Hintergrund der Erfindung
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Die ursprüngliche chemische Methode, Pulp aus Holz herzustellen, hatte den Aufschluss
von Lignin im Holz mit Natriumsulfid und Natriumhydroxid zum Inhalt. Dieses Verfahren
wird als Sulfatverfahren oder Kraftzellstoffverfahren bezeichnet.
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Holzstoff der mittels des Kraftzellstoffverfahrens hergestellt wird, enthält im allgemeinen
als Rückstand 5-8 Gew.% modifiziertes Lignin, welches dem Pulp die charakteristische
braune Farbe verleiht. Um einen Pulp von sehr hohem Weissgrad und Weissgradstabilität
zu erhalten, muss das Lignin durch bestimmte Oxidationsmittel, die gewöhnlich als
Bleichchemikalien bezeichnet werden, entfernt werden. Es existieren viele Bleichprozesse
und fast alle beginnen mit dem Chlorierungs-Extraktions-Schritt (C-E). Während dieses
C-E Schrittes tritt ein Verlust von Cellulosefasern ein. Die C-E Abwässer die vom
behandelten Pulp herrühren enthalten eine sehr grosse Anzahl von organischen
Verbindungen die einen gebundenen Chlorgehalt von 2.5 - 3.5 kg/Tonne Pulp enthalten.
Einige dieser Verbindungen, hauptsächlich die chlorierten Phenole, sind dafür bekannt,
dass sie toxische, mutationsauslösende und krebserzeugende Wirkung haben. (Alberti,
B.N. and Klibanow, A.M. (1981) Biotechnology and Bioengineering Symp. 11:373-379).
Diese Abwässer sind sehr ungeeignet zum Recyclisieren innerhalb des Aufschlusssystems
im Hinblick auf ihren hohen Anteil von korrosiven Chloriden. Es wurden deshalb seit langen
von der Industrie Alternativmöglichkeiten für die Chlorbleiche gesucht.
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Es hat sich gezeigt, dass Wasserstoffperoxid aus Sulfitzellstoff Lignin genügend entfernt,
aber an sich ist es ein relativ unwirksames Mittel zum Bleichen von Kraftzellstoff. Wenn es
jedoch in Verfahrensreihen neben Chlor enthaltenden Bleichmitteln verwendet wird, so
leistet Peroxid einen signifikanten Beitrag zur Ligninzerstörung, zum Weissgrad des
Zellstoffes und zur Weissgradstabilität.
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Es wurde extensiv untersucht, Sauerstoff und Ozon im Bleichprozess mit anzuwenden. Der
Hauptnachteil dieser Verbindungen ist ihr nicht spezifischer oxidative Angriff auf
Cellulosefasern. Die Folge sind niedere Pulp Ausbeuten und die Pulp Eigenschaften sind
im allgemeinen schlechter gegenüber solchen, die durch eine Chlorbleichfolge erhalten
werden.
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Eine Forschung, die durch das U.S. Department of Agriculture's (USDA) Forest Products
Laboratory gefördert wurde, hat gezeigt, dass 50-75% des Ligninrückstandes durch Pilz
Kulturen von Phanerochaete chrysosporium in 6 bis 8 Tagen beseitigt wurde. Eine längere
Inkubation hatte eine grössere Ligninreduktion zur Folge, aber die Daten wurden
quantitativ nicht bestimmt. Während der Inkubation wurde der Pulp wesentlich heller in der
Farbe (Kirk, T.K. and Chang, H. (1981) Enzyme Microb. Technol. 3:189-196).
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Bleichen ist bei Verwendung von Pilz Kulturen unpraktisch langsam. Es wurde gefunden,
dass die Lignin Entfernung aus Kraftzellstoff (z.B. Erniedrigung der Kappa-Zahl) ein
dreistufiger Vorgang ist: 1) Keine Lignin Entfernung während des Wachstums des Pilzes
im Pulp über die ersten zwei Tage, 2) eine schnelle Ligninzerstörung während der
folgenden zwei Tage, und 3) eine langsamere Ligninzerstörung danach. Die anfängliche
zwei Tage Verzögerung ist auf den sekundären metabolischen Einfluss der
Ligninzerstörung zum Pilz Wachstum zurückzuführen.
