FI87473B - Anvaendning av rldmtm1-6 och andra ligninolytiska enzymer. - Google Patents

Description

1 87^73

TM

rLDM 1-6 ja muiden ligninolyyttisten entsyymien käyttäminen

Keksinnön tausta 5 Kraftmassa

Alkuperäinen kemiallinen menetelmä selluloosan valmistamiseksi puusta vaatii puussa olevan ligniinin hajottamisen natriumsulfidillä ja natriumhydroksidilia. Tätä on kutsuttu sulfaatti- tai kraftprosessiksi.

10 Kraftprosessissa tuotettu puumassa sisältää taval lisesti 5-8 p-% jäännösligniiniä, modifioitua ligniiniä, joka antaa sellulle tyypillisen ruskean värin. Jotta saataisiin erittäin kirkasta selluloosaa ja hyvä kirkkauden säilyminen täytyy ligniini poistaa tietyillä hapettavilla 15 aineilla, joita tavallisesti kutsutaan valkaisuaineiksi.

On olemassa monia valkaisuprosesseja, mutta lähes kaikki alkavat klooraus-uutamis (C-E)-vaiheella. (C-E) -vaiheen aikana menetetään selluloosakuituja. Käsitellystä selluloosasta saadussa C-E eluenteissa on hyvin suuria määriä 20 orgaanisia yhdisteitä, joihin on sitoutunut kloorimäärä 2,5 - 3,5 kg selluloosatonnia kohti. Joidenkin näistä yhdisteistä, pääasiassa kloorattujen fenoleiden, tiedetään olevan vaikutuksiltaan myrkyllisiä, mutageenisia ja karsinogeenisia. (Alberti, B.N. ja Klibanov, A.M. (1981) 25 Biotechnology and Bioengineering Symp. 11:373-379). Nämä jätenesteet ovat erittäin sopimattomia kierrätettäviksi selluloosasysteemiin, koska niissä on suuri korroosiota aiheuttavien kloridien pitoisuus. Vaihtoehtoja kloori-valkaisulle on siten kauan etsitty teollisuudessa.

30 Vetyperoksidin on havaittu tyydyttävästi vapautta van sulfiittimassan ligniinistä, mutta se on sellaisenaan suhteellisen tehoton menetelmä valkaistaessa kraftsellu-loosaa. Kun sitä käytetään yhdessä klooripitoisten valkaisuaineiden kanssa, peroksidi kuitenkin merkittävästi 35 auttaa ligniinin poistamisessa, massan kirkkaudessa ja ja kirkkauden säilymisessä.

2 87473

Happea ja otsonia on voimakkaasti tutkittu valkaisuprosessien yhteydessä. Näiden yhdisteiden pääasiallisena haittapuolena on niiden epäspesifinen hapettava vaikutus selluloosakuituja vastaan. Saadaan pienempiä sellu-5 loosasaantoja ja selluloosan ominaisuudet ovat tavallisesti huonompia kuin kloorivalkaisulla saadut.

Tutkimus, jota on rahoittanut U.S. Department of Agriculture's (USDA) Forest Products Laboratory, esittää, että 50-75 % jäännösligniinistä poistui Phanerochaete chrysosporium sienikasvuston vaikutuksesta 6-8 päivässä. Pitemmillä inkuboinneilla saavutettiin suuremmat ligniinin poistumat, mutta tuloksia ei kvantifioitu. Inkuboinnin aikana selluloosasta tulee oleellisesti vaaleampaa väriltään (Kirk, T.K. ja Chang, H. (1981) Enzyme Microb.

15 Technol. 3:189-196).

Valkaiseminen on epäkäytännöllisen hidasta käytettäessä kokonaisia sieniviljelmiä. Havaittiin, että ligniinin poisto tapahtui (siis kappaluku pieneni) kraftmassas-ta kolmifaasisen mallin mukaisesti: 1) ei ligniini pois-20 toa sienen selluloosaan sijoittamisen jälkeen ensimmäisenä kahtena päivänä, 2) nopea ligniinin poistuminen seu-raavina kahtena päivänä ja 3) tämän jälkeen hitaampi ligniinin poistuminen. Alkuperäinen kahden päivän viivästys johtuu ligniinihajoituksen sekundäärisestä metaboli-25 sesta merkityksestä sienen kasvulle.

Toinen sienivalkaisun haittapuoli on se, että tämä organismi sisältää entsyymejä, jotka hajottavat sekä selluloosaa että hemiselluloosaa. Jokaisessa tehokkaassa val-kaisumallissa, täytyy selluloosakuitujen hajottaminen ol-20 ia kokonaan poistettua, koska selluioosakuidut ovat erityisen herkkiä kraftmassan valmistamisen jälkeen. Sellulaasia sisältämättömät mutantit ovat jossain määrin voittaneet tämän ongelman, mutta niitä on vaikea saada ja jotkut niistä ovat tehottomampia ligniinin hajoittajia kuin tavalliset 3 5 sienikasvustot. Lopullinen sienisolujen käytön haittapuoli 3 87473 on se, että ne voivat toimia optimaalisesti vain ympäristössä, jossa lämpötila ja mikrobien aiheuttamat kontaminaatiot on täysin kontrolloitu.

