DE3546518C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel, welches für die Diagnose maligner Tumore geeignet ist und einen mikrobiellen Extraxt aus Rhodococcus rhodochrous (Jomol®) enthält.

Solche Extrakte können als Arzneimittel und als diagnostische Mittel verwendet werden. Sie sind insbesondere als Mittel zur Steigerung der zelligen Abwehr und für die Diagnose und Therapie von malignen Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr geeignet. Sie können als Träger für diagnostische und therapeutische Stoffe verwendet werden.

Die Diagnose maligner Tumoren ist trotz intensiver Forschung heute noch schwierig. Es ist fast unmöglich, maligne Tumoren im Frühzustand zu erkennen, und bis heute steht kein Verfahren zur Verfügung, mit dem eine Frühdiagnose durchgeführt werden kann.

In den deutschen Patentanmeldungen P 33 34 751.4, P 33 36 583.0 und P 34 02 312.7 (entsprechend der europäischen Patentanmeldung 8 41 10 118.1 und folgender weiterer Patentanmeldungen in ausländischen Staaten: Kanada (4 63 991), Südafrika (84/7296), Australien (33 327/84), Japan (2 02 859/84), UdSSR (37 98 784.13), Polen (P.2 49 725), Rumänien (1 15 800), Jugoslawien (P-1639/84), Spanien (5 36 085), Argentinien (2 97 977), Südkorea (84-5894), DDR (2 67 559), Dänemark (4553/84), USA (6 89 728)) wird ein Mittel zur Diagnose und Therapie von bösartigen Tumoren sowie zur Therapie von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr beschrieben, das einen Immunmodulator in und/oder auf Liposomen oder lipidiert oder mit einem mit einem radioaktiven Strahler, einem Farbstoff oder einem Cytostatikum markierten Immunmodulator enthält.

Es besteht jedoch weiterhin Bedarf nach diagnostischen Mitteln, die möglichst keinerlei Nebenwirkungen zeigen und insbesondere sehr einfach herzustellen sind. Die bekannten Mittel besitzen weiterhin den Nachteil, daß ihre intravenöse Verabreichung mit gewissen Schwierigkeiten verbunden ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel für die Diagnose von Tumoren zur Verfügung zu stellen. Das Mittel soll hochwirksam sein und daher in geringerer Konzentration als die bekannten Mittel verabreicht werden können. Das erfindungsgemäße Mittel soll bewirken, daß der Organismus des Patienten weniger stark belastet wird, und weiterhin soll seine Verabreichung auf einfache Weise möglich sein.

Das Mittel soll weiterhin intravenös verabreichbar sein und als Träger für radioaktive Strahler und Farbstoffe dienen.

Das Mittel soll unbegrenzt verfügbar sein und einfach anzu­ wenden sein. Es soll gut dosierbar sein.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß ein mikrobieller Extrakt, der im folgenden auch als Immunmodulator bezeichnet wird (Jomol®), den man aus dem Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous gewinnt, die erfindungsgemäße Aufgabe löst.

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen mikrobiellen Extrakt, erhalten durch

• a) Züchtung von Rhodococcus rhodochrous (DSM 43 202 bzw. ATCC 21 953) auf einem Nährmedium,
• b) Gewinnung der Zellen,
• c) Suspendierung der Zellen in einem Puffer und 15 Minuten bis einige Stunden Stehenlassen der Suspension,
• d) Behandlung der Suspension mit einem murolytischen Enzym,
• e) Zerstörung der Zellen,
• f) Trennung des erhaltenen Materials in Bodensatz und Überstand,
• g) Trennung des Überstands an Sephadex-Säulen unter Verwendung von Puffer als Elutierungsmittel,
• h) Gewinnung der aktiven Fraktionen, die im UV-Spektrum eine Absorption bei 214 nm zeigen,
• i) Umsetzung der aktiven Fraktionen mit Acetaldehyd in einem Molverhältnis von 1 mol aktiver Fraktion (angenommenes mittleres Molekulargewicht 4000) mit 1,8 bis 2,2 mol Acetaldehyd, gegebenenfalls gekoppelt mit einem Molekül, das einen radioaktiven Strahler und/oder einen Farbstoff binden kann,

enthält.

