DE3624575C2

DE3624575C2 -

Info

Publication number: DE3624575C2
Application number: DE19863624575
Authority: DE
Inventors: Ken-Ichi Kanagawa Jp Kasai; Naofumi Yokohama Kanagawa Jp Ito
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1985-07-22
Filing date: 1986-07-21
Publication date: 1991-01-17
Also published as: FR2585035A1; JPS62104592A; GB2178533B; GB2178533A; FR2585035B1; GB8617162D0; DE3624575A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Analysenverfahren zum Nachweis der Enzymvorstufen Glu- und Lys-Plaminogen, bei dem insbesondere kontinuierlich eine Serie von Stufen durchgeführt wird, und zwar eine Stufe zur Auftrennung von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen Enzymvorstufen, die durch den gleichen Aktivator aktiviert werden können, durch eine Flüssigchromatographiesäule, eine Stufe zur Aktivierung der Einzymvorstufen im Aluat aus dieser Säule und eine Stufe zum Nachweis der enzymatischen Aktivitäten der aktivierten Plasminogene, wobei diese Stufen in einer Vorrichtung durchgeführt werden, die Abschnitte für die jeweiligen Stufen aufweist, die der Reihe nach über Strömungsbahnen miteinander verbunden sind.

Enzymvorstufen sind inaktive Vorläuferprodukte von Enzymen. Einige Arten von Enzymen werden biologisch in Form von Vorstufen, die keine Aktivität besitzen und deren Aktivität erst nach einer speziellen Modifikation durch einen Aktivator entsteht, synthetisiert. Beispielsweise liegen das Verdauungsenzym Trypsin in Form der Vorstufe Trypsinogen und das fibrinolytische Enzym Plasmin in Form der Vorstufe Plasminogen vor, wobei beide Vorstufen wichtige Indikatoren für Erkrankungen des Verdauungssystem bzw. des Kreislaufsystems darstellen. Somit ist die Analyse der Enzymvorstufen eine sehr wichtige Aufgabe auf dem Gebiet der Medizin und Biochemie; vergl. "Blood coagulation, Fibrinolysis and Kinin", Hrsg. Nobuo Aoki, Sadaaki Iwanaga, Verlag Chugai Igakusha, 1979.

Von den Enzymvorstufen liegen einige in zwei oder mehr unterschiedlichen Arten vor, die mit dem gleichen Aktivator unter Bildung des gleichen Enzyms oder unter Bildung von Isoenzymen mit der gleichen enzymatischen Aktivität aktiviert werden können. Um zwei oder mehr derartige Typen von Enzymvorstufen voneinander zu trennen, bedient man sich häufig der Flüssigchromatographie, wobei die jeweiligen Vorstufen mit einer Säule getrennt werden. Anschließend leitet man das Eluat aus der Säule in einen Detektor, der einem Detektor zum üblichen Nachweis von Proteinen entspricht. Als Detektoren werden bei diesem Verfahren in Abhängigkeit von der Menge und der Art der Probe und von ähnlichen Faktoren häufig ein Brechungsindexdetektor, ein Absorptionsdetektor im sichtbaren Bereich, ein UV-Absorptionsdetektor, ein fluorimetrischer Detektor und dergl. verwendet. Insbesondere werden UV-Absorptionsdetektoren und fluorimetrische Detektoren, bei denen inhärente optische Eigenschaften von Proteinen ausgenutzt werden, verwendet.

Bei diesem Analysenverfahren können zwei oder mehr Arten von Enzymvorstufen in Einzelstufen voneinander getrennt werden. Die Gegenwart von Proteinen mit einem Gehalt an diesen Enzymvorstufen läßt sich in den Eluaten nachweisen. Werden jedoch in den gleichen Eluatpositionen, die auch die gewünschten Enzymvorstufen einnehmen, auch andere Proteine eluiert, so wird nicht nur die genaue Bestimmung der Menge der Enzymvorstufe verhindert, sondern auch der Nachweis, ob die gewünschte Enzymvorstufe vorliegt oder nicht, stark erschwert. Zur Analyse von Enzymvorstufen, die nicht nur auf deren Proteinbeschaffenheit, sonder auch auf deren speziellen biologischen Eigenschaften beruht, wird häufig ein Analysenverfahren durchgeführt, das folgende Einzelstufen umfaßt:

(1) Eine Trennstufe, bei der die jeweiligen Enzymvorstufen in einer Probe mit einem Gehalt an zwei oder mehr Enzymvorstufen durch eine Flüssigchromatographiesäule in zwei oder mehr Gruppen aufgetrennt werden;
(2) eine Fraktionierungsstufe, bei der das Eluat aus der Säule in mehrere Fraktionen aufgetrennt wird;
(3) eine Aktivierungsstufe, bei der ein Aktivator für die Enzymvorstufen zu den jeweiligen Fraktionen gegeben wird, um die Enzymvorstufen zu aktivieren; und
(4) eine Nachweisstufe, bei der die Enzymaktivität der einzelnen, in Stufe (3) aktivierten Enzymvorstufen unter Durchführung einer enzymatischen Reaktion in den jeweiligen Fraktionen nachgewiesen wird.

