DE69104675T2 - Thermostabile Endoxylanasen. - Google Patents

Thermostabile Endoxylanasen.

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von hitzebeständigen Enzymsystemen, die von Thermomonospora fusca Stämmen erhalten werden, und einen neuen Bakterienstamm, Thermomonospora fusca mit der Bezeichnung KW3, und dessen hitzebeständige Enzyme, welche über einen breiten pH-Bereich und bei höheren Temperatur aktiv sind, um Zellstoffeigenschaften zu verändern, speziell um den Ligningehalt zu reduzieren.
  • Holz ist ein komplexes Material, welches aus Zellulose, Hemicellulose und Lignin zusammen mit anderen geringeren Komponenten zusammengesetzt ist. Lignin ist mit Zellulose und Hemicellulose (Polymere verschiedener Hexosen und Pentosen, z.B. Xylane) assoziiert und wahrscheinlich auch kovalent daran gebunden.
  • Beim Papierherstellungsverfahren wird Lignin im allgemeinen vom Zellstoff entfernt, da es dem Endprodukt eine bräunliche Farbe verleiht, dessen Stärke reduziert und ihm andere unerwünschte Eigenschaften vermittelt. Die Entfernung von Lignin kann auf verschiedene Weise geschehen.
  • Beim chemischen Zellstoffaufschluss wird eine Mehrheit des Lignins vom Zellstoff entfernt (z.B. Kraftverfahren). Beim Bleichverfahren wird der chemische Zellstoff dann routinemässig mit Chlor und anderen delignifizierenden Chemikalien umgesetzt, um noch mehr Lignin zu entfernen und dann mit Bleichmitteln umgesetzt, um das Lignin des Zellstoffs zu modifizieren, wobei ein beständig gebleichter Zellstoff erhalten wird. Aus Umweltbewusstseinsgründen ist die Behandlung mit Chlor jedoch unerwünscht, da die resultierenden Abwässer grosse Mengen toxischer Verbindungen (z.B. chlorierte Phenole) enthalten. Die Industrie sucht deshalb nach alternativen Bleichverfahren, wobei manche Alternativen beträchtliche Kapitalinvestitionen oder grössere Chemikalienmengen (z.B. Chlordioxid) erfordern.
  • In der Literatur werden Versuche beschrieben, wo Pilze (z.B. Weissfäulepilze) und Enzymsysteme von Pilzen und auch Bakterien verwendet werden, um das Lignin in Zellstoffen zu verändern oder zu vermindern, um die gewünschte Aufhellung oder ähnliche praktische Effekte zu erhalten. Es wurden jedoch nur wenige Enzymsysteme gefunden, welche den Zellstoff selektiv angreifen, in anderen Worten, welche den Zellulosegehalt des Zellstoffs nicht negativ beeinflussen. Es wurden speziell Xylanasezubereitungen mit genügend niedriger Cellulaseaktivität verwendet, um Zellstoff zu delignifizieren. Xylanasen sind Enzyme, welche selektiv Xylan hydrolysieren. Um diese niedrige Cellulaseaktivität zu erreichen, werden die Xylanasen entweder von den Cellulasen getrennt, z.B. durch Ultrafiltration oder chromatographische Methoden, oder sie müssen von speziell ausgewählten Mikroorganismen hergestellt werden, die unter speziell optimierten Bedingungen gezüchtet werden. Alle diese beschriebenen Enzymzubereitungen sind nur in saurem pH-Bereich aktiv und haben Temperaturoptima von bis zu 50ºC.
  • Für die industrielle Nutzung wäre es jedoch ein beträchtlicher Vorteil, wenn es Enzyme gäbe, die über einen breiten pH-Bereich, speziell pH 7-9, und bei einer höheren Temperatur aktiv sind.
  • Xylanasen von einem Thermomonospora fusca-Stamm mit der Bezeichnung MT816 wurden unlängst beschrieben (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1985) 21:238-244). Es wurde aber kein Verweis auf deren mögliche Anwendung bei der Zellstoffdelignifizierung gemacht.
