FR2585035A1 - Procede d'analyse de precurseurs d'enzyme et dispositif a utiliser dans ce but - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN DISPOSITIF POUR L'ANALYSE DE PRECURSEURS D'ENZYME. SELON L'INVENTION, IL COMPREND UNE SECTION DE SEPARATION AYANT UNE PARTIE 1 D'ALIMENTATION D'UN SUPPORT DE TRANSFERT, UNE PARTIE 4 D'INJECTION D'UN ECHANTILLON ET UNE COLONNE 5 DE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE POUR SEPARER LES PRECURSEURS RESPECTIFS D'ENZYME DANS UN ECHANTILLON CONTENANT DEUX PRECURSEURS D'ENZYME OU PLUS QUE L'ON PEUT ACTIVER PAR LE MEME ACTIVATEUR, UNE SECTION D'ACTIVATION 10 QUI EST RELIEE AU TRAJET D'ECOULEMENT DE L'ELUAT DE LA COLONNE ET ACTIVE LE PRECURSEUR D'ENZYME PAR CONTACT AVEC UN ACTIVATEUR; ET UNE SECTION DE DETECTION COMPRENANT UN REACTEUR ENZYMATIQUE 14 QUI EST CONNECTE AU TRAJET D'ECOULEMENT DE L'EFFLUENT ET PERMET A LA REACTION ENZYMATIQUE DE SE PASSER PAR CONTACT DE L'EFFLUENT AVEC UN SUBSTRAT QUI PEUT SPECIFIQUEMENT REAGIR AVEC LE PRECURSEUR D'ENZYME ACTIVE ET UN DETECTEUR 15 DU PRODUIT REACTIONNEL CONTENU DANS L'EFFLUENT DU REACTEUR. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT AU DIAGNOSTIC OU A LA SURVEILLANCE, PAR EXEMPLE, DES MALADIES DE LA CIRCULATION DU SANG.

Description

La présente invention se rapporte à un procédé d'analyse de précurseurs

d'enzyme. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un procédé d'analyse de précurseurs d'enzyme, qui consiste à accomplir continuellement une série d'opérations de séparation des précurseurs respectifs d'enzyme dans un échantillon contenant deux ou plusieurs précurseurs d'enzyme que l'on peut activer par le même activateur à travers une colonne de chromatographie liquide, d'activation des précurseurs d'enzyme dans l'éluat de ladite colonne et de détection des activités enzymatiques des précurseurs d'enzyme activés dans un dispositif ayant des sections pour les opérations respectives connectées en succession par des

traJets d'écoulement.

Les précurseurs d'enzyme sont des substances inactives précurseurs d'enzyme. En effet, certains types d'enzymes sont biosynthétisés en tant que précurseurs n'ayant pas d'activité et présentent des activités après

avoir reçu des modifications spéciales par un activateur.

Par exemple, une enzyme digestive, la trypsine, existe sous la forme d'un trypsinogène précurseur et une enzyme fibrinolytique, la plasmine, en tant que plasminogène précurseur, les deux étant des indices importants de maladie dans le système des organes digestifs et le

système des organes de la circulation respectivement.

Ainsi, l'analyse du précurseur d'enzyme est l'une des tâches très importantes dans le domaine de la médecine et de la biochimie l"Blood coagulation, Fibrinolysis and Kinin" édité par Nobuo Aoki, Sadaaki Iwanaga, publié par

Chugai Igakusha (1979)].

Parmi les précurseurs d'enzyme, certains existent en deux types différents ou plus que l'on peut activer par le même activateur pour les convertir en la même enzyme ou des isozymes ayant la même activité enzymatique. Comme procédé de séparation de ces deux types ou plus de précurseurs d'enzyme l'un de l'autre par chromatographie liquide, il arrive fréquemment que l'on sépare les précurseurs respectifs à travers une colonne, et ensuite on conduit l'éluat de la colonne tel quel dans un détecteur comme dans la détection ordinaire des protéines, pour une détection en tant que protéine. Comme détecteur à utiliser dans ce procédé, selon la quantité, le type et autres de l'échantillon, on utilise fréquemment un détecteur de l'indice de réfraction, un détecteur d'absorption visible, un détecteur d'absorption des rayons ultraviolets ou un détecteur fluorométrique et autres. En particulier, un détecteur d'absorption d'ultraviolets et un détecteur fluorométrique utilisant les propriétés optiques inhérentes aux protéines sont

fréquemment utilisés.

Dans le procédé d'analyse décrit ci-dessus, deux types de précurseurs d'enzyme ou plus peuvent être séparés l'un de l'autre et la présence des protéines contenant des précuseurs d'enzyme peut être confirmée dans les éluats. Cependant, lorsque d'autres protéines sont éluées dans la même position éluée que le précurseur d'enzyme souhaité, non seulement la quantité existante du précurseur d'enzyme ne peut être connue avec précision mais la confirmation de l'existence, ou non, du précurseur d'enzyme souhaité ne peut être faite sans difficulté. Comme procédé pour l'analyse d'un précurseur d'enzyme, non seulement en tant que protéine mais également spécifiquement basée sur ses caractéristiques spécifiques biologiques, le procédé qui suit est fréquemment utilisé. En effet, selon ce procédé, l'analyse est accomplie en effectuant individuellement les opérations respectives montrées ci-dessous: 1. L'opération de séparation o les précurseurs respectifs d'enzyme dans un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus sont séparés en deux groupes ou plus à travers une colonne de chromatographie liquide; 2. L'opération de fractionnement o l'éluat de ladite colonne est fractionné en plusieurs fractions; 3. L'opération d'activation o un activateur desdits précurseurs d'enzyme est ajouté à chaque fraction pour activer lesdits précurseurs d'enzyme; et 4. L'opération de détection o l'activité de l'enzyme de chaque précurseur d'enzyme activé en 3 est détectée en effectuant une réaction enzymatique pour

chaque fraction.