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Ein anderer Nachteil der Pilz Bleichung ist, dass diese Organismen Enzyme enthalten,
welche sowohl Cellulose als auch Hemicellulose abbauen. In jedem wirksamen
Bleichschema muss der Abbau von Cellulosefasern vollständig unterdrückt werden, da die
Cellulosefasern nach dem Kraftzellstoffaufschluss besonders angreifbar sind. Mutanten
mit weniger Cellulase haben im bestimmten Mass dieses Problem überwunden, aber sie
sind schwierig zu steuern und einige sind weniger wirksam im Abbau von Lignin als
normale Pilz Kulturen. Ein letzter Nachteil in der Verwendung von Pilzzellen ist der, dass
diese nur optimal in einer Umgebung arbeiten können, wo die Temperatur und mikrobielle
Verunreinigung sorgfältig kontrolliert werden. Das Ziel des mechanischen
Holzaufschlusses ist, einen Pulp mit hoher Ausbeute herzustellen. Vor einigen Jahren war
der mechanische Holzaufschluss auf ein einziges Verfahren, dem Zerkleinern von
Rundholz gegen einen Schleifstein beschränkt, aber seitdem hat sich der mechanische
Holzaufschluss zu einer Reihe von Verfahren entwickelt, die chemische, thermische und
Druck Technologien verwenden (Casey, J.P. (1983) Tappi Journal 66:95-96). Ein Nachteil
der augenblicklich verwendeten Methoden ist, dass sie einen Pulp mit geringer
Bindefestigkeit und Weissgradstabilität liefern.
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Thermomechanische Holzstoff (TMP)-, chemothermomechanische Holzstoff (CTMP)- und
chemomechanische Holzstoff (CMP)-Verfahren haben sich entwickelt, um die Holzstoff-
Qualität zu verbessern und um die Anwendung in Fertigprodukten zu vergrössern.
Thermomechanischer Aufschluss ist das vorherrschende Alternativaufschlussverfahren mit
hohen Ausbeuten. Seine Haupteinschränkung ist die Erfordernis einer hohen elektrischen
Energiezufuhr wovon die meiste als minderwertige Hitze endet.
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Die Verwendung von thermomechanischem Holzstoff würde sehr steigen, wenn eine
Erhöhung der Festigkeitseigenschaft und die Stabilität des Weissgrades, z.B. das
Verhindern der Nachdunklung verbessert werden könnte. Die Nachdunklung von
handelsüblichem Pulp kann in Verbindung gebracht werden mit der Anwesenheit von
oxidierten Gruppen. Diese Gruppen sind prinzipiell von verbleibenden
Ligninabbauprodukten abgeleitet. Es wird vorausgesetzt, dass die Einführung von Aldehyd-
und Ketongruppen in die Cellulose nach dem Bleichen bei der Nachdunklung auch
mitwirkt, wenn auch in einem geringeren Ausmass (Springer, E.L. (1983) Tappi Journal 66:
93-96). Die Abbauprodukte von Lignin verursachen die Nachdunklung durch
Mechanismen, die jetzt in einigen Laboratorien erforscht werden. Es wurde vorausgesetzt,
dass α-Carboxylgruppen nachbarständig zu aromatischen Ringen im verbleibenden Lignin,
Tageslicht absorbieren und diese Energie in Sauerstoff umwandeln, welcher seinerseits
mit den phenolischen Gruppen des Lignins reagiert, was zur Bildung von gefärbten
(gelben) Chinonen führt (Rapson, W.H. (1969) Appita 23:102-114). Diese Reaktion kann
nur an "exponierten" Ligninringen welche eine freie Hydroxylgruppe enthalten, stattfinden.
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Grobteiliges TMP kann mit relativ geringer Energiezufuhr hergestellt werden. Jedoch, das
nachfolgende sekundär Raffinieren benotigt beträchtlich Energie zur Entwicklung der
Pulpeigenschaften, (Higuchi, T. (1982) Experientia 38:159-166). Versuche haben gezeigt,
(Pilon, L., Desrochers, M., Jurasek, L., Neumann, P.J. (1982) Tappi Journal 65: 93-96)
dass die Behandlung von grobteiligen TMP mit P. chrysosporium Kulturen während
14 Tagen den Energiebedarf für ein sekundäres Raffinieren wesentlich reduzieren kann
ohne Verlust der Pulpqualität. Vorläufige Studien zeigten, dass der Energiebedarf um einen
gegebenen Freiheitsgrad in Pilz behandeltem Pulp zu entwickeln, um 25-30% reduziert
wurde verglichen mit unbehandeltem Pulp. Weiter sind die Pulpeigenschaften, gemessen
am Burst-Index, beträchtlich verbessert worden. Da das Raffinieren von Holzstoff nach
dem Anschwellen in Alkali die Festigkeitseigenschaft wesentlich verbessern kann, wurden
beide, der Pilz behandelte und unbehandelte Pulp einem Raffinieren nach dem
Anschwellen in Alkali unterworfen. Der mit Pilz behandelte Pulp brauchte 50% weniger
Raffinierenergie als der unbehandelte Pulp, ohne irgendeinen Verlust in den
Festigkeitseigenschaften.