Jedoch bereitet eine rasche und einfache Durchführung dieses Verfahrens Schwierigkeiten. Insbesondere handelt es sich bei den Schritten, bei denen die Aktivierung der aufgetrennten Enzymvorstufen vorgenommen wird und bei denen die anschließende Messung der enzymatischen Aktivität erfolgt, meistens um recht aufwendige Schritte. Aus diesem Grund ist in der Praxis häufig eine lange Zeitdauer für die Aktivierungsreaktionen und/oder die enzymatische Reaktion erforderlich, was auf die auch in den einfachsten Fällen notwendigen verschiedenen Kombinationen von Arbeitsschritten zurückzuführen ist. In Fällen, bei denen die für die Aktivierungsreaktion und/oder für die enzymatische Reaktion erforderliche Zeitspanne lang ist, kann man zur Abkürzung der Analysenzeit in den meisten Fällen die Bestimmung der enzymatischen Aktivität abkürzen, indem man in einem Zustand arbeitet, in dem die Aktivierungsreaktion und/oder die enzymatische Reaktion noch nicht vollständig abgelaufen sind. In derartigen Fällen ist es erforderlich, die Zeit für die jeweiligen Arbeitsvorgänge genau zu kontrollieren, was wiederum sehr aufwendig ist. Um beim vorstehend geschilderten Verfahren eine genaue Information zu erhalten, ist es erforderlich, die Anzahl der Fraktionen des aus der Säule stammenden Eluats zu erhöhen und demgemäß die Aktivierungsreaktion und die enzymatische Reaktion in einer entsprechend großen Anzahl von Fraktionen durchzuführen. Somit ist ein sehr hoher Zeitaufwand erforderlich, bevor nach der Trennung mittels der Säule das endgültige Analysenergebnis vorliegt. Es ist äußerst schwierig, die Analysenergebnisse praktisch gleichzeitig mit dem Trennvorgang zu erhalten.

Handelt es sich bei den zu analysierenden Substanzen um Enzyme, so ist es möglich, die Enzyme spezifisch nachzuweisen, indem man ein für die Enzyme spezifisches Substrat in die Strömungsbahn des aus der Säule stammenden Eluats gibt und das durch die enzymatische Reaktion gebildete Produkt nachweist. Demgegenüber steht im Fall von Enzymvorstufen, die selbst nicht mit dem Substrat reagieren, kein derartiges spezifisches Nachweisverfahren zur Verfügung. Ferner kann die Maßnahme der vorherigen Zugabe eines Aktivators in eine Enzymvorstufe enthaltende Probenlösung zur Aktivierung der Enzymvorstufen vor dem Einspritzen nicht angewandt werden, da ein derartiges Verfahren den tatsächlich vorliegenden Zustand der Enzymvorstufen in einer Probenlösung nicht korrekt wiedergibt. Insbesondere können die durch die Aktivierung gebildeten Enzyme die im gleichen Gefäß vorliegenden nicht-umgesetzten Enzymvorstufen verändern oder eine Selbstverdauung hervorrufen. Beispielsweise liegen Plasminogene, bei denen es sich um die Vorstufen des fibrinolytischen Enzyms Plasmin handelt, im allgemeinen in den Formen Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen vor, wobei deren Mengen und deren Mengenverhältnisse Aussagen über die Funktion des fibrinolytischen Systems zulassen. Da Plasmin jedoch eine Veränderung von Glu-Plasminogen in Lys-Plasminogen bewirkt, wenn die Plasminogene vor dem Einspritzen in die Säule unter Bildung von Plasmin aktiviert werden, gibt das Analysenergebnis den tatsächlich vorliegenden Zustand in Bezug auf Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen vor dem Einspritzen nicht korrekt wieder. Ferner besteht dann, wenn ein Enzyminhibitor gleichzeitig in einer Probenlösung vorhanden ist, der Nachteil, daß die enzymatische Aktivität nicht korrekt nachgewiesen werden kann.

Wie vorstehend erläutert, lassen sich bei der Analyse von Enzymvorstufen durch Flüssigchromatographie, insbesondere Hochleistungsflüssigchromatogaphie (HPLC) aufgrund der Tatsache, daß gemäß dem Stand der Technik kein Verfahren zum Nachweis von Enzymvorstufen, das auf der biologischen Spezifität der Enzyme beruht, die charakteristischerweise bei der Hochleistungsflüssigchromatographie gegebene Einfachkeit und Schnelligkeit in den meisten Fällen nicht voll ausnutzen.

In "J. of Chromatography", Band 292, Nr. 2, S. 269-382 (1984) wird ein Verfahren zur Bestimmung von Plasmin und Plasminogen beschrieben, in dem das Plasminogen vor der Aufgabe auf eine Hochleistungs-Affinitätschromatographiesäule mit Urokinase aktiviert, in Plasmin und Plasminogen getrennt und die Plasminaktivität mit Hilfe einer Substratlösung in einer Fluoreszenzzelle bestimmt wird. Die Affinitätschromatographiesäule wird dabei mit einer wäßrigen, Natriumphosphat und Natriumchlorid enthaltenden Lösung äquilibriert, das Plasminogen wird einer wäßrigen, Natriumphosphat, Natriumchlorid und 6-Aminohexansäure enthaltenden Lösung eluiert. Für die Eluierung von Plasmin wird dieser Lösung noch Harnstoff zugesetzt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, die vorstehend erwähnten Nachteile beim Nachweis von Enzymvorstufen durch Flüssigchromatographie zu beseitigen und ein Analysenverfahren für die quantitative Bestimmung von Gluund Lys-Plasminogen anzugeben, bei dem in einfacher und rascher Weise kontinuierlich eine Serie von Arbeitsschritten durchgeführt wird, die in der Trennung von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen Enzymvorstufen, die durch den gleichen Aktivator aktiviert werden können, in der Aktivierung der Plasminogene im aus der Säule stammenden Eluat und im Nachweis der enzymatischen Aktivitäten der aktivierten Plasminogene besteht. Diese Arbeitsschritte werden in einer Vorrichtung durchgeführt, in der Abschnitte für die jeweiligen Arbeitsschritte miteinander der Reihe nach verbunden sind.

