperatur von 10 ºC bis 20 ºC während einer langen Zeitdauer ablaufen kann; damit ist das Verfahren vom industriellen Standpunkt für die Herstellung alkoholischer Flüssigkeiten nicht notwendigerweise zufriedenstellend.
Die Erfinder haben akut den Bedarf an einem Urease-Präparat empfunden, das stabil ist und selbst in Alkohol enthaltenden sauren alkoholischen Flüssigkeiten gut wirkt, um alkoholische Flüssigkeiten hoher Güte herzustellen, und fanden als Ergebnis ihrer Forschungen, daß eine Behandlung mit Urease, die aus Milchsäure-Bakterien abgeleitet ist und einen optimalen pH-Wert im sauren pH-Bereich von 2 bis 5 hat, das in alkoholischen Flüssigkeiten vorhandene Carbamid durch Zersetzung mit einer kleinen Menge Urease in sehr kurzer Zeit selbst bei höherer Temperatur zu entfernen vermag. Nach weiteren Untersuchungen haben die Erfinder die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete saure Urease bedeutet eine solche, die 2 mol Ammoniak und 1 mol Kohlenstoffdioxid-Gas aus 1 mol Carbamid und 1 mol Wasser erzeugt, wobei der optimale pH-Wert für die Aktivität im Bereich von pH 2 bis 5, vorzugsweise pH 2 bis 4,5, liegt, und es gibt keine Einschränkungen hinsichtlich der allgemeinen Eigenschaften des Enzyms wie der pH-Stabilität, der optimalen Temperatur, der thermischen Stabilität, der Substrat-Spezifität, der Natur der Inhibitoren, des Km-Wertes und des Molekulargewichts.
Säure-Urease wird gewöhnlich erzeugt durch eine Kultur von Säure-Urease produzierenden Bakterien-Stämmen. Solche Stämme sind vorzugsweise diejenigen der sogenannten "Milchsäure- Bakterien", beispielsweise diejenigen, die zu den Gattungen Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus und Bifidobacterium gehören. Repräsentativ werden Streptococcus faecium, Streptococcus mitis, Lactobacillus casei var. casei, Streptococcus mitior, Streptococcus bovis, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis und Bifidobacterium choerinum verwendet, aber es besteht keine Beschränkung hinsichtlich des Stammes; selbst neue Isolate aus Milchprodukten, Boden, ranzigen und sauer gewordenen verfaulenden Lebensmitteln, Organen und Ausscheidungen von Tieren etc. können eingesetzt werden, soweit sie Säure-Urease zu erzeugen vermögen. Zusätzlich verwendet werden können Varianten, die aus den Stämmen künstlich durch UV-Bestrahlung oder durch Behandlung mit Mutagenen erhalten wurden, und andere Bakterien-Stämme, die durch Rekombination der künstlich getrennten Gen-Fragmente erhalten wurden, die für die Expression der erwähnten Säure-Urease-Aktivität notwendig sind.
Zu Säure-Urease produzierenden Stämmen zählen konkret Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM P-8990), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (IFO 14512, FERM P-8991), Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14513, FERM P-8992), Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14633, FERM P-9460), Streptococcus bovis PG-186 (IFO 14634, FERM P-9461) und Bifidobacterium choerinum PG-196 (IFO 14635, FERM P-9462) Die IFO-Zahlen bezeichnen die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO), und die Ferm P- Zahlen bezeichnen die Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI). Diese Mikroorganismen, die bei FRI am Datum der nachstehenden Tabelle hinterlegt wurden, sind in eine Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag umgewandelt worden und werden bei FRI unter den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Hinterlegungsnummern FERM-BP aufbewahrt. Mikroorganismus Datum der Hinterlegung bei FRI Hinterlegungsnummer unter d. Budapest. Vertr. Lactobacillus fermentum Streptococcus mitior Streptococcus bovis Bifidobacterium choerinum
Lactobacillus fermentum JCM 5867, Lactobacillus fermentum JCM 5868 und Lactobacillus fermentum JCM 5869 sind in der "Research Communication No. 13 (Annual Report 1985-1986) 1987", veröffentlicht von IFO, unter den oben angegebenen IFO-Nummern aufgeführt
Die sechs oben beschriebenen Mikroorganismen haben die folgenden bakteriologischen Eigenschaften. Eigenshaften Stämme Form der Zellen Motilität Sporenbildung Gram-Färbung Temperatur des optimalen Wachstums Wachstum bei Sauerstoff-Bedarf Oxidations-Fermentations-Test Fermentations-Typ Gas-Bildung Glucose Gluconsäure Säure-Bildung Mannit Salicin Raffinose Dulcit Inosit Lactose Melezitose kurze Stäbchen fakultativ anaerob fermentiert DL-Milchsäure und Ethanol reichlich aus Glucose produziert Fortsetzung Eigenschsften Stämme Melibiose Maltose Cellobiose Aesculin Glycerin Mannose Rhamnose Ribose Arabinose Sorbit Sucrose Fructose Galactose Trehalose Xylose Katalase Oxidase Nitrat-Reduktion Gelatine-Verflüssigung Auxotrophie Thiamin, Calciumpantothenat, Niacin, Thiamin, Calciumpantothenat, Niacin, Riboflavin Eigenschaften Stämme Herkunft Form der Zellen Motilität Sporenbildung Gram-Färbung Sauerstoff-Bedarf Oxidations-Fermentations-Test Fermentations-Typ Katalase Oxidase Stickstoff-Reduktion Gelatine-Verflüssigung Hydrolyse von Stärke Zersetzung von Äsculin MR-Test VP-Test Bildung von Indol Bildung von Hydrogensulfid Bildung von NH&sub3; aus Arginin Lackmus-Milch Gas-Bildung aus Glucose Schwein: Intestinum duodenum kurze Stäbchen mikroaerophil fermentativ Homo-L-Milchsäure + (schwach) Schwein: Intestinum jejunum Coccen fakultativ anaerob Schwein: Colon Fortsetzung Eigehchaften Stämme Temperatur des optimalen Wachstums Wachstum bei Wachstum in 3-proz. wäßriger Natriumchlorid-Lösung α-Hämolyse β-Hämolyse Säure-Bildung Adonit Arabinose Arabit Arbutin Cellobiose Dulcit Fructose Galactose Gluconat Glucose Glycerin Inosit Inulin Lactose Maltose Mannit + (schwach) Fortsetzung Eigenshaften Stämme Melezitose Melibiose α-Methylglucosid Raffinose Rhamnose Ribose Salicin Sorbit Sorbose Stärke Sucrose Trehalose Xylose Xylit DNA-Gehalt (%) Typ des Peptidglycans + (schwach)