  • Es wurde gemäss vorliegender Erfindung, wie sie in den Ansprüchen dargestellt ist, gefunden, dass die Enzymsysteme von Thermomonosporastämmen, die zumindest ein Enzym mit Wirkung auf Hemicellulose umfassen, verwendet werden können, um eine Vielzahl von Zellstoffen bei einer hohen Temperatur und unter alkalischen Bedingungen selektiv zu behandeln, wobei der Ligningehalt reduziert wird, während der Zellulosegehalt des Zellstoffs nicht wesentlich beinträchtigt wird. Das bevorzugte Enzymsystem umfasst Xylanase. Ein weiter bevorzugtes Enzymsystem enthält auch Mannanase und andere enzymatische Komponenten von T. fusca KW3, insbesondere wenn Weichholz behandelt werden soll.
  • Xylanase ist ein Enzym, welches die Hydrolyse von Xylan, einer Hauptkomponente der Hartholz- und Weichholzhemicellulose, katalysiert, während Mannanase die Hydrolyse von mannanhaltigen Kohlehydraten, einer Hauptkomponente der Weichholzhemicellulose, katalysiert.
  • Die Enzyme von T. fusca, speziell diejenigen des neuen Stammes KW3, wirken auf die Hemicellulose/Cellulose-Matrix mit welcher das Lignin assoziiert oder verbunden ist, so dass nach Behandlung des Zellstoffs mit diesen Enzymen, das Lignin freigesetzt wird und/oder freisetzbar wird und durch ein geeignetes Extraktionsmittel abgetrennt und vom Zellstoff entfernt werden kann.
  • Das komplette Enzymsystem, das vom T. fusca Stamm KW3 hergestellt wird, beinhaltet auch Cellulase. Es wurde jedoch gefunden, dass die Überstände vom T. fusca Stamm KW3, wenn sie unter geeigneten Bedingungen produziert werden, nur kleine Mengen Cellulase-Aktivität enthalten, welche die Cellulose und die Qualität des Papiers, das daraus hergestellt wird, nicht negativ beeinflussen.
  • Es können alle T. fusca gemäss dieser Erfindung verwendet werden, die bevorzugten Stämme jedoch sind jene, welche grosse Mengen delignifizierender Enzyme herstellen, welche bei hoher Temperatur und unter alkalischen Bedingungen aktiv sind und als Enzymüberproduzierer gekennzeichnet werden können. Ein Beispiel eines solchen Stammes ist T. fusca KW3, welcher bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Nummer DSM 6013 hinterlegt wurde.
  • Der neue Stamm wurde als Thermomonspora fusca klassifiziert, indem dessen morphologische Eigenschaften mit denen von verschiedenen Referenzstämmen unter dem Licht- und Elektronenmikroskop verglichen wurde. Zusätzlich besass der neue Stamm die folgenden biochemischen Eigenschaften, welche typisch für Thermomonospora fusca sind: Mesodiaminopimelinsäure in der Zellwand, Empfindlichkeit gegenüber höheren Salzkonzentrationen, Wachstum bei pH 11 und bei 50ºC.
  • Der neue Stamm KW3 unterscheidet sich von den anderen bekannten Stämmen, z.B. 'Stammtypus' DSM 43792 = ATCC 27730, durch seine Fähigkeit bei Temperaturen von bis zu 60ºC zu wachsen und durch die höhere Hitzebeständigkeit seiner Xylanaseaktivität. KW3 unterscheidet sich vom Stamm T. fusca MT 816 (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1985) 21:238-244) durch die höhere Hitzebeständigkeit seiner Xylanasen, durch die höhere Xylanaseproduktion unter den gleichen Züchtungsbedingungen und durch den breiteren pH-Bereich der Xylanaseaktivität. Zusätzlich zeigt der neue Stamm KW3 eine Resistenz gegenüber Kristallviolett, was für Thermomonospora fusca atypisch ist.
