CN106120422B - 纸浆的漂白 - Google Patents

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Abstract

过氧化物酶和紫尿酸或其衍生物在漂白纸浆，如纸质材料，如纸、挂面纸板(linerboard)、瓦楞纸板(corrugated paperboard)、薄纸、纸巾、瓦楞状容器或盒子中的用途。本发明的过氧化物酶归类为1.11.1.7。过氧化物酶的作用是对纸浆例如纸纸浆和所得的纸质材料进行漂白和脱墨。

Description

纸浆的漂白
本发明是基于申请日为2011年7月1日，申请号为“201180042414.5”(国际申请号为PCT/EP2011/061111)，发明名称为“纸浆的漂白”的专利申请的分案申请。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及用过氧化物酶、过氧化氢和紫尿酸或其衍生物漂白纸浆。
背景技术
在纸质材料的制造中酶的使用是公知的。用于该目的的酶的实例为蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶，以及多种氧化酶如漆酶和过氧化物酶。
这些酶的作用是广泛的，例如控制多种沉积物如沥青，强度改善，脱墨，排水改善，薄纸(tissue)软化，漂白等。
发明内容
本发明人令人惊讶地发现木素纤维素材料(例如纸浆和所得的纸质材料)可通过将该木素纤维素材料在约pH 2至约pH 7与归类为EC 1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源和选自紫尿酸及其某些衍生物的介导物(mediator)相接触来有效地漂白。
发明详述
纸和纸浆
术语“纸质材料”指可从纸浆制成的产物，如纸、挂面纸板(linerboard)、瓦楞纸板(corrugated paperboard)、薄纸、纸巾、包装材料、瓦楞状容器或盒子。
术语“纸浆”意指可用于产生纸质材料的任何纸浆。例如，所述纸浆可作为原浆供应，或可来源于回收的来源。所述纸浆可为木质纸浆，非木质纸浆或从废纸制成的纸浆。木质纸浆可从软木如松(pine)、红杉(redwood)、枞(fir)、云杉(spruce)、西洋杉(cedar)和铁杉(hemlock)，或从硬木如枫(maple)、桤(alder)、桦(birch)、山胡桃(hickory)、山毛榉(beech)、白杨(aspen)、金合欢(acacia)和桉(eucalyptus)制成。非木质纸浆可例如从亚麻(flax)、大麻(hemp)、甘蔗渣、竹、棉花或洋麻(kenaf)制成。废纸浆可通过将废纸如报纸、混合办公室废物、计算机打印纸、白色账簿纸(white ledger)、杂志纸、牛奶硬纸盒(milkcartons)、纸杯等重新制浆来制成。
在一个具体实施方案中，待处理的纸浆包含硬木纸浆和软木纸浆两者。
待处理的木纸浆可为机械纸浆(如磨碎的木质纸浆，GP)，化学纸浆(如Kraft纸浆或亚硫酸盐纸浆)，半化学纸浆(SCP)，热机械纸浆(TMP)，化学热机械纸浆(CTMP)，或漂白的化学热机械纸浆(BCTMP)。
机械纸浆通过研磨和精磨方法来制造，其中对原材料施以周期性压力冲击。TMP是热机械纸浆，GW是磨木纸浆(groundwood pulp)，PGW是加压的磨木纸浆，RMP是精磨机机械纸浆，PRMP是加压精磨机机械纸浆，而CTMP是化学热机械纸浆。
化学纸浆通过碱煮炼来制造，由此去除了大多数木质素和半纤维素。在Kraft制浆或硫酸盐煮炼中，使用硫化钠或氢氧化钠作为主要的煮炼化学品。
待处理的Kraft纸浆可为漂白的Kraft纸浆，其可组成为软木漂白的Kraft(SWBK，亦称作NNBKP(Nadel Holz Bleached Kraft Pulp))，硬木漂白的Kraft(HWBK，亦称作LBKP(Laub Holz Bleached Kraft Pulp))，或这些的混合物。
待在本发明的工艺中使用的纸浆为机械或化学纸浆的悬液或其组合。例如，待用于本发明的工艺中的纸浆可包含0％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，或90-100％的化学纸浆。在一个具体实施方案中，化学纸浆形成用于制造纸质材料的纸浆的一部分。在本文上下文中，表述“构成…的一部分”意指在待用于本发明的工艺的纸浆中，化学纸浆的百分比处于1-99％的范围。在具体的实施方案中，化学纸浆的百分比处于2-98％，3-97％，4-96％，5-95％，6-94％，7-93％，8-92％，9-91％，10-90％，15-85％，20-80％，25-75％，30-70％，40-60％，或45-55％的范围。
在本发明的用途和工艺的一个具体实施方案中，所述化学纸浆是Kraft纸浆，亚硫酸盐纸浆，半化学纸浆(SCP)，热机械纸浆(TMP)，化学热机械纸浆(CTMP)，漂白的化学热机械纸浆(BCTMP)。在具体实施方案中，所述Kraft纸浆是漂白的Kraft纸浆，例如软木漂白的Kraft(SWBK，亦称作NBKP(Nadel Holz Bleached Kraft Pulp))，硬木漂白的Kraft(HWBK，亦称作LBKP(Laub Holz Bleached Kraft Pulp))，或其混合物。
漂白
漂白定义为旨在去除纸浆中来源于残余的木质素或其它有色杂质的颜色的工艺。天然木材仅略微有色，而在煮炼之后化学纸浆的剩余木质素高度着色。传统对于纸浆漂白的观点包括基于氯和氧的氧化剂，其选择性去除纸浆中存在的发色团结构。漂白的程度通过测量白度(brightness)来观察，所述白度定义为使用具有457nm的有效波长的光的限定色谱条带，从一个纸浆板的垫子的蓝色可见光的反射度。官方ISO标准方法为ISO 2469或ISO 2470。漂白至完全白色(full brightness)(>88％ISO)需要多阶段施用漂白化学品。漂白工序中的第一阶段通常认为是去木质素作用(delignification)，其中去除大部分残余的木质素。后一阶段通常称作增白(brightening)阶段，其中消除纸浆中的发色团以保持高白度水平。
亲脂提取物的去除
来自木材和其它木素纤维素材料的亲脂提取物，即非极性可提取级分常常称作木质树脂(wood resin)，包括烷烃、脂肪醇、脂肪酸、树脂酸、固醇、其它萜类化合物、缀合的固醇、甘油三酯和蜡状物。这些亲脂化合物随着纸浆和纸制造工艺的进行导致所谓沥青沉积。沥青沉积在纸浆和造纸工业中是严重问题，因为其导致减少的生产水平，更高的设备维护成本，更高的运营成本，和增加的成品中瑕疵的发生率，这减少品质和益处。此外，含有木质提取物的工艺流出物可为有毒的，并对环境有害。
除了漂白纸浆之外，本发明的组合物和方法亦可用于去除纸浆中的亲脂的提取物。
组合物、方法和用途
本发明提供了一种用于漂白纸浆的方法，其包括将纸浆在约pH 2至约pH 7(优选约pH 3至约pH 7，更优选约pH 3.5至约pH 7)的水溶液中与归类于EC 1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物相接触：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
本发明亦提供了一种用于去除纸浆中亲脂性提取物的方法，其包括将纸浆在约pH2至约pH 7(优选约pH 3至约pH 7，更优选约pH 3.5至约pH 7)的水溶液中与归类于EC1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物相接触：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
本发明亦提供了一种漂白组合物，其包含归类于EC 1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
如上所述，本发明的组合物可用于漂白纸浆或用于去除纸浆中的亲脂性提取物。
优选地，U1、U2和U3相同或不同，且为O或S；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
更优选地，U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
更优选地，U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
具体而言，所述介导物选自1-甲基紫尿酸，1,3-二甲基紫尿酸，硫代紫尿酸(thiovioluric acid)，紫尿酸，及其酯、醚或盐。更具体而言，所述介导物是紫尿酸或其盐。
在一个实施方案中，所述纸浆是木质纸浆。其它可选的纸浆类型如上所述。
在另一个实施方案中，本发明的方法的水溶液具有约2.5至约6的pH，优选约pH 3至约pH 6，更优选约pH 3.5至约pH 6。其它可选的pH范围如下所述。