In der vorstehenden Tabelle bedeutet das Symbol "ND", daß Versuche nicht durchgeführt wurden, und Lys, Asp, Ala, Glu, Orn, Ser und m-DAP stellen Lysin, Asparaginsäure, Alanin, Glutaminsäure, Ornithin, Serin bzw. meso-Diaminopimelinsäure dar. Die taxonomische Position der obigen Stämme wurde durch Vergleich der obigen bakteriologischen Eigenschaften mit der Beschreibung in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2 (1986), geprüft. Die Ergebnisse zeigen, daß es zutrifft, daß der Stamm PG-196, obwohl jeweils die Bildung von Säure aus Arabinose, Cellobiose, Ribose und Xylose positiv ist, ein Mikroorganismus von Bifidobacterium choerinum ist, der Stamm PG-154, obwohl die α-Hämolyse negativ ist, ein solcher von Streptococcus mitior ist, und der Stamm PG-186, obwohl die Hydrolyse von Aesculin negativ ist, ein solcher von Streptococcus bovis ist.
Säure-Urease wird aus diesen Stämmen kontinuierlich oder intermittierend durch eine konventionelle stehende Kultur, Schüttelkultur, Belüftungs-Schleuderkultur oder feste Kultur gewonnen. Die eingesetzten Kulturmedien sind solche von herkömmlicher Zusammensetzung, in denen die Bakterien zu wachsen vermögen. Die Kohlenstoff-Quellen werden aus Kohlenhydraten, Fetten, Fettsäuren und Alkoholen, die assimiliert werden können, passend ausgewählt und werden getrennt oder in Kombination verwendet. Zu den Stickstoff-Quellen zählen organische Stickstoff-Quellen wie Pepton, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenöl, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt und Molke sowie anorganische Stickstoff-Quellen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat, die je nach Notwendigkeit getrennt oder in geeigneter Kombination eingesetzt werden. Es ist wünschenswert, daß zusätzlich zu den Kohlenstoff- Quellen und Stickstoff-Quellen wesentliche Wachstumsfaktoren oder wachstumsfördernde Mittel wie Mineralien, Aminosäuren und Vitamine den Medien zugesetzt werden. Carbamid, Thioharnstoff oder dergleichen wird manchmal zugesetzt, um die Produktion von Säure-Urease zu induzieren. Für die Steuerung des pH-Wertes und des Schäumens während der Kultivierung ist es wirkungsvoll, in geeigneter Weise eine Ätzalkali-Lösung, Natriumcarbonat-Lösung oder eine Calciumsalz-Lösung oder ein Antischaummittel zuzusetzen.
Die Temperatur der Kultivierung wird aus dem Bereich gewählt, der für das Wachstum der eingesetzten Bakterien geeignet ist, und beträgt gewöhnlich 15 ºC bis 50 ºC, vorzugsweise 25 ºC bis 40 ºC. Die Kultivierung wird eine solche Zeitdauer fortgesetzt, die für das Wachstum der Bakterien und für die Produktion der Säure-Urease ausreicht, gewöhnlich 5 bis 50 h.
Nach der Kultivierung unter den oben beschriebenen Bedingungen ist die Säure-Urease gewöhnlich in den Bakterien-Zellen enthalten, Die aus der Kultur durch Zentrifugation, Sedimentation, Aggregation, Filtration durch eine poröse Membran oder Keramik etc. gesammelten lebensfähigen Zellen können in der vorliegenden Erfindung als rohres Säure-Urease-Präparat ohne weitere Behandlung oder nach dem Trocknen mittels Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Aceton-Trocknung etc. verwendet werden. Es ist ebenfalls praktizierbar, das Enzym durch Behandeln der Zellen durch Einfrieren-Auftauen, Mahlen, Ultraschallbehandlung, osmotischen Schock, Lysozym, ein Tensid etc. zu solubilisieren, wobei die Methoden getrennt oder in Kombination angewandt werden. Danach kann das Enzym mittels einer geeigneten Kombination der konventionellen Techniken zur Reinigung von Enzymen wie der Protamin- Behandlung, dem Aussalzen, der Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, der isoelektrischen Fällung, der Elektrophorese, der Ionenaustauschchromatographie, der Gelfiltration, der Affinitätschromatographie und der Kristallisation gereinigt werden, wodurch rohe oder gereinigte Enzym-Präparate mit einer höheren spezifischen Aktivität als derjenigen der lebensfähigen Zellen für eine Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Im folgenden wird das Verfahren der Behandlung alkoholischer Flüssigkeiten mit Säure-Urease erläutert.
Die bei der Behandlung alkoholischer Flüssigkeiten mit dem Enzym verwendete Form des Enzyms können die das Enzym enthaltenden Bakterien-Zellen oder durch Extraktion und Reinigung mittels konventioneller Techniken erhaltene rohe oder gereinigte Säure-Urease-Präparate oder ein immobilisiertes Präparat, das durch Einschließen des Enzym-Präparats in ein natürliches Polymer wie Agar und Carragenan oder ein synthetisches Polymer wie Polyacrylamid- und Urethan-Harz erhalten wurde, oder ein immobilisiertes Präparat sein, das durch Binden an einen Träger wie Aktivkohle, Keramik, Dextran, Agarose und deren verwandte Substanzen und poröses Glas erhalten wurde.
Die mittels des Verfahrens in der vorliegenden Erfindung zu behandelnden alkoholischen Flüssigkeiten sind solche, die Carbamid enthalten, darunter Brauerzeugnisse wie raffinierter Sake, Bier, Wein, Obstweine, Samshu, Whisky-Maische, Shochu-Maische (Shochu: japanischer Branntwein) und Branntwein-Maische etc. und deren Zwischenprodukte. Beispielsweise können im Fall von Sake die fertige Maische, unraffinierter Sake im Faß nach der Filtration durch Kompression der Maische, Roh-Sake, konservierter Sake nach der Pasteurisierung, raffinierter Sake vor der Abfüllung auf Flaschen etc. mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden, jedoch ist die Behandlung mit dem Enzym vor der Pasteurisierung am meisten wünschenswert.
Wenn diese alkoholischen Flüssigkeiten mit der Säure-Urease behandelt werden sollen, ist es praktisch vorteilhaft, wenn die Säure-Urease mit 0,00001 Einheiten/ml bis 1 Einheit/ml, insbesondere mit 0,0001 Einheiten/ml bis 0,1 Einheiten/ml, zugesetzt werden. Eine Einheit bedeutet diejenige Menge des Enzyms, die zur Zersetzung von Carbamid zur Freisetzung von 1 umol Ammoniak pro Zeiteinheit (1 min) erforderlich ist. Im folgenden wird eine Einheit als 1 U geschrieben.