Der mikrobielle Extrakt kann in oder auf Liposomen oder lipidiert vorliegen.

Er kann mit einem radioaktiven Strahler oder einem Farbstoff markiert sein, wobei die Markierung unter Verwendung von An­ kopplungsmitteln, wie beispielsweise DTPA oder Kryptofix (4,7,13,16,21,24-Hexy-oxo-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan), erfolgen kann. Als Kopplungsmittel kann man alle solchen Kopplungsmittel verwenden, die einen radioaktiven Strahler oder einen Farbstoff tragen oder binden können.

Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel kann gegebenenfalls übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel enthalten.

Der Anmelder hat überraschenderweise gefunden, daß ein be­ stimmter Mikroorganismus des Genus Nocardia opaca = Rhodococcus rhodochrous eine Verbindung ergibt, die nach Um­ setzung mit Acetaldehyd überraschende Eigenschaften als Träger für diagnostische Stoffe aufweist. Der Stamm Rhodo­ coccus rhodochrous wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Griesbachstraße 8, D-3400 Göttingen, am 16. Mai 1972 unter der Nummer SDM 43 202 (= DSM 363 =ATCC 21 953) hinterlegt. Der Stamm ist frei verfügbar, und seine Lebensfähigkeit wurde am 28. Februar 1985 erneut nachgewiesen.

Bei der Durchführung des Verfahrens zur Herstellung des mikrobiellen Extrakts wird ein eine Kohlenstoffquelle, eine Stick­ stoffquelle und Mineralien enthaltendes Kulturmedium verwendet. Dieses Kulturmedium kann auch Anti-Schaummittel und/oder andere übliche Komponenten enthalten. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, Alkohole, Kohlenwasser­ stoffe und Kleie. Beispiele für Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Pepton, Fischmehl, Ammoniumsalze, Nitratsalze und Harnstoff. Die Mineralquelle umfaßt anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Zinksalze, Calciumsalze, Mangansalze, Molyb­ dänsalze und Kupfersalze.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann nach Bedarf geändert werden, und während der Fermentation können diese Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralquellen zusätzlich zu­ gegeben werden. Zur Herstellung eines Inokulums wird der Mikroorganismus beispielsweise auf DST-Oxoid® (Nährboden) oder Traubenzucker-Agar (2%) in Platten­ technik auf drei bis vier Platten fünf bis acht Tage kultiviert. Man erhält hierbei ein Produkt, das dann als Inokulium zur Herstellung des Materials in technischem Maßstab ver­ wendet werden kann.

Die Züchtung des Mikroorganismus in technischem Maßstab kann beispielsweise in Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml normale Nährbouillon enthalten, erfolgen. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen.

Die Züchtungstemperatur beträgt 20 bis 40°C, und der pH- Wert des Kulturmediums liegt bei 7,2 bis 7,4. Die bevorzugte Temperatur beträgt 30 bis 37°C, und die geeignete Züchtungs­ zeit beträgt normalerweise 2 bis etwa 30 Tage und kann auf geeignete Weise, abhängig von der Auswahl der anderen Kultur­ bedingungen, geändert werden.

Die Mikroorganismen werden dann geerntet, vorzugsweise durch Abzentrifugieren. Man kann die Mikroorganismen jedoch auch über Glasfilter abfiltrieren. Das Zentrifugieren kann beispielsweise mit 4000 Umdrehungen pro Minute während einer Zeit von 5 bis 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge mit einem Rotor von 40 cm Durchmesser erfolgen. Die erhaltenen Mikroorganismen werden üblicherweise gewaschen, beispielsweise mit Wasser oder 0,01m Tris-HCl- Puffer mit einem pH-Wert von beispielsweise 7,4. Der Tris- HCl-Puffer enthält vorzugsweise EDTA-NA₂, zum Beispiel 0,1 bis 0,04%, vorzugsweise 0,06%. Der Waschvorgang kann einmal oder mehrere Male wiederholt werden.

Die Mikroorganismen werden sodann, vorzugsweise nachdem sie wie oben gewaschen wurden, in Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), bei­ spielsweise 0,01m, der vorzugsweise 0,1 bis 0,05% EDTA-Na₂ und 8 bis 12%, vorzugsweise 10%, Glucose enthält, suspendiert.