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Die technischen Probleme, Organismen im industriellen Holzstoff anzuwenden,
einschliesslich der TMP Verarbeitung, sind dreifach: a) im Uebertragen auf grösserer Skala
mit der verlangten sorgfältigen Kontrolle von Feuchtigkeit, Belüftung und Temperatur; b) in
der Verhinderung von Verunreinigung durch unerwünschte Organismen; und c) in der
unzweckmässigen Langsamkeit des Ligninabbaus.
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Die ursprüngliche chemische Methode, Pulp aus Holz herzustellen, hatte den Aufschluss
von Lignin im Holz mit Natriumsulfid und Natriumhydroxid zum Inhalt. Dieses Verfahren
wird als Sulfatverfahren oder Kraftzellstoffverfahren bezeichnet.
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Holzstoff der mittels des Kraftzellstoffverfahrens hergestellt wird, enthält im allgemeinen
5-8 Gew.% modifiziertes Lignin als Rückstand, welches dem Pulp die charakteristische
braune Farbe verleiht. Um einen Pulp von sehr hohem Weissgrad und Weissgradstabilität
zu erhalten, muss das Lignin durch bestimmte Oxidationsmittel entfernt werden, die
gewöhnlich als Bleichchemikalien bezeichnet werden. Es existieren viele Bleichprozesse,
aber fast alle beginnen mit dem Chlorierungs-Extraktions-Schritt (C-E). Die Ablauge des
ersten Alkali-Extraktions-Schritt, der beim Bleichen der Chlorierung folgt, üblicherweise als
E&sub1; Abwasser bezeichnet, enthält über 80% der Farbe im Abwasser, die von der
Kraftbleichanlage ausfliesst (Kirk, T.K. and Chang, H-M. (1981) Enzyme Microb.
Technol. 3:189-196). Das Abwasser muss als Folge seines hohen Anteils an korrosiven
Chloriden entsorgt werden. Polymere Ligninabbauprodukte, die Hauptfaktoren der Farbe
im Abwasser der Bleichanlage, sind beim derzeitigen Abwasser Behandlungsverfahren mit
Bakterien beständig gegen Abbau. Wechselweise Behandlungsverfahren wie Ultrafiltration,
Aktivkohleadsorption und massive Kalkfällung werden für eine wirksame Beseitigung der
Farbe verlangt, sind aber sehr teuer. Sparsame Farbentfernungssysteme existieren
gegenwärtig nicht, wären aber wünschenswert für eine Abwasser Behandlung bevor das
Wasser in den Abfluss geht.
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Pilz Entfärbungssysteme wurden studiert. In Laborversuchen, die durch USDA gefördert
wurden (Kirk, T.K. (1983) in The Filamentous Fungi, Vol. 4, Fungal Technology,
Smith, J.E., Berry, D.R., Kristiansen, B., eds., Edward Arnold Press, London) wurden mehr
als 80% Entfärbung von Bleichabwässern, die durch Chlorierung und Alkalibehandlung von
Sulfatgekochten synthetischen Ligninen hergestellt wurden, in 24 Stunden unter
Verwendung von Phanerochaete chrysosporium Kulturen erreicht.
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Es gibt drei Probleme bei der Verwendung von Pilzkulturen um Abwässer aus
Bleichanlagen zu entfärben: (1) der Pilz verlangt sorgfältige Kulturbedingungen (wie
Feuchtigkeit, Durchlüftung, Temperatur und pH) die nicht vereinbar sind mit industriellen
Verfahrensumgebungen; (2) Pilze benötigen einen langen Zeitraum und bauen Lignin nur
sehr langsam ab; und (3) Pilze können nicht auf Lignin wachsen. Eine zusätzliche
Nahrungsquelle muss hinzugefügt werden, um das Pilzwachstum zu unterstützen.
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In TAPPI JOURNAL, Vol. 67, No. 10, October 1984 bespricht der Erfinder der vorliegenden
Patentanmeldung die mögliche Verwendung von Phanerochaete chrysosporium Enzymen
zum Bleichen, Aufschliessen und Entfärben von Abwasser. Jedoch wird nicht offenbart,
dass die ligninlösende Mischung, die zum Bleichen von Kraftzellstoff, Behandeln von
mechanisch hergestelltem Holzstoff oder Entfärbung von E&sub1; Abwasser verwendet wird, von
einer mutanten Kultur von Phanerochaete chrysosporium durch Ultrafiltration durch ein
10K Filter geerntet wird.