Die Temperatur der Behandlung der alkoholischen Flüssigkeiten beträgt gewöhnlich 0 ºC bis 80 ºC, vorzugsweise 10 ºC bis 60 ºC. Der pH-Wert beträgt 2 bis 7, wünschenswerterweise 3 bis 5. Die Behandlung wird eine genügende Zeit fortgesetzt, um Carbamid aus den alkoholischen Flüssigkeiten zu entfernen, gewöhnlich 20 min bis 200 d, häufiger 5 h bis 120 d.
Die Behandlung der alkoholischen Flüssigkeiten mit der Säure-Urease kann auch in der Weise durchgeführt werden, daß man lebensfähige Zellen Säure-Urease produzierender Mikroorganismen während des Vorgangs der alkoholischen Gärung bei der Herstellung der alkoholischen Flüsigkeiten gleichzeitig anwesend sein läßt.
Säure-Urease produzierende Bakterien können jederzeit vor der Beendigung der alkoholischen Gärung zugesetzt werden. Vorzugsweise werden die Säure-Urease produzierenden Bakterien während des Prozesses der Erzeugung der Hefe-Maische oder des Prozesses der Herstellung der verzuckerten Mischung inokuliert und dann der Haupt-Fermentation (alkoholischen Gärung) gemäß dem herkömmlichen Verfahren unterworfen. Säure-Urease produzierende Bakterien können zu geeigneter Zeit während der Haupt-Fermentation inokuliert und kultiviert werden, vorzugsweise vor der Mitte der gesamten Zeitdauer der Gärung.
Wenn man die Säure-Urease produzierenden Bakterien in der Hefe-Maische alkoholischer Flüssigkeiten wachsen läßt, werden die Säure-Urease produzierenden Bakterien vor der üblichen Zugabe der Hefe inokuliert, und die Hefe wird dann inokuliert, wenn die Säure-Urease produzierenden Bakterien genügend gewachsen sind; dann wird nach dem üblichen Verfahren eine Impf-Maische hergestellt und zum Maischen verwendet. Wenn man die Säure-Urease produzierenden Bakterien in Rohstoffen oder verzuckerten Rohstoffen wachsen läßt, werden die Säure-Urease produzierenden Bakterien in Rohstoffe [z.B. gedämpften Reis, Koji-Reis (eine Kultur von Aspergillus oryzae auf gedämpftem Reis), Malz, Gerstensaft, Traubensaft, Stärke] oder verzuckerte Rohstoffe inokuliert und nach hinreichendem Wachstum zum Maischen verwendet.
Die Temperatur der Kultivierung der die Säure-Urease produzierenden Bakterien wird nicht speziell festgelegt, obwohl sie vorzugsweise 28 ºC bis 40 ºC beträgt. Der Titer (Count) der gewachsenen, Säure-Urease produzierenden Bakterien wird nicht speziell festgelegt, obwohl er vorzugsweise 10&sup8;/ml oder mehr beträgt. Impf-Maische oder Rohstoffe oder verzuckerte Rohstoffe, die gewachsene, Säure-Urease produzierende Bakterien enthalten, können in jedem Stadium des Maischens und zu jeder Zeit des Maisch-Verfahrens vor der Beendigung der alkoholischen Gärung eingesetzt werden. Bei der Herstellung von raffiniertem Sake können sie beispielsweise zur Zeit der ersten, mittleren oder beendenden Zugabe in dem Maisch-Verfahren oder zu jeder beliebigen Zeit des Maisch-Verfahrens eingesetzt werden. Die zuzusetzende Menge der Impf-Maische oder der Rohstoffe oder verzuckerten Rohstoffe, die die Säure-Urease produzierenden Bakterien enthalten, wird nicht speziell festgelegt, beträgt jedoch vorzugsweise 3 bis 15 %.
Wenn die Säure-Urease produzierenden Bakterien zu einer Impf-Maische hinzugefügt werden sollen, ist der Zusatz einer Säure unnötig, sofern die Bakterien solche von Säure erzeugenden Stämmen sind, wohingegen eine Säure wie Milchsäure vor der Addition der Hefe in einer Menge, die nahezu äquivalent der gewöhnlich verwendeten ist, zu der Impf-Maische hinzugefügt wird, wenn die Bakterien nicht Säure produzieren.
Die alkoholische Gärung in der vorliegenden Erfindung kann unter konventionellen Bedingungen (Temperatur, Zeit etc.) durchgeführt werden, und in den Bedingungen der nachfolgenden Prozesse wie Filtration, Kompressionsfiltration, Pasteurisierung, Lagerung, Alterung und Destillation ist keinerlei Modifikation erforderlich.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung der Behandlung alkoholischer Flüssigkeiten mit Säure-Urease ist wirtschaftlich vorteilhafter, da im Vergleich mit den konventionellen Methoden der Behandlung mit neutraler bis alkalischer Urease aus Canavalia Adans. nur eine viel niedrigere Menge der Urease benötigt wird. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordert nämlich nur etwa 1/100 bis 1/10000 Enzym- Einheiten oder etwa 1/10 bis 1/100 oder weniger des Gewichts der bei den konventionellen Verfahren für eine vollständige Entfernung des Carbamids durch Zersetzung benötigten Menge. Aus diesem Grunde ist eine Wertminderung infolge restlicher Urease in alkoholischen Flüssigkeiten nach der Behandlung praktisch vernachlässigbar, was ein vorteilhafterer Punkt im Vergleich mit den konventionellen Methoden ist.
Daneben vermag bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Zersetzung des Carbamids bei höherer Temperatur in kürzerer Zeit selbst bei einem sauren pH-Wert von 3 bis 5 fortzuschreiten, wie er bei alkoholischen Flüssigkeiten gängig ist; das Carbamid kann mit einem hohen Wirkungsgrad zersetzt werden, was industriell vorteilhaft ist.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung konkreter mit Beispielen erläutert. Die Beispiele sind jedoch nicht mehr als Beispiele und beschränken den Umfang der Erfindung in keiner Weise.
Die Aktivität der Säure-Urease in einer Kultur wurde kolorimetrisch nach der Nitroprussid-Methode für Ammoniak bestimmt, das durch 30 min Reaktion der Mischung eines Volumens einer Suspension der Zellen in sterilisiertem entionisiertem Wasser bei 37 ºC erzeugt wurde; die Zellen waren durch Zentrifugation der Kultur gesammelt worden, die in geeigneter Weise mit einem gleichen Volumen 0,2 M Citrat- Puffer (pH 4,0), der Harnstoff enthielt, verdünnt worden war. Die Aktivität wurde in Einheiten ausgedrückt; eine Einheit (1 U) bezeichnet diejenige Menge des Enzyms, die zur Erzeugung von 1 umol Ammoniak pro Zeiteinheit (1 min) erforderlich ist.