Cependant, ce procédé pose des problèmes relativement à la rapidité, la simplicité, et autres. En particulier, les opérations comprenant l'activation des précurseurs d'enzyme séparés et la mesure subséquente des activités enzymatiques sont fastidieuses dans la plupart des cas. Pour cette raison, le temps requis, dans la pratique, pour la réaction d'activation et/ou la réaction enzymatique est fréquemment considérablement longue du fait des diverses combinaisons d'opérations, même dans le plus court des cas. De même, lorsque le temps requis pour la réaction d'activation et/ou la réaction enzymatique est long, afin d'écourter le temps pour l'analyse, une détermination de l'activité enzymatique peut être mise en pratique dans la plupart des cas à l'état o la réaction d'activation et/ou la réaction enzymatique n'ont pas complètement progressé. Dans un tel cas, il est nécessaire de contr8ler strictement le temps pour chaque opération et des efforts importants sont nécessaires dans ce but. Par ailleurs, selon le procédé ci-dessus, afin d'obtenir une information précise, le nombre des fractions de l'éluat de la colonne doit être accru, et la réaction d'activation et la réaction enzymatique doivent être effectuées pour les fractions respectives. En conséquence, il faut un temps énorme avant que le résultat analytique final puisse être obtenu après séparation à travers la colonne, et il est extrêmement difficile d'obtenir le résultat analytique sensiblement

simultanément avec la séparation.

Là, si les substances à analyser sont des enzymes, il est possible de détecter spécifiquement les enzymes en ajoutant un substrat spécifique auxdites enzymes dans l'éluat de la colonne dans un trajet d'écoulement et en détectant le produit formé par la réaction. Au contraire, dans le cas des précurseurs d'enzyme, ils ne réagissent pas, en eux-même, avec le substrat et par conséquent une méthode spécifique de détection telle que celle ci-dessus décrite ne peut s'appliquer. De même, le procédé d'addition au préalable d'un activateur dans une solution de l'échantillon contenant des précurseurs d'enzyme pour activer lesdits précurseurs d'enzyme avant injection ne peut être employée, parce qu'un tel procédé ne réfléchit pas de manière correcte l'état existant des précurseurs d'enzyme dans la solution de l'échantillon. Plus particulièrement, des enzymes formées par activation peuvent quelquefois changer les précurseurs d'enzyme n'ayant pas réagi dans les mêmes récipients ou provoquer une auto-digestion. Par exemple, les plasminogènes qui sont des précurseurs de l'enzyme fibrinolytique, la plasmine, existent généralement sous les formes de Glu-plasminogène et Lys-plasminogène, dont les quantités d'existence et le rapport d'existence peuvent être des indices de la fonction du système fibrinolytique. Cependant, comme la plasmine a pour action de changer Glu- plasminogène en Lys-plasminogène, si les plasminogènes sont activés pour être convertis en plasmines avant injection dans la colonne, le résultat de l'analyse ne peut réfléchir de manière correcte l'état existant de Glu- plasminogène et Lys-plasminogène avant injection. Par ailleurs, dans le cas o un inhibiteur d'enzyme est co-existant dans une solution de l'échantillon, il y a également un inconvénient par le fait que l'activité enzymatique ne

peut être correctement détectée.

Comme on l'a décrit ci-dessus, dans le cas de l'analyse de précurseurs d'enzyme par chromatographie liquide, en particulier chromatographie liquide haute performance, du fait de l'absence du procédé de détection des précurseurs d'enzyme en se basant sur leur spécificité biologique dans l'art antérieur, la simplicité et la rapidité que possède de manière caractéristique la chromatographie liquide haute performance ne peuvent être totalement utilisées dans la plupart des cas. En conséquence, les présents inventeurs ont étudié intensément, afin de surmonter les inconvénients décrits ci-dessus de la détection lors de l'analyse de précurseurs d'enzyme selon la chromatographie liquide et ont trouvé en conséquence un procédé d'analyse pour accomplir spécifiquement l'analyse, et de manière simple et rapide en utilisant un procédé continu d'accomplissement d'une série d'opérations de séparation des précurseurs respectifs d'enzyme dans un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus que l'on peut activer par le même activateur, en activant les précurseurs d'enzyme dans l'éluat de ladite colonne et en détectant les activités enzymatiques desdits précurseurs activés d'enzyme dans un dispositif o des sections pour les opérations respectives sont connectées en succession les unes aux autres. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci

apparaÂtront plus clairement au cours de la description

explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels: - la figure i est une illustration montrant le déroulement du procédé d'analyse de la présente invention; - la figure 2 est un chromatogramme montrant le résultat de la détection de Lys-plasminogène à l'exemple i; - la figure 3 est un chromatogramme montrant le résultat de la détection de Glu-plasminogène à l'exemple 2; - la figure 4 est un chromatogramme montrant les résultats de la détection de Glu-plasminogène et Lys-plasminogène à l'exemple 3; - la figure 5 est un chromatogramme montrant les résultats de la détection de Glu-plasminogène et Lys-plasminogène dans le plasma de l'exemple 4; - la figure 6 est un chromatogramme montrant

les résultats de l'exemple de comparaison.