Zu der erhaltenen Suspension, die gegebenenfalls bebrütet wurde, wird dann ein murolytisches Enzym, vorzugsweise Lysozym und vorzugsweise zur Entfernung der Nucleinsäuren und zur Herabsetzung der Viskosität Desoxyribonuclease zugesetzt. Man verwendet beispielsweise für 5 g Bakterien 100 ml Tris-HCl-Puffer und gibt dann zu dieser Supension 10 mg Lysozym und 3 mg Desoxyribonuclease.

Die Behandlung mit Glucose und den Fermenten wird während einer Zeit von 30 Minuten bis mehreren Stunden, vorzugsweise während einer Zeit von 2 bis 3 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 37°C, durchgeführt.

Anschließend werden die Zellen zerstört. Dies kann mit allen geeigneten Methoden geschehen. Vorzugsweise wird Ultraschall während beispielsweise einer Minute, verwendet. Die mechanische Zerstörung der Zellen muß nicht durchgeführt werden, sie wird jedoch vorzugsweise durchgeführt, weil dadurch die Ausbeute an dem gewünschten Produkt erhöht wird.

Das erhaltene Mittel wird danach in Überstand und Bodensatz, vorzugsweise durch Zentrifugieren, getrennt. Das Zentri­ fugieren kann in einer normalen Zentrifuge durchgeführt werden, bevorzugt wird es jedoch in einer Kühlzentrifuge bei einer Temperatur von 4 bis 6°C bei 4000 Umdrehungen pro Minute 10 bis 15 Minuten lang durchgeführt. Der Bodensatz kann gegebenenfalls einmal oder mehrere Male mit Wasser oder dem oben erwähnten Puffer gewaschen werden, wobei die erhaltenen Waschlösungen mit dem Überstand vereinigt werden. Der Überstand wird gegebenenfalls nach Einengen im Hochvakuum bei tiefen Temperaturen an Sephadex®-G-75-Säulen chromatographiert.

Wird auf ein Waschen des erhaltenen Bodensatzes verzichtet, so wird der Überstand direkt der Chromatographie, ohne daß er eingeengt wird, unterworfen. Man erhält beispielsweise aus 5 g Bakterien einen Überstand, den man vorzugsweise in fünf gleiche Teile teilt und auf fünf vorbereitete Sephadex®- G-75-Säulen zu je einem Teil gibt. Die Säulen sind 80 cm lang, der Innendurchmesser beträgt 2,5 cm, und die Sephadex®- Füllungshöhe beträgt 60 cm. Wird nur eine Säule verwendet, so wird der Teil, der nicht chromatographiert wird, bei -25°C eingefroren und bei dieser Temperatur aufbewahrt.

Wenn man bei der Chromatographie auf einer der Säulen zur Charakterisierung des mikrobiellen Extrakts "Albumin aus Humanserum-Markierung" benutzt, tritt der erste Peak der Rohsubstanz mit dem Albumin (MG 69 000) und die Fraktion 2b* mit dem ebenfalls zur Säulen­ eichung benutzten Vitamin B₁₂ (MG 1355,4) aus Fig. 2.

Als Elutionsmittel wird 0,01m Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 0,06% EDTA-Na₂ enthält, verwendet. Die Tropfgeschwindigkeit beträgt 2 Tropfen pro Minute, wobei man auch niedrigere oder höhere Geschwindigkeiten anwenden kann. Die aktive Fraktion, die als Fraktion 2b* bezeichnet wird, wird in einer Zeit von 12 bis 14 Stunden nach Beginn der Gelchromatographie gesammelt. Das Elutionsvolumen beträgt ca. 900 bis 980 ml, und die Fraktionierung erfolgt unter UV-Detektion bei 214 nm.

Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden lyophilisiert und anschließend eine Stunde bei 80°C zur Zerstörung der Abbau­ enzyme inkubiert. Wenn nicht lyophilisiert wird, werden die verdünnten Lösungen bei -20°C, vorzugsweise -40°C, besonders bevorzugt -80°C, eingefroren und als Lösung aufbewahrt.

Vor dem Lyophilisieren bzw. Einfrieren werden die erhaltenen Lösungen bei aktiven Fraktionen vorzugsweise mit einer 1m Acetaldehyd-(reinst)wäßrigen-Lösung im unten angegebenen Molverhältnis gemischt und 10 Minuten bis 2 Stunden, vor­ zugsweise zum Beispiel 30 Minutne, bei Raumtemperatur stehen­ gelassen.