Beispiel 1

Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM BP-1454), der durch Stabkultur in einem aus 0,5 % Glucose, 1,0 % Polypepton, 1,0 % Hefeextrakt, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5 % Kochsalz, 1,0 % Calciumcarbonat und 1,5 % Agar bestehenden Medium kultiviert worden war, wurde in zwei 200ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils 50 ml eines sterilisierten Mediums pH 7,0 (neutralisiert mit 30-proz. Ätznatron) enthielten, das aus 2,0 % Glucose, 2,0 % wasserfreiem Natriumacetat, 1,0 % Polypepton, 1,0 % Fleischextrakt, 0,2 % Hefeextrakt, 0,5 % Kochsalz und 0,005 % Mangansulfat (mit etwa 4 mol Kristallwasser pro 1 mol) bestand; danach erfolgte eine Kultur durch 24 h Stehen bei 37 ºC. Die resultierende Impf-Kultur in jedem Kolben wurde in einen von zwei 2 Liter-Erlenmeyer-Kolben überführt, die jeweils 1 Liter des sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung enthielt, wie sie oben beschrieben ist; danach erfolgte eine Kultur durch 24 h Stehen bei 37 ºC. Die Urease-Aktivität in diesen Kulturen betrug 0,1 U/ml.
Die Zellen wurden aus den Kulturen durch Zentrifugation gesammelt, mit 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 7,2) zweimal gewaschen, in einer Flüssigkeit suspendiert, die 30 ml 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 7,2), 0,02 M EDTA und 0,01 M Dithiothreit enthielt, und einer Ultraschallbehandlung unterworfen; der überstand wurde der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat unterzogen, und die mit einer Sättigung von 40 % bis 70 % erhaltenen Niederschläge wurden gesammelt und in 10 ml 0,05 M Phosphat-Puffer gelöst, über Nacht dialysiert und gefriergetrocknet, wonach 260,4 mg rohes Enzym- Pulver der Säure-Urease erhalten wurde. Die Urease-Aktivität betrug 0,5 U/mg, und der Wirkungsgrad der Reinigung betrug 65,1 %.
Die allgemeinen Eigenschaften des rohen Enzym-Pulvers sind die folgenden:
Optimaler pH-Wert pH 2 bis 4,5;
Optimale Temperatur 60 ºC bis 70 ºC;
pH-Wert-Stabilität: Stabil bei pH 2 bis 10, wenn 2 h bei 37 ºC behandelt;
Thermische Stabilität: Stabil unterhalb von 60 ºC, wenn 2 h bei pH 4 behandelt.
Dann wurde das rohe Enzym-Pulver in raffiniertem Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) gelöst, so daß die Konzentration 0,02 U/ml oder 0,1 U/ml betrug, und die Mischung wurde bei 30 ºC gehalten, um eine Zersetzung des Carbamids in dem raffinierten Sake zu bewirken; das Ergebnis ist in der Tabelle 1 angegeben. Ein im Handel erhältliches Urease-Präparat aus Canavalia Adans. wurde mit 10 U/ml als Kontrolle verwendet. Das Carbamid in dem raffinierten Sake wurde bei der 5 d dauernden Behandlung mit 10 U/ml der Urease aus Canavalia Adans. nur etwa zur Hälfte zersetzt, wohingegen die Säure-Urease bei einem so niedrigen Gehalt wie 0,1 U/ml das Carbamid in nur 1 d vollständig zersetzte.
Die Aktivität der Säure-Urease und diejenige der Urease aus Canavalia Adans. wurden durch Kolorimetrie mittels der Nitroprussid-Methode auf Ammoniak bestimmt, das bei pH 4,0 bzw. pH 7,0 produziert wurde. Der Carbamid-Gehalt in dem raffinierten Sake wurde mittels der enzymatischen Methode unter Verwendung NADP&spplus;-abhängiger Glutamat-Dehydrogenase auf Ammoniak bestimmt, das durch Zersetzung von Carbamid mit Urease produziert worden war.
Diese Methoden der Bestimmung wurden auch in den folgenden Beispielen angewandt. Tabelle 1 Tage der Behandlung Art und Menge der eingesetzten Urease Säure-Urease Säure-Urease aus Canavalia Adans.