De ce point de vue, les lignes en trait plein sur les figures 2 à 6 montrent les résultats par le détecteur de l'activation et les lignes en pointillé ceux par le détecteur de la protéine, B0 (solution aqueuse) indiquant une solution aqueuse de phosphate de sodium 50 mM (pH 6,5) et B1 (solution aqueuse), une solution aqueuse contenant 50 mM de phosphate de sodium et 100 mM de chlorure de sodium; et -chacune des figures 7 et 8 représente un diagramme montrant un exemple du dispositif de la

présente invention.

Selon un aspect, la présente invention concerne un procédé d'analyse quantitative continue pour déterminer les précurseurs respectifs d'enzyme dans un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus que l'on peut activer par les mêmes activateurs selon une série d'opérations de séparation, activation et détection dans un dispositif ayant des sections pour effectuer les opérations respectives qui sont reliées en succession à travers un trajet d'écoulement en série, lesdites opérations comprenant: (1) l'opération de séparation o lesdits précurseurs d'enzyme sont séparés en deux groupes ou plus à travers une colonne de chromatographie liquide; (2) l'opération d'activation o tout ou une partie de l'éluat de ladite colonne est mis en contact, tel quel, dans le réacteur pour la réaction d'activation, avec un activateur desdits précurseurs d'enzyme pour activer lesdits précurseurs d'enzyme; et (3) l'opération de détection o l'activité enzymatique desdits précurseurs activés d'enzyme est détectée. Selon un autre aspect, la présente invention offre également un dispositif pour l'analyse des précurseurs d'enzyme comprenant: (I) une section de séparation ayant une partie d'alimentation du support de transfert (1) sur la figure 1, une partie d'injection de l'échantillon (2) et une colonne de chromatographie liquide (3) pour séparer les précurseurs respectifs d'enzyme en un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus qui peuvent être activés par le même activateur, reliés l'un à l'autre dans l'ordre indiqué; (II) une section d'activation qui est connectée au trajet d'écoulement de l'éluat de ladite colonne et qui active le précurseur d'enzyme en mettant ledit éluat en contact avec un activateur dudit précurseur d'enzyme (4); et (III) une section de détection comprenant un réacteur enzymatique qui est connecté au trajet d'écoulement de l'effluent de ladite section d'activation et qui force la réaction enzymatique (5) à se passer par contact dudit effluent avec un substrat qui peut spécifiquement réagir avec ledit précurseur d'enzyme activé et un détecteur (6) pour détecter le produit réactionnel contenu dans l'effluent à la sortie dudit

réacteur, avec un enregistreur (7).

Le précurseur d'enzyme de la présente invention indique un composé qui, en lui-même, n'a pas d'activité enzymatique mais qui peut être changé par activation en

une enzyme ou un complexe ayant une activité enzymatique.

La plupart des précurseurs d'enzyme sont des précurseurs d'enzyme protéolytique. Dans ce qui suit, des exemples des précurseurs d'enzyme sont montrés par les enzymes

correspondantes après activation.

Les enzymes protéolytiques peuvent être réparties en endopeptidases et exopeptidases. Des exemples typiques des enzymes appartenant aux endopeptidases peuvent comprendre les enzymes coagulant le sang, les enzymes fibrinolytiques, les enzymes de la digestion et les enzymes caillant le lait. Parmi elles, les précurseurs d'enzyme appartenant aux enzymes coagulant le sang comprennent la prothrombine, le facteur VII de coagulation du sang, le facteur IX de coagulation du sang, le facteur X de coagulation du sang, le facteur XI de coagulation du sang et le facteur XII de coagulation du sang, et les enzymes après activation sont respectivement appelées thrombine, facteur VII activé, facteur IX activé, facteur X activé, facteur XI activé et facteur XII activé. Comme précurseur de l'enzyme appartenant à l'enzyme fibrinolytique, il y a le plasminogène et l'enzyme après son activation est la plasmine. Lorsqu'un plasminogène est activé à la streptokinase, un complexe qui n'est pas une enzyme mais a une activité enzymatique se forme. Des exemples du précurseur d'enzyme appartenant aux enzymes de la digestion peuvent comprendre le pepsinogène, le trypsinogène, le chymotrypsinogène et autres. On les active pour devenir des enzymes respectivement appelées pepsine, trypsine et chymotrypsine. Comme précurseur d'enzyme appartenant aux enzymes caillant le lait, il y a la prochymosine que l'on peut activer pour devenir une

enzyme appelée la chymosine.

Un exemple typique d'un précurseur d'enzyme appartenant aux exopeptidases est la procarboxypeptidase et l'enzyme après activation est appelée carboxypeptidase. Le procédé d'analyse de la présente invention doit de préférence être utilisé pour l'analyse de précurseurs d'enzymes protéolytiques. Parmi elles, il est particulièrement préféré de l'utiliser pour l'analyse de précurseurs des enzymes coagulant le sang et des enzymes

fibrinolytiques.

L'échantillon de la présente invention n'est pas particulièrement limité uniquement si les enzymes précurseurs y sont contenus, mais de préférence un fluide corporel ne contenant pas d'éléments formés comme le plasma, le sérum, un hémolysat dont les éléments formés

sont enlevés, l'urine et analogues peuvent être énumérés.

Dans le cas de l'analyse des précurseurs des enzymes coagulant le sang et des enzymes fibrinolytiques, l'échantillon doit, en particulier, être de préférence du

plasma.

Dans la première étape de la séparation de la présente invention, les précurseurs d'enzyme sont séparés par une colonne de chromatographie liquide. Pour la chromatographie liquide, la chromatographie liquide haute performance est particulièrement préférable dans le cas d'une quantité minuscule de l'échantillon du point de vue capacité de séparation, sensibilité, et autres. En particulier, en utilisant une colonne de chromatographie liquide garnie d'un gel dur, on peut mettre une chromatographie haute performance en pratique. Là, le gel dur indique celui ayant des pores appelés permanents, dont l'aire superficielle spécifique à l'état sec est

sensiblement inchangée par rapport à l'état humide.