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Der Erfindungsgegenstand betrifft ein Verfahren ausgewählt aus:
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a) Bleichen von Kraftzellstoff; oder
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b) Verbesserung der Festigkeitseigenschaften und Weissgradstabilität von mechanisch
hergestelltem Holzstoff; oder
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c) Entfärben von E&sub1; Abwasser,
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durch Behandeln dieses Kraftzellstoffes oder mechanisch hergestellten Holzstoffes oder
E&sub1; Abwassers mit einer ligninlösenden Mischung, welche ein Konzentrat des
extrazellularen Nährmediums von Kulturen von Phanerochaete chrysosporium ist, dadurch
gekennzeichnet, dass das Konzentrat von einer mutanten Kultur mit den
Identifikationsmerkmalen von NRRL 15978 erhalten wird und dass das extrazellulare
Nährmedium von einer Kultur des Mutantenstammes durch Zentrifugieren und
Konzentrierung mittels Ultrafiltration durch ein 10K Filter geerntet wird. Die ligninlösende
Mischung enthält Ligninasen, welche hochspezifisch sind und die schwer zu beseitigende
restliche Ligninpolymere in chemisch hergestellten Zellstoffen ohne Beschädigung der
Cellulosefasern abbauen.
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Diese Ligninasen können Kraftzellstoff bleichen und sind augenblicklich aktiv. So gibt es
keine Verzögerung in der Aktivität wie bei Pilzkulturen. Da die Ligninasen biologische
Moleküle sind, sind sie vorteilhafterweise nicht korrosiv, verursachen keine Verunreinigung
und stellen keine Umweltgefahr dar, wenn sie freigesetzt werden.
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Der Erfindungsgegenstand betrifft auch die Verbesserung der Festigkeits- eigenschaften
von Holzstoff, einschliesslich TMP, CTMP und CMP durch deren Behandlung mit dieser
ligninlösenden Mischung. Die ligninlösenden Enzyme die in diesem extrazellulären
Nährmedium gegenwärtig sind, bauen selektiv nur die chemischen Komponenten die im
Lignin gebildet werden ab, aber nicht Cellulose oder Hemicellulose.
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Die ligninlösende Mischung kann die Festigkeitseigenschaften dieser Pulpen verbessern
und die Enzyme darin sind augenblicklich aktiv. So gibt es keine Verzögerung in der
Aktivität wie bei Pilzkulturen. Da die ligninlösenden Enzyme biologische Moleküle sind, sind
sie vorteilhafterweise nicht korrosiv, verursachen keine Verunreinigung und stellen keine
Umweltgefahr dar, wenn sie freigesetzt werden.
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Wie oben angedeutet betrifft der Erfindungsgegenstand auch die Entfärbung von E&sub1;
Abwasser durch Behandlung des Abwassers mit einer ligninlösenden Mischung gemäss
dem anhängenden Anspruch 1.
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Die ligninlösende Mischung die im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden kann
wurde von einem neuen stabilen Mutantenstamm des Weissfäulepilzes Phanerochaete
chrysosporium isoliert. Der neue Mutantenstamm, bezeichnet als SC 26, wurde in der
permanenten Sammlung eines öffentlichen Kultur Depots hinterlegt um für mindestens
30 Jahre erhalten zu werden. Das Kultur Depot ist "The Northern Regional Research
Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, USA". Die
Zugangnummer ist NRRL 15978 und das Hinterlegungsdatum ist der 3. Juli 1985.
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Diese hinterlegte Kultur ist der Oeffentlichkeit zugänglich wie es durch die Patentgesetze
in Ländern verlangt wird, wo Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung, oder des
Nachfolgers eingereicht wurden. Jedoch muss betont werden, dass die Zugänglichkeit des
hinterlegten Stammes nicht eine Lizenz enthält, um die vorliegende Erfindung auszuüben
in Minderung von Patentrechten, die durch Regierungsverordnung erteilt wurden.
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Der neue Mutant SC26 wurde durch UV Mutagenese des wildwachsenden Typs
Phanerochaete chrysosporium, ATCC 24725 erhalten.
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Der neue Mutant SC26 wuchs auf einem Stickstoff-limitierten Spurenelement Medium
ergänzt mit Glucose und auf einen pH von 4.5 gepuffert.
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Die Isolierung und Reinigung der Ligninasen von der extrazellularen Flüssigkeit in der
Fermentation wurde durch Ultrafiltration und FPLC (fast protein liquid chromatography)
unter Verwendung einer Anionaustauschkolonne durchgeführt.