Beispiel 2

Zu rohem Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) wurde das in Beispiel 1 erhaltene rohe Enzym- Pulver der Säure-Urease hinzugefügt, so daß die Aktivität der Säure-Urease 0,01 U/ml oder 0,003 U/ml betrug, und die Mischung wurde bei 10 ºC oder bei 15 ºC gehalten, um das Carbamid zu zersetzen. Wie in der Tabelle 2 angegeben ist, war das Carbamid in dem rohen Sake nach 8 d der Behandlung mit 0,003 U/ml der Säure-Urease bei 10 ºC vollständig zersetzt. Ein sensorischer Test ergab, daß der nach der Behandlung erhaltene raffinierte Sake qualitativ wünschenswerter mit weniger (unerwünschtem) Beigeschmack war als der raffinierte Kontroll-Sake (der nicht mit dem rohen Enzym-Pulver der Säure-Urease behandelt worden war). Tabelle 2 Tage der Behandlung Temperatur Menge der Urease

Beispiel 3

Zellen wurden aus 4 l der Kultur von Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM BP-1454) gesammelt, die durch Kultivieren in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, und gefriergetrocknet, wodurch 2,0 g getrocknete Zellen erhalten wurden. Die Aktivität der Säure-Urease dieser getrockneten Zellen betrug 0,35 U/mg.
Roher Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) wurde 1 min bei 75 ºC pasteurisiert und rasch auf 30 ºC abgekühlt; hierzu wurden die oben beschriebenen getrockneten Zellen hinzugefügt, so daß die Aktivität der 0,01 U/ml oder 0,003 U/ml betrug, und die Mischung wurde bei 30 ºC gehalten. Die Änderung der Konzentration des Carbamids mit der Zeit ist in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Tage der Behandlung Menge der Urease

Beispiel 4

Raffinierter Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) wurde 15 min bei 62 ºC pasteurisiert und rasch auf 55 ºC abgekühlt; hierzu wurde das in Beispiel 1 erhaltene rohe Enzym-Pulver der Säure-Urease hinzugefügt und aseptisch aufgelöst, so daß die Aktivität der 0,003 U/ml betrug, und die Mischung wurde rasch auf Raumtemperatur abgekühlt und unter den für raffinierten Sake üblichen Bedingungen aufbewahrt. Die Änderung der Konzentration des Carbamids mit der Zeit ist in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Tage der Behandlung Menge der Urease Temperatur der Mischung

Beispiel 5

Zu der fertigen Maische von Sake nach der Beendigung der Gärung (die 18 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,2) wurde das in Beispiel 1 erhaltene rohe Enzym-Pulver der Säure-Urease hinzugefügt, so daß die Aktivität 0,01 U/ml betrug, und die Mischung wurde bei 13 ºC gehalten und 3 Tage später in Fässer filtriert. Das Carbamid in der fertigen Maische war in 3 Tagen vollständig zersetzt, wie aus Tabelle 5 hervorgeht. Kein Carbamid wurde in dem Sake in den Fässern nach der Filtration der fertigen Maische nachgewiesen. Tabelle 5 Tage der Behandlung Sake in Fässern Carbamid (ppm)

Beispiel 6

In Bier (das 4,2 % Alkohol und 5,1 ppm Carbamid enthielt; pH 4,2) wurde das in Beispiel 1 erhaltene rohe Enzym-Pulver der Säure-Urease hinzugefügt, so daß die Konzentration 0,003 U/ml betrug, und die Mischung wurde 3 d bei 10 ºC gehalten. Die Änderung der Konzentration des Carbamids mit der Zeit ist in Tabelle 6 aufgeführt. Das Carbamid sollte in drei Tagen vollständig zersetzt werden. Ein sensorischer Test ergab, daß das so behandelte Bier besser war und weniger (unerwünschten) Beigeschmack hatte als Bier ohne die Behandlung mit der Säure-Urease. Tabelle 6 Tage der Behandlung Carbamid (ppm)

Beispiel 7

Zellen wurden durch Zentrifugation aus 4 l der Kultur von Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM BP-1454) gesammelt, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, und gefriergetrocknet, wodurch 2,0 g getrocknete Zellen erhalten wurden. Die Aktivität der Säure- Urease in diesen getrockneten Zellen betrug 0,35 U/mg. Diese getrockneten Zellen wurden in raffiniertem Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) mit der Konzentration von 0,5 mg/ml suspendiert und 6 h bei 50 ºC gehalten, so daß das Carbamid vollständig verschwand.