Le mode de séparation par la chromatographie liquide n'est pas particulièrement limité, tant qu'il est approprié à la séparation des protéines. Par exemple, une

chromatographie par filtration sur gel, une chromato-

graphie d'échange d'ions, une chromatographie par affinité ou une chromatographie en phase inverse peuvent

être employées. Parmi elles, en utilisant une chromato-

graphie par affinité, toutes les étapes de séparation, activation et détection deviennent spécifiques, il devient donc possible d'accomplir l'analyse à une très haute spécificité. Par suite, les précurseurs respectifs des isozymes dans un échantillon contenant des matières intermédiaires ou l'un des différents précurseurs d'une enzyme, que l'on pouvait difficilement analyser dans l'art antérieur, peuvent être en particulier efficacement analysés. Par exemple, après avoir séparé tels quels Glu-plasminogène et Lys-plasminogène tels que décrits ci-après, on peut les activer et les détecter, ce qui rend possible la détermination des puretés de divers types d'échantillons de plasminogène. Lorsqu'un plasma est utilisé comme échantillon, des applications pour diagnostic ou la surveillance de la thérapie des maladies de la coagulation du sang et fibrinolytiques sont possibles, ce qui contribue de manière marquée et

importante au domaine de la biochimie et de la médecine.

A la seconde étape de la présente invention, le précurseur d'enzyme contenu dans l'éluat de la colonne de chromatographie liquide est activé par contact avec un activateur. Là, l'activation consiste à impartir une activité enzymatique à un précurseur d'enzyme n'ayant pas d'activité enzymatique. En d'autres termes, le précurseur d'enzyme lui-même est changé en une enzyme ou un complexe ayant une activité enzymatique. La substance qui provoque cette activation est appelée l'activateur et des activateurs spécifiques existent pour des précurseurs respectifs d'enzyme. Des exemples d'activateurs sont montrés ci-dessous. Pour les enzymes fibrinolytiques, les activateurs suivants sont inclus. En effet, l'activateur du plasminogène en plasmine est appelé activateur du plasminogène, comprenant l'urokinase, l'activateur du tissu, la streptokinase et la staphylokinase. Pour l'activation des précurseurs d'enzyme appartenant aux enzymes coagulant le sang, on peut inclure le facteur X activé en tant qu'activateur qui active la prothrombine en thrombine; le facteur X activé en tant qu'activateur qui active le facteur VII coagulant le sang en facteur VII activé; le facteur XI activé en tant qu'activateur qui active le facteur IX coagulant le sang en facteur IX activé; le facteur IX activé ou facteur VIII activé qui active le facteur X coagulant le sang en facteur X activé; le facteur XII activé en tant qu'activateur qui active le facteur XI coagulant le sang en facteur XI activé; la kallikréine, la trypsine et le facteur XI activé en tant qu'activateur qui active le facteur XII coagulant le sang en facteur XII activé. Des exemples d'activateurs pour les précurseurs d'enzyme appartenant aux enzymes de la digestion comprennent ceux montrés cidessous. En effet, l'activateur qui active le trypsinogène en trypsine comprend l'entéropeptidase et la trypsine. L'activateur pour l'activation du chymotrypsinogène en chymotrypsine peut être représenté

par la trypsine et la chymotrypsine.

Parmi les précurseurs d'enzyme, certains peuvent être accélérés en forçant une substance ayant pour effet d'accélérer la réaction d'activation (que l'on appelera ci-après "accélérateur") à être coprésente avec eux. De même, dans la présente invention, un tel accélérateur peut être quelquefois employé. Comme exemples d'accélérateurs, on peut mentionner la lysine et les analogues de la lysine comme l'acide

6-aminohexanoique, l'acide trans-4-aminométhylcyclo-

hexane-1-carboxylique, et autres. IL. Banyai, L. Patthy, J. Biol. Chem., 259 (10), 6466 (1984)] en particulier pour l'activation de Gluplasminogène qui est un type de plasminogène. De même l'ion calcium, les phospholipides, le facteur V activé peuvent également être mentionnés comme exemples typiques lors de l'activation de la prothrombine. Le procédé d'activation du précurseur d'enzyme élué de la colonne de chromatographie liquide n'est pas particulièrement limité. Un exemple est le procédé dans lequel une solution aqueuse contenant un activateur est aJoutée à l'éluat de la colonne. Un autre exemple est le procédé o une colonne garnie d'un support insoluble o est immobilisé un activateur ou une conduite sur la surface interne de laquelle est immobilisé un activateur, est préparée et l'éluat de la colonne est forcé à la traverser pour ainsi procéder à l'activation. Lorsque l'on utilise un accélérateur, on peut le forcer à coexister dans le support de transfert ou une solution

aqueuse contenant un activateur.

Le précurseur d'enzyme est activé par l'activateur ci-dessus selon le procédé d'activation

décrit ci-dessus pour avoir une activité enzymatique.

Dans la troisième étape de la présente invention, le précurseur d'enzyme est détecté spécifiquement en détectant l'activité enzymatique. Pour la détection de l'activité enzymatique, on peut employer le procédé décrit ci-dessous. En effet, dans un réacteur enzymatique à travers lequel passe une solution aqueuse contenant l'enzyme ou le complexe ayant une activité enzymatique formé par l'activation ci-dessus décrite, on force un substrat qui peut réagir spécifiquement avec ladite enzyme ou ledit complexe ayant une activité enzymatique à coexister, pour ainsi forcer la réaction enzymatique à se produire dans le réacteur, et le produit

formé est détecté en détectant l'activité enzymatique.