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Die ligninlösende Mischung die im Erfindungsgegenstand verwendet wurde, wurde wie
folgt hergestellt:
Herstellungsbeispiel 1
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Wachstum von Mutant SC26 (NRRL 15978) zur Herstellung eines Fermentationsmedium
enthaltend neue Ligninasen
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Impfgut wurde durch Homogenisieren von 50 ml einer 1.5 Tageskultur von Mutant SC26,
gewachsen in einer 1 Literflasche, enthaltend das folgende als Stickstoff-limitiertes
BIII/Glucosemedium bezeichnetes Medium, hergestellt:
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Das BIII Medium enthält 1.08 x 10&supmin;³M Ammonium-tartrat, 1.47 x 10&supmin;² M KH&sub2;PO&sub4;, 2.03 x 10&supmin;
³M MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 6.8 x 10&supmin;&sup4; M CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 2.96 x 10&supmin;&sup6; M Thiamin.HCl und 10 ml.L&supmin;¹ einer
Spurenelementlösung. Die Spurenelementlösung enthält 7.8 x 10&supmin;³ M Nitriloessigsäure,
1.2 x 10&supmin;² M MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 1.7 x 10&supmin;² M NaCl, 3.59 x 10&supmin;&sup4; M FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 7.75 x 10&supmin;
&sup4;M CoCl&sub2;, 9.0 x 10&supmin;&sup4; M CaCl&sub2;, 3.48 x 10&supmin;&sup4; MZnSO&sub4;.7H&sub2;O,4 x 10&supmin;&sup5; MCuSO&sub4;.5H&sub2;O,2.1 x 10&supmin;
&sup5;M ALK(SO&sub4;)&sub2;.12H&sub2;O, 1.6 x 10&supmin;&sup4; M H&sub3;BO&sub3;, 4.1 x 10&supmin;&sup5; M Na MoO&sub4;.2 H&sub2;O und 2.9 x 10&supmin;³ M
MnSO&sub4;.H&sub2;O.
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Das Medium wurde mit 10% (Gewicht/Liter) Glucose ergänzt und mit 10 mM trans-
Aconitsäure, pH 4.5 gepuffert.
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Flaschen (125 ml, enthaltend 10 ml keimfreies Medium bestehend aus dem oben
beschriebenen Medium) wurden mit 0.5 ml des obigen Homogenates angeimpft und bei
39ºC unverändert gehalten. Die Flaschen wurden an den Tagen 0,3 und 6 mit Wasser
gesättigem O&sub2; gespült. Alternativ wurde ein drehender, biologischer Reaktor (RBC) zum
Wachsen des Pilzes verwendet. 2.5 Liter des oben beschriebenen Mediums wurden mit
100 ml des obigen Homogenates angeimpft und bei 39ºC mit einem RBC Umlauf von
1 rpm mit kontinuierlicher Oxygenierung wachsen gelassen. Die Ligninaseaktivität wurde
periodisch durch Bestimmung der Oxidationsrate von Veratrylalkohol zu Veratrylaldehyd
bestimmt. Die Reaktionsmischungen enthielten 275 ul der extrazellularen Flüssigkeit (von
Flaschen oder dem RBC), 2 mM Veratrylalkohol und unmittelbar nach dem Puffer wurden
0.4 mM H&sub2;O&sub2; zugegeben und bei 310 nm überwacht. Das Protein wurde nach Bradford
(Bradford, M.M (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254) unter Verwendung von
Rinderserumalbumin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) als Standard bestimmt.
Herstellungsbeispiel 2
Isolation und Reinigung der neuen ligninlösenden Enzyme
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Die extracellularen Nährmedien von Kulturen die in Flaschen gewachsen sind, wie oben
beschrieben, wurden durch Zentrifugieren bei 5000 xG, 10 Min., 4ºC erhalten. Das
extracelluare Nährmedium wurde dann durch Ultrafiltration durch ein 10 K Filter
konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wird als ligninlösende Mischung bezeichnnet. Die
ligninlösende Mischung kann ein oder mehrere der rLDM s (ligninlösende Enzyme wie
im folgenden beschrieben und charakterisiert) oder andere ligninlösende Enzyme in
wechselnden Anteilen enthalten. Die rLDM die in dieser ligninlösenden Mischung
enthalten sind, wurden durch FPLC (fast protein liquid chromatography) unter Verwendung
einer Pharmacia Mono Q Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) mit einem Gradient von
Natriumacetatpuffer, pH 6, von 10 mM bis 1 M getrennt. rLDM 1, 2, 3, 4, 5 und 6 eluieren
von der Säule in einer typischen Präparation bei folgenden Natriumacetat Molaritäten:
0.16, 0.18, 0.34, 0.40, 0.58 und 0.43 M um im wesentlichen reines rLDM 1-6 zu geben.