Mekaaninen massa 5 Mekaanisen massanvalmistuksen tarkoituksena on val mistaa massaa suurella saannolla. Muutamia vuosia sitten mekaaninen massanvalmistus rajoittui yksittäiseen prosessiin, pyöröpuun jauhamiseen puuhiomakiveä vastaan, mutta sitten mekaaninen massanvalmistus on laajentunut proses-10 sien alueelle, jotka käyttävät kemian-, lämpö- ja puristus-teknologioita (Casey, J.P. (1983) Tappi Journal 66:95-96. Tämän hetkisten menetelmien haittapuolena on se, että ne tuottavat selluloosaa, jolla on huono sidoslujuus ja huono kirkkausstabiilisuus.

15 Kuumahierre (TMP), kemikuumahierre (CTMP) ja kemi- mekaaninen massa (CMP) -prosessit on kehitetty parantamaan mekaanisen massan laatua, laajentaen sen käyttöä lopputuotesovellutuksissa . Kuumahierre on vallitseva vaihtoehto suuren saannon selluloosaprosesseille. Sen pääasiallisena 20 rajoituksena on vaatimus suuresta sähköenergian syötöstä, josta suurin osa muuttuu matala-arvoiseksi lämpöenergiaksi.

Kuumahierteen käyttö olisi edullisempaa, jos sillä olisi paremmat kestävyysominaisuudet ja jos sen kirkkaus-stabiilisuutta voitaisiin parantaa, siis estää kirkkauden 25 huononeminen. Kaupallisten sellujen kirkkauden heikkeneminen voidaan yhdistää hapetettujen ryhmien läsnäoloon. Nämä ryhmät on alunperin johdettu ligniinin jäännöshajoamis-tuotteista. On esitetty, että aldehydin ja ketoniryhmien lisääminen selluloosaan valkaisun aikana myös vastustaa 20 kirkkauden vähenemistä, vaikkakin vähäisemmässä määrin (Springer, E.L. (1983) Tappi Journal 66:93-96). Ligniinin hajoamistuotteet aiheuttavat kirkkauden vähenemistä mekanismilla, joka on nyt selvitetty useissa laboratorioissa.

On esitetty, että aromaattisiin renkaisiin liittyvät 35 CC -karboksyyliryhmät jäännösligniinissä absorboivat 4 87473 päivänvaloa ja siirtävät tämän energian hapelle joka puolestaan reagoi ligniinin fenolisten ryhmien kanssa muodostaen värillisiä (keltaisia) kinoneja (Rapson, W.H. (1969) Appita 23:102-114). Tämä reaktio voi tapahtua vain "altis-5 tetuilla" ligniinirenkailla, jotka sisältävät vapaita hydroksyyliryhmiä.

Raaka-TMP:tä voidaan tuottaa suhteellisen vähäisellä energiasyötöllä. Seuraava sekundäärinen puhdistaminen kuitenkin vaatii lisäenergiaa selluloosaominaisuuksien kehit-10 tyrnistä varten (Higuchi, T. (1982) Experientia 38:159-166). Kokeet ovat osoittaneet (Pilon, L. Desrochers, M., JUrasek, L., Neuman, P.J. (1982) Tappi Journal 65:93-96), että raaka-TMP:n käsitteleminen 14 päivän ajan P. chrysosporium viljelmillä voi oleellisesti pienentää ener-15 giatarvetta toista puhdistusta varten ilman massan laadun heikkenemistä. Alustavat tutkimukset osoittivat, että energiatarpeet annetun puhtauden saavuttamiseksi sienillä käsitellyssä masssassa oli pienentynyt 25-30 % käsittelemättömään massaan verrattuna. Lisäksi massan ominaisuudet 20 mitattuna puhkaisuindeksillä olivat myös parantuneet merkittävästi. Koska puuhiokkeen puhdistaminen emäksessä turpoamisen jälkeen voi merkittävästi parantaa lujuusominaisuuksia, puhdistettiin sekä sienillä käsitelty ja käsittelemätön massa emäksessä turvottamisen jälkeen. Sienillä 25 käsitelty massa vaati silloin 50 % vähemmän energian kuin käsittelemätön massa ilman mitään menetyksiä lujuusominaisuuksissa.

Tekniset ongelmat käytettäessä organismia teollisiin puuhiokkeisiin, mukaan lukien TMP prosessointi, ovat 30 kolmitahoisia: (a) järjestää vaadittu huolellinen kosteu den, ilmastuksen ja lämpötilan kontrolli; (b) estää kontaminoituminen ei-toivotuilla organismeilla; (c) epäkäytännöllinen hitaus ligniinin hajottamisessa.

5 H 7^73 Jätenesteen E1 värinpoisto

Primäärinen kemiallinen menetelmä massan valmistamiseksi puusta vaatii puussa olevan ligniinin hajottamista natriumsulfidillä ja natriumhydroksidilla. Tätä 5 kutsutaan sulfaatti- tai kraftprosessiksi.