在另一个实施方案中，所述过氧化物酶包含或组成为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。其它归类于EC 1.11.1.7的过氧化物酶如下所述。
仍在另一个实施方案中，所述方法进一步包括碱性过氧化物漂白的步骤。
在一个优选实施方案中，所述组合物进一步包含纸浆。在另一个优选实施方案中，所述组合物为具有约2至约7的pH，优选约3至约7的pH，更优选约3.5至约7的pH，更优选约3至约6的pH，且特别是约3.5至约6的pH，或约2.5至约6的pH的水性组合物。其它可选的pH范围与适用于本发明的方法的pH是相同的，并如下所述。
工艺条件
本发明的工艺特别适用于在制备纸质材料的工艺中漂白纸浆。
在纸和纸浆加工的情况下，根据本发明的工艺可在任何纸浆生产阶段进行。可将酶添加至任何收集罐(holding tank)中，例如，添加至纸浆储藏容器(储藏箱(storagechest))，储藏塔，混合箱(mixing chest)或测量箱(metering chest)。酶处理可在纸浆的漂白之前进行，与纸浆漂白工艺一同进行，或在漂白之后进行。当与纸浆漂白一同进行时，可将酶制备物与漂白化学品如氯或二氧化氯一同添加。亦可施用氧气、过氧化氢或臭氧或其组合来进行纸浆的漂白。所述酶制备物亦可与这些物质一同添加。优选地，所述酶制备物在漂白之前添加。所述酶亦可添加至循环的来自漂白的工艺水(白水(white water))和来自机械或化学机械制浆工艺的工艺水(褐水(brown water))。在Kraft制浆工艺的一个具体实施方案中，酶在褐浆洗涤(brown-stock washing)过程中添加。
在本文上下文中，术语“工艺水”如无其它定义(i.a.)，包括1)作为原材料添加至纸制造工艺的水；2)从用于制备纸质材料的工艺的任何步骤得到的中间水产物；以及3)作为工艺的输出或副产物的废水。在一个具体实施方案中，所述工艺水是，已经是，将要是，或旨在是进行循环的(再循环的)，即在工艺的另一个步骤重新使用。术语“水”因此意指任何水性介质、溶液、悬液，例如普通自来水，和自来水与多种造纸工艺中常用的添加剂和助剂的混合物。在一个具体实施方案中，所述工艺水具有低含量的固体(干)物质，例如低于20％，18％，16％，14％，12％，10％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，20％或低于1％的干物质。
本发明的工艺可在纸和纸浆加工中的常规条件下进行。所述工艺条件会取决于施用的酶、反应时间和给出的条件。
本发明的酶应以有效量添加。通过术语“有效量”意指足以取得所需和预期效果，如氧化沥青组分，获得所需的漂白和或脱墨等的量。
在一个具体实施方案中，过氧化物酶和其它酶(若存在)的剂量，是约0.1mg酶蛋白至约100,000mg酶蛋白(每种酶)每吨纸浆。
在进一步的具体实施方案中，过氧化物酶和其它酶(若存在)的量，为0.00001-20，或0.0001-20mg酶(作为纯酶蛋白计算)每克(干重量)纸浆材料的范围，如0.0001-10mg/g，0.0001-1mg/g，0.001-1mg/g，0.001-0.1，或0.01-0.1mg的酶每克纸浆材料。同样，这些量指每种酶的量。
酶处理可以以常规的浓度(consistency)进行，例如，0.5至10％干物质。在具体实施方案中，所述浓度在0.5-45％；0.5-40％；0.5-35％；0.5-30％；0.5-25％；0.5-20％；0.5-15％；0.5-10％；0.5-8％；0.5-6％；或0.5-5％干物质的范围。
酶处理可在约10℃至约100℃的温度进行。温度范围的进一步实例(上下限均为约值)如下所述：20-120℃，30-120℃，35-120℃，37-120℃，40-120℃，50-120℃，60-120℃，70-120℃，10-100℃，10-90℃，10-80℃，10-70℃，10-60℃，和30-60℃，以及本文提示的上下限值的任何组合。通常温度是约20至90℃，或20至95℃，优选约40至70℃，或40至75℃。通常，酶处理在大气压进行。但当温度超过100℃时，处理在1-2巴的压力进行(高至超过大气压1巴)。
酶处理在约2至约7的pH，优选约2.5至约6的pH，更优选在约3至约5.5的pH，且最优选在约3.5至约5的pH进行。
酶处理的合适时间可为约几秒至几个小时，例如约30秒至约48小时，或约1分钟至约24小时，或约1分钟至约18小时，或约1分钟至约12小时，或约1分钟至5小时，或约1分钟至约2小时，或约1分钟至约1小时，或约1分钟至约30分钟的范围。通常的反应时间是约10分钟至3小时，1分钟至10小时，优选15分钟至1小时，或15分钟至2小时。
若需要，来自大气的分子氧通常会以充足量存在。因此，所述反应可方便地在开放反应器中，即在大气压进行。
若存在，在本发明的工艺或用途中可使用除了过氧化物酶和其它酶之外的多种添加剂。表面活性剂和/或分散剂常常存在于，和/或添加至纸浆。因此本发明的工艺和用途可在常规用于纸浆的阴离子、非离子、阳离子和/或两性离子表面活性剂和/或分散剂的存在下进行。阴离子表面活性剂的实例为烷基、取代的烷基或芳基的羧酸盐/酯、硫酸盐/酯、磺酸盐/酯或磷酸盐/酯。非离子表面活性剂的实例为聚氧乙烯化合物，如醇乙氧基化物，丙氧基化物或混合的乙氧基/丙氧基化物，聚甘油和其他多元醇，以及某些嵌段共聚物(block-copolymers)。阳离子表面活性剂的实例为水溶性阳离子聚合物，如季铵硫酸盐/酯和某些胺类，例如表氯醇/二甲胺聚合物(EPI-DMA)及其交联溶液，聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)，DADMAC/丙烯酰胺共聚物，和紫罗烯(ionene)聚合物，如公开于美国专利号5,681,862和5,575,993中的那些。两性离子或兼性表面活性剂的实例是甜菜碱，甘氨酸盐/酯、氨基丙酸盐/酯、亚氨基丙酸盐/酯和多种咪唑啉衍生物。同样，可使用公开于美国专利号5,256,252的聚合物。
同样根据本发明，如上所述的表面活性剂，包括其任何组合，可与如本文中定义的过氧化物酶一同用于造纸工艺，和与此种酶一同包含于组合物。在此种组合物中每种表面活性剂的量可为组合物的约1至约1000ppm。在具体实施方案中，每种表面活性剂的量为约10至约1000ppm，或约10至约500ppm，或约50至约500ppm。
在另一个具体实施方案中，上述范围的每一个指表面活性剂的总量。
在上述方法，和本发明的工艺的进一步的具体实施方案中，所述过氧化物酶以0.005-50ppm(mg/L)，或0.01-40，0.02-30，0.03-25，0.04-20，0.05-15，0.05-10，0.05-5，0.05-1，0.05-0.8，0.05-0.6，或0.1-0.5ppm的量使用。酶的量指明确限定的酶组合物的mg数。
在本发明的工艺中，所述过氧化物酶可单独施用或与其它酶一同施用。术语“其它酶”意指至少一种其它酶，例如一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或甚至更多种其他的酶。
术语“与…一同施用”(或“与…一同使用”)意指其它酶可在本发明的工艺的相同或另一个步骤中施用。其它工艺步骤在造纸工艺中与其中用过氧化物酶漂白纸浆的步骤相比，可为上游或下游的。
在具体实施方案中，所述其它酶是具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、氧还酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、固醇酯酶(steryl esterase)和/或胆固醇酯酶活性的酶。氧还酶的实例为具有漆酶和/或过氧化物酶活性的酶。在一个优选实施方案中，所述其它酶是脂肪酶。
术语工艺的“步骤”意指至少一个步骤，且其可为一个、两个、三个、四个、五个或甚至更多工艺步骤。换言之，本发明的过氧化物酶可在至少一个工艺步骤中施用，且其它酶亦可在至少一个工艺步骤中施用，该步骤与其中使用过氧化物酶的步骤相比可为相同或不同的工艺步骤。
术语“酶制备物”意指含有至少一种过氧化物酶的产物。所述酶制备物可包含具有其它酶活性的酶，优选脂肪分解酶。除了所述酶活性之外，此种制备物优选地含有至少一种佐剂。可在用于纸和纸浆工业的酶制备物中的佐剂的实例为缓冲液、聚合物、表面活性剂和稳定剂。
在一个实施方案中，本发明的工艺亦包括碱性过氧化物漂白阶段(E阶段和/或P阶段)，如Camarero,S.等,Enzyme and Microbial Technology,35(2004),pp.113-120(特别参见段落2.4)中所述。优选地，所述碱性过氧化物漂白在本发明的酶漂白方法之后进行。对于碱性过氧化物漂白阶段的通常条件为10至11范围的起始pH值和高于8.5的最终pH；温度通常在70至90℃的范围，而过氧化物以0.5至1％给料(charge)1.5小时。可添加过氧化物稳定剂，且可在过氧化物漂白之前的阶段或与此同时进行金属控制(metal management)。