Fig. 1 zeigt ein Fließdiagramm des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens.

Fig. 2 ist ein Chromatogramm mit dem Nachweisergebnis von Lys-Plasminogen gemäß Beispiel 1.

Fig. 3 ist ein Chromatogramm mit dem Nachweisergebnis von Glu-Plasminogen gemäß Beispiel 2.

Fig. 4 ist ein Chromatogramm mit den Nachweisergebnissen von Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen gemäß Beispiel 3.

Fig. 5 ist ein Chromatogramm mit den Nachweisergebnissen von Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen in Plasma gemäß Beispiel 4.

Fig. 6 ist ein Chromatogramm mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels.

Die ausgezogenen Linien in Fig. 2 bis 6 zeigen die Ergebnisse des Detektors für die Aktivierung und die gestrichelten Linien die Ergebnisse des Proteindetektors. B₀ (wäßrige Lösung) bedeutet eine 50 mMol/l wäßrige Natriumphosphatlösung (pH-Wert 6,5) und B₁ (wäßrige Lösung) eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 50 mMol/l Natriumphosphat und 100 mMol/l Natriumchlorid.

Fig. 7 und Fig. 8 zeigen in schematischer Darstellung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Gegenstand der Erfindung ist ein kontinuierliches, quantitatives Analysenverfahren zur Bestimmung von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen mit dem gleichen Aktivator aktivierbaren Plasminogenen, bei dem in gesonderten Stufen (1) die Trennung durch Hochleistungs-Affinitätschromatographie, (2) die Aktivierung mit Urokinase und (3) der Nachweis der Plasminaktivität mit Hilfe einer Substratlösung erfolgt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß dadurch gekennzeichnet, daß man kontinuierlich in einer Vorrichtung, die entsprechende Abschnitte für die Durchführung dieser Stufen aufweist und in der diese Abschnitte der Reihe nach durch eine Strömungsbahn miteinander verbunden sind, die nachstehenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge durchführt:

(1) eine Trennstufe, in der Glu- und Lys-Plasminogen voneinander getrennt werden durch
- (a) Behandeln der an der Säule absorbierten Probe mit einer wäßrigen, Natriumphosphat enthaltenden Lösung und
- (b) Durchleiten einer wäßrigen, Natriumphosphat und Natriumchlorid enthaltenden Lösung zur Eluierung von Glu-Plasminogen und dann einer wäßrigen Natriumphosphat, Natriumchlorid und 6-Aminohexansäure enthaltenden Lösung zur Eluierung von Lys-Plasminogen;
(2) eine Aktivierungsstufe, bei der das Eluat aus der genannten Säule ganz oder zum Teil im Reaktor mit einem Aktivator für die Plasminogene in Kontakt gebracht wird, um die Plasminogene zu aktivieren; und
(3) eine Nachweisstufe, bei der die enzymatische Aktivität der aktivierten Plasminogene nachgewiesen wird.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung für die Analyse von Glu- und Lys-Plasminogen, die folgendes umfaßt:

(I) Einen Trennabschnitt, der eine Vorrichtung zum Einspeisen eines Übertragungsmittels, eine Probeneinspritzvorrichtung und eine Flüssigchromatographiesäule zum Trennen von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen mit dem gleichen Aktivator aktivierbaren Plasminogenen aufweist, wobei die genannten Einrichtungen in der angegebenen Reihenfolge miteinander verbunden sind;
(II) einen Akktivierungsabschnitt, der mit der Strömungsbahn des Eluats aus der Säule verbunden ist und der Glu- und Lys-Plasminogen aktiviert, indem das Eluat mit einem Aktivator für Glu- und Lys-Plasminogen in Kontakt gebracht wird; und
(III) einen Nachweisabschnitt, der einem Enzymreaktor, der mit der Strömungsbahn der vom Aktivierungsabschnitt ausströmenden Flüssigkeit verbunden ist und in dem die enzymatische Reaktion durch Kontakt der genannten ausströmenden Flüssigkeit mit einem Substrat das spezifisch mit dem aktivierten Glu- und Lys-Plasminogen reagiert, abläuft, und einen Detektor zum Nachweis der in der aus dem Reaktor ausströmenden Flüssigkeit enthaltenen Reaktionsprodukte aufweist.

Der Ausdruck "Enzymvorstufe" betrifft eine Verbindung, die selbst keine enzymatische Aktivität aufweist, aber durch Aktivierung in ein Enzym oder einen Komplex mit enzymatischer Aktivität übergeführt werden kann. Bei den meisten Enzymvorstufen handelt es sich um Vorstufen von proteolytischen Enzymen.

Ein Beispiel für Enzymvorstufen aus der Gruppe der fibrinolytischen Enzyme ist Plasminogen, aus dem nach Aktivierung Plasmin entsteht. Wird Plasminogen mit Streptokinase aktiviert, so wird ein Komplex, der selbst kein Enzym darstellt, aber enzymatische Aktivität besitzt, gebildet.

Das erfindungsgemäße Analysenverfahren wird für die Bestimmung von Glu- und Lys-Plasminogen angewandt, d. h. von Vorstufen von Blut koagulierenden Enzymen und fibrinolytischen Enzymen.