Kraftprosessissa tuotettu puumassa sisältää tavallisesti 5-8 p-?. jäännöksenä modifioitua ligniiniä, joka antaa massalle tyypillisen ruskean värin. Jotta saataisiin erittäin kirkasta massaa ja hyvä kirkkauden stabiilisuus, 10 täytyy ligniini poistaa tietyillä hapettavilla aineilla joita tavallisesti kutsutaan valkaisuaineiksi. Olemassa on useita valkaisuprosesseja, mutta lähes kaikki alkavat klooraus-uutto (C-E) -vaiheella. Jäteliemi, joka saadaan ensimmäisestä alkaliuuttovaiheesta valkaisussa kloorauk-15 sen jälkeen, johon yleisesti viitataan E1 -jätenesteenä, sisältää yli 80 % jäteväristä, joka virtaa ulos kraft-valkaisulaitoksesta (Kirk, T.K. ja Chang, H-M. (1981)

Enzyme Microb. Technol. 3:189-196). Jäteneste täytyy heittää pois, koska siinä on liian korkea korrodoivien klori-20 dien pitoisuus. Polymeeriset ligniinin hajoamistuotteet, jotka ovat valkaisulaitoksen jäteveden värjäyksen pääaine-osia, ovat resistantteja nykyisiä bakteeripohjäisiä jäte-nesteen käsittelyprosesseja vastaan. Vaihtoehtoisia käsittelymenetelmiä kuten ultrasuodatusta, hiiliadsorptiota ja 25 massiivista kalkkisaostamista vaaditaan tehokkaaseen värinpoistoon, mutta ne ovat melko kalliita. Tällä hetkellä ei ole olemassa taloudellisia värinpoistosysteemejä ja toivottavaa olisi jäteveden käsitteleminen ennen kuin se lasketaan vastaanottaviin vesiin.

30 Sieni -värinpoistosysteemejä on tutkittu. USDA

rahoitetuissa laboratoriokokeissa (Kirk, T.K. (1983), The Filamentous Fungi, voi. 4, Fungal Technology, Smith, J.E., Berry, D.R., Kristiansen, B., toim. Edward Arnold Press, London) , saavutettiin suurempi kuin 80 7. värinpoisto val-35 kaisujätenesteistä, jotka oli valmistettu kraft-keitetyistä 6 87*73 synteettisistä ligniineistä klooraus- ja alkalikäsitte-lyllä, 24 tunnissa käyttämällä Phanerochaete chrysosporium viljelmiä.

Kolme ongelmaa on käytettäessä sieniviljelmiä val-5 kaisulaitosten jätenesteiden värinpoistoon: (1) Sieni vaatii huolelliset viljelyolosuhteet (siis kosteuden, ilmastuksen, lämpötilan ja pH:n), jotka eivät ole sopusoinnussa teollisten prosessiympäristöjen kanssa; (2) sieni vaatii pitkän viivästysajän ja hajottaa silloin vain vähän 10 ligniiniä; ja (3) sieni ei voi kasvaa ligniinillä. Lisä-ruokalähde täytyy lisätä tukemaan sienen kasvua.

Lyhyt yhteenveto keksinnöstä

Kyseinen keksintö koskee kraftmassan valkaisemista TM

rLDM :llä ja muilla ligninolyyttisillä entsyymeillä.

TM

15 rLDM :t ovat ligninaaseja, jotka ovat erittäin spesifisiä ja jotka hajottavat vaikeasti poistettavia ligniinipoly-meerijäännöksiä sellussa vahingoittamatta selluloosakui-tu ja.

TM

rLDM :t voivat valkaista kraftmassaa ja ne ovat 20 välittömästi aktiivisia. Siten niillä ei ole viivettä ak-

TM

tiivisuudessa kuten sienikasvustoilla. Koska rLDM :t ovat biologisia molekyylejä, ne ovat edullisesti ei-korrodoivia, ne eivät aiheuta saastumista ja ne eivät aiheuta vapautettuina ympäristöhaittoja.

25 Keksinnön ligniiniä hajottavia entsyymejä, joita

TM TM

merkitään rLDM :ksi, merkittiin aikaisemmin Pulpases :ksi.

Kyseinen keksintö koskee myös puuhiokkeen lujuusominaisuuksien parantamista mukaan lukien TMP, CTMP ja CMP

TM

käsittelemällä ne rLDM :llä tai muilla ligninolyyttisillä 30 entsyymeillä. Näitä muita ligninolyyttisiä entsyymejä on läsnä solun ulkopuolisessa kasvatusväliaineessa fermentoi-

TM

taessa Phanerochaete chrysosporium:ia. rLFM :t selektiivisesti hajottavat vain ligniiniin muodostuneita kemiallisia osia ja eivät hajota selluloosaa tai hemiselluloosaa.

7 87473

TM

rLDM :t voivat parantaa lujuusominaisuuksia näissä massoissa ja ne ovat välittömästi aktiivisia. Siten niillä ei ole mitään viivettä aktiivisuudessa kuten sienikasvus-

TM

toissa. Koska rLDM :t ovat biologisia molekyylejä, ne 5 edullisesti eivät ole korrodoivia, eivät aiheuta saastumista ja eivät vapautettuina aiheuta ympäristöhaittoja.

Lisäksi kyseinen keksintö koskee E1 jätenesteen värinpoistoa käsittelemällä jäteneste rLDM :llä ja muilla ligninolyyttisillä entsyymeillä, joita on läsnä solun ul- 10 kopuolisessa kasvuväliaineessa fermentoitaessa

TM

Phanerochaete chrysosporium;ia. rLDM :t ovat ligninaase- ja, jotka ovat erittäin spesifisiä ja jotka hajottavat

TM

ligniinipolymeerejä. rLDM :t eivät vaadi tarkkoja kasvatusolosuhteita ja ne ovat välittömästi aktiivisia tehok-15 kaasti valkaisemaan jätenesteitä korrodoimattomalla ja saastuttamattomalla tavalla.