Jedes rLDM ist im wesentlichen frei von anderen rLDM und von nativen Proteinen
einschliesslich ungewünschter natürlicher zersetzender Proteasen. Es gibt Hinweise dieser
Proteasen in rohen Mischungen welche schwierig zu trennen sind (jedes, im wesentlichen
reine rLDM gibt ein negatives Ergebnis im Azocolltest).
Charakterisierung der neuen rLDM
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Die rLDM wurden durch folgende Merkmale charakterisiert:
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(1) Fähigkeit die Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrylaldehyd zu katalysieren;
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(2) Molekulargewicht bestimmt durch SDS-PAGE;
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(3) Aminosäurezusammensetzung;
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(4) Hämgehalt
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(5) Homologie durch Antikörperreaktivität;
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(6) Spezifische Aktivität gegen Lignin Modell Substanzen; und
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(7) Elution von einer FPCL Kolonne bei vorgegebenen Acetatmolaritäten.
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Alle rLDM katalysieren die Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrylaldehyd wie
spektrophotometrisch bei 310 nm überwacht wird. Eine Einheit der Aktivität wird definiert
als die Herstellung von 1 Mikromol Veratrylaldehyd in der durch rLDM katalysierten
Reaktion. Die spezifischen Aktivitäten von typischen Präparaten bei ungefähr 24ºC sind
die folgenden:
Spezifische Aktivität
Einheiten/MG.Minuten
Molekulargewicht kD
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Aminosäurezusammensetzung: Die Aminosäurezusammensetzung wurde durch eine
Modifikation des Verfahrens nach Jones et al. bestimmt (Jones, B.N., Paabo, S. und
Stein, S. (1981) J. Liquid Chromatography 4: 565-586). Das Verhältnis der
Aminosäuren wird, bedingt durch die Beschränkung der Methode und Menge von
Protein, das in der Bestimmung verwendet wird, nur annähernd angegeben. Siehe
Tabelle 1:
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Häm und Kohlenhydrat Inhalt: rLDM 1, 2, 3, 4, 5 und 6 enthalten jede eine einzelne
Protohäm IX Komponente. Alle sind gemäss der Perjodsäurefärbung (PAS) glykosyliert
und binden an Con A-Sepharose (Sigma).
Immunoblot-Verfahren
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Dieses Verfahren wurde verwendet um die rLDM weiter zu charakterisieren. Es ist ein
Standardverfahren welches in Towbin et al. offenbart ist (Towbin, H., Staehelin, T. und
Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350). Dieses Verfahren beinhaltet
die Trennung der Proteine durch Elektrophorese in einem Gel, Uebertragen der
Proteine auf eine feste Matrix und Reagieren lassen mit (1) einer primär Probe von
Kaninchen Anti-rLDM Antikörper und (2) einer sekundär Probe von Ziege Anti-
Kaninchen Antikörper verknüpft mit Meerettichperoxidase.
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rLDM 1, 3, 4, 5 und 6 reagieren mit polyklonalen Antikörpern, die von den rLDM 2
und 6 ausgelöst wurden unter Verwendung des obigen Immunoblot-Verfahrens.
rLDM 2 reagiert im selben Verfahren mit polyklonalen Antikörpern, die von rLDM 6
ausgelöst wurden.
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Alle rLDM die hier offenbart sind, haben die folgenden einmaligen Wirksamkeiten auf
Lignin-Modell substraten, wie Veratrylalkohol, 1-(3',4'-Di-methoxy-phenyl)-glyzerin-β-
guajakoläther, Phenol, methoxylierte Benzole wie 1,4-Dimethoxybenzol:
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(1) oxidative Spaltung von Cα-Cβ;
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(2) Hydroxilierung von benzylischen Methylengruppen;
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(3) Oxidation von Benzylalkoholen zu Aldehyden;
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(4) Phenoloxidation; und
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(5) Oxidation von Methoxy und Aethoxybenzol.
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Lignin Modellsubstrate sind Chemikalien welche Teilen von Lignin gleichen. Die
Reaktionsprodukte der Modellverbindungen mit rLDM s können praktische
Anwendung haben, vorallem, aber nicht darauf limitiert, als chemische
Ausgangsmaterialien für Nahrungsmittel, pharmazeutische und chemische Industrien. Die oben
genannten Wirksamkeiten sind für die hier offenbarten rLDM charakteristisch.