过氧化物酶
可使用EC编号来对酶进行归类。参照了Recommendations of the NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology,Academic Press Inc.,1992。
应理解的是，本文中提及的术语酶，以及多种酶和酶分类，涵盖了野生型酶以及其任何保持所述活性的变体。此类变体可通过重组技术产生。所述野生型酶亦可通过重组技术产生，或通过从天然来源分离和纯化产生。
在一个具体实施方案中，所述酶是明确限定的，意指仅存在一种主要酶组分。这可通过例如在合适的大小排阻柱上进行分级来推断。此种明确限定的，或纯化的，或高度纯化的酶可如本领域中已知和/或在涉及所述具体酶的文献中所述来获得。
根据本发明的过氧化物酶是酶分类EC 1.11.1.7中包含的过氧化物酶，或源自其的任何呈现过氧化物酶活性的片段。
优选地，根据本发明的过氧化物酶是植物过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(参见SEQ ID NO:2)，大豆过氧化物酶(参见SEQ ID NO:3)，或王棕(royal palm tree)过氧化物酶(参见SEQ ID NO:4))，或真菌或细菌过氧化物酶。
一些优选的真菌包括属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)，例如镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Tricoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝孢属(Verticillum)、Arthromyces、Caldariomyces、单格孢属(Ulocladium)、蠕孢属(Embellisia)、枝孢属(Cladosporium)或Dreschlera，特别是尖镰孢(Fusarium oxysporum，DSM 2672)、特异腐质霉(Humicola insolens)、里氏木霉(Trichoderma reesii)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucana，IFO 6113)、黑白轮枝孢(Verticillum alboatrum)、大丽轮枝孢(Verticillum dahlia)、Arthromyces ramosus(FERM P-7754)、Caldariomyces fumago、纸单格孢(Ulocladium chartarum)、Embellisiaalli或Dreschlera halodes的菌株。
其他优选的真菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)担子菌纲(Basidiomycetes)，例如，鬼伞属(Coprinus)、平革菌属(Phanerochaete)、革盖菌属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)，特别是灰盖鬼伞f.微孢(Coprinus cinereusf.microsporus)(IFO 8371)、长根鬼伞(Coprinus macrorhizus)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium，例如，NA-12)或栓菌属(原先称作多孔菌属(Polyporus))，例如，变色栓菌(T.versicolor)(例如，PR428-A)的菌株。
进一步优选的真菌包括属于接合菌亚门(Zygomycotina)毛霉纲(Mycoraceae)，例如，根霉属(Rhizopus)或毛霉属(Mucor)，特别是冻土毛霉(Mucor hiemalis)的菌株。
一些优选的细菌包括放线菌目(Actinomycetales)，例如，类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)、热紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)(IFO 12382)或Streptoverticillum verticillium ssp.Verticillium的菌株。
其它优选的细菌包括类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红单胞菌(Rhodomonas palustri)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、Pseudomonas purrocinia(ATCC 15958)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)和芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如微小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(ATCC 12905)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
进一步优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)，例如变绿粘球菌(M.virescens)的菌株。
所述过氧化物酶可进一步为可由下述方法产生的过氧化物酶，所述方法包括在允许过氧化物酶表达的条件下在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞用重组DNA载体转化，所述载体携带编码所述过氧化物酶的DNA序列，以及编码允许所述编码过氧化物酶的DNA序列表达的功能的DNA序列，并从培养回收过氧化物酶。
具体而言，重组产生的过氧化物酶是来源于鬼伞属菌种(Coprinus sp.)(亦称作Coprinopsis sp.)，具体为长根鬼伞或灰盖鬼伞的过氧化物酶(参见例如SEQ ID NO:1)。
在一个优选实施方案中，本发明的方法和组合物的过氧化物酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，如至少85％同一性，至少90％同一性或至少95％同一性。
在另一个优选实施方案中，本发明的方法和组合物的过氧化物酶由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，如至少85％同一性，至少90％同一性或至少95％同一性。
在另一个优选实施方案中，本发明的方法和组合物的过氧化物酶包含或组成为(consists of)氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有一个或几个(如1至10个或1至5个)氨基酸取代。
在另一个优选实施方案中，本发明的方法和组合物的过氧化物酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在另一个优选实施方案中，本发明的方法和组合物的过氧化物酶由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，具有过氧化物酶活性的化合物包含过氧化物酶，和源自细胞色素、血红蛋白或过氧化物酶酶的过氧化物酶活性片段。
过氧化物酶活性(POXU)的确定
一个过氧化物酶单位(POXU)为在含有下述的混合物中在30℃每分钟催化一微升过氧化氢的转化的酶的量：
0.1M磷酸盐缓冲液,pH 7.0；
0.88mM过氧化氢；和
1.67mM 2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(盐/酯))(ABTS)。
反应继续进行60秒(在混合之后15秒)，同时测量在418nm的吸光度的变化。吸光度应在0.15至0.30的范围。过氧化物酶活性使用氧化的ABTS的吸收系数为36mM-1cm-1，和每氧化两微升ABTS对应一微摩尔H2O2转化的化学计量来计算。
过氧化氢源
过氧化物酶，或呈现过氧化物酶活性的化合物所需的过氧化氢源，可作为过氧化氢或用于原位产生过氧化氢的过氧化氢前体的水溶液提供。任何在溶解时释放可由过氧化物酶使用的过氧化物的固体物质可充当过氧化氢源。在溶解于水或合适的基于水的介质时产生过氧化氢的化合物，包括但不限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸盐、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧酯、尿素过氧化物、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。