Yksityiskohtainen keksinnön esittely TM

rLDM :t, joita voidaan käyttää kyseisen keksinnön prosessissa, eristettiin valkolaho-sienen Phanerochaete 20 crysosporium:n uudesta stabiilista mutanttilajista. Uusi mutanttilaji, merkittynä SC26, on tallennettu julkisen viljelmävaraston pysyvään kokoelmaan ylläpidettäväksi vähintään 30 vuodeksi. Viljelmävarasto on Nothern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, 25 Peoria, Illinois 61604, USA. Saantinumero on NRRL 15978 ja esiintymispäivä heinäkuun 3. 1985. Tämä viljelmä on julkisesti saatavissa patenttilakien mukaisesti maissa, joissa on rekisteröity kyseinen hakemus tai sen seuraus. Tulisi kuitenkin ottaa huomioon, että esiintymän saata-30 vuus ei oikeuta käyttämään kyseessä olevaa keksintöä hallinnollisin toimenpitein saatujen patenttioikeuksien vastaisesti .

Uusi mutantti saatiin UV mutageneesillä luonnon-tyypistä Phanerochaete chrysosporium, ATCC 24725.

8 87473

Uusi mutantti SC26 kasvatettiin typpirajoitteises- sa hivenaineväliaineessa, johon oli lisätty glukoosia ja puskuroitu pH-arvoon 4,5.

Ligninaasien eristäminen ja puhdistaminen fermen- 5 taatiossa solun ulkopuolisesta nesteestä suoritettiin ultrasuodatuksen avulla ja FPLC -menetelmällä käyttäen anioninvaihtopylvästä.

TM

rLDM :t, joita käytettiin kyseisen keksinnön prosessissa valmistettiin seuraavasti: 10 Valmistus

Esimerkki 1

Mutantti SC26 (NRRL 15978):n kasvatus tuottamaan fermen-taatioväliainetta, joka sisältää uusia ligninaaseja

Ymppäämistä valmistettiin homogenisoimalla 50 ml 15 mutantin SC26 1,5 päivän kasvustoja 1 litran pulloissa, joissa oli seuraavaa väliainetta, jota on merkitty typpira j oitteisek s i Bill/glukoosivällaineeksi: -3

Bill väliaine sisältää 1,8 x 10 M ammoniumtart- raattia, 1,47 x 10~2 M KH2PC>4, 2,03 x 10-3 M MgSC>4 * 7H20, 20 6,8 x 10"4 M CaCl · 211,0, 2,96 x 10~6 M tiamiini ♦ HCl -1 ^ ^ ja 10 ml L hivenaineliuosta. Hivenaineliuos sisältää 7,8 x 10 3 M nitriloetikkahappoa, 1,2 x 10 2 M MgS04 * 7 H20, 1,7 x 10”2 M NaCl, 3,59 x 10"4 M FeS04 * 7H20, 7,75 x 10~4 M CoCl2, 9,0 x 10-4 M CaCl2, 3,48 x 10"4 M 25 ZnS04 ‘ 7 H20, 4 x 10~5, M CuSo4 * 5 H20, 2,1 x 10~5 M A1K(S04)2 · 12 H20, 1,6 X 10"4 M H3B03, 4,1 x 10_5 M NaMo04 * 2 H20 ja 2,9 x 10~3 M MnS04 · H20.

Väliaineeseen lisättiin 10 % (paino/litra) glukoosia. Väliaine puskuroitiin 10 mM transakoniittihapolla 30 pH-arvoon pH 4,5.

Pullot (125 ml, sisältäen 10 ml steriiliä väliainetta, jossa oli edellä esitetty keskjlaatu) ympättiin kukin 0,5 ml:11a edellistä homogenaattia ja pidettiin stationaa-risena 39°C:ssa. Pulloihin laskettiin päivinä 0, 3 ja 6 35 vedellä kyllästettyä happea. Vaihtoehtoisesti käytettiin 9 87473 pyörivää biologista kontraktoria (RBC) sienien kasvattamiseen. 2,5 litraa edellä esitettyä väliainetta ympättiin 100 ml:11a edellistä homogenaattia ja kasvatettiin 39°C:ssa RBC:llä, joka pyöri 1 kpm, jatkuvasti hapettaen.

5 Ligninaasiaktiivisuus mitattiin jaksoittain määrit tämällä veratryylialkoholin hapettumisnopeus veratryyli-aldehydiksi. Reaktioseokset sisälsivät 275 μΐ solun ulkopuolista nestettä (pulloista tai RBC:sta), 2 mM veratryy-lialkoholia, 0,4 mM ^2°2 lisättiin välittömästi puskurin 10 lisäämisen jälkeen ja seurattiin 310 nm:11a. Proteiini määritettiin Bradfordin mukaisesti (Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254) käyttäen karjaseerumialbumiinia (Sigma Chemical, St. Louis, MO) standardina.

Valmistus 1 5 Esimerkki 2

TM

Uusien rLDM :ien eristäminen ja puhdistaminen

Solun ulkopuolinen kasvatusväliaine pulloissa kasvatetuista kasvustoista kuten edellä on esitetty, otettiin talteen sentrifugoimalla 5000 xG, 10 min, 4°C. Solun 20 ulkopuolinen kasvatusväliaine konsentroitiin sitten ultra- suodattamalla 10K suodattimen läpi. Saatua konsentraattia

TM

kutsutaan Ligninolyyttiseksi Seokseksi . Ligninolyyttinen

: : TM TM

seos voi sisältää yhden tai useamman rLDM :n tai muun lininolyyttisen entsyymin erilaisissa suhteissa. Tähän • · 25 Ligninolyyttiseen Seokseen sisältyvät rLDM * :t erotettiin FPLC -menetelmällä käyttäen Pharmacia Mono Q pylvästä (Pharmacia, Piscataway, NJ) ja natriumasetaattipuskuri-