  • Der Überstand wird vorzugsweise von T. fusca-Kulturen gewonnen, welche in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle wachsen. Die bevorzugten Kohlenstoffquellen beinhalten Weizenkleie, Xylan, Xylose, Mannan (Galactomannan, Glucomannan oder Galactoglucomannan), Mannose, mechanischen Zellstoff, chemischen Zellstoff, Sägemehl, Weizenstroh, oder andere Substanzen, welche Hemicellulose enthalten oder von Hemicellulose abstammen. Der Mikroorganismus wächst auf der gewünschten Kohlenstoffquelle und die optimale Enzymproduktion wird üblicherweise nach 1-5 Tagen erreicht. Man fand, dass die Kohlenstoffquelle das Xylanase-Isoenzymmuster beeinflusst, d.h. Molekulargewicht, spezifische Aktivität und pH-Optima der individuellen Proteine.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren kann in vitro so lange ausgeführt werden, bis der Ligningehalt des Zellstoffs abgenommen hat. Das Verfahren umfasst die Kontaktierung des Zellstoffs mit einer Menge eines Enzymsystems, die genügt, um Lignin freizusetzen. Das Enzymsystem umfasst ligninfreisetzende Enzyme, vorzugsweise Endo-Xylanasen, welche im Überstand einer T. fusca-Kultur enthalten sind. Man kann den Überstand als solchen verwenden, er wird jedoch bevorzugt vor der Verwendung konzentriert. Eine sehr geeignete Konzentrationsmethode umfasst eine einfache Ultrafiltration, die dazu dient, den Überstand 5-25fach zu konzentrieren und in jedem Fall ein Konzentrat zur Verwendung zu erhalten, das im wesentlichen alle Enzyme enthält, welche auf die Grundkomponenten von Holz wirken, z.B. Cellulasen, Hemicellulasen und jedes Enzym, das auf Lignin wirkt (hier "lignolytische Enzyme"). Für diesen Zweck kann man alle Substanzen entfernen, welche ein Molekulargewicht von weniger als 10'000 besitzen. Das resultierende Konzentrat, welches nicht nur den Xylanasegehalt von T. fusca enthält, sondern auch den Cellulasegehalt und andere enzymatische Aktivitäten davon, ist wirksam, um den Ligningehalt vom Zellstoff auf selektive Weise zu reduzieren, d.h. ohne den Fasergehalt, der für die Papierherstellung gewünscht ist, im wesentlichen zu beschädigen.
  • Es ist bevorzugt, dass das Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt wird, welche die enzymatische Aktivität in vitro verstärkt. Die Temperaturen können sich in einem Bereich von 10-90ºC bewegen, wobei 50-80ºC bevorzugt wird. Noch bevorzugter ist der Bereich 60-70ºC. Der bevorzugte pH für das Verfahren ist 5-10, ein noch bevorzugterer Bereich ist 6,5-9,5. Es ist kennzeichnend für die Enzymzubereitung der Erfindung, dass sie über einen breiten pH-Bereich aktiv ist, sowie auch, dass sie bei pH 7-9, welches der pH des Zellstoffs in den Lagertürmen ist, wie sie von den Zellstoffabriken verwendet werden, hohe Aktivität besitzt.
  • Die Behandlungszeit variiert, abhängig von Faktoren wie z.B. gewünschtes Ergebnis, Menge des verwendeten Substrats, Menge der verwendeten Enzyme im Überstand, spezifische Aktivität des Überstands, Typus des verwendeten Zellstoffs, Temperatur und ähnliches.
  • Eine geeignete Enzymdosierung liegt im Bereich von ungefahr 0,01 bis 200 Einheiten/g trockener Zellstoff, bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 50 Einheiten/g. Die Xylanaseaktivität der Enzymzubereitungen wird wie folgt bestimmt: Zu 0,5ml Xylanlösung (1%, Sigma Nr. X-0627, zubereitet in 50mM Phosphatpuffer, pH 7) werden 0,5 ml eines geeignet verdünnten Enzyms im gleichen Puffer hinzugefügt. Die Lösung wird während exakt 10 Minuten bei 70ºC inkubiert. Die Reaktion wird dann gestoppt, indem 1 ml DNS-Reagens (3,5-Dinitrosalicylat 10g/l; Na,K-Tartrat 300g/l; NaOH 16g/l) hinzugefügt wird, und die Farbe wird entwickelt, indem die Probe 5 Minuten gekocht wird. Dann wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 540nm gemessen. Eine Enzymeinheit setzt ein Micromol des reduzierenden Zuckers frei, berechnet als Xylose pro Minute unter Versuchsbedingungen. Die Aktivität wird von einer Enzymverdünnung berechnet, die 4 Micromole des reduzierenden Zuckers unter Versuchsbedingungen freisetzt.