Le substrat est un composé ou une molécule qui est soumis à l'action d'une enzyme. Comme substrat utilisé dans la présente invention, il est préférable d'utiliser un substrat pouvant donner une substance formée par réaction enzymatique ayant des propriétés optiques différentes de celles du substrat. Plus particulièrement, le spectre d'absorption visible, le spectre d'absorption ultraviolet ou le spectre de fluorescence du produit de la réaction enzymatique doivent de préférence être différents de ceux du substrat. Un substrat capable de former une substance détectable par un détecteur fluorométrique est préféré en ce qui concerne la sensibilité, en particulier dans le

cas d'une quantité minuscule d'un précurseur d'enzyme.

Des exemples du substrat à utiliser dans la présente invention sont décrits en se réfèrant au cas de l'analyse des plasminogènes. Comme substrat spécifique pour la plasmine qui est l'enzyme formée par activation d'un plasminogène, on utilise fréquemment des peptides ayant 1 à 3 acides aminés ayant une structure o l'acide aminé à l'extrémité carboxyle terminale est la L-lysine ou la L-alginine avec une substance fluorescente liée au groupe carboxylique dudit acide aminé. Des exemples spécifiques

de tels substrats comprennent la 7-(t-butyloxycarbonyl-L-

glutamyl-L-lysyl-L-lysineamido)-4-méthylcoumarine, la 7-(tbutyloxycarbonyl-L-valyl-L-leusyl-L-lysineamido)-4-

méthylcoumarine, la 7-(D-valyl-L-leusyl-L-lysineamido)-4-

méthylcoumarine, la 7-(succinyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-

L-lysineamido)-4-méthylcoumarine, la 7-(méthoxysuccinyl-

L-alanyl-L-phénylalanyl-L-lysineamido)-4-méthylcoumarine,

la 7-(benzyloxycarbonyl-glycyl-L-prolyl-L-alginineamido)-

4-méthylcoumarine, la 7-(D-alanyl-L-leusyl-L-lysine-

amido)-4-méthylcoumarine, et analogues. Par l'utilisation de ces substrats, par suite de la réaction enzymatique, il se forme la 7-amino-4méthylcoumarine, que l'on peut détecter par un détecteur fluorométrique. Autrement, un substrat pouvant former la p-nitroaniline en tant que

produit de la réaction enzymatique comme le D-valyl-L-

leusyl-L-lysyl-p-nitroanilide peut également être utilisé. Dans ce cas, la p-nitroaniline peut être

détectée par un détecteur d'absorption visible.

Pour les autres précurseurs d'enzyme, il est possible d'utiliser des substrats spécifiques de l'enzyme correspondante formée par activation, comme ceux du cas du plasminogène. Par exemple, dans le cas de l'analyse du facteur X de coagulation du sang, le substrat spécifique du facteur X activé peut être représenté par la

7-(t-butyloxycarbonyl-L-isoleusyl-L-glutamyl-glycyl-L-

alginineamido)-4-méthylcoumarine. Dans le cas de l'analyse de la prothrombine, des exemples du substrat

spécifique pour la thrombine comprennent la 7-(L-alanyl-

L-phénylalanyl-L-lysineamido)-4-méthylcoumarine, la

7-(benzoyl-L-phénylalanyl-L-valyl-L-alginineamido)-4-

méthylcoumarine, la 7-(benzyloxycarbonyl-glycyl-L-propyl-

L-alginineamido)-4-méthylcoumarine, la 7-(t-butyloxycar-

bonyl-L-valyl-L-prolyl-L-alginineamido)-4-méthylcoumarine, et analogues. Dans le cas de l'analyse des trypsinogènes, des exemples du substrat spécifique pour la trypsine

comprennent la 7-(benzoyl-L-alginineamido)-4-méthylcouma-

rine, la 7-(t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanyl-L-séryl-L-

alginineamido)-4-méthylcoumarine, la 7-(acétyl-L-lysine-

amido)-4-méthylcoumarine, la 7-(benzyloxycarbonyl-L-

alginineamido)-4-méthylcoumarine et analogues. Dans le cas de l'analyse des chymotrypsinogènes, des exemples du substrat spécifique pour la chymotrypsine comprennent la

7-(succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phényl-alanine-

amido)-4-méthylcoumarine, la 7-(succinyl-L-leusyl-L-

leusyl-L-valyl-thyrosineamido)-4-méthylcoumarine et analogues. Comme procédé pour forcer le substrat à coexister dans le réacteur enzymatique, on peut employer le procédé o un substrat est forcé au préalable à coexister dans le support de transfert ou bien un procédé o une solution aqueuse contenant un substrat est ajoutée

à l'éluat de la colonne.

Par ailleurs, dans le procédé d'analyse de la présente invention, le précurseur d'enzyme dans l'éluat de la colonne peut être détecté sous la forme d'une protéine, ce qui permet ainsi d'obtenir avantageusement plus d'informations. Pour le procédé de détection, on peut employer le procédé dans lequel un détecteur capable de détecter la protéine est connecté à la suite de la colonne. Le détecteur n'est pas particulièrement limité tant qu'il peut détecter la protéine mais un détecteur d'absorption d'ultraviolets ou un détecteur fluorométrique est préféré par rapport à la spécificité pour la protéine. Dans le cas d'une quantité minuscule d'un échantillon ou dans le cas o beaucoup de substances absorbant les rayons ultraviolets sont contenues en tant qu'impuretés, on préfère fréquemment un détecteur

fluorométrique.