TM

gradienttia, pH 6, 10 mM-1 M. rLDM 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 eluoituivat pylväästä tyypillisessä valmistuksessa seu- 30 raavilla natriumasetaatin molarisuuksilla, vastaavasti: 0,16, 0,1818, 0,34, 0,40, 0,58 ja 0,43 M, jolloin

TM TM

saatiin huomattavan puhdasta rLDM 1-6. Kukin rLDM on

TM

huomattavan vapaa muista rLDM :sta ja luontaisista pro-. .·. telineistä mukaan lukien merkittävä puhtaus ei-toivotuista ·. 35 luontaisista hajottavista proteaaseista. Näistä proteaa- seista on merkkejä raakaseoksissa, joita on vaikea erottaa 10 87473

TM

(kukin huomattavan puhdas rLDM antaa negatiivisen tuloksen Azocoll kokeessa).

TM

Uusien rLDM :ien karakterisointi TM

rLDM :t on karakterisoitu seuraavilla kriteereillä: 5 1) kyky katalysoida veratryylialkoholin hapetusta veratryy1ialdehydiksi; 2) molekyylipaino on kuten on määritettynä SDS-PAGE:11a; 3) aminohappokoostumus; 10 4) hemipitoisuus; 5) vastaavuus vasta-ainereaktiivisuudessa; 6) aktiivisuuden spesifisyys ligniinimalliaineita vastaan; ja 7) eluoituminen FPLC pylväästä spesifisillä ase- 15 taattimolaarisuuksilla.

TM

Kaikki rLDM :t katalysoivat veratryylialkoholin hapetusta veratryylialdehydiksi kuten on havaittu spektro-fotometrisesti aallonpituudella 310 nm. Aktiivisuusyksikkö on määritetty 1 mikromoolin veratryylialdehydin tuottami-20 sena rLDM katalysoidussa reaktiossa. Spesifiset aktiivisuudet tyypillisille valmistuksille noin 24°C:ssa ovat seuraavat:

TM

rLDM 1 2 3 4 5 6

Spesifinen aktiivisuus 2,6 17,1 5,1 9,7 9,4 12,4 25 Yksikköä/mg-minuutti

Molekyylipaino 38 38 42 42 43 42

Kilodattonia

Aminohappokoostumus—Aminohappokoostumus määritettiin muunnelmalla Jones et ai. menetelmästä (Jones, B.N., 30 Paabo, S. ja Stein, S. (1981) J. Liquid Chromatography 4:565-586). Aminohappojen suhde aiheutuu lähes tekniikan rajoituksista ja määrityksessä käytetyn proteiinin määrästä. Katso taulukko 1 „ 87473 1 1

Taulukko 1 TM

rLDM :n aminohappokoostumus

VD

iti a)

Eh 'O -¾1 g oooororoixinor^ror-coro^roo Q 0 ...............

j w rooomroco^T-^ooo-^rrororo»— in S o _ „

Eh T3 o cm ro σ* γ·* oo xi o uo ro vo o ro g | ^ ^ K s v Q3 in oi M K1 If ·<3·η«— vo ro ro CO ro J C/3 »- ΓΜ T- r- u ro S o Λ Λ

Eh tJ ^ oo o ro o cm^ocN^oi— mm ^ S ^ ^ H V | q 3 m co »r ^ co^r-t— r^t'-'^tcoco ω r- i- cm <- !h ro S ω

En Ό Sä or-T-ror^mcNcm co o ro co o Q 3 «^»•».«.•.*.'.11'····*·*·*" jcn cor^^romro»— r-~ ro ro ro ro *—

M

SO)

Eh T3

Sxl ^oro^mcoi-roro co *— o m m Q C - - -.....I.....

jJ U3 ι-ΙΟΟ'Ο'ΙΟίΝι-Γ'Ο h— r- »— t— O

M

o a a

Id CC

XI 10 -H

O <d Cm C v \ •h aciHW^MtprdM-prHOiDCin g tOHQ)-HrHX:>HH>ia)(dX:-H(U>i

<C idCnioxitji-PtdnJ-ag^a-HrHiH

12 87473

TM

Hemi- 3a hiilihydraattipitoisuus—rLDM 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 sisältävät kukin yksittäisen protohemi-IX osan. Kaikki glykolysoituvat periodisen happovärjäyksen mukaisesti (PAS) ja sitoutuvat Con A-Sepharoseen (Sigma).

5 Immunitäplämenetelmä

Tätä menetelmää käytettiin edelleen karakterisoi-TM

maan rLDM :iä. Se on standardimenetelmä, jonka ovat esittäneet Towbin et ai. (Towbin, H., Staehelin, T. ja Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:4350). Menetelmä 10 vaatii proteiinien erottamisen elektroforeesilla geelissä, proteiinien siirron kiinteään matriisiin ja reaktion 1)

TM

primäärisen kokeen jäniksen anti-rLDM vasta-aineen kanssa ja 2) sekundäärisen kokeen vuohen vasta-jänis vasta- aineen kanssa liitettynä piparjuuriperoksidaasiin.

TM

15 rLDM 1, 3, 4, 5 ja 6 reagoivat polyklonaalisiksi

TM

vasta-aineiksi, tehtynä rLDM 2:lle ja 6:lle, käyttäen

TM

edellistä immunituplämenetelmuä. rLDM 2 samassa menetelmässä reagoi polyklonaalisiksi vasta-aineiksi tehtynä TM

rLDM 6:lie.