Hinsichtlich des Probenmaterials bestehen erfindungsgemäß keine speziellen Beschränkungen. Vorzugsweise werden Körperflüssigkeiten, die keine geformten Bestandteile enthalten, verwendet, wie Plasma, Serum, Hämolysate, aus denen geformte Bestandteile entfernt worden sind, Urin und dergl. Bei der Analyse von Vorstufen von Blut koagulierenden Enzymen und fibrinolytischen Enzymen handelt es sich beim Probenmaterial vorzugsweise um Plasma.

In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Enzymvorstufen Glu- und Lys-Plasminogen voneinander mit einer Hochleistungs-Affinitätschromatographiesäule getrennt, die insbesondere mit einem harten Gel gepackt sein kann. Unter harten Gelen sind solche Gele zu verstehen, die sog. permanente Poren aufweisen, wobei die spezifische Oberfläche im trockenen Zustand sich im wesentlichen vom feuchten Zustand nicht unterscheidet.

Bei der Affinitätschromatographie ist eine spezifische Durchführung sämtlicher Trenn-, Aktivierungs- und Nachweisstufen möglich, wodurch es gelingt, die Analyse mit sehr hoher Spezifität durchzuführen. Somit lassen sich erfindungsgemäß Glu- und Lys-Plasminogen von Isoenzymen in einer Probe, die störende Bestandteile oder andere Vorstufen eines Enzyms enthält, die gemäß dem Stand der Technik nur schwierig analysiert werden konnten, mit besonderem Erfolg analysieren. Nach der Trennung von Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen werden diese Bestandteile aktiviert und nachgewiesen, wodurch es möglich wird, die Reinheit von verschiedenen Arten von Plasminogenproben zu bestimmen. Bei Verwendung von Plasmaproben ist eine Diagnose oder Therapieüberwachung von Erkrankungen mit Blut koagulierenden und fibrinolytischem Hintergrund möglich. Dadurch leistet das erfindungsgemäße Verfahren einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der Biochemie und Medizin.

In der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die im Eluat der Flüssigchromatographiesäule enthaltene Enzymvorstufe durch Kontakt mit einem Aktivator aktiviert. Unter dem Ausdruck Aktivierung ist zu verstehen, daß einer Enzymvorstufe, die keine enzymatische Aktivität aufweist, enzymatische Aktivität verliehen wird. Mit anderen Worten, es wird die Enzymvorstufe selbst in ein Enzym oder einen Komplex mit enzymatischer Aktivität übergeführt. Die Substanz, die eine derartige Aktivierung bewirkt, wird als Aktivator bezeichnet. Für die jeweiligen Enzymvorstufen gibt es spezifische Aktivatoren. Beispiele für Aktivatoren sind nachstehend aufgeführt. Für die fibrinolytischen Enzyme ist der Aktivator, der Plasminogen in Plasmin überführt, z. B. Urokinase, Gewebeaktivator, Streptokinase oder Staphylokinase.

Im erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine Beschleunigung durchführen, indem man dafür sorgt, daß eine Substanz, die die Aktivierungsreaktion beschleunigt, (nachstehend als "Beschleuniger" bezeichnet) gleichzeitig vorhanden ist, z. B. Lysin und Lysinanaloge, wie 6-Aminohexansäure oder trans- 4-Aminoethylcyclohexyan-1-carbonsäure (vergl. L. Bányai, L. Patthy, J. Biol. Chem., Bd. 259 (10) (1984), S. 6466) insbesondere bei der Aktivierung von Glu-Plasminogen.

Hinsichtlich der Aktivierungsmethode für die aus der Flüssigchromatographiesäule eluierte Enzymvorstufe gibt es keine speziellen Beschränkungen. Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren besteht darin, daß man eine wäßrige Lösung, die einen Aktivator enthält, dem aus der Säule stammenden Eluat zusetzt. Ein weiteres Beispiel für ein derartiges Verfahren besteht darin, daß man eine Säule, die mit einem unlöslichen Träger, an dem sich ein immobilisierter Aktivator befindet, gepackt ist, oder eine Leitung, an deren Innenseite sich immobilisierter Aktivator befindet, bereitstellt und das Eluat aus der Säule zur Durchführung der Aktivierung durch diese Vorrichtung hindurch leitet. Bei Verwendung eines Beschleunigers kann dieser im Übertragungsmittel oder in einer wäßrigen Lösung, die einen Aktivator enthält, vorliegen.

In der dritten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Plasminogen spezifisch durch Nachweis der enzymatischen Aktivität nachgewiesen. Dabei wird dafür gesorgt, daß in einem enzymatischen Reaktor, durch den eine wäßrige Lösung mit dem auf die vorstehende Weise aktivierten Enzym oder dem Komplex mit enzymatischer Aktivität geleitet wird, gleichzeitig ein Substrat vorliegt, das spezifisch mit dem Enzym oder dem Komplex mit enzymatischer Aktivität reagieren kann. Dadurch wird der Ablauf der enzymatischen Reaktion im Reaktor verursacht. Das gebildete Produkt wird durch Nachweis der enzymatischen Aktivität nachgewiesen.