Beispiel 8

Zu Wein (der 12,1 % Alkohol und 6,2 ppm Carbamid enthielt; pH 3,7) wurden in Beispiel 7 erhaltene, Säure-Urease enthaltende getrocknete Zellen hinzugefügt, so daß die Aktivität 0,03 U/ml betrug, und 5 d bei 15 ºC gehalten, so daß das Carbamid in dem Wein vollständig verschwand.
Dann wurden die Zellen aus dem Wein entfernt, und der Wein wurde in einem sensorischen Test mit Wein ohne Behandlung mit den Zellen verglichen. Der mit den Zellen behandelte Wein war besser und hatte weniger (unerwünschten) Beigeschmack.

Beispiel 9

Zu Whisky-Maische (die 5,3 % Alkohol und 5,0 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) wurde das in Beispiel 1 erhaltene rohe Enzym-Pulver der Säure-Urease hinzugefügt, so daß die Konzentration 0,01 U/ml betrug, und die Mischung wurde 24 h bei 22 ºC gehalten, so daß das Carbamid in der Whisky-Maische vollständig zersetzt wurde.
Die so behandelte Whisky-Maische und eine Whisky-Maische ohne eine solche Behandlung wurden jeweils zweimal in einer Glas-Destillations-Apparatur destilliert, wodurch Whisky- Erzeugnisse, die 50 % Alkohol enthielten, erhalten wurden. Diese beiden Whisky-Erzeugnisse wurden in einem sensorischen Test miteinander vergleichen; das Whisky-Erzeugnis nach der Behandlung war besser und hatte weniger (unerwünschten) Beigeschmack.

Beispiel 10

Zu Reis-Shochu-Maische (die 17,5 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 3,8) wurden in Beispiel 7 erhaltene, Säure-Urease enthaltende getrocknete Zellen hinzugefügt, so daß die Aktivität 0,03 U/ml betrug, und 2 d bei 15 ºC gehalten, so daß das Carbamid in der Shochu-Maische vollständig verschwand.
Die Shochu-Maische mit den zugesetzten Zellen und diejenige ohne die Zellen wurden unter vermindertem Druck destilliert, wonach Shochu-Erzeugnisse mit 40 % Alkohol erhalten wurden. Diese beiden Produkte wurden in einem sensorischen Test verglichen. Das nach der Behandlung erhaltene Erzeugnis war besser und hatte weniger (unerwünschten) Beigeschmack.

Beispiel 11

Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14511, FERM BP-1454), der durch Stabkultur in einem aus 0,5 % Glucose, 1,0 % Polypepton, 1,0 % Hefeextrakt, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5 % Kochsalz, 1,0 % Calciumcarbonat und 1,5 % Agar bestehenden Medium kultiviert worden war, wurde in zwei 1 Liter-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils 500 ml eines sterilisierten Mediums pH 7,0 (neutralisiert mit 30-proz. Ätznatron) enthielten, das aus 2,0 % Glucose, 2,0 % wasserfreiem Natriumacetat, 1,0 % Polypepton, 1,0 % Fleischextrakt, 0,2 % Hefeextrakt, 0,5 % Kochsalz und 0,005 % Mangansulfat (mit etwa 4 mol Kristallwasser pro 1 mol) bestand; danach erfolgte eine Kultur durch 24 h Stehen bei 37 ºC, so daß der Count lebenfähiger Zellen 2,4 x 10&sup8;/ml betrug. Die resultierende Impf-Kultur wurde 10 min bei 10 000 UpM zentrifugiert, und die gesammelten Zellen wurden mit 500 ml sterilisiertem Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Die gewaschenen Zellen wurden In 10 ml sterilisiertem Wasser suspendiert.
Zu dem Gemisch aus gedämpftem Reis und Koji, entsprechend 30 kg schmierig-gemahlenem Reis und 30 kg Koji-Reis, wurden 120 l Wasser hinzugefügt, und das Gemisch wurde durch 5 h Halten bei 55 ºC verzuckert. Die verzuckerte Mischung wurde durch Erwärmen auf 70 ºC und 5 min Halten dieser Temperatur sterilisiert und dann auf 35 ºC abgekühlt. Hierzu wurden 10 ml der oben beschriebenen Suspension lebensfähiger Zellen von Lactobacillus fermentum JCM 5867 gegeben. Dann wurde die Mischung 2 d bei 35 ºC inkubiert. Der Count der Milchsäure- Bakterien wurde so eingestellt, daß er 2 x 10&sup8;/ml betrug. Die Mischung wurde auf 28 ºC gekühlt und dann mit Sake-Hefe Kyokai-7 inokuliert, so daß die Konzentration 2 x 10&sup7;/ml betrug; die Maische erhielt den ersten Zusatz nach 4 d Inkubation, wurde 1 d ohne Zusatz (odori) sich setzen gelassen und erhielt dann den zweiten Zusatz und den dritten Zusatz; dann ließ man die Gärung unter konventioneller Temperaturänderung fortschreiten. Dann erhielt am 19. Tag die Maische den vierten Zusatz, und der Alkohol und der unraffinierte Sake wurden in Fässer filtriert. Die Mengen der Bestandteile in jeder Stufe des Maischens in diesem Beispiel sind in der Tabelle 7 aufgeführt. Die Veränderungen der Impf-Maische sind in der Tabelle 8 zusammengestellt. Die Ergebnisse der Analyse des in Fasser filtrierten Sake sind in Tabelle 9 dargestellt. Wie aus den Tabellen deutlich hervorgeht, wurde Carbamid kaum nachgewiesen, da es durch die Säure-Urease in der fertigen Maische, die aus der mit den Säure-Urease produzierenden Milchsäure-Bakterien hergestellten Impf-Maische zersetzt worden war, wohingegen Carbamid in der Kontrolle nachgewiesen wurde. Die Qualität des Produkts war ebenfalls besser; es hatte einen volleren Geschmack als die Kontrolle. Tabelle 7 Mengen der Bestandteile (kg) in jeder Stufe des Maisch-Prozesses Sake-Hefe Kultur Zusatz Insgesamt Voll-Reis Gedämpfter Reis Koji-Reis Wasser Tabelle 8 Veränderungen der Impf-Maische mit der Zeit Tage nach Zusatz der Hefe Baumé (Bé) Kontrolle Vorliegende Erfindung Alkohol (Alk.) (%) Acidität (T.A) Aminosäure-Acidität (A.A) Lactobacillus fermentum Milchsäure (ppm) Tabelle 9 Ergebnisse der Analyse des in Fässer filtrierten Sake Carbamid (ppm) Kontrolle Vorliegende Erfindung