Die Umsetzung der Fraktion 2b* mit Acetaldehyd erfolgt im molaren Verhältnis Fraktion 2b* : Acetaldehyd = 1 : 1,8 bis 2, vorzugsweise im Verhältnis von 1 : 2, wobei man für die Fraktion 2b* ein mittleres Molekulargewicht von ca. 4000 annimmt.

Überraschenderweise zeigte sich, daß man bei der Umsetzung der aktiven Fraktion 2b* mit Acetaldehyd eine "Fraktion 2b" erhält (Jomol®), die überraschende pharmakologische Eigen­ schaften aufweist, als Trägersubstanz verwendet werden kann und in dem erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel als mikro­ bieller Extrakt eingesetzt wird.

Die Ausbeute aus 5 g Bakterien beträgt 50 bis 75 mg Immunmodulator in reiner Form.

Das Produkt ist sehr hygroskopisch. Gegebenenfalls kann mit üblichen Methoden eine Wassergehaltsbestimmung des Lyophilisats durchgeführt werden.

Nach dem Trocknen ist die Substanz gelbweiß und flockig, mit etwas mehr Wasser erscheint sie im Augenblick "kristallin", mit etwas mehr Wasser ist sie farblos, glasartig, gelatinös und zieht Fäden, wie Haushaltsalleskleber. Bei steriler Lagerung ohne Lichtzutritt unter Stickstoff ist die Substanz bei einer Temperatur unter -25°C stabil. Die Substanz ist unter Lichtzutritt bei Raumtemperatur eine gewisse Zeit lang stabil.

Wie oben erläutert, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Nocardia-Bakterien verwendet. Nocardien sind grampo­ sitive Actinomyceten. Ihr mehrschichtiges Zellwandgrundgerüst weist Einlagerungen von Proteinen und Polysacchariden auf. Ihm aufgelagert sind Deckschichten, die schwer ablösbar sind.

Herstellungsbeispiele für das diagnostische Mittel

Der mikrobielle Extrakt wird im folgenden als Immunmodulator bezeichnet.
(1) Immunmodulator-DTPA (Immunmodulator-In) (IMM-DTPA) (zum Beispiel geeignet zur Beladung mit ¹¹¹In, aber auch direkt und über Sn von reduziertem ^99mTc).
Reaktionsgefäße werden säuregewaschen verwendet.

1. 5,7 mg DTPA-Anhydrid wurden in 10 ml absolutem (CH₃CH₂)₂O suspendiert. S1
2. Ca. 5 mg IMM (Fraktion 2b) wurden in 175 µl (zwei Röhrchen á 175 µl), 0,05 m Carbonat-Puffer (pH 7,0) gelöst. Anschließend wurden 40 µl Suspension S1 unter gleichzeitigem starken Rütteln am Mixer (30 bis 60 Sekunden) zugegeben. Nach 1 Stunde bei 37°C (Brutschrank) (Ether dabei abdunsten lassen) wurde der IMM-DTPA und eventuell nicht umgesetztes DTPA-Anhydrid über eine FPLC-Säule getrennt.

Auf die Säule:
ca. 330 µl
Mobile Phase:	0,1m Phosphat-Puffer
Fluß:	1 ml/min
Detektion bei λ:	214 nm
HPLC-Pumpe:	LC-Pumpe 410, Kontron

Herstellung der Applikationslösung:

¹¹¹Indiumchlorid:
INS IP; Lot 599 BA
Sterile Lösung in 0,04m HCl:	2 mCi, 74 MBq; 10 mCi, 370 mBq pro ml um 12.00 Uhr, GMT 16. 1. 1985 0,2 ml, 0,2 µg In/ml

1) 5 Teile IMM-DTPA (0,5 mg IMM-DTPA/ml 0,05m Carbonat- Puffer/0,9% NaCl)
2) 2 Teile Kaliumphosphat-Puffer 0,1m/pH 7,0
3) 1 Teil ¹¹¹InCl₃