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Im Folgenden sind Beispiele angegeben, welche das beste Verfahren zur Durchführung
der Erfindung veranschaulichen. Diese Beispiele sollten nicht als Limitierung ausgelegt
werden. In allen diesen Beispielen sind Prozente Gewichtsprozente und
Lösungsmittelmischungsverhältnisse sind Volumenprozente solange nicht etwas
anderes angegeben ist.
Beispiel 1 - Bleichen von Kraftzellstoff mit rLDM und anderen ligninlösenden Enzymen
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Die ligninlösende Mischung , wie im Herstellungsbeispiel 2 beschrieben, wurde zu
Kraftzellstoff, der eine charakteristische braune Farbe aufweist, gegeben mit 3%
Konsistenz in 10 mM trans-Aconitsäure, pH 4.5, 400 uM H&sub2;O&sub2; und 100 uM MnSo&sub4;. Die
Pulpsuspension wurde mit O&sub2; gespült und unter langsamen Schütteln bei 39ºC für
12 Std. inkubiert, nach welcher Zeit die Kraftzellstofflösung dekantiert wurde;
1 M NaOH-Lösung wurde dem Pulp zugegeben und für 60 Minuten bei 65ºC inkubiert.
Anschliessend wurde dekantiert und der Kraftzellstoff mit Wasser gewaschen. Der
erhaltene Kraftzellstoff wies keine dunkelbraune Farbe mehr auf, aber anstelle dessen
die gewünschte hellere Farbe.
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Die Verwendung von MnSO&sub4; ist nicht zwingend.
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Mit Bezug auf die obigen Bedingungen, gibt es für jeden Parameter einen Bereich von
Werten, der verwendet werden kann, um das gewünschte Ergebnis zu erhalten.
Typische Werte und annehmbare Bereiche für jeden Parameter sind in Tabelle 2
angegeben.
Beispiel 2
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Durch Substituieren der ligninlösenden Mischung gemäss Beispiel 1 durch
extracellulares Nährmedium, hergestellt wie im Herstellungsbeispiel 1 offenbart, wird
ein Kraftzellstoff mit der gewünschten helleren braunen Farbe erhalten.
Beispiel 3
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Durch Substituieren der ligninlösenden Mischung gemäss Beispiel 1 durch eine
Mischung, enthaltend alle der folgenden Komponenten oder jede Kombination davon:
rLDM 1-6, einzeln oder Mischungen davon; ligninlösende Mischung ; und
extrazellulares Nährmedium; wird ein Kraftzellstoff erhalten, welcher die gewünschte
hellere braune Farbe aufweist.
Beispiel 4 - Behandlung von TMP mit rLDM und anderen ligninlösenden Enzymen
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Die ligninlösende Mischung , wie im Herstellungsbeispiel 2 beschrieben (0.15 - 1.5 mg
Protein total) wurde zu 10 mg von TMP (Trockengewicht) mit 3% Konsistenz in 10 mM
trans-Aconitsäure, pH 4.5, 400 uM H&sub2;O&sub2; und 100 uM MnSO&sub4; zugefügt. Die
Pulpsuspension wurde mit O&sub2; gespült und unter langsamen Schütteln bei 39ºC für
12 Std. inkubiert, nach welcher Zeit das TMP mit Wasser gewaschen wurde.
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Die Zugfestigkeit, die Indices für Reissen und Bersten als auch die Bruchlänge des
Pulpes wurden gemessen und gefunden wurde, dass es gegenüber einem
unbehandelten Muster eine verbesserte Festigkeit aufweist. Die Nachdunklung des
behandelten Musters war geringer als die des unbehandelten Musters; demzufolge war
die Weissgradstabilität durch die Behandlung mit der ligninlösenden Mischung erhöht.
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Die Verwendung von MnSO&sub4; ist nicht zwingend.
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Mit Bezug auf die obigen Bedingungen, gibt es für jeden Parameter einen Bereich von
Werten, der verwendet werden kann, um das gewünschte Ergebnis zu erhalten.
Typische Werte und annehmbare Bereiche für jeden Parameter sind in Tabelle 3
angegeben.
Beispiel 5
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Durch Substituieren der ligninlösenden Mischung gemäss Beispiel 4 durch ein
extrazellulares Nährmedium, hergestellt wie im Herstellungsbeispiel 1 offenbart, erhält
man einen Pulp von hoher Qualität.