Beim Substrat handelt es sich um eine Verbindung oder ein Molekül, auf das ein Enzym einwirkt. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise solche Substrate verwendet, die aufgrund der enzymatischen Reaktion zur Bildung von Substanzen führen, deren optische Eigenschaften sich von denen des Substrats unterscheiden. Inbesondere sollen sich das Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich, das UV-Absorptionsspektrum oder das Fluoreszenzspektrum des Produkts der enzymatischen Reaktion vom entsprechenden Spektrum des Substrats unterscheiden. Substrate, die zur Bildung von Substanzen führen, die mittels eines fluorimetrischen Detektors nachweisbar sind, werden wegen ihrer Empfindlichkeit besonders in den Fällen bevorzugt, wo geringe Mengen an Enzymvorstufen nachzuweisen sind. Nachstehend werden Beispiele für Substrate, die sich für die Analyse von Plasminogenen eignen, aufgeführt. Als Substrate, die für Plasmin, d. h. das durch Aktivierung von Plasminogen gebildete Enzym, spezifisch sind, werden häufig Peptide mit 1 bis 3 Aminosäuren verwendet, die als carboxylendständige Aminosäure L-Lysin oder L-Arginin aufweisen, wobei eine fluoreszierende Substanz an die Carboxylgruppe dieser Aminosäure gebunden ist. Spezielle Beispiele für derartige Substrate sind 7-(tert.-Butyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-lysyl- L-lysinamido)-4-methylcumarin, 7- (tert.-Butyloxycarbonyl- L-valyl-L-leucyl-L-lysinamido)-4-methylcumarin, 7-(D-Valyl- L-leucyl-L-lysinamido)-4-methylcumarin, 7-(Succinyl-L- alanyl-L-phenylalanyl-L-lysinamido-4-methylcumarin, 7-(Methoxysuccinyl- L-alanyl-L-phenylalanyl-L-lysinamido)-4-methylcumarin, 7-(Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-prolyl-L-argininamido)- 4-methylcumarin, 7-(D-Alanyl-L-leucyl-L-lysinamido)- 4-methylcumarin und dergl. Bei Verwendung dieser Substrate entsteht aufgrund der enzymatischen Reaktion 7-Amino-4- methylcumarin, das mittels eines fluorimetrischen Detektors nachgewiesen werden kann. Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung eines Substrats, das p-Nitroanilin als enzymatisches Reaktionsprodukt bilden kann, z. B. D-Valyl- L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilid. In diesem Fall kann p-Nitroanilin unter Verwendung eines im sichtbaren Bereich arbeitenden Absorptionsdetektors nachgewiesen werden.

Zur Bereitstellung des Substrats im enzymatischen Reaktor kann man dafür Sorge tragen, daß das Substrat vorher im Übertragungsmittel vorliegt oder man kann eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an einem Substrat dem aus der Säule stammenden Eluat zusetzen.

Zusätzlich kann beim Analysenverfahren der Erfindung die Enzymvorstufe im aus der Säule stammenden Eluat als Protein nachgewiesen werden, wodurch man eine zusätzliche Information erhält. Zur Durchführung dieses Nachweises kann ein Detektor, der sich zum Proteinnachweis eignet, im Anschluß an die Säule vorgesehen werden. Hinsichtlich des Detektors gibt es keine speziellen Beschränkungen, sofern er zum Proteinnachweis geeignet ist. UV-Absorptionsdetektoren oder fluorimetrische Detektoren werden im Hinblick auf die Spezifität gegenüber Proteinen bevorzugt. Im Fall von geringen Probenmengen oder wenn ein großer Anteil an im UV-Bereich absorbierenden Substanzen als Verunreinigungen vorhanden ist, wird häufig ein fluorimetrischer Detektor bevorzugt.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für den Fließverlauf des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens. Bei fließendem Übertragungsmittel wird eine Probenlösung mit einem Gehalt an Glu- und Lys-Plasminogen in die Säule eingespritzt, um sie voneinander zu trennen. Das aus der Säule ausströmende Eluat wird in den Reaktor für die Aktivierungsreaktion eingespeist, worin die Enzymvorstufen aktiviert werden. Anschließend wird das aktivierte Produkt in den Reaktor für die enzymatische Reaktion eingespeist, worin die aktivierten Glu- und Lys-Plasminogene mit einem Substrat umgesetzt werden und das Reaktionsprodukt mittels eines Detektors nachgewiesen wird. Die Ausgangsgröße am Detektor wird mittels einer Aufzeichnungsvorrichtung aufgezeichnet.

Nachstehend wird eine bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens näher beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine Vorrichtung zur Analyse von Glu- und Lys-Plasminogenen, die folgendes umfaßt:

(I) Einen Trennabschnitt, der eine Einrichtung zum Einspeisen eines Übertragungsmittels, eine Probeneinspritzvorrichtung und eine Flüssigchromatographiesäule zum Trennen von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen mit dem gleichen Aktivator aktivierbaren Enzymvorstufen aufweist, wobei die Vorrichtungen in der angegebenen Reihenfolge miteinander verbunden sind;
(II) einen Aktivierungsabschnitt, der mit der Strömungsbahn des Eluats aus der Säule verbunden ist und Glu- und Lys-Plasminogen aktiviert, indem das Eluat mit einem Aktivator für Glu- und Lys-Plasminogen in Kontakt gebracht wird; und
(III) einen Nachweisabschnitt, der einen Enzymreaktor, der mit der Strömungsbahn der vom Aktivierungsabschnitt ausströmenden Flüssigkeit verbunden ist und in dem die enzymatische Reaktion durch Kontakt der genannten ausströmenden Flüssigkeit mit einem Substrat, das spezifisch mit Glu- und Lys-Plasminogen reagiert, abläuft, und einen Detektor zum Nachweis der in der aus dem Reaktor ausströmenden Flüssigkeit enthaltenen Reaktionsprodukte aufweist.