  • Die vorliegende Erfindung kann angewendet werden, um irgendeinen einer Vielzahl von bearbeiteten Zellstoffen zu verbessern oder bei der Verbesserung zu helfen, d.h. Zellstoffe, die bereits zuvor auf irgendeine Art und Weise behandelt wurden, um deren Ligningehalt zu reduzieren und die durch das erfindungsgemässe Verfahren behandelt werden, um den Ligningehalt weiter zu reduzieren oder die Ligninentfernung durch chemische Methoden zu verstärken oder die Entwässerbarkeit der Zellstoffe zu verstärken. Die Erfindung kann angewendet werden, um mechanische Zellstoffe zu behandeln, um deren Weissgrad zu verstärken, indem zusätzliches Lignin entfernt wird. Die Erfindung ist besonders auf chemischen Zellstoffen anwendbar, d.h. diejenige, in welchen die Ligninkomponente durch verschiedene chemische Behandlungen, wie z.B. Sulfit-, Organosolv-, Soda- und Sulfat(Kraft)-Verfahren und Sauerstoffbleiche, chemisch modifiziert wurde, und wird bevorzugt auf Kraftzellstoffe angewandt.
  • Besonders geeignete Zellstoffe sind solche, bei denen schon 80 bis 99% des Lignins entfernt wurde und die im wesentlichen behandelt werden, um zusätzliches Lignin, einschliesslich chemisch modifiziertes Lignin zu entfernen. Solch eine Behandlung von chemischen Zellstoffen wird im allgemeinen als Bleichen bezeichnet und wird durch eine Aufhellung des Zellstoffs sichtbar gemacht.
  • Der resultierende Zellstoff wird behandelt, um die freisetzbare Ligninkomponente mittels Verwendung eines geeigneten Extraktionsmittels zu entfernen. Solche Extraktionsmittel bewirken im wesentlichen die Lösbarkeit der veränderten Ligninkomponenten, und geeignete Extraktionsmittel schliessen Basen, wie z.B. Alkalimetallhydroxide (E), DMF, Dioxan, Aceton und Alkohol ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Hydroxidextraktionen können mit Wasserstoffperoxid (EP) oder Sauerstoff (EO) kombiniert werden. Der resultierende Zellstoff kann dann durch eine chemische Bleichfolge bis zu einem gewünschten Weissgrad weiter gebleicht werden, wobei beträchtliche Einsparungen bei den Chemikalien beobachtet werden, wenn man mit Zellstoff, der durch die gleiche Folge aber ohne Verwendung von Enzymbehandlung bis zum gleichen Weissgrad gebleicht wird, vergleicht. Bleichen ohne elementares Chlor, kann auf diese Weise erreicht werden.
  • Die Entfernung kleiner Mengen Hemicellulose und amorpher Cellulose zusätzlich zur Abnahme des Ligningehalts eines Zellstoffs, wenn er mit der beschriebenen Enzymzubereitung behandelt wird, erzeugt zusätzliche Vorteile wie z.B. erhöhte Entwässerbarkeit und herabgesetzte Wasserretention des Zellstoffs.
  • Die vorliegende Erfindung kann mit Verweis auf die folgenden Beispiele veranschaulicht werden.