另一种过氧化氢的来源是过氧化氢生成酶系统，如氧化酶连同氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于氨基酸氧化酶(参见例如US 6,248,575)和合适的氨基酸，葡萄糖氧化酶(参见例如WO 95/29996)和葡萄糖，乳酸氧化酶和乳酸，半乳糖氧化酶(参见例如WO 00/50606)和半乳糖，和醛糖氧化酶(参见例如WO 99/31990)和合适的醛糖。
通过研究EC 1.1.3.-、EC 1.2.3.-、EC 1.4.3.-和EC 1.5.3.-，或类似的分类(根据International Union of Biochemistry)，此类氧化酶和底物的组合的其它实例对于本领域技术人员可容易地识别。
过氧化氢或过氧化氢源可在工艺开始时或在工艺过程中，例如，通常亦对应于0.001mM至25mM的水平，优选0.005mM至5mM的水平，且特别是0.01至1mM的水平的过氧化氢的量来添加。过氧化氢亦可以以对应于0.1mM至25mM的水平，优选0.5mM至15mM的水平，更优选1mM至10mM的水平，且最优选2mM至8mM的水平的过氧化氢的量来添加。
介导物
根据本发明的介导物作为过氧化物酶的电子供体起作用。所述介导化合物改善过氧化物酶和纸浆之间的电子转移以改善本发明的方法的漂白作用。根据本发明的介导物具有下述化学结构：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基，C1-C4烷基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
在一个实施方案中，U1、U2和U3相同或不同，且为O或S；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基，C1-C4烷基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
在另一个实施方案中，U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基，C1-C4烷基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
在另一个实施方案中，U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
在另一个实施方案中，U1、U2和U3相同或不同，且为O或S；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
在另一个实施方案中，U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
优选的介导物为1-甲基紫尿酸，1,3-二甲基紫尿酸，硫代紫尿酸(thiovioluricacid)和紫尿酸(四氧嘧啶-4,5-二肟)。
特别优选的介导物是四氧嘧啶-4,5-二肟(紫尿酸)和/或其酯、醚或盐。
根据本发明，所述介导物可以以0.01mM至1000mM的范围，优选以0.05mM至500mM的范围，更优选以0.05mM至100mM的范围，且最优选以0.1mM至50mM的范围的浓度存在。
其它酶
任何具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、氧化酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、固醇酯酶和/或胆固醇酯酶活性的酶可用作本发明的用途和工艺中的其它酶。下面列出此类其它酶的非限定性实例。以大写书写的酶是可从Novozymes A/S,Krogshoejvej 36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark获得的商品酶。任何这些其它酶的活性可使用任何本领域中已知的用于所述酶的方法来进行分析，包括在引用的参考文献中提及的方法。
角质酶的实例是来源特异腐质霉(US 5,827,719)，镰孢属(Fusarium)例如大刀粉红镰孢(F.roseum culmorum)，特别是茄镰孢豌豆专化型(F.solani pisi)的菌株(WO 90/09446；WO 94/14964,WO 94/03578)的那些。所述角质酶亦可来源于丝核菌属(Rhizoctonia)例如立枯丝核菌(R.solani)的菌株，或链格孢属(Alternaria)例如A.brassicicola(WO94/03578)的菌株，或其酶变体如描述于WO 00/34450或WO 01/92502中的那些。
蛋白酶的实例为ALCALASE、ESPERASE、SAVINASE、NEUTRASE和DURAZYM蛋白酶。其它蛋白酶来源于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、B.vulgatus、B.mycoide，以及来源于芽孢杆菌属的芽孢杆菌蛋白酶，特别是来自拟诺卡氏菌属菌种，达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)的蛋白酶如公开于WO 88/03947中的那些，及其突变体，例如WO 91/00345和EP 415296中公开的。
淀粉酶的实例为BAN、AQUAZYM、TERMAMYL和AQUAZYM Ultra淀粉酶。脂肪酶的实例为RESINASE A2X脂肪酶。木聚糖酶的实例为PULPZYME HC半纤维素酶。内切葡聚糖酶的实例为NOVOZYM 613、342和476酶产物。
甘露聚糖酶的实例为等,J.Biotechnol.29(1993),229-242中描述的里氏木霉内切β-甘露聚糖酶。
固醇酯酶、过氧化物酶、漆酶和胆固醇酯酶的实例公开于其背景技术部分中提及的文献。氧还酶的进一步的实例为公开于EP 730641、WO 01/98469、EP 719337、EP 765394、EP 767836、EP 763115和EP 788547中的过氧化物酶和漆酶。在本文的上下文中，无论何时提及需要或受益于接受物(acceptor)(例如氧或过氧化氢)，增强物，介导物和/或活化物的存在的氧还酶，此类化合物应视作包含在内。增强物和介导物的实例公开于EP 705327、WO98/56899、EP 677102、EP 781328和EP 707637。视需要，可通过将氧还酶酶系统(例如漆酶、或过氧化物酶酶系统)定义为所述酶及其接受物，以及任选亦包括对于所述酶的增强物和/或介导物的组合来进行区分。
本文中描述和要求保护的发明的范围并不受本文中公开的具体实施方案所限，因为这些实施方案旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的实施方案包含在本发明的范围内。事实上，除了本文中显示和描述的之外，根据前述描述，本发明的多种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。此类描述旨在落入所附权利要求书的范围。在冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。
本文中引用了多种参考文献，其公开通过提述以其整体并入本文。
本发明还涉及：
1.一种用于漂白纸浆的方法，其包括将纸浆在约pH 2至约pH 7的水溶液中与归类于EC 1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物相接触：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
2.项1的方法，其中U1、U2和U3相同或不同，且为O或S；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
3.项1的方法，其中U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
4.项1的方法，其中所述介导物选自1-甲基紫尿酸，1,3-二甲基紫尿酸，硫代紫尿酸，紫尿酸，及其酯、醚或盐。
5.项4的方法，其中所述介导物是紫尿酸，或其盐。
6.项1至5任一项的方法，其中所述纸浆是木质纸浆。
7.项1至6任一项的方法，其中所述水溶液具有约2.5至约6的pH。
8.项1至6任一项的方法，其中所述水溶液具有约3至约7的pH。
9.项1至6任一项的方法，其中所述水溶液具有约3.5至约7的pH。
10.项1至9任一项的方法，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，如至少85％同一性，至少90％同一性或至少95％同一性。