Beispiel 12

Zu dem Gemisch aus gedämpftem Reis und Koji, das 60 kg schmierig-gemahlenem Reis und 40 kg Koji-Reis entsprach, wurden 180 l Wasser hinzugefügt, und das Gemisch wurde durch 5 h Halten bei 55 ºC verzuckert. Die verzuckerte Mischung wurde durch Erwärmen auf 70 ºC und 5 min Halten dieser Temperatur sterilisiert und dann auf 35 ºC abgekühlt. Hierzu wurden 40 ml der in Beispiel 11 beschriebenen Suspension lebensfähiger Zellen von Lactobacillus fermentum JCM 5867 gegeben. Dann wurde die Mischung 2 d bei 35 ºC inkubiert. Der Count der Milchsäure-Bakterien wurde so eingestellt, daß er 2 x 10&sup8;/ml betrug. Die gesamte Menge dieser verzuckerten Mischung (4. Zusatz) wurde der Maische am 12. Tag zugesetzt, und der 5. Zusatz und Alkohol wurden am 18. Tag hinzugefügt, und der Sake wurden in Fässer filtriert. Die Mengen der Bestandteile in jeder Stufe des Maischens in diesem Beispiel sind in der Tabelle 10 aufgeführt, und die Veränderungen des Carbamid-Gehalts der Maische mit der Zeit sind in der Tabelle 11 dargestellt. Die letztere Tabelle zeigt an, daß der Carbamid-Gehalt in der Maische, zu der der 4. Zusatz mit den Säure-Urease produzierenden Milchsäure-Bakterien (4. Zusatz) hinzugefügt worden war, nach der Zugabe abnahm und zur Zeit der Filtration in Fässer Null geworden war, was nahelegt, daß das Carbamid durch Säure-Urease zersetzt worden war. In dem Sake in den Fässern wurde keinerlei Carbamid nachgewiesen. Ein sensorischer Test ergab, daß die Qualität des Sake in den Fässern hervorragend war und der Sake einen vollen und erfrischenden Geschmack hatte. Tabelle 10 Mengen der Bestandteile (kg) in jeder Stufe des Maisch-Prozesses Sake-Hefe Kultur Zusatz Insgesamt Voll-Reis Koji-Reis Gedämpfter Reis Wasser Tabelle 11 Veränderung des Carbamid-Gehalts in der Maische (ppm) Alter der Maische (d) Vorlieg.Erfindung Sake in Fässern Kontrolle

Beispiel 13

Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14633, FERN BP-1448), der auf einem im Handel erhältlichen halbfesten GAM-Medium (Nissui Seiyaku Co., Japan) kultiviert worden war, wurde in einen 200 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, der 50 ml eines sterilisierten Impf-Mediums pH 7,0 (neutralisiert mit 30-proz. Ätzalkali) enthielt, das aus 3 % Glucose, 1,5 % Polypepton, 1 % Fleischextrakt, 0,8 % Hefeextrakt, 0,5 % Kochsalz, 0,2 % wasserfreiem Natriumacetat, 0,005 % Mangansulfat (mit etwa 4 mol Kristallwasser pro 1 mol) und 0,001 % Cobaltsulfat (Heptahydrat) bestand; danach erfolgte eine Kultur durch 24 h Stehen bei 34 ºC. 5 ml dieser Impf-Kultur wurden in einen 200 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml eines sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung enthielt; danach erfolgte eine Kultur durch 2 d Stehen bei 32 ºC. Die Aktivität der Säure-Urease dieser Kultur wurde bestimmt, und die Potenz betrug 0,6 U/ml.
5 ml der gemäß obiger Beschreibung erhaltenen Kultur wurden 10 min bei 3000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit Wasser gewaschen, zentrifugiert und in 1 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, dem 50 ul Isobutanol zugesetzt worden waren, und 15 min bei 50 ºC gehalten, wonach eine Enzym-Lösung erhalten wurde, deren optimaler pH-Wert unter Verwendung von 0,2 M Citrat-Puffer bestimmt wurde. Das Ergebnis ist in der Tabelle 12 dargestellt. Wie aus der Tabelle hervorgeht, hatten alle Stämme in der vorliegenden Erfindung starke Aktivitäten der Zersetzung von Harnstoff im sauren Bereich. Tabelle 12 pH-Wert Relative Aktivität (%)
Zellen wurden aus 80 ml der Kultur durch Zentrifugation gesammelt, durch Eintauchen in 50-proz. Alkohol sterilisiert, zentrifugiert und gefriergetrocknet. Die resultierenden gefriergetrockneten Zellen wogen 16,9 mg und hatten eine Säure-Urease-Aktivität von 1,44 U/mg.
Die getrockneten Zellen wurden zu einem raffinierten Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) hinzugefügt, so daß die Aktivität der Säure-Urease 0,01 U/ml betrug, und bei 30 ºC gehalten, um das Carbamid in dem raffinierten Sake zu zersetzen. Das Ergebnis ist in der Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13 Tage der Behandlung Carbamid (ppm)