    • BEISPIELE Beispiel 1 Züchten von Thermomonospora fusca KW3 A. Kulturmedium für Schüttelflaschenkulturen
  • T. fusca Stamm KW3 lässt man auf Platten mit LB-Medium oder in flüssigem LB- Medium wachsen, wo er auch aufbewahrt wird. LB-Medium enthält:
    • LB-Medium
  • Pepton 15 g
  • Hefeextrakt 5 g
  • Natriumchlorid 5 g
  • Glucose.H&sub2;O 1.1 g
  • Agar 20 g (nur für Platten)
  • Destilliertes Wasser Auffüllen auf 1000 ml
  • vor dem Autoklavieren auf pH 7,5 eingestellt
  • Die Kultur für die Enzymproduktion wurde im folgenden Medium durchgeführt:
    • Medium für Schüttelflaschen
  • M6 100 ml
  • Hefeextrakt 1 g
  • Spurenelementlösung 1 ml
  • Substrat 2-20 g
  • Destilliertes Wasser Auffüllen auf 1000 ml
  • vor dem Autoklavieren auf pH 7,2 eingestellt
  • Um den pH während des Züchtens zu stabilisieren wurden 12,5 ml Phosphatpuffer (0,1M, pH 8,0) zu 250 ml dieses Mediums hinzugefügt.
    • Mineralsalzmedium M6
  • (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 3 g
  • NaCl 3 g
  • MgSO&sub4; 1 g
  • CaCO&sub3; 0.2 g
  • Destilliertes Wasser Auffüllen auf 1000 ml
    • Spurenelementlösung
  • ZnCl&sub2; 40 mg
  • FeCl&sub3; 200 mg
  • CuCl&sub2;.2H&sub2;O 10 mg
  • MnCl&sub2;.4H&sub2;O 10 mg
  • Na&sub2;B&sub4;O&sub7;.4H&sub2;O 10 mg
  • (NH&sub4;)&sub2;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;.4H&sub2;O 10 mg
  • Destilliertes Wasser Auffüllen auf 1000 ml
    • Substrate
  • 1% Xylan aus Haferspelz (practical grade, Sigma) oder 1% Galactomannan (Sigma) oder 0,5% kommerzielle Weizenkleie wurden vor dem Autoklavieren hinzugefügt.
    • Zubereitung des Inokulums
  • Sporen oder Myzel von einem Schrägagar oder von einer gefrorenen Teströhrchenkultur wurden zu 100 ml LB-Medium hinzugefügt. Diese Schüttelflasche wurde während 48 Std., bei 48ºC und 150 UpM auf einen Schüttler gestellt. Aus dieser Kultur wurden 10% des Endkulturvolumens als Inokulum verwendet.
    • Züchtung
  • Die Züchtung wurde in 1 Liter-Schüttelflaschen mit je 250 ml Kulturmedium bei 48ºC und 150 UpM durchgeführt. Maximale Xylanase- oder Mannanaseaktivität wurde nach 2-3 Tagen festgestellt. Die Kulturüberstände wurden durch Zentrifugation (3000 UpM, 10 min.) und Filtration durch einen Zellulosefilter geerntet. Xylanaseaktivitäten von ungefähr 5 El&supmin;¹ und Mannanaseaktivitäten von ungefähr 1 El&supmin;¹ wurden von Kulturen erhalten, die auf Haferspelzxylan aufgewachsen wurden und 3 El&supmin;¹ und 0,5 El&supmin;¹ von Kulturen, die auf Weizenkleie aufgewachsen wurden.
    • B. Enzymproduktion in einem 15 Liter-Bioreaktor Bioreaktorausrüstung
  • Ein 15 Liter-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 10 Litern (MBR, Sulzer; Schweiz) wurde verwendet.
    • Zubereitung des Inokulums
  • Das Wachsen der Kulturen wurde durch Inokulation der 1000 ml Schüttelflaschen, die 250 ml LB-Medium enthalten, mit einer gefrorenen Teströhrchenkultur gestartet. Die Flaschen wurden während 48-55 Std., bei 48ºC und 150 UpM auf einen Schüttler gestellt. 500 ml wurden verwendet, um den Bioreaktor zu inokulieren.