11.项1至9任一项的方法，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
12.项1至9任一项的方法，其中所述过氧化物酶由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，如至少85％同一性，至少90％同一性或至少95％同一性。
13.项1至9任一项的方法，其中所述过氧化物酶由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
14.项1至13任一项的方法，其进一步包括碱性过氧化物漂白的步骤。
15.一种漂白组合物，其包含归类于EC 1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基。
16.项15的组合物，其中U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
17.项15至16任一项的组合物，其中所述介导物选自1-甲基紫尿酸，1,3-二甲基紫尿酸，硫代紫尿酸，紫尿酸，及其酯、醚或盐。
18.项17的组合物，其中所述介导物是紫尿酸或其盐。
19.项15至18任一项的组合物，其进一步包含纸浆。
20.项15至19任一项的组合物，其为具有约2至约7的pH的水性组合物。
21.项15至19任一项的组合物，其中所述水性溶液具有约3至约7的pH。
22.项15至19任一项的组合物，其中所述水性溶液具有约3.5至约7的pH。
23.项15至22任一项的组合物，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，如至少85％同一性，至少90％同一性或至少95％同一性。
24.项15至22任一项的组合物，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
25.项15至22任一项的组合物，其中所述过氧化物酶由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，如至少85％同一性，至少90％同一性或至少95％同一性。
26.项15至22任一项的组合物，其中所述过氧化物酶由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
27.项15至26任一项的组合物用于漂白纸浆或用于去除纸浆中的亲脂性提取物的用途。
28.一种从纸浆产生的纸质材料，其中所述纸浆经项1至14任一项的方法处理。
实施例
灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)的氨基酸序列示为SEQ ID NO:1。
辣根过氧化物酶(HRP)的氨基酸序列示为SEQ ID NO:2。
大豆过氧化物酶(SBP)的氨基酸序列示为SEQ ID NO:3。
王棕过氧化物酶(RPP)的氨基酸序列示为SEQ ID NO:4。
Polyporus pinsitus漆酶(PpL)的氨基酸序列示于WO 96/00290，图1，序列编号1。
灰盖鬼伞漆酶(CcL)的氨基酸序列示于WO 97/08325，图1，序列编号27。
微型纸浆测定法的标准实验室实验方案
称取60mg干的、未漂白的纸浆，置入10mL玻璃试管。通常每次试验准备12至40个试管。将2mL缓冲溶液添加至每个试管，并任纸浆在室温预浸泡30分钟。添加酶溶液以达到所需浓度。将磁性棒(例如4.5x15nm)添加至每个试管。将试管置于预加热至所需温度(例如40至50℃)的恒温搅拌块(stirring block thermostat)(Variomag Themomodul 40ST，具有50个孔(whole))。在大约5分钟之后，添加介导物储液和其它辅助物。添加去离子水至达到4mL的最终液体体积，并充分混合纸浆悬液。添加氧化剂。当衡量过氧化物酶时，所述氧化剂是过氧化氢，作为2x2mM过氧化氢添加，其中第二次过氧化氢添加是在30分钟温育之后进行。对于漆酶的氧化剂是通过小塑料管供应的分子氧，所述塑料管从纸浆悬液的底部提供恒定的氧流。将样品在磁力搅拌下使用所述恒温搅拌块在所需温度温育60分钟。在酶介导物温育之后，移除磁性棒，并将试管使用Eppendorf Centrifuge 5810以4000rpm离心5分钟。将上清通过倾析去除，并将纸浆重悬于6mL去离子水。重复该洗涤步骤–离心，重悬于6mL去离子水，并离心。将洗涤的纸浆用2mL碱溶液处理，所述溶液含有0.5g/L EDTA，2.0g/LNaOH和1g/L H2O2。将所述碱性悬液置于水浴中，在80℃无搅拌进行30分钟。接着，将试管使用Eppendorf Centrifuge 5810以4000rpm离心5分钟，并通过倾析去除上清。将纸浆重悬于8mL去离子水，并在抽吸下通过尼龙过滤器(直径20mm)过滤。将形成的纸垫置于金属平板上，用3层滤纸覆盖，并使用Labtech自动纸页压榨机(sheet press)以两步方法压榨。压榨步骤1：0.4MPa进行5.5分钟，和压榨步骤2：0.4MPa进行3分钟。将纸垫在室温干燥过夜。白度使用Macbeth Color-Eye 7000Remissions分光光度计对于每个纸垫在460nm(在每一面上)测量两次来确定。
实施例1
用灰盖鬼伞过氧化物酶和紫尿酸漂白亚麻纸浆
对未漂白的亚麻纸浆使用紫尿酸(VA；Fluka 95120)作为介导物衡量灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)。应用对于微型测定法的标准实验室实验方案，并将亚麻纸浆脱水，并在50℃在磁力搅拌下在缓冲液中崩解大约18小时。将CiP-VA系统与三种漆酶介导物系统相比较：
Polyporus pinsitus漆酶(PpL)和1-羟基苯并三唑(HOBT)；
Polyporus pinsitus漆酶和紫尿酸(VA)；
灰盖鬼伞漆酶(CcL)和紫尿酸。
在崩解之前的原始纸浆片(pulp sheet)的白度列为市场纸浆。
条件：
0.01mg过氧化物酶蛋白/mL；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
50℃；
如表1中列出的pH；
如表1中列出的介导物浓度。
白度值是基于两次确定。在添加之前制备介导物的储液：将紫尿酸溶解于去离子水；并将HOBT溶解于乙醇，并在去离子水中稀释。
表1：在标准实验室实验方案中，未漂白的亚麻纸浆在用所述氧化酶-介导物系统处理之后的白度
CiP和VA的组合比衡量的漆酶/介导物系统更加有效。
实施例2
用灰盖鬼伞过氧化物酶和紫尿酸漂白桉纸浆
使用对于微量纸浆测定法的标准实验室实验方案来应用CiP-VA系统漂白桉纸浆。将纸浆在室温在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.5中水化30分钟。测试了四个介导物浓度。测量了形成的纸垫的白度，而结果示于表2。
条件：
0.01mg过氧化物酶蛋白/mL；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
50℃；
pH 4.5；
如表2中列出的介导物浓度。
2x2mM过氧化氢如表2中所示添加。
白度值基于两次确定。
表2：在标准实验室实验方案中，用所述的CiP-CA系统处理之后未漂白的桉纸浆的白度。空白处理中未添加过氧化氢和表面活性剂。
处理 白度
空白 42.9
H2O2+表面活性剂 44.2
CiP+H2O2+表面活性剂 44.7
CiP+H2O2+表面活性剂+1mM VA 57.5
CiP+H2O2+表面活性剂+2mM VA 58.9
CiP+H2O2+表面活性剂+3mM VA 60.3
用CiP-VA系统处理未漂白的桉纸浆导致白度令人惊讶地高度增加。
实施例3
用灰盖鬼伞过氧化物酶和不同的介导物漂白纸浆
将灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)和紫尿酸(VA)系统对未漂白的桉纸浆的性能在相同介导物剂量下(2mM)与其它N-羟基介导物相比较。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案，并将桉纸浆在室温(无搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.5中水化30分钟。
条件：
0.001mg过氧化物酶蛋白/mL；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
50℃；
pH 4.5；
2mM如表3中列出的介导物。
2x2mM过氧化氢。
白度值基于两次确定。在添加之前制备介导物的储液：将紫尿酸和4-甲氧基-Tempo溶解于去离子水；并将HOBT和N-羟基邻苯二甲酰亚胺溶解于乙醇，并在去离子水中稀释。