La figure 1 montre un exemple du déroulement du procédé d'analyse de la présente invention. Tandis qu'un support de transfert s'écoule, une solution de l'échantillon contenant des précurseurs d'enzyme est injectée dans la colonne pour séparer les précurseurs d'enzyme. L'éluat élué de la colonne est conduit dans le réacteur pour la réaction d'activation, o les précurseurs d'enzyme sont activés. Subséquemment, le produit activé est conduit dans le réacteur pour la réaction enzymatique o les précurseursactivés d'enzyme sont forcés à réagir avec un substrat et le produit formé par cette réaction est détecté par un détecteur et la

sortie du détecteur est enregistrée sur un enregistreur.

Un dispositif préféré pour la mise en pratique du procédé d'analyse de la présente invention sera décrit ci-dessous. En effet, c'est un dispositif pour l'analyse des précurseurs d'enzyme qui comprend: (I) une section de séparation ayant une partie d'alimentation du support de transfert, une partie d'inJection de l'échantillon et une colonne de chromatographie liquide pour séparer les précurseurs respectifs d'enzyme dans un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus, que l'on peut activer par le même activateur, reliés les uns aux autres dans l'ordre indiqué; (II) une section d'activation qui est connectée au traJet d'écoulement de l'éluat de ladite colonne et qui active le précurseur d'enzyme en mettant ledit éluat en contact avec un activateur dudit précurseur d'enzyme; et (III) une section de détection comprenant un réacteur enzymatique qui est connecté dans le traJet d'écoulement de l'effluent de ladite section d'activation et qui permet à la réaction enzymatique de se passer par contact dudit effluent avec un substrat qui peut i spécifiquement réagir avec ledit précurseur activé d'enzyme et un détecteur pour détecter le produit

réactionnel contenu dans l'effluent dudit réacteur.

Parmi ces dispositifs, un exemple du dispositif comprenant, comme section d'activation, une partie de mélange connectée au trajet d'écoulement de l'éluat de la colonne pour mélanger une solution aqueuse contenant un activateur du précurseur d'enzyme dans l'éluat et un réacteur pour la réaction d'activation pour y effectuer la progression de l'activation du précurseur d'enzyme du mélange formé dans la partie de mélange est montré sur la figure 7. Sur cette figure, 1 est un support de transfert. Chaque support de transfert est commuté par une soupape de changement 2 et est introduit par une pompe 3. L'échantillon contenant les précurseurs d'enzyme est injecté par un injecteur 4 et conduit dans une colonne 5 pour la séparation. Une portion de l'éluat de la colonne est introduite séparément par une pompe 6 dans un mélangeur 9. Au mélangeur 9, une solution aqueuse 7 contenant un activateur des précurseurs d'enzyme est également introduite par une pompe 8, et après mélange est conduite dans un serpentin pour l'activation 10 et les précurseurs d'enzyme sont activés en passant à travers le serpentin 10. La solution aqueuse contenant les précurseurs activés d'enzyme est délivrée à un mélangeur 13 o elle est mélangée à une solution aqueuse contenant un substrat 11 introduit par une pompe 12 et le produit de réaction formé pendant le passage du mélange à travers le serpentin pour la réaction enzymatique 14 est

détecté par un détecteur 15.

Sur la figure 7, sans l'utilisation d'une pompe 6, le dispositif peut être transformé en un système o la totalité de l'éluat de la colonne de séparation 5 est

conduit au mélangeur 9.

Ensuite, un exemple du dispositif o la section d'activation comprend une colonne 16 o est immobilisé l'activateur pour le précurseur d'enzyme qui est connectée au trajet d'écoulement de la section de séparation de façon que l'éluat de la section de séparation puisse traverser ladite colonne, est montré sur la figure 8. Comme sur la figure 7, l'échantillon est introduit dans la colonne de séparation 5 et ensuite l'éluat est conduit dans une colonne 16 o est immobilisé l'activateur pour le précurseur d'enzyme, o le précurseur d'enzyme est activé. L'éluat de la colonne 16 est introduit dans un mélangeur 13 o il est mélangé à une solution aqueuse 11 contenant un substrat introduit par une pompe 12 puis il passe à travers un serpentin pour la réaction enzymatique 14. Le produit réactionnel

formé là est détecté par un détecteur.

En utilisant le procédé d'analyse de la présente invention, l'efficacité des opérations peut être améliorée en comparaison au cas o l'opération de séparation, l'opération de fractionnement, l'opération d'activation et l'opération de détection sont accomplies individuellement, et le temps de traitement peut 8tre écourté de manière importante. De même, lorsque les précurseurs d'enzyme sont séparés insuffisamment des autres composants, lesdits précurseurs d'enzyme peuvent être spécifiquement rapidement et facilement détectés pour permettre leur détermination quantitative. Par ailleurs, comme aucun prétraitement comme une activation n'est entrepris avant l'injection d'un échantillon dans la colonne, il est possible d'obtenir des informations précises de la quantité existante, de l'état d'existence

et autres, des précurseurs d'enzyme avant l'analyse.

La présente invention sera décrite en plus de détail en se réfèrant aux exemples suivants, qui ne

doivent en aucun cas la limiter.

Exemple 1.

Cet exemple montre l'application de la présente invention pour l'analyse des plasminogènes en utilisant

une chromatographie par affinité de haute performance.

Au moyen d'une pompe pour chromatographie liquide haute performance (TWINCLE, produite par Japan Spectroscopic Co., Ltd), on a forcé une solution aqueuse contenant 50 mM de phosphate de sodium et 100 mM de chlorure de sodium (pH 7,4) (ayant ci-après pour abbréviation "solution aqueuse B1i") à s'écouler en tant que support de transfert, à un débit de 1,0 ml/mn. Une solution d'échantillon contenant 9g de Lys-plasminogène a été injectée dans une colonne de chromatographie liquide

à partir de l'injecteur en utilisant une microseringue.