TM

20 Kaikilla tässä esitetyillä rLDM :llä on seuraavat ainutlaatuiset aktiivisuudet ligniinimalliaineille siis veratryylialkoholille, 1-(3',4'-dimetoksifenyyli)glyseroli-β-kuaiasyylieetteri, fenoli, metoksiloidut bentseenit kuten 1,4-dimetoksibentseeni: 25 1) hapettava CÄ -C^ katkeaminen; 2) bentsyylisten metyleeniryhmien hydroksylointi; 3) bentsyylialkoholien hapetus aldehydeiksi; 4) fenolihapetus; ja 5) metoksi- ja etoksibentseenien hapetus.

30 "Ligniinimalliaineet" ovat kemikaaleja, jotka muistuttavat

ligniinin osia. Malliyhdisteiden reaktiotuotteilla TM

rLDM :ien kanssa voi olla käytännön merkitystä erityisesti, mutta kuitenkaan rajoittamatta, ruokateollisuudelle, farmaseuttisten aineiden teollisuudelle ja kemianteollisuu- 35 delle kemiallisina syöttöaineina. Edellä esitetyt aktiivi-

TM

suudet ovat karakteristisia tässä esitetyille rLDM :lle.

13 87473

Seuraavana on esimerkkejä, jotka valaisevat parasta tapaa käyttää keksintöä. Näitä esimerkkejä ei tule ottaa rajoittavina. Tässä kaikissa esimerkeissä prosentit ovat painoprosentteja ja liuotinseososuudet ovat tilavuu-5 teen perustuvia ellei toisin ole merkitty.

Esimerkki 1

TM

Kraftmassan valkaiseminen rLDM rllä ja muilla lig-ninolyyttisillä entsyymeillä

TM

Ligninolyyttinen Seos , kuten esitetään valmiste 10 esimerkissä 2, lisättiin kraftinassaan, jossa oli tyypillinen ruskea väri ja 3 % pitoisuus 10 mM transkoniittihappoa, pH 4,5, 400 μΜ ^2°2 3a 1^0 μΜ · Selluloosalietteeseen johdettiin C^sta ja inkuboitiin hitaasti ravistaen 39°C:ssa 12 tuntia, jonka jälkeen dekantoitiin kraftmassaliuos ja 15 lisättiin 1M NaOH massaan ja inkuboitiin 60 min 65°C:ssa. Sitten tämä dekantoitiin ja kraftmassa pestiin vedellä. Saadulla kraftmassalla ei enää ollut tummaa ruskeaa väriä, vaan sen sijaan toivottu vaaleampi väri.

MnS0^:n käyttäminen on valinnaista.

20 Edellä esitetyissä olosuhteissa kullekin parametril le on olemassa arvoalue, jota voidaan käyttää haluttujen ominaisuuksien saamiseksi. Tyypilliset arvot ja hyväksyttävät rajat kullekin parametrille on esitetty taulukossa 2.

Esimerkki 2 TM

25 rLDM 1-6 yksinään tai niiden seoksina voidaan käyttää kraftmassan käsittelemiseen käyttämällä oleellisesti samanlaista menetelmää kuin esimerkissä 1, mukaan lukien alueet, tai valinnaisesti sen muunnelmalla. Saadulla kraftmassalla on toivottu vaaleampi väri.

30 Esimerkki 3

TM

Korvaamalla esimerkin 1 Ligninolyyttinen Seos solun ulkopuolisella kasvatusväliaineella, joka on valmistettu kuten esitetään valmiste esimerkissä 1, saadaan kraftmassaa, jolla on toivottu vaaleamman ruskea väri.

14 87 473

Esimerkki 4

TM

Korvaamalla esimerkin 1 Ligninolyyttinen Seos seoksella, joka sisältää kaikkia seuraavia tai jotakin niiden yhdistelmiä: rLDM 1-6 yksittäisinä tai niiden

TM

5 seoksina; Ligninolyyttinen Seos ; ja solun ulkoinen kas-vuväliaine; saadaan kraftmassa, jolla on toivottu vaaleamman ruskea väri.

Esimerkki 5

TM

TMP:n käsitteleminen rLDM :llä ja muilla 1iqninolyytti-10 sillä entsyymeillä

TM

Ligninolyyttinen Seos , kuten esitetään valmiste esimerkissä 2, (0,15 - 1,5 mg proteiinia kaikkiaan), lisättiin 10 gm:aan TMP:tä (kuiva paino) sisältäen 3 % 10 mM transakoniittihappoa, pH 4,5, 400 μΜ ja 100 μΜ MnSO^.

15 Sellulietteeseen johdettiin C^ta ja inkuboitiin hitaasti ravistaen 39°C:ssa 12 tuntia, jonka jälkeen TMP pestiin vedellä. Vetoindeksi, repäisy- ja puhkaisuindeksit kuten myös katkeamispituus mitattiin massasta ja niiden havaittiin olevan parempia kuin käsittelemättömällä näytteellä.

20 Kirkkauden heikentyminen oli pienempi kuin käsittelemättömällä näytteellä; siten kirkkausstabiilisuus kasvoi Lig-

TM

ninolyyttisella Seoksella käsittelemällä.

MnSO^sn käyttäminen on valinnaista.

Edellä esitettyjen olosuhteiden mukaisesti on kul-25 lekin parametrille olemassa arvojen alue, jota voidaan käyttää toivottujen tulosten saavuttamista varten. Taulukossa 3 esitetään tyypilliset arvot ja hyväksyttävät alueet kullekin parametrille.