表3：在标准实验室实验方案中，在用所述的CiP-介导物系统处理之后的未漂白的桉纸浆的白度。空白处理中未添加过氧化物和表面活性剂。
CiP-VA系统优于其它N羟基介导物。
实施例4
用灰盖鬼伞和紫尿酸漂白木质纸浆
将在氧合之前和之后取样的未漂白的桦纸浆和未漂白的桉纸浆用灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)和紫尿酸处理。氧合在ECF和TCF漂白中是公认的步骤。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案，并将纸浆在室温(无搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.5中水化30分钟。
条件：
0.005mg过氧化物酶蛋白/mL；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
50℃；
pH 4.5；
如表3中列出的紫尿酸的浓度；
2x2mM过氧化氢。
白度值基于双重确定。从在去离子水中制备的储液添加紫尿酸。
表4：在用CiP-VA系统处理之后不同的未漂白的硬木纸浆的白度。空白处理中未添加过氧化氢和表面活性剂。
CiP-VA系统对于所有三种类型的纸浆显著改善了白度。
实施例5
用植物过氧化物酶和紫尿酸漂白桉
将在氧合之前取样的未漂白的桉纸浆用大豆过氧化物酶(SBP；Sigma P1432,90红紫棓精单位/mg；SEQ ID NO:3)和辣根过氧化物酶(HRP；Type VI-A,Sigma P6782；1000ABTS单位/mg；SEQ ID NO:2)处理，并与木质素过氧化物酶(LiP；Sigma 42603,0.46U/mg的二甲氧基苯甲醇)和灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)和0.5mM紫尿酸(VA)相比较。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案，并将纸浆在室温(无搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0或pH4.5中水化30分钟。
条件：
0.001mg CiP蛋白/mL；1.8ABTS单位HRP/ml；1.8红紫棓精单位SBP/mg；0.0005LiPU/ml。
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
40℃；
pH 4.0或4.5；
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)
2x1mM过氧化氢如表5中所示添加。
白度值基于两次确定。40mM紫尿酸的储液用去离子水制备。
表5，在用CiP、LiP、HRP和SBP以及0.5mM紫尿酸处理之后未漂白的桉Kraft纸浆的白度。空白处理中未添加过氧化氢和表面活性剂。
过氧化物酶 条件 白度
空白 pH 4.5缓冲液 41.6
对照 pH 4.5+H2O2+表面活性剂 44.1
CiP pH 4.5+H2O2+表面活性剂+VA 52.5
LiP pH 4.0+H2O2+表面活性剂+VA 44.9
HRP pH 4.5+H2O2+表面活性剂+VA 48.8
SBP pH 4.0+H2O2+表面活性剂+VA 52.9
SBP pH 4.5+H2O2+表面活性剂+VA 55.5
CiP、SBP和HRP均改善了未漂白的桉Kraft纸浆的白度。
实施例6
用CiP以9％浓度(consistency)漂白桉–时间概貌
将氧合的桉纸浆用灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)和0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)以9％浓度处理15、69和240分钟。应用下述步骤：
称取2g干的、氧合的桉纸浆置入Stomacher袋(BA6040,Seward)中。将10ml 50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.5添加至纸浆，并密封Stomacher袋。将纸浆在水浴中在45℃水化30分钟。将去离子水、酶、介导物、表面活性剂和过氧化物添加至纸浆(以所述顺序)并手动将每个成分混合。调整水的量以给出20ml的最终体积。每次处理中的实际浓度列于表6。将样品温育指定时间，并将纸浆通过使用配有聚酯夹紧器(binging clamp polyester)的玻璃漏斗进行过滤(真空)来排水。将经排水的纸浆用40ml去离子水洗涤两次，并排水。将纸浆垫置于金属平板上，用3层滤纸覆盖，并使用Labtech自动纸页压榨机(sheet press)以两步方法压榨。压榨步骤1：0.4MPa进行5.5分钟，和压榨步骤2：0.4MPa进行3分钟。将纸垫称重，并计算干物质含量(通常在50％干物质的范围)。将120mg半干纸浆用2mL含有0.5g/L EDTA、2.0g/L NaOH和1g/L H2O2的碱性溶液进行处理。将碱性悬液置于水浴中，在80℃不搅拌进行30分钟。接着，将试管使用Eppendorf Centrifuge 5810以4000rpm离心5分钟，并通过倾析去除上清。将纸浆重悬于8mL去离子水，并在抽吸下通过尼龙过滤器(直径20mm)过滤。将形成的纸垫置于金属平板上，用3层滤纸覆盖，并使用Labtech自动纸页压榨机(sheet press)以两步方法压榨。压榨步骤1：0.4MPa进行5.5分钟，和压榨步骤2：0.4MPa进行3分钟。将纸垫在室温干燥过夜。白度使用Macbeth Color-Eye 7000Remissions分光光度计对于每个纸垫在460nm(在每一面上)测量两次来确定。
表6：在不同温育时间下用CiP和0.5mM紫尿酸处理之后的氧合的桉Kraft纸浆的白度。
观察到在过氧化物酶/紫尿酸处理过程中的温育时间与白度的非常良好的相关性。
实施例7
用王棕过氧化物酶和紫尿酸漂白未漂白的和氧预漂白的桉–酶剂量概貌
将氧合之前取样的未漂白的桉Kraft纸浆和氧预漂白的桉Kraft纸浆用不同剂量水平的王棕过氧化物酶(RPP；SEQ ID NO:4)和0.5mM紫尿酸(VA)来处理。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案。将纸浆在室温(未搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0中水化30分钟。
条件：
如表7中所示的不同剂量水平的RPP酶蛋白/ml
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)
在时点0分钟和30分钟添加的2x 1mM过氧化氢(H2O2)
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
70℃；
pH 4.0
白度值基于两次确定。20mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
表7：在用RPP和0.5mM紫尿酸处理继以碱提取之后的未漂白和氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度。
RPP过氧化物酶对未漂白的和氧预漂白的桉纸浆均效果良好。
实施例8
用大豆过氧化物酶和紫尿酸漂白未漂白和氧预漂白的桉–酶剂量概貌
将氧合之前取样的未漂白的桉Kraft纸浆和氧预漂白的桉Kraft纸浆用不同剂量水平的大豆过氧化物酶(SBP；SEQ ID NO:3)和0.5mM紫尿酸(VA)来处理。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案。将纸浆在室温(未搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0中水化30分钟。
条件：
如表8中所示的不同剂量水平的SBP酶蛋白/ml
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)
在时点0分钟和30分钟添加的2x1mM过氧化氢(H2O2)
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
70℃；
pH 4.0
白度值基于两次确定。20mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
表8：在用SBP和0.5mM紫尿酸处理继以碱提取之后的未漂白和氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度。
SBP酶对未漂白的和氧预漂白的桉纸浆均效果良好。
实施例9