Ein Beispiel für eine derartige Vorrichtung, die als Aktivierungsabschnitt eine Mischeinrichtung, die mit der Strömungsbahn des aus der Säule stammenden Eluats verbunden ist und zum Einmischen einer wäßrigen, einen Aktivator für Glu- und Lys-Plasminogen enthaltenden Lösung dient, und einen Reaktor für die Aktivierungsreaktion zur Durchführung der Aktivierung von Glu- und Lys-Plasminogen in dem in der Mischeinrichtung gebildeten Gemisch aufweist, ist in Fig. 7 dargestellt. In dieser Figur bezeichnet das Bezugszeichen 1 ein Übertragungsmittel. Die Zufuhr des jeweiligen Übertragungsmittels erfolgt mittels eines Umstellventils 2 und einer Pumpe 3. Die die Enzymvorstufen enthaltende Probe wird mittels eines Injektors 4 eingespritzt und der Trennsäule 5 zugeführt. Ein Teil des aus der Säule stammenden Eluats wird separat mittels einer Pumpe 6 in eine Mischvorrichtung 9 eingespeist. In die Mischvorrichtung 9 wird ferner eine wäßrige Lösung 7, die einen Aktivator für Glu- und Lys-Plasminogen enthält, mittels einer Pumpe 8 eingespeist. Nach erfolgter Mischung wird das Gemisch in eine Spiralleitung 10 zur Aktivierung eingeleitet. Die Plasminogene werden beim Passieren der Spirale 10 aktiviert. Die die aktivierten Plasminogene enthaltende wäßrige Lösung wird einem Mischer 13 zugeführt, worin sie mit einer wäßrigen Lösung, die ein Substrat 11 enthält und mittels einer Pumpe 12 eingespeist wird, vermischt wird. Das während der Passage des Gemisches durch die Spirale 14 zur Durchführung der enzymatischen Reaktion gebildete Reaktionsprodukt wird mit einem Detektor 15 nachgewiesen.

In der Vorrichtung von Fig. 7 kann ohne Verwendung der Pumpe 6 eine Vorrichtung bereitgestellt werden, bei der das gesamte, aus der Trennsäule 5 kommende Eluat der Mischvorrichtung 9 zugeführt wird.

In Fig. 8 ist ein Beispiel für eine derartige Vorrichtung dargestellt, in der der Aktivierungsabschnitt eine Säule 16 umfaßt, die einen immobilisierten Aktivator für Glu- und Lys-Plasminogen enthält und mit der Strömungsbahn des Trennabschnitts so verbunden ist, daß das aus dem Trennabschnitt kommende Eluat durch die genannte Säule geleitet wird. Ähnlich wie in Fig. 7, wird die Probe in die Trennsäule 5 eingespeist. Anschließend wird das Eluat in eine Säule 16 geleitet, die den immobilisierten Aktivator für die Enzymvorstufe enthält und in der Glu- und Lys-Plasminogen aktiviert werden. Das aus der Säule 16 kommende Eluat wird in eine Mischvorrichtung 13 eingespeist, worin es mit einer durch eine Pumpe 12 zugeführten wäßrigen Lösung 11, die ein Substrat enthält, vermischt wird. Anschließend durchläuft das Gemisch eine Spirale 14 zur Durchführung der enzymatischen Reaktion. Auch hier wird das gebildete Reaktionsprodukt mittels eines Detektors nachgewiesen.

Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens läßt sich im Vergleich zu einem herkömmlichen Verfahren, bei dem die Trenn-, Fraktionsierungs-, Aktivierungs- und Nachweisstufen einzeln durchgeführt werden, der Wirkungsgrad des Verfahrens steigern und die erforderliche Zeit erheblich verkürzen. Selbst wenn Glu- und Lys-Plasminogene von den übrigen Bestandteilen in unzureichender Weise getrennt werden, lassen sich diese Enzymvorstufen rasch und leicht spezifisch nachweisen, so daß ihre quantitative Bestimmung möglich ist. Ferner wird beim erfindungsgemäßen Verfahren keine Vorbehandlung, z. B. eine Aktivierung, vor dem Einspritzen der Probe in die Säule durchgeführt. Dadurch ist es möglich, genaue Informationen über die tatsächlich vorliegende Menge und/oder den tatsächlich vorliegenden Zustand der Glu- und Lys-Plasminogene vor der Analyse zu erhalten.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher eräutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung der Erfindung zur Analyse von Plasminogenen unter Einsatz von Hochleistungs affinitätschromatographie.