    • Zusammensetzung des Bioreaktormediums MorM3
  • Xylan 3 gl&supmin;¹
  • Hefeextrakt 1 gl&supmin;¹
  • NaCl 1.5 gl&supmin;¹
  • (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 3.1 gl&supmin;¹
  • KH&sub2;PO&sub4; 0.2 gl&supmin;¹
  • Salzlösung 10 mll&supmin;¹
  • Vitaminlösung 1 mll&supmin;¹
  • pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt
    • Vitaminlösung
  • Thiamin.HCl 1 mgl.&supmin;¹
  • Biotin 1 mgl.&supmin;¹
    • Salzlösung
  • Na&sub3;EDTA 5 gl&supmin;¹
  • MgSO&sub4;.7H&sub2;O 20 gl&supmin;¹
  • ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 0.8 gl&supmin;¹
  • MnSO&sub4;.H&sub2;O 1.5 gl&supmin;¹
  • FeSO&sub4;.7H&sub2;O 2 gl&supmin;¹
  • CaCl&sub2; 2 gl&supmin;¹
    • Züchtung
  • Die Züchtung wurde bei 48ºC, 500 UpM (normaler Flügelrührer) durchgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde bei 0,5 (v/v/min) belüftet und der pH wurde automatisch bei 7,2 (NaOH 2N) gehalten. Die maximale Xylanaseaktivität wurde nach 1-2 Tagen festgestellt. Der Kulturüberstand wurde durch Zentrifugation (5000 UpM, 10-60 min.) geerntet. Die Xylanaseaktivität betrug gewöhnlich ungefähr 40'000 El&supmin;¹ und die CMCase- Aktivität war weniger als 1%.
  • Die Produktion von Mannanase wurde gemäss dem gleichen Verfahren durchgeführt, ausser das Galactomannan anstatt Xylan verwendet wurde.
    • BEISPIEL 2 Analyse des Enzymüberstands
  • Kulturüberstände aus Schüttelflaschenkulturen, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurden, zeigten die folgenden enzymatischen Aktivitäten (uMole des reduzierenden Zuckers/min./ml): Enzymaktivitäten (uMol/min./ml) C-Quelle XYLANASE MANNANASE CELLULASE (CMC) Weizenkleie Xylan Galactomannan
  • Versuche zur Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden wie folgt ausgeführt:
    • Xylanaseaktivität
  • Zu 0,5 ml einer Xylansuspension (1%, Sigma Nr. X-0627, zubereitet in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7) wurden 0,5 ml eines geeignet verdünnten Enzyms (um OD&sub5;&sub4;&sub0; zwischen 0,1 und 0,9 zu ergeben) im gleichen Puffer hinzugefügt. Die Lösung wurde exakt 10 Minuten bei 70ºC inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 1ml DNS-Reagens (3,5-Dinitrosalicylat 10g/l; Na-K-Tartrat 300g/l; NaOH 16g/l) gestoppt und die Farbe wurde durch Kochen der Probe während 5 Minuten entwickelt. Nachdem 5 ml H&sub2;O hinzugefügt wurden, wurde die Absorption bei 540 nm gemessen. Eine Enzymeinheit setzt ein Micromol reduzierenden Zucker frei, berechnet als Xylose pro Minute unter Versuchsbedingungen.
    • Mannanase-Aktivität
  • Es wurde das gleiche Verfahren wie für die Endo-Xylanase verwendet, ausser dass Galactomannan (Sigma Nr. G-0753) anstatt Xylan verwendet wurde.
    • Cellulase-Aktivität
  • Die Bestimmung wurde gemäss dem Verfahren, das von der "International Union of Pure and Applied Chemistry" (IUPAC) empfohlen wird und Carboxymethylcellulose (CMC, Fluka Nr. 21901) als Substrat verwendet (Pure & Applied Chemistry, Vol. 59 (2), 257- 268) (1987)) mit den folgenden Änderungen durchgeführt: Phosphatpuffer pH 7, 70ºC.
  • Analyse der Kulturüberstände mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese brachte einen Satz von mindestens 6 Isoenzymen mit Xylanaseaktivität zum Vorschein. Die Hauptbande hatte ein relatives Molekulargewicht von ungefähr 20'000. Analyse mittels isoelektrischer Fokusierung, Polyacrylamidgelelektrophorese und darauffolgender Aktivitätsanfärbung brachte 6 Banden mit Xylanaseaktivität zum Vorschein, von denen die Hauptkomponente einen isoelektrischen Punkt von 4,5 und ein Mr von 20 kDalton besass. Dasselbe Verfahren zeigte 4 Mannanase-Isoenzyme.