Esimerkki 6 30 rLDM™ 1-6 yksittäin tai niiden seoksina voidaan käyttää TMP:n käsittelyyn käyttäen pääosin samaa menetelmää, kuin esitetään esimerkissä 5, mukaan lukien alueet, tai sen ilmeisellä muunnelmalla. Saatava massa on korkealaatuista.

15 87 473

Esimerkki 7

TM

Korvaamalla Ligninolyyttinen Seos esimerkistä 5 solun ulkoisella kasvatusvällaineella, joka oli valmistettu valmiste esimerkki 1:ssä esitetyllä tavalla, saatiin 5 korkealaatuista massaa.

Esimerkki 8

TM

Korvaamalla Ligninolyyttinen Seos esimerkistä 5 seoksella, jossa on kaikkia seuraavia aineita tai jotakin

TM

niiden yhdistelmää: rLDM 1-6 yksittäisinä tai niiden seok- mw 1 0 sinä; Ligninolyyttinen Seos ; ja solun ulkoinen kasvatus- väliaine; saadaan korkealaatuista puumassaa.

Esimerkki 9

Lisäämällä CTMP tai CMP TMP:n tilalle esimerkeissä 5-8, saadaan korkealaatuista puumassaa.

15 Esimerkki 10

TM

Jätenesteen värinpoisto rLDM :llä tai muilla lignino-syyttisillä entsyymeillä

Valmiste esimerkissä 2 esitetyn kaltainen Lignino-TM

lyyttinen Seos lisättiin E1 jätenesteen 0,2 % liuokseen 20 10 mM:ssa transakoniittihappoa, pH 4,5, 4 00 uM ^2°2 2a 100 uM MnSC>4. Liuokseen laskettiin 02:ta ja inkuboitiin hitaasti ravistaen 39°C:ssa 12 tuntia. Liuosta tarkkailtiin spaktrofotometrisesti ultraviolettivalon ja näkyvän valon alueilla. Edellä esitetyllä tavalla käsitelty E1 25 jäteneste vaaleni merkittävästi väriltään ja sen absor- banssi pieneni aallonpituudella 465 nm. (Huomaa, että väri on mitattu A465 nm:llä, jossa 1,0 absorbanssi 465 nm:lla, pH 7,6, vastaa 3774 National Council for Air and Stream Improvement väriyksikköä.) 20 MnSO^ on valinnainen.

Edellä esitettyjen olosuhteiden mukaisesti on kullekin parametreista olemassa arvojen alue, jota voidaan käyttää halutun tuloksen saamiseksi. Tyypilliset arvot ja hyväksyttävät alueet kullekin parametrille on esitetty taulukos- 2 5 sa 4 .

16 87473

Esimerkki 11 TM

rLDM 1-6 yksittäin tai niiden seoksina voidaan käyttää jätenesteen käsittelyyn käyttäen pääosin samaa menetelmää kuin esitetään esimerkissä 10, mukaan lukien 5 rajat, tai sen ilmeisellä muunnelmalla. Saatu jäteneste on vaalentunut.

Esimerkki 12

Korvaamalla solun ulkoinen kasvuväline Phanerochaete chrysosporium fermentaatiosta, joka on saatu kuten esitetään

10 valmiste esimerkissä 1, esimerkin 10 Ligninolyyttisellä TM

Seoksella , saadaan valkaistua E1 jätenestettä.

Esimerkki 13

TM

Korvaamalla Ligninolyyttinen Seos esimerkissä 10 seoksella, jossa on kaikkia seuraavia aineita tai jotakin

TM

15 niiden seosta: rLDM 1-6 yksittäin tai niiden seoksina;

TM

Ligninolyyttinen Seos ; ja solunulkoinen kasvatusväliaine; saadaan valkaistua E1 jäteliuosta.

TM

Kyseisen keksinnön rLDM :iä voidaan käyttää raaka-

TM

muodossa, puhdistetussa muodossa, jossa kukin rLDM on 20 huomattavan vapaa muista rLDM :sta ja luontaisista pro- telineistä, ja niiden seoksina. Erityisen toivottavaa on käyttää rLDM :iä, jotka on pääosin puhdistettu ja jotka ovat oleellisen vapaita hajottavista proteaaseista. Alan

TM

ammattilaisen taitojen mukaista on säätää rLDM :n määrät

25 käytetyn rLDM™ valmisteen puhtauden mukaisesti. rLDMT

voidaan yhdistää erilaisten laimentimien, lisäaineiden ja muiden kemikaalien kanssa mukaan lukien proteiinit, jotka

TM

eivät ole haitallisia rLDM :ille ja niiden käytölle, erilaisia tarkoituksia varten kuten markkinoitavien muotojen 30 valmistamiseksi ja niiden käytön lisäämiseksi.

"Luontaisilla proteiineilla" tarkoitetaan tässä muita solun ulkoisessa fermentointiväliaineessa läsnäolevia proteiineja, kuten edellä on esitetty.