Mittels einer Pumpe für die Hochleistungsflüssigchromatographie (Twincle, Japan Spectroscopic Co., Ltd.) wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 50 mMol/l Natriumphosphat und 100 mMol/l Natriumchlorid (pH-Wert 7,4) (nachstehend kurz "B₁ wäßrige Lösung") als Übertragungsmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durch die Vorrichtung geleitet. Eine Probenlösung mit einem Gehalt an 9 g Lys-Plasminogen wird unter Verwendung einer Mikrospritze in die Injektionsvorrichtung einer Flüssigchromatographiesäule eingespritzt. Um zusätzlich zum erfindungsgemäßen Analysenverfahren auch über einen Proteinnachweis zu verfügen, wird das Eluat von der Säule in einen fluorimetrischen Detektor (RF-530, Shimadzu Seisakusho K. K., Erregungswellenlänge 285 nm, Emmissionswellenlänge 340 nm) geleitet. Protein wird unter Verwendung dieses Detektors nachgewiesen. Ein Teil des Eluats aus dem Proteindetektor wird mittels einer peristaltischen Pumpe (HP-4, Gilson Co.) zur Probennahme verwendet, mit der B₁ wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Urokinase als Aktivator in einer Konzentration von 100 U/ml vermischt und durch eine Spirale zur Durchführung der Aktivierungsreaktion (Innendurchmesser 0,25 mm×4 m Länge) bei 37°C geleitet. Am Auslaß der Aktivierungsspirale wird das ausströmende Produkt mit einer wäßrigen 0,5 m Natriumphosphatlösung (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 7-(tert.- Butyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-lysinamido)-4-methylcumarin, das ein spezifisches Substrat für Plasmin darstellt, in einer Konzentration von 20 µm vermischt und durch eine Spirale zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion (Innendurchmesser 0,25 mm×Länge 4 m) bei 37°C geleitet. Wenn im aus der Säule ausströmenden Produkt Plasminogen enthalten ist, wird 7-Amino-4-methylcumarin gebildet, das durch einen fluorimetrischen Detektor (FD-110, Japan Spectroscopic Co., Ltd., Erregungswellenlänge 365 nm, Emissionswellenlänge 460 nm) als Detektor zum Nachweis der Aktivität nachgewiesen wird. Bei Durchleitung des vorerwähnten Übertragungsmittels wird im Aktivierungsdetektor kein Lys-Plasminogen nachgewiesen, was bestätigt, daß Lys-Plasminogen adsorbiert wird. Verwendet man als Übertragungsmittel die B₁-wäßrige Lösung mit einem Zusatz von 20 mMol/l 6-Aminohexansäure (nachstehend kurz "6-AHA") zur Elution von Lys-Plasminogen, wird Lys- Plasminogen eluiert und im Proteindetektor nachgewiesen. Ferner wird Lys-Plasminogen in der Aktivierungsspirale aktiviert. Die Aktivität läßt sich im Aktivitätsdetektor nachweisen. Somit läßt sich Lys-Plasminogen spezifisch nachweisen.

Bei der eingesetzten Säule handelt es sich um eine Chromatographiesäule aus rostfreiem Stahl (Innendurchmesser 6 mm×Länge 10 cm), die mit einem Adsorptionsmittel mit p-Aminobenzamidin, das über einen Abstandshalter an einem Vinylalkohol-Copolymeren immobilisiert ist (vergl. Beispiel 4 der JP-OS 37 095/1986), gepackt ist. Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 2 gezeigt. Daraus geht hervor, daß die B₁-wäßrige Lösung 10 Minuten von Analysenbeginn durchgeleitet wird und die Durchleitung von B₁-wäßriger Lösung mit einem Gehalt an 20 mMol/l 6-AHA als Übertragungsmittel nach 10 Minuten beginnt. In der Abbildung zeigt der mit einem Pfeil gekennzeichnete durchgezogene Peak das Nachweisergebnis für Lys-Plasminogen gemäß dem erfindungsgemäßen Analysenverfahren. Die gestrichelte Linie zeigt das Ergebnis des Proteinnachweises.

Beispiel 2

Der nachstehende Versuch wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, wobei hinsichtlich der Verwendung des Übertragungsmittels und der Zusammensetzung der wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Urokinase Abänderungen durchgeführt werden.

Bei Durchleitung der B₁-wäßrigen Lösung als Übertragungsmittel mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min und Injektion einer Probenlösung mit einem Gehalt an 15 µg Glu-Plasminogen wird Glu-Plasminogen später als die direkt durchgehende Fraktion eluiert und mittels des Proteindetektors nachgewiesen. Beim Vermischen mit B₁-wäßriger Lösung mit einem Gehalt an Urokinase als Aktivator in einer Konzentration von 100 U/ml und zusätzlich 20 mMol/l trans-4-Aminomethylcyclohexan-1-carbonsäure (nachstehend kurz "t-AMCHA") als Beschleuniger wird Glu-Plasminogen in der Aktivierungsspirale aktiviert. Die Aktivität läßt sich im Aktivitätsdetektor nachweisen, womit ein spezifischer Nachweis für Glu-Plasminogen gelingt. Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 3 gezeigt, worin der mit einem Pfeil gekennzeichnete durchgezogene Peak das Nachweisergebnis für Glu-Plasminogen gemäß dem erfindungsgemäßen Analysenverfahren wiedergibt.

Beispiel 3

Der folgende Versuch wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abänderung, daß die Zusammensetzung und die Verwendungsart des Übertragungsmittels und die Strömungsmerkmale der wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Urokinase modifiziert werden.

Bei Durchleiten einer wäßrigen 50 mMol/l Natriumphosphatlösung (pH-Wert 6,5) (nachstehend kurz "B₀" wäßrige Lösung) als Übertragungsmittel mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min und Injektion einer gemischten Probenlösung mit einem Gehalt an 7 µg Glu-Plasminogen und 4 µg Lys-Plasminogen werden beide Substanzen adsorbiert. Verwendet man als Übertragungsmittel die B₁-wäßrige Lösung, wird es Glu-Plasminogen eluiert. Während diese Schrittes wird durch Zumischen von B₁-wäßriger Lösung mit einem Gehalt an Urokinase in einer Konzentration von 100 U/ml und zusätzlich 20 mMol/l t-AMCHA als Beschleuniger Glu-Plasminogen aktiviert und spezifisch nachgewiesen.

Zur Elution von Lys-Plasminogen geht man hinsichtlich des Übertragungsmittels auf eine B₁-Lösung mit einem Gehalt an 20 mMol/l 6-AHA über. Gleichzeitig wird die vorgenannte Lösung mit einem Gehalt an Urokinase und t-AMCHA in eine B₁-wäßrige Lösung mit einem Gehalt an Urokinase in einer Konzentration von 100 U/ml verändert und zugemischt. Lys-Plasminogen wird eluiert, aktiviert und nachgewiesen. Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 4 abgebildet.