Beispiel 14

Die in der folgenden Tabelle 14 aufgeführten Stämme, die auf einem im Handel erhältlichen halbfesten GAM-Medium (Nissui Seiyaku Co., Japan) kultiviert worden waren, wurden in 200 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils 50 ml einer sterilisierten, im Handel erhältlichen halbfesten GAM- Brühe (Nissui Seiyaku Co., Japan) enthielten; danach erfolgte eine Kultur durch 24 h Stehen bei 34 ºC. 5 ml jeder der so erhaltenen Impf-Kulturen wurden in 200 ml- Erlenmeyer-Kolben überführt, die jeweils 100 ml eines sterilisierten Mediums enthielten, das durch Zusatz von 0,005 % Mangansulfat (mit etwa 4 mol Kristallwasser auf 1 mol) zu der gleichen, im Handel erhältlichen GAM-Brühe erhalten worden war; danach erfolgte eine Kultur durch 3 d Stehen bei 32 ºC. Die Aktivitäten der Säure-Urease dieser Kulturen wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14 Stamm Säure-Urease-Aktivität in der Kultur (U/ml) Streptococcus bovis PG-186 (IFO 14634, FERM BP-1449) Bifidobacterium choerinum PG-196 (IFO 14635, FERM BP-1450)
Zellen wurden aus 5 ml der nach der oben beschriebenen Methode erhaltenen Kulturen durch 10 min Zentrifugation bei 3000 UpM gesammelt, mit Wasser gewaschen, zentrifugiert und in 1 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, dem 50 ul Isobutanol zugesetzt worden waren, und 15 min bei 50 ºC gehalten; die resultierende Enzym-Lösung wurde unter Verwendung von 0,2 M Citrat-Puffer auf ihren optimalen pH-Wert untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle 15 dargestellt. Wie aus der Tabelle hervorgeht, zeigten die Stämme in der vorliegenden Erfindung starke Aktivitäten der Zersetzung von Harnstoff im sauren Bereich.
Zellen wurden durch Zentrifugation aus 80 ml jeder der Kulturen der Stämme PG-186 und PG-196, die nach der oben beschriebenen Methode erhalten worden waren, gesammelt, durch 4 h Eintauchen in 50-proz. Alkohol sterilisiert, zentrifugiert und gefriergetrocknet. Die so erhaltenen gefriergetrockneten Zellen wogen 30,2 mg und 64,0 mg und hatten eine Säure-Urease-Aktivität von 0,38 U/mg bzw. 0,6 U/mg.
Die getrockneten Zellen wurden zu einem raffinierten Sake (der 20 % Alkohol und 30 ppm Carbamid enthielt; pH 4,3) hinzugefügt, so daß die Aktivität der Säure-Urease 0,01 U/ml betrug, und bei 30 ºC gehalten, um das Carbamid in dem raffinierten Sake zu zersetzen. Das Ergebnis ist in der Tabelle 16 dargestellt. Tabelle 15 pH-Wert Relative Aktivität (%) Tabelle 16 Tage der Behandlung Urease aus

Claims

1. Verfahren zur Senkung des Carbamid-Gehaltes alkoholischer Flüssigkeiten, umfassend das Behandeln Carbamid enthaltender alkoholischer Flüssigkeiten mit Urease, dadurch gekennzeichnet, daß die Urease eine Säure-Urease ist, die einen optimalen pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 hat und von Säure-Urease produzierenden Mikroorganismen abgeleitet ist, die zu den Gattungen Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus oder Bifidobacterium gehören und zur Produktion der Säure-Urease befähigt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die alkoholischen Flüssigkeiten solche, die mittels des Verfahrens des Brauens erzeugt worden sind, oder Zwischenprodukte desselben sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Brauerzeugnisse Sake, Bier, Wein, Obstwein, Samshu, Whisky-Maische, Shochu-Maische oder Brandy-Maische sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Säure-Urease eine solche ist, die 2 mol Ammoniak und 1 mol Kohlenstoffdioxid-Gas aus 1 mol Carbamid und 1 mol Wasser erzeugt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die alkoholischen Flüssigkeiten mit der Säure-Urease in Form von die Urease enthaltenden Bakterien-Zellen oder rohen oder gereinigten Säure-Urease-Präparaten behandelt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Behandlung in der Weise durchgeführt wird, daß die Säure-Urease den alkoholischen Flüssigkeiten in einer Menge von 0,00001 Einheiten/ml bis 1 Einheit/ml zugesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Behandlung in der Weise durchgeführt wird, daß man lebensfähige Zellen von Säure-Urease produzierenden Mikroorganismen während der Vorgänge der alkoholischen Gärung bei der Erzeugung der alkoholischen Flüssigkeiten koexistieren läßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin man die Säure-Urease produzierenden Mikroorganismen inokuliert und während des Vorgangs zur Erzeugung der Hefe-Maische oder des Vorgangs zur Herstellung eines saccharifizierten Gemischs wachsen läßt und dann der Haupt-Gärung aussetzt.