  • Weitere Analyse der entsprechenden ungereinigten Überstände zeigte, dass die Zubereitungen mehr als 50% der maximalen Aktivitäten im pH-Bereich von 5,5 bis 9 behielten, mit einer maximalen Aktivität bei pH 6-7 gemessen bei 70ºC. Die optimale Temperatur bei pH 7 beträgt 60º-70ºC, aber bei 80ºC werden noch mehr als 30% der maximalen Aktivitäten beibehalten. pH-Profil der Enzymaktivitäten bei 70ºC pH Aktivität (% des Maximums) Xylanase Mannanase CMCase Temperaturprofil der Enzymaktivitäten bei pH 7 Temp. ºC Aktivität (% des Maximums) Xylanase Mannanase CMCase
  • Die Stabilität der Xylanaseaktivität im ungereinigten Überstand wurde bei pH 7 und 9 überprüft. Die Ergebnisse sind wie folgt. Xylanasestabilität bei pH 7 Stunden Relative Aktivität(%) Xylanasestabilität bei pH 9 Stunden relative Aktivität (%)
    • BEISPIEL 3 Delignifizierung des Kraftzellstoffs Enzymzubereitung
  • Die ungereinigte Enzymzubereitung, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde unter Verwendung einer Ultrazentrifugationsmembran (Molekulargewichtabtrennung bei 10'000) zu einer Konzentration von 2500 Xylanaseeinheiten pro Milliliter konzentriert.
  • Alternativ dazu wurde die ungereinigte Enzymzubereitung lyophilisiert. Das Trockenpulver wurde dann in einem Volumen, das 10 mal kleiner als das ursprüngliche Volumen ist wieder gelöst und gegen das 100fache Volumen an Phosphatpuffer pH 7 dialysiert (Molekulargewichtabtrennung bei 10'000).
    • Zellstoffbehandlung
  • Hartholz- und Weichholzzellstoff (2,5% Feststoffgehalt) wurde mit der in Anzahl Xylanase-Einheiten angegebenen Menge Enzym während 2 Stunden bei 70ºC inkubiert. Vor der Zugabe des Enzyms wurde der pH durch Zugabe von Salzsäure auf 7 und durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 9 eingestellt. Die angegebene Enzymdosis war die Aktivität gemessen unter Ständardbedingungen (Beispiel 2). Nach 2 Stunden wurde die Zellstoffsuspension durch ein Whatman Nr. 1 Filterpapier filtriert. Der Zellstoff wurde weiter unter alkalischen Bedingungen extrahiert (2,5% NaOH/g Zellstoff, 1 Stunde bei 50ºC) und an der Luft getrocknet. Die Delignifizierung wurde als Änderung der Kappa- Zahl gemessen. Das Ausmass der Delignifizierung und Bleichbarkeit des Zellstoffs kann durch die Kappa-Zahl angegeben werden. Eine niedrige Kappa-Zahl ist wünschenswert, da es anzeigt, dass eine kleinere Menge Lignin vorhanden ist.