用王棕过氧化物酶和紫尿酸漂白氧预漂白的桉–温度和pH对活性的影响
将氧预处理的桉Kraft纸浆用固定剂量水平的王棕过氧化物酶(RPP；SEQ IDNO:4)和0.5mM紫尿酸(VA)处理。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案。将纸浆在室温(未搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0中水化30分钟。
条件：
0.018mg RPP酶蛋白/ml或对于空白处理无酶
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)或对于空白处理无VA
在时点0分钟和30分钟添加的2x1mM过氧化氢；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
温度：66℃；75℃；80℃；83℃；和86℃
pH：3.5；4.0；和5.0
白度值基于两次确定。20mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
表9：在不同pH和温度空白处理继以碱性提取之后氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度。
温度/pH 3.0 3.5 4.0 5.0
66 68.3 67.0 67.2 64.8
75 71.8 68.9 70.4 67.1
80 67.4 67.2 67.4 68.0
83 72.4 70.6 72.1 69.5
86 69.6 67.3 66.1 64.1
90 71.1 70.4 71.6 69.1
表10：在不同pH和温度过氧化物酶+VA处理继以碱性提取之后氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度。
温度/pH 3.0 3.5 4.0 5.0
66 76.0 75.8 76.4 74.0
75 71.6 75.5 74.6 70.6
80 66.2 66.2 74.9 73.9
83 71.0 70.3 74.3 74.4
86 67.3 65.3 66.7 66.8
90 70.1 67.8 65.1 68.3
表11：在不同pH和温度过氧化物酶+VA处理-空白处理继以碱性提取之后氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度差。负的白度差显示为零。
温度/pH 3.0 3.5 4.0 5.0
66 7.7 8.8 9.2 9.2
75 0 6.6 4.2 3.5
80 0 0 7.5 5.9
83 0 0 2.3 4.9
86 0 0 0.6 2.7
90 0 0 0 0
实施例10
用大豆过氧化物酶和紫尿酸漂白氧预漂白的胺–在85℃pH对活性的影响
将氧预漂白的桉Kraft纸浆用固定剂量水平的大豆过氧化物酶(SBP；SEQ ID NO:3)和1.0mM紫尿酸(VA)来处理。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案，但修饰了在碱提取过程中的浓度，并遵循下文提及的条件。将纸浆(对于4至5范围的pH水平在50mM乙酸(盐)缓冲液中、对于6至7范围的pH在磷酸盐缓冲液中和对于3至3.5的更低pH值通过用H2SO4直接调整来获得)在室温(未搅拌)水化30分钟。
条件：
0.021mg RPP酶蛋白/ml或对于空白处理无酶
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)或对于空白处理无VA
在时点0分钟和30分钟添加的2x2mM过氧化氢；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
温度：85℃
pH：3.5；4.0；4.5；5.0；6.0和7.0
碱提取，Ep条件：
0.05g/L MgSO4
1.1g/L NaOH
0.9g/L H2O2
90分钟
85℃
白度值基于两次确定。20mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
表12：在不同pH处理继以碱提取之后氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度。
大豆过氧化物酶(SBP)+紫尿酸(VA)系统在85℃在广泛pH范围显示活性。
实施例11
用大豆过氧化物酶和紫尿酸漂白氧预漂白的胺–在70℃pH对活性的影响
将氧预漂白的桉Kraft纸浆用固定剂量水平的大豆过氧化物酶(SBP；SEQ ID NO:3)和0.5mM紫尿酸(VA)来处理。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案，但修饰了在碱提取过程中的浓度，并遵循下文提及的条件。将纸浆(对于4至5范围的pH水平在50mM乙酸缓冲液中、对于6至7范围的pH在磷酸盐缓冲液中和对于3至3.5的更低pH值通过用H2SO4直接调整来获得)在室温(未搅拌)水化30分钟。
条件：
0.001mg RPP酶蛋白/ml或对于空白处理无酶
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)或对于空白处理无VA。20mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
在时点0分钟和30分钟添加的2x 2mM过氧化氢；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
温度：70℃
pH：3.0；3.5；4.0；4.5；5.0和6.0
碱提取，Ep条件：
0.05g/L MgSO4
1.1g/L NaOH
0.9g/L H2O2
90分钟
85℃
白度值基于两次确定。20mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
表13：在不同pH处理继以碱提取之后氧预漂白的桉Kraft纸浆的白度。
大豆过氧化物酶(SBP)+紫尿酸(VA)系统在70℃在广泛pH范围效果良好。
实施例12
用大豆过氧化物酶和紫尿酸在不同温度漂白氧预漂白的桉
将氧合的桉纸浆用固定剂量水平为0.011mg蛋白/L的大豆过氧化物酶(SBP；SEQID NO:3)和0.5mM紫尿酸(VA)处理。(VA；Fluka 95120)。将过氧化氢(H2O2；Merck,Perhydrol30％)以4mM浓度水平剂量添加。所有处理包括0.1g/L的Neodol 25-3。
应用下述步骤：
称取5g干的、氧合的桉纸浆置入Stomacher塑料袋(BA6040,Seward)中。将22.5ml100mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.5添加至纸浆，并密封Stomacher袋。将纸浆在水浴中在60℃水化30分钟。将去离子水、酶、介导物、表面活性剂和H2O2添加至纸浆(以所述顺序)并手动将每个成分混合。调整水的量以给出50ml的最终体积。将样品在60℃、70℃或80℃温育180分钟，并将纸浆通过使用配有聚酯夹紧器的玻璃漏斗进行过滤(真空)来排水。将经排水的纸浆用100ml去离子水洗涤两次，并排水。
对纸浆进一步给予包含过氧化物(Ep)的碱提取，之后将其洗涤，并形成纸页以供白度测量。应用下述步骤：
将经排水的纸浆转移至塑料袋，并添加提取液体，得到MgSO4 0.5kg/吨干纸浆，NaOH 10kg/吨干纸浆和H2O2 8kg/吨干纸浆。总体积为50ml。将袋置于85℃水浴中进行90分钟。在将提取液排干之后，将排干的纸浆用100ml的去离子水洗涤2次，并进行排水。将纸垫进一步用印迹纸压榨5分30秒(5:30min)。将经压榨的纸浆转移至Tappi粉碎机，并添加2L去离子水，且粉碎进行300转，再添加0.5L水，并使用1L纸浆悬液用于在半自动纸页成形器(sheet former)中制备纸页。将制成的纸页置于金属平板上，用3层滤纸覆盖，并使用Labtech自动纸页压榨机(sheet press)以两步方法压榨。压榨步骤1：0.4MPa进行5.5分钟，和压榨步骤2：0.4MPa进行3分钟。将纸垫在室温干燥过夜。白度使用Macbeth Color-Eye7000Remissions分光光度计对于每个纸页在460nm测量五次来确定。
表14：在用SBP+VA在不同温度处理继以碱提取之后，氧合的桉Kraft纸浆的白度。
大豆过氧化物酶(SBP)+紫尿酸(VA)系统在所有三个温度效果良好。
实施例13
用大豆过氧化物酶或王棕过氧化物酶和紫尿酸漂白未漂白的桉–在不同过氧化氢 浓度的酶剂量概貌