Beispiel 6
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Durch Substituieren der ligninlösenden Mischung gemäss Beispiel 4 durch eine
Mischung, enthaltend alle der folgenden Komponenten oder jede Kombination davon:
rLDM 1-6, einzeln oder Mischungen davon; ligninlösende Mischung ; und
extrazellulares Nährmedium; wird ein Pulp von hoher Qualität erhalten.
Beispiel 7
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Durch Substituieren von TMP durch CTMP oder CMP in den Beispielen 4-6 erhält man
einen Pulp von hoher Qualität.
Beispiel 8 - Entfärbung von Abwasser mit rLDM und anderen ligninlösenden Enzymen
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Die ligninlösende Mischung , wie im Herstellungsbeispiel 2 beschrieben, wurde einer
0.2%-igen Lösung des E&sub1; Abwassers in 10 mM trans-Aconitsäure, pH 4.5, 400 uM H&sub2;O&sub2;
und 100 uM MnSO&sub4; zugegeben. Die Lösung wurde mit O&sub2; gespült und mit langsamen
Schütteln bei 39ºC für 12 Std. inkubiert. Die Lösung wurde spektrophotometrisch im
ultravioletten und sichtbaren Bereich überwacht. Das so behandelte E&sub1; Abwasser war
bemerkenswert entfärbt und in der Extinktion auf 465 nM reduziert. (Die Farbe wird bei
A465 nm gemessen, wobei eine Extinktion von 1.0 bei 465 nm, pH 7.6 gleich 3774
National Council for Air and Stream Improvement color units.)
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Das MnSO&sub4; ist nicht zwingend.
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Mit Bezug auf die obigen Bedingungen, gibt es für jeden Parameter einen Bereich von
Werten, der verwendet werden kann, um das gewünschte Ergebnis zu erhalten.
Typische Werte und annehmbare Bereiche für jeden Parameter sind in Tabelle 4
angegeben.
Beispiel 9
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Durch Substituieren der ligninlösenden Mischung gemäss Beispiel 8 durch ein
extrazellulares Nährmedium einer Phanerochaete chrysosporium Fermentation,
erhalten wie im Herstellungsbeispiel 1 offenbart, erhält man ein entfärbtes E&sub1;-
Abwasser.
Beispiel 10
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Durch Substituieren der ligninlösenden Mischung gemäss Beispiel 8 durch eine
Mischung, enthaltend alle der folgenden Komponenten oder jede Kombination davon:
rLDM 1-6, einzeln oder Mischungen davon; ligninlösende Mischung ; und
extrazellulares Nährmedium; wird ein entfärbtes E&sub1; Abwasser erhalten.
Tabelle I
Aminosäurezusammensetzung von rLDM
Aminosäuren
Verhältnis
Tabelle 2
Parameter
Typisch
Bereich
Konsistenz
Konzentration von trans-Aconitsäure**
Konzentration von H&sub2;O&sub2;
Konzentration von MnSO&sub4;
Inkubation der Pulpsuspension (Erste Inkubation)
Temperatur der ersten Inkubation
Konzentration von NaOH***
Inkubation von Pulp nach der alkalischen Behandlung (zweite Inkubation)
Temperatur der zweiten Inkubation
* Konzentrationen von grösser als 20% können verwendet werden, wenn die
Fluidkonsistenz des Mediums aufrechterhalten wird.
** Andere nichttoxische Enzympuffer wie Ammoniumtartrat können verwendet
werden.
*** KOH oder andere alkalische Lösungen können verwendet werden.
Tabelle 3
Parameter
Typisch
Bereich
Konsistenz
Verhältnis von ligninlösender Mischung zum Holzstoff
(mg von Protein/g des Pulpes)
Konzentration von trans-Aconitsäure**
Konzentration von H&sub2;O&sub2;
Konzentration von MnSO&sub4;
Inkubationszeitraum
Temperatur während der Inkubation
* Konzentrationen von grösser als 20% können verwendet werden, wenn die
Fluidkonsistenz des Mediums aufrechterhalten wird.
** Andere nichttoxische Enzympuffer, wie Ammoniumtartrat können verwendet
werden.
Tabelle 4
Parameter
Typisch
Bereich
Konzentration des Abwassers
Konzentration von trans-Aconitsäure*
Konzentration der ligninlösenden Mischung
Konzentration von H&sub2;O&sub2;
Konzentration von MnSO&sub4;
Inkubationszeitraum
Temperatur während der Inkubation
Einheit/ml**
Einheiten/ml
* Andere nichttoxische Enzympuffer, wie Ammoniumtartrat können verwendet
werden.
** VAO/Einheit = Veratrylalkohol Oxidation Aktivität Einheit