Ί7 87473

Taulukko 2

Parametri_ Tyypillinen Vaihteluväli

Konsistenssi 3 % 0,01 - 20 %1

5 Transakoniittihapon pitoisuus2 10 mM 0,005 - 0,5 M

pH 4,5 2-7

konsentraatio 400 μΜ 2 pm - 10 mM

MnSO^:n konsentraatio 100 μΜ 10 - 500 μΜ

Selluloosalietteen inkubointi 12 h 2 min - 48 h 10 (ensimmäinen inkubointi)

Ensimmäisen inkuboinnin lämpö- 39°C 15° - 50°C

tila

NaOH:n konsentraatio3 1M 0,01 - 5 M

Emäskäsittelyn jälkeinen sellu- 60 min 2 min - 48 h 15 loosan inkubointi (toinen inkubointi)

Toisen inkuboinnin lämpötila 65°C 5° - 100°C

Voidaan käyttää suurempaa konsistenssia kuin 20 %, 20 mikäli väliaine säilyy nesteenä.

2

Voidaan käyttää muita myrkyttömiä entsyymipuskureita kuten esimerkiksi ammoniumtartraatti 3

Voidaan käyttää KOH:ta tai muita emäksisiä liuoksia.

18 87473

Taulukko 3

Parametri_Tyypillinen Vaihteluväli 5 Konsistenssi 3 % 0,01 - 20 %*

TM

Ligninolyyttisen Seoksen ja puuhiokkeen suhde 0,08 0,015-0,15 (mg proteiinia/g selluloosa)

Transakoniittihapon konsent- 10 mM 0,005 - 0,5 M

10 raatio** pH 4,5 2-7

Η2<32:η konsentraatio 400 μΜ 2 μΜ - 10 mM

MnSO^rn konsentraatio 100 μΜ 10 - 500 μΜ

Inkubointiaika 12 h 2 min - 48 h

15 Inkubointilämpötila 39°C 15 - 50°C

* Voidaan käyttää suurempia konsistensseja kuin 20 %, mikäli väliaine pysyy nesteenä.

** Voidaan käyttää muita myrkyttömiä entsyymipuskureita 20 kuten esim. ammoniumtartraattia.

i9 87473

Taulukko 4

Parametri_Tyypillinen Vaihteluväli Jätenesteen konsentraatio 0,2 % 0,01 - 20 %

.1 Transakoniittihapon konsent- 10 mM 0,005 - 0,5 M

raatio*

TM

Ligninolyyttisen Seoksen 1 VAO/ 0,01 - 30 konsentraatio yksikköä/ml·** yksikköä/ml pH 4,5 2-7

j Η2θ2:η konsentraatio 400 μΜ 2 μΜ - 10 mM

MnSO^rn konsentraatio 100 μΜ 10 - 500 μΜ

Inkubointiaika 12 h 2 min - 48 h

Inkubointilämpötila 39°C 15° - 50°C

15 * Voidaan käyttää muita myrkyttömiä entsyymipuskureita kuten ammoniumtartraattia.

** VAO/yksikkö = veratryylialkoholin hapetusaktiivisuus-yksikkö.

Claims (13)

20 8 7 4 73 Patenttivaatimukset

1. Prosessi, jossa a) valkaistaan kraftmassaa; tai 5 b) parannetaan puuhiokkeen lujuusominaisuuksia ja kirkkauden stabiilisuutta; tai c) valkaistaan El jätenestettä, ja jossa käsitellään kyseistä kraftmassaa tai puuhioketta tai El jätenestettä Liginolyyttisellä Seoksella, joka on

2. Patenttivaatimuksen 1 mykainen prosessi, jossa 15 kyseinen Ligninolyyttinen Seos™ saadaan Phanerochaete chrysosporium fermentaatiosta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen prosessi, jossa kyseinen Phanerochaete chrysosporium on uusi mutanttilaji, jota on merkitty SC26 ja jonka identifiointikarakteristika 20 on NRRL 15978.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, jossa kyseiset rLDM™:t ovat rLDM™ 1-6 tai niiden seos.

5. Kraftmassan valkaisumenetelmä, jossa kyseistä kraftmassaa käsitellään Phanerochaete chrysosporium:n fer- 25 mentoinnin solun ulkoisella kasvatusväliaineella, jossa on rLDM™:iä ja muita ligninolyyttisiä entsyymejä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jossa kyseinen Phanerochaete chrysosporium on uusi mutanttilaji merkittynä SC26 ja jonka identifiointikarakteristikat ovat

30 NRRL 15978.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jossa kyseiset rLDM™:t ovat rLDM™ 1-6 tai niiden seos.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, jossa valkaistaan kraftmassaa ja jossa kyseistä kraftmassaa kä- 35 siteitään rLDM™: llä, joka on rLDM™ 1, rLDM™ 2, rLDM™ 3, 2i 87473 rLDM™ 4, rLDM™ 5 ja rLDM™ 6 tai niiden seos.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, jossa kyseinen puuhioke on TMP, tai CTMP tai CMP.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, jolla 6 parannetaan puuhiokkeen lujuusominaisuuksia ja kirkkauden stabiilisuutta ja jossa kyseistä puuhioketta käsitellään rLDM™ entsyymeillä tai Ligninolyyttisillä Seoksilla™.

10 Phanerochaete chrysosporium-viljelmien solun ulkoisen kas- vatusväliaineen konsentraatti, joka on saatu sentrifugoi-malla ja konsentroitu ultrasuodattamalla 10K-suodattimen läpi.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen prosessi, jossa kyseiset rLDM™:t ovat rLDM™ 1-6 tai niiden seoksia.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, jossa valkaistaan El jätenestettä, ja jossa kyseistä jätenes-tettä käsitellään rLDM™ entsyymeillä tai Ligninolyytti-sellä Seoksella™.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, jossa 15 kyseiset rLDM™:t ovat rLDM™ 1-6 tai niiden seoksia. 22 8 7 4 73