Afin d'obtenir le résultat de la détection sous forme de

la protéine en plus du résultat selon le procédé d'ana-

lyse de la présente invention, l'éluat de la colonne a été conduit dans un détecteur fluorométrique (RF-530, produit par Shimadzu Seisakusho K.K., longueur d'onde d'excitation 285 nm, longueur d'onde d'émission 340 nm) et la protéine a été détectée en utilisant ce détecteur en tant que détecteur de la protéine. Une portion de l'éluat du détecteur de la protéine a été échantillonnée par une pompe péristaltique (HP-4, produite par Gilson Co.) en mélange avec la solution aqueuse B1 contenant de l'urokinase en tant qu'activateur à une concentration de U/ml et on l'a fait passer à travers un serpentin pour la réaction d'activation (diamètre interne 0,25 mm x 4 m de long) à 37 C. A la sortie du serpentin pour la réaction d'activation, l'effluent a été mélangé à une solution aqueuse à 0,5 mole de phosphate de sodium (pH

7,4) contenant de la 7-(t-butyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-

lysyl-L-lysineamido)-4-méthylcoumarine qui est un substrat spécifique de la plasmine à une concentration de 20 M et on a fait passer à travers un serpentin pour la réaction enzymatique (diamètre interne 0,5 mm x longueur 4m) à 37 C. Lorsque du plasminogène est contenu dans

l'effluent de la colonne, il se forme de la 7-amino-4-

méthylcoumarine et celle-ci a été détectée par un détecteur fluorométrique (FD-110, produit par Japan Spectroscopic Co., Ltd., longueur d'onde d'excitation 365nm, longueur d'onde d'émission 460 nm) en tant que détecteur de l'activité. Lorsque le support de transfert ci- dessus décrit s'est écoulé, on n'a pas détecté de Lys-plasminogène par le détecteur pour l'activation, mais

on a confirmé qu'il y avait absorption de Lys-

plasminogène. Lorsque le support de transfert a été changé en solution aqueuse B1 additionné de 20 mM d'acide 6-aminohexanoique (ayant ci-après pour abbréviation "6-AHA"), pour l'élution de Lys-plasminogène, on a élué Lys-plasminogène et on l'a détecté par le détecteur de la protéine. De même, Lys-plasminogène a été activé dans le serpentin pour la réaction d'activation et l'activité a pu être détectée par le détecteur de l'activité. Ainsi,

on a pu spécifiquement détecter Lys-plasminogène.

La colonne employée était une colonne chromatographique faite en acier inoxydable (diamètre interne 6 mm x longueur 10 cm) garnie d'un adsorbant o était immobilisée de la p-amino-benzamidine par un écarteur sur un copolymère d'alcool vinylique (comme cela est révélé à l'exemple 4 de la publication du brevet

Japonais non examiné No. 37095/1986).

Le chromatogramme obtenu est montré sur la figure 2. On peut voir que la solution aqueuse B1 s'est écoulée en tant que support de transfert (a) pendant 10 minutes après début de l'analyse et la solution aqueuse B1 contenant 20 mM de 6-AHA s'est écoulée en tant que support de transfert au bout de 10 minutes. Sur la figure, la crête de la ligne en trait plein montrée par la flèche indique le résultat de la détection de Lysplasminogène selon le procédé d'analyse de la présente invention. La ligne en pointillé montre le résultat de la détection de la protéine. (b) indique la

solution aqueuse contenant de l'urokinase.

Exemple 2. L'expérience qui suit a été entreprise en utilisant le même procédé qu'à l'exemple i à l'exception de la façon dont le support de transfert s'est écoulé et de la composition de la solution aqueuse contenant de

l'urokinase.

Lorsque l'on a fait s'écouler la solution aqueuse B1 en tant que support de transfert à un débit de 1,0 ml/mn et qu'une solution de l'échantillon contenant

pg de Glu-plasminogène a été injectée, Glu-plasmi-

nogène a été élué plus tard que la fraction ayant

traversé est détectée par le détecteur de la protéine.

Lors d'un mélange avec la solution B1 contenant l'urokinase en tant qu'activateur à une concentration de

U/ml et de plus avec 20 mM d'acide trans-4-amino-

méthylcyclohexane-l-carboxylique (ayant ci-après pour abbréviation "tAMCHA") en tant qu'accélérateur, Glu-plasminogène a été activé dans le serpentin pour la réaction d'activation et son activité a pu être détectée par le détecteur de l'activité, permettant ainsi la détection spécifique de Glu-plasminogène. Le chromatogramme obtenu est montré sur la figure 3, o la crête de la ligne en trait plein montrée par la flèche indique le résultat de la détection de Glu-plasminogène

selon le procédé d'analyse de la présente invention.

Exemple 3.

L'expérience qui suit a été entreprise en utilisant le même procédé qu'à l'exemple 1 à l'exception de la composition et du mode de changement du support de transfert et du mode d'écoulement de la solution aqueuse

contenant l'urokinase.

Lorsqu'une solution aqueuse à 50 mM de phosphate de sodium (pH 6,5) (ayant ci-après pour abbréviation "solution aqueuse B0") s'est écoulée en tant que support de transfert à un débit de 1,0 ml/mn et qu'une solution mélangée d'échantillon contenant 7 pg de Glu-plasminogène et 4 pg de Lysplasminogène a été

injectée, on a trouvé que les deux étaient adsorbés.