    • Bestimmung der Kappa-Zahl
  • Die Kappa-Zahl ist das Volumen (in Milliliter) an 0,1N Kaliumpermanganatlösung, welches von einem Gramm feuchtigkeitsfreiem Zellstoff unter Bedingungen, die in dieser Methode spezifiziert werden, verbraucht wird. Die Ergebnisse werden auf 50% Verbrauch des hinzugefügten Permanganats korrigiert. Die folgende Standardmethode wurde verwendet: TAPPI Testmethoden, (Tappi, Atlanta, GA), Vol. 1, 1988 "Kappa number of pulp - T 236 cm 85". Delignifizierung von Hartholzkraftzellstoff Enzymdosis (E/g Zellstoff) pH Kappa-Zahl Viskosität (%) Delignifizierung von Weichholzkraftzellstoff Enzymdosis (E/g Zellstoff) pH Kappa-Zahl Viskosität (%)
    • BEISPIEL 4 Bleichen von Hartholzkraftzellstoff ohne elementares Chlor
  • Eukalyptus-Kraftzellstoff mit einer Kappa-Zahl von 18,5 wurde mit 20 E/g Zellstoff Xylanaseaktivität während 3 Stunden bei 80ºC, pH 9 und einer Zellstoffkonsistenz von 15% behandelt. Der resultierende Zellstoff wurde weiter chemisch gebleicht unter Verwendung der folgenden Folge unter Standardbedingungen: EP D&sub1; EP D&sub2;. Um die Vorteile, die durch die Verwendung des Enzyms erhalten werden, zu veranschaulichen, wurden auch zwei gewöhnliche Bleichfolgen angewendet. Zellstoffeigenschaften Folge Ausbeute (%) Viskosität (dm³/kg) Weissgrad (% ISO) aktives Chlor (kg/t) ungebleicht
  • Die Daten zeigen, dass bei Verwendung des Enzyms beträchtlich weniger aktives Chlor als bei üblichen Bleichfolgen gebraucht wird, um den gleichen Weissgrad zu erreichen.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden bei pH 7 erhalten. Untersuchungen der Papiereigenschaften bei ºSR 20, 40 und 60 brachten keine wesentlichen Unterschiede zwischen Enzym und Chlor enthaltenden Folgen hervor.
    • BEISPIEL 5 Bleichen von Weichholzkraltzellstoff ohne elementares Chlor
  • Sauerstoffgebleichter Fichten-Kraftzellstoff mit einer Kappa-Zahl von 17,9 wurde mit 3 E/g Zellstoff Xylanaseaktivität während 5 Stunden bei 70ºC, pH 7 und einer Zellstoffkonsistenz von 15% behandelt. Der resultierende Zellstoff wurde weiter unter Verwendung der folgenden Folge unter Standardbedingungen: D&sub1;EOPD&sub2;EPD&sub3; (D&sub1; wurde wie eine C-Behandlung durchgeführt) gebleicht. Zellstoffeigenschaften Folge Ausbeute (%) Viskosität (dm³/kg) Weissgrad (% ISO) aktives Chlor (kg/t) ungebleicht
  • Die Daten zeigen wieder, dass verglichen mit einer Bleichfolge, die kein elementares Chlor enthält, beträchtlich weniger aktives Chlor verwendet werden muss, um den gleichen Weissgrad zu erhalten, wenn das Enzym verwendet wird. Die Papiereigenschaften, verglichen bei den gleichen ºSR, blieben unverändert.

Claims (9)

1. Verfahren zur Behandlung von Zellstoff, um dessen Ligningehalt zu reduzieren, in welchem der Zellstoff bei einer Temperatur von über 50ºC mit einem Enzymsystem in Berührung gebracht wird, das von einem Stamm von Thermomonospora fusca erhalten wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem ein Enzymsystem von Thermomonospora fusca mit der Bezeichnung KW3 und der Hinterlegungsnummer DSM 6013 verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem der Zellstoff mit dem Überstand behandelt wird, der durch Zentrifugation der Kultur erhalten wird, die aus dem Wachsen von Thermomonospora fusca resultiert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem das Enzymsystem zumindest eine von Thermomonospora fusca erhaltene Xylanase enthält.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der behandelte Zellstoff Kraft-Zellstoff ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem der Überstand vor der Kontaktierung mit dem Zellstoff konzentriert wird, um die Materialien, die ein Molekulargewicht von weniger als 10'000 besitzen, zu entfernen.
7. Neuer Stamm von Thermomonospora fusca mit der Bezeichnung KW3 und der Hinterlegungsnummer DSM 6013.
8. Verfahren für die Produktion von lignolytischen Enzymen, welches das Wachsen des Stammes nach Anspruch 7 in Gegenwart einer geeigneten Kohlenstoffquelle und die Isolierung des erhaltenen Enzymsystems umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Kultur in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wird, die aus der Gruppe bestehend aus Weizenkleie, Stroh, Gerstenkleie, Zellstoff, Xylan, Xylose, Galactomannan, Glucomannan, Mannose und Mischungen davon, ausgewählt wird.
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