将未漂白的桉Kraft纸浆用不同剂量水平的大豆过氧化物酶(SBP；SEQ ID NO:3)或王棕过氧化物酶(RPP；SEQ ID NO:4)和0.5mM紫尿酸(VA)处理。应用对于微量测定法的标准实验室实验方案。将纸浆在室温(未搅拌)在50mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.0中水化30分钟。
条件：
如表15和16中所示的SBP或RPP酶蛋白/ml的不同剂量水平；
0.5mM紫尿酸(VA；Fluka 95120)；
在时点0分钟和30分钟添加的2x 1；2x 2；2x 3；或2x 5mM过氧化氢；
0.1g/L Neodol 25-3(表面活性剂)；
70℃；
pH 4.0。
白度值基于两次确定。10mM紫尿酸的储液在去离子水中制备。
表15：在用SBP和0.5mM紫尿酸在不同过氧化氢浓度处理继以碱提取之后，未漂白的桉Kraft纸浆的白度。
SBP过氧化物酶在所有不同的过氧化氢浓度均效果良好。
表16：在用RPP和0.5mM紫尿酸在不同过氧化氢浓度处理继以碱提取之后，未漂白的桉Kraft纸浆的白度。
RPP过氧化物酶在所有不同的过氧化氢浓度均效果良好。
实施例14
用大豆过氧化物酶和紫尿酸在不同介导物浓度漂白氧预漂白的桉。
将氧合的桉纸浆用0.001或0.005mg蛋白/L的固定剂量水平的大豆过氧化物酶(SBP；SEQ ID NO:3)和0.5mM或1.0mM紫尿酸(VA)处理。(VA；Fluka 95120)。将传统过氧化氢(H2O2；Merck,Perhydrol 30％)在4mM浓度水平剂量添加。所有处理包括0.1g/L的Neodol25-3。
应用下述步骤：
称取5g干的、氧合的桉纸浆置入Stomacher塑料袋(BA6040,Seward)中。将22.5ml100mM乙酸(盐)缓冲液pH 4.5添加至纸浆，并密封Stomacher袋。将纸浆在水浴中在70℃水化30分钟。将去离子水、酶、介导物、表面活性剂和H2O2添加至纸浆(以所述顺序)并手动将每个成分混合。调整水的量以给出50ml的最终体积。将样品在70℃温育180分钟，并将纸浆通过使用配有聚酯夹紧器的玻璃漏斗进行过滤(真空)来排水。将经排水的纸浆用100ml去离子水洗涤两次，并排水。
对纸浆进一步给予包含过氧化物(Ep)的碱提取，之后将其洗涤，并形成纸页以供白度测量。应用下述步骤：
将经排水的纸浆转移至塑料袋，并添加提取液体，得到MgSO4 0.5kg/吨干纸浆，NaOH 10kg/吨干纸浆和H2O2 8kg/吨干纸浆。总体积为50ml。将袋置于85℃水浴中进行90分钟。在将提取液排干之后，将排干的纸浆用100ml的去离子水洗涤2次，并进行排水。将纸垫进一步用印迹纸压榨5分30秒(5:30min)。将经压榨的纸浆转移至Tappi粉碎机，并添加2L去离子水，且粉碎进行300转，再添加0.5L水，并使用1L纸浆悬液用于在半自动纸页成形器(sheet former)中制备纸页。将制成的纸页置于金属平板上，用3层滤纸覆盖，并使用Labtech自动纸页压榨机(sheet press)以两步方法压榨。压榨步骤1：0.4MPa进行5.5分钟，和压榨步骤2：0.4MPa进行3分钟。将纸垫在室温干燥过夜。白度使用Macbeth Color-Eye7000Remissions分光光度计对于每个纸页在460nm测量五次来确定。
表17：在用SBP+VA在不同温度处理继以碱提取之后，氧合的桉Kraft纸浆的白度。
条件 白度
空白+表面活性剂 70.5
空白+H2O2+表面活性剂 71.0
0.001mg酶蛋白/ml+0.5mM VA+H2O2+表面活性剂 73.4
0.005mg酶蛋白/ml+0.5mM VA+H2O2+表面活性剂 73.0
0.001mg酶蛋白/ml+1.0mM VA+H2O2+表面活性剂 75.5
0.005mg酶蛋白/ml+1.0mM VA+H2O2+表面活性剂 75.1

Claims (28)

1.一种用于漂白纸浆的方法，其包括将纸浆在pH 2至pH 7的水溶液中与归类于EC1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物相接触：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基；
其中所述过氧化物酶为灰盖鬼伞过氧化物酶。
2.权利要求1的方法，其中U1、U2和U3相同或不同，且为O或S；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
3.权利要求1的方法，其中U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
4.权利要求1的方法，其中所述介导物选自1-甲基紫尿酸，1,3-二甲基紫尿酸，硫代紫尿酸，紫尿酸，及其酯、醚或盐。
5.权利要求4的方法，其中所述介导物是紫尿酸，或其盐。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述纸浆是木质纸浆。
7.权利要求1至5任一项的方法，其中所述水溶液具有2.5至6的pH。
8.权利要求1至5任一项的方法，其中所述水溶液具有3至7的pH。
9.权利要求1至5任一项的方法，其中所述水溶液具有3.5至7的pH。
10.权利要求1至5任一项的方法，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或由SEQ IDNO:1所示氨基酸序列组成。
11.权利要求1至5任一项的方法，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
12.权利要求1至5任一项的方法，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
13.权利要求1至5任一项的方法，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
14.权利要求1至5任一项的方法，其进一步包括碱性过氧化物漂白的步骤。
15.一种漂白组合物，其包含归类于EC 1.11.1.7的过氧化物酶、过氧化氢源、和具有下述化学结构的介导物：
其中U1、U2和U3相同或不同，且为O、S或NOH；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲酰基，氨甲酰基或磺酰基团，磺酰基团的酯或盐，氨磺酰基，硝基，亚硝基，氨基，氰基，苯基，苯甲基C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羰基，或羰基C1-C4烷基；
其中所述过氧化物酶为灰盖鬼伞过氧化物酶。
16.权利要求15的组合物，其中U1、U2和U3为O；且R1和R2相同或不同，且为氢，羟基，甲基，乙基，苯基，苯甲基，甲酰基，氨基，氰基，亚硝基，甲氧基和/或乙氧基。
17.权利要求15至16任一项的组合物，其中所述介导物选自1-甲基紫尿酸，1,3-二甲基紫尿酸，硫代紫尿酸，紫尿酸，及其酯、醚或盐。
18.权利要求17的组合物，其中所述介导物是紫尿酸或其盐。
19.权利要求15的组合物，去进一步包含纸浆。
20.权利要求15的组合物，其为具有2至7的pH的水性组合物。
21.权利要求15的组合物，其为具有3至7的pH的水性组合物。
22.权利要求15的组合物，其为具有3.5至7的pH的水性组合物。
23.权利要求15的组合物，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQID NO:1所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
24.权利要求15的组合物，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQID NO:1所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
25.权利要求15的组合物，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQID NO:1所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
26.权利要求15的组合物，其中所述过氧化物酶包含氨基酸序列，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性；或其中所述过氧化物酶包含SEQID NO:1所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成。
27.权利要求15的组合物用于漂白纸浆或用于去除纸浆中的亲脂性提取物的用途。
28.一种从纸浆产生的纸质材料，其中所述纸浆经权利要求1至14任一项的方法处理。
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