Lorsque le support de transfert a été changé pour une

solution aqueuse B1, il y a eu élution de Glu-plasmi-

nogène (c). Pendant cette opération, par mélange avec une solution aqueuse B1 de l'urokinase à une concentration de U/ml et de plus 20 mM de t-AMCHA en tant qu'accélérateur, Glu-plasminogène a été activé et détecté spécifiquement. Pour l'élution de Lys-plasminogène (d), le support de transfert a été changé en solution B1 contenant 20 mM de 6-AHA et en même temps la solution ci-dessus contenant de l'urokinase et t-AMCHA1en solution aqueuse B1 contenant de l'urokinase à une concentration de 100 U/ml, et on a mélangé. Il y a eu élution de Lys-plasminogène, que l'on a activé et détecté. Le

chromatogramme obtenu est tel que montré sur la figure 4.

Exemple 4.

L'expérience a été entreprise en utilisant le même procédé qu'à l'exemple i à l'exception du mode de changement du support de transfert, de la composition et du mode de changement de la solution aqueuse contenant de l'urokinase. La solution aqueuse B1 s'est écoulée en tant que support de transfert à un débit de 1,0 ml/mn et l'on a directement injecté, sans aucun prétraitement, 40, pl de plasma d'une personne saine. Lors d'un mélange avec la solution aqueuse B1 contenant de l'urokinase à une concentration de 500 U/ml et 20 mM de t-AMCHA comme accélérateur, Gluplasminogène a pu être activé et spécifiquement détecté. Alors, à la place de la solution ci-dessus décrite contenant de l'urokinase et t- AMCHA, on a fait s'écouler une solution aqueuse B1 (tampon) (e) pendant 10 mn. Subséquemment, pour l'élution de Lys-plasminogène, le support de transfert a été changé en solution aqueuse B1 contenant 20 mM de 6-AHA et en même temps la solution aqueuse B1 ci-dessus décrite a été changée en solution aqueuse B1 contenant de l'urokinase en tant qu'activateur à une concentration de 100 U/ml, et on a mélangé. On a élué Lys-plasminogène et on pu spécifiquement le détecter. Le chromatogramme est tel que

montré sur la figure 5.

Exemple de comparaison.

La même opération qu'à l'exemple 4 a été effectuée sans utiliser l'activateur. En effet, à la place de l'utilisation de la solution aqueuse contenant de l'urokinase, on a employé une solution aqueuse B1 (tampon). L'on n'a pu activer ou spécifiquement détecter

ni Glu-plasminogène ni Lys-plasminogène. Le chromato-

gramme obtenu est tel que montré sur la figure 6.

On peut voir, de l'exemple 4, que l'on n'a pu séparer Glu-plasminogène ni Lys-plasminogène. Cependant, dans l'exemple de comparaison sans l'opération d'activation, l'on n'a pu voir aucune crête de la partie

en trait plein. Ainsi, on peut comprendre que Glu-

plasminogène et Lys-plasminogène ne peuvent être spécifiquement détectés à moins d'employer le procédé de

la présente invention.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'analyse quantitative continue pour déterminer des précurseurs respectifs d'enzyme dans un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus que l'on peut activer par le même activateur selon une série d'opérations de séparation, activation et détection dans un dispositif ayant des sections pour effectuer les opérations respectives qui sont reliées en succession par un traJet d'écoulement en série, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) l'opération de séparation o lesdits précurseurs d'enzyme sont séparés en deux groupes ou plus par une colonne de chromatographie liquide; (2) l'opération d'activation o tout ou une partie de l'éluat de ladite colonne est mis en contact tel quel dans le réacteur pour la réaction d'activation avec un activateur desdits précurseurs d'enzyme pour activer lesdits précurseurs d'enzyme; et (3) l'opération de détection o l'activité enzymatique desdits précurseurs activés d'enzyme est de

plus détectée.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les précurseurs d'enzyme

comprennent des précurseurs d'enzymes protéolytiques.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les enzymes protéolytiques sont les enzymes coagulant le sang et/ou les enzymes fibrinolytiques.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les précurseurs d'enzyme sont des plasminogènes.

5. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'échantillon

est un fluide corporel.

6. Procédé selon la revendication 5,

caractérisé en ce que le fluide corporel est du plasma.

7. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la colonne

pour chromatographie liquide est une colonne garnie d'un

gel dur.

8. Procédé selon l'une quelconque des

revendications précédentes, caractérisé en ce que

l'activité enzymatique est détectée en détectant la substance formée par la réaction du précurseur activé

d'enzyme et un substrat.

9. Dispositif pour l'analyse de précurseurs d'enzyme caractérisé en ce qu'il comprend: (I) une section de séparation ayant une partie (1) d'alimentation d'un support de transfert, une partie (4) d'injection de l'échantillon et une colonne de chromatographie liquide (5) pour séparer les précurseurs respectifs d'enzyme en un échantillon contenant deux précurseurs d'enzyme ou plus que l'on peut activer par le même activateur, reliées les unes aux autres dans l'ordre indiqué; (II) une section d'activation (10) qui est connectée au trajet d'écoulement de l'éluat de ladite colonne et qui active le précurseur d'enzyme en mettant ledit éluat en contact avec un activateur dudit précurseur d'enzyme; et (III) une section de détection comprenant un réacteur enzymatique (14) qui est connecté au trajet d'écoulement de l'effluent de ladite section d'activation et qui permet à la réaction enzymatique de se passer par contact dudit effluent avec un substrat qui peut spécifiquement réagir avec ledit précurseur d'enzyme activé et un détecteur (15) pour détecteur le produit

réactionnel contenu dans l'effluent dudit réacteur.