Beispiel 4

Der folgende Versuch wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abänderung, daß hinsichtlich der Verwendungsart des Übertragungsmittels sowie der Zusammensetzung und der Verwendungsart der wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Urokinase Modifikationen vorgenommen werden.

Die B₁-wäßrige Lösung wird als Übertragungsmittel mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durchgeleitet und 40 µl Plasma einer gesunden Person werden direkt ohne eine Vorbehandlung eingespritzt. Bei Zumischen einer B₁-wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Urokinase in einer Konzentration von 500 U/ml und 20 mMol/l t-AMCHA als Beschleuniger kann Glu-Plasminogen aktiviert und spezifisch nachgewiesen werden. Anschließend wird anstelle der vorerwähnten Lösung mit einem Gehalt an Urokinase und t-AMCHA eine B₁-wäßrige Lösung (Puffer) 10 Minuten lang durchgeleitet. Sodann geht man zur Elution von Lys-Plasminogen vom Übertragungsmittel auf eine B₁-wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 20 mMol/l 6-AHA über und gleichzeitig wird die vorerwähnte B₁-wäßrige Lösung in eine B₁-wäßrige Lösung mit einem Gehalt an Urokinase als Aktivator in einer Konzentration von 100 U/ml verändert und zugemischt. Lys- Plasminogen wird eluiert und läßt sich spezifisch nachweisen. Das Diagramm ist in Fig. 5 gezeigt.

Vergleichsbeispiel

Man verfährt wie in Beispiel 4, verwendet aber keinen Aktivator. Somit wird anstelle der wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an Urokinase eine B₁-wäßrige Lösung (Puffer) verwendet. Weder Glu-Plasminogen noch Lys-Plasminogen lassen sich aktivieren und spezifisch nachweisen. Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 6 gezeigt.

Aus Beispiel 4 ist ersichtlich, daß Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen abgetrennt werden können. Jedoch ist beim Vergleichsbeispiel ohne Aktivierungsvorgang kein Peak in der durchgezogenen Linie erkennbar. Somit ist ersichtlich, daß Glu-Plasminogen und Lys-Plasminogen nur dann spezifisch nachgewiesen werden können, wenn das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird.

Claims

1. Quantitatives Analyseverfahren zur Bestimmung von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen mit dem gleichen Aktivator aktivierbaren Plasminogen, bei dem in gesonderten Stufen (1) die Trennung durch Hochleistungs-Affinitätschromatographie, (2) die Aktivierung mit einem Plasminogen-Aktivator und (3) der Nachweis der Plasminaktivität mit Hilfe einer Substratlösung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß man kontinuierlich in einer Vorrichtung, die entsprechende Abschnitte für die Durchführung dieser Stufen aufweist und in der diese Abschnitte der Reihe nach durch eine Strömungsbahn miteinander verbunden sind, die nachstehenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge durchführt:

(1) eine Trennstufe, in der Glu- und Lys-Plasminogen voneinander getrennt werden durch
- (a) Behandeln der an der Säule absorbierten Probe mit einer wäßrigen, Natriumphosphat enthaltenden Lösung und
- (b) Durchleiten einer wäßrigen, Natriumphosphat und Natriumchlorid enthaltenden Lösung zur Eluierung von Glu-Plasminogen und dann einer wäßrigen Natriumphosphat, Natriumchlorid und 6-Aminohexansäure enthaltenden Lösung zur Eluierung von Lys-Plasminogen;
(2) eine Aktivierungsstufe, in der die Gesamtmenge oder ein Teil des Eluats aus der Säule im Reaktor mit einem Aktivator für Plasminogene in Kontakt gebracht wird, um die Plasminogene zu aktivieren; und
(3) eine Nachweisstufe, in der die enzymatische Aktivität der aktivierten Plasminogene nachgewiesen wird.

2. Analysenverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hochleistungs-Affinitätschromatographiesäule um eine mit einem harten Gel gepackte Säule handelt.

3. Vorrichtung zur Durchführung eines Analysenverfahrens zur Bestimmung von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen mit dem gleichen Aktivator aktivierbaren Plasminogenen, bei dem in gesonderten Stufen (1) die Trennung durch Hochleistungs-Affinitätschromatographie, (2) die Aktivierung mit einem Plasminogen-Aktivator und (3) der Nachweis der Plasminaktivität mit Hilfe einer Substratlösung erfolgt, gekennzeichnet durch

(I) einen Trennabschnitt, der eine Einrichtung zum Einspeisen eines Übertragungsmittels, eine Probeneinspritzeinrichtung und eine Flüssigchromatographiesäule zum Trennen von Glu- und Lys-Plasminogen in einer Probe mit einem Gehalt an diesen mit dem gleichen Aktivator aktivierbaren Plasminogenen aufweist, wobei die Vorrichtungen in der angegebenen Reihenfolge miteinander verbunden sind;
(II) einen Aktivierungsabschnitt, der mit der Strömungsbahn des Eluats aus der Säule verbunden ist und der Glu- und Lys-Plasminogen aktiviert, indem das Eluat mit einem Aktivator für Glu- und Lys-Plasminogen in Kontakt gebracht wird; und
(III) einen Nachweisabschnitt, der einen Enzymreaktor, der mit der Strömungsbahn der vom Aktivierungsabschnitt ausströmenden Flüssigkeit verbunden ist und in dem die enzymatische Reaktion durch Kontakt der genannten ausströmenden Flüssigkeit mit einem Substrat, das spezifisch mit Glu- und Lys-Plasminogen reagiert, abläuft, und einen Detektor zum Nachweis der in der aus dem Reaktor ausströmenden Flüssigkeit enthaltenen Reaktionsprodukte aufweist.