Die Anteile des Eluats, die nicht sofort verwendet werden, sollten bei -20°C eingefroren und so aufbewahrt werden. Die Markierung mit ^99mTechnetium erfolgt nach Stickstoffdurch­ blasung des Eluatanteils unter Stickstoff durch Zugabe von 3 µl einer wäßrigen 3 mM SnCl₂×H₂-Lösung je ca. 10 µg IMM- DTPA und Zugabe von 740-1110 MBq (20 bis 30 mCi) ^99mTc in physiologischer Kochsalzlösung (zur selben vorgenannten Immunmodulator-DTPA-Menge). Wartezeiten vor der Anwendung sind nicht erforderlich (i.V.-Test, γ-Kamera), eine Neutralisierung der erhaltenen Lösung ist nicht zwingend, aber wegen der geringen Menge ist oft eine Streckung der Lösung erwünscht, wobei diese mit dem oben genannten 0,05m Bicarbonat- Puffer (pH 7,0) durchgeführt auch dazu dient.

Zu einer Markierung mit ¹¹¹In, das meist als ¹¹¹INCl₃ in salzsaurer Lösung geliefert wird, werden zum Beispiel ca. 10 µg IMM-DTPA in bzw. als o.g. Eluat mit der doppelten Menge des o.g. Puffers und zum Beispiel 74-111 MBq (2 bis 3 mCi) des o.g. Indiums zusammengegeben; die erhaltene Lösung ist für den i.V.-Test mit der γ-Kamera sofort (ca. 5 Minuten später) verwendbar.
(2) Immunmodulator, angereichert mit angebundenem Uridin (Immunmodulator) (IMM-U) (zum Beispiel geeignet zur Markierung mit radioaktivem Iod für die Diagnostik) (analoges gilt für Immunmodulator-J/Ts^x und Immun­ modulator-J/Tn^xx).
x: angereichert mit L-Tyrosin durch Anbindung von α-Amino-β-[p-hydroxy-phenyl]-propionaldehyd (30 µg in 10 µl S1) (Sigma)
xx: angereichert mit L-Thyronin durch Anbindung von α-Amino-β-[p-hydroxy-phenyl-(p-hydroxy-phenyl- ethher)]-propionaldehyd (S1 dito)

Die Herstellung erfolgt analog der Anbindung des DTPA, wobei allerdings 30 µg Uridin-2′,3′-dialdehyd in 10 µl getrocknetem Diethylether (vgl. (1) S1) (IMM-DTPA) verwendet werden Uridin-2′,3′-dialdehyde, Diethylenetriamine­ pentaacetic-acid-anhydride. Die Iodmarkierung mit einem entsprechenden Radionuclid wird nach dem für Uridin üblichen Verfahren von entsprechenden Insitutionen durchgeführt.

Die Bindung des DTPA an der Aminogruppe des Lysins ist stabil, andere Anbindungen hydrolisieren.
(3) Immunmodulator-Vorstufe des Kryptofix 222® (4,7,13,16,21,24- Hexa-Oxo-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan (Immunmodulator-Ra) (IMM-CE) (zum Beispiel geeignet als Träger für ²²⁴Radium zur i.v.-Therapie durch α-Strahlenzerstörung von Tumorzellen) CE-Molekül:

CE enthält die komplette Amidbindung im Kronenether (im Gegensatz zu Kryptofix 222®), eine längere Inkubations­ zeit mit Ra zu dessen Aufnahme ist nötig als beim Kryptofix 222®. Die Stabilitätskonstante hinsichtlich der Radiumbindung ist für CE und Kryptofix 222® gleich: log K = 6,64 (dieser Logarithmus ist für Radium höher als für alle in Frage kommenden anderen Metallionen). Das angebundene Radium soll hinsichtlich seiner Bindung nur durch ein saures Milieu abgelöst werden (im Magen instabil, im übrigen Körper stabil). Annäherungen müssen nach der Bindung des Radiums an das CE unterbleiben.
Herstellungsbeispiel für IMM-CE:
1 ml 0,2m Borat-Puffer (pH 8,0, mit Borsäure eingestellt) + 200 µl einer wäßrigen Lösung von 1 mg Immunmodulator (aus Nocardia opaca Fraktion 2b, siehe Beispiel oben)
+ 240 µl Ce (1 mg/ml Ethanol PA)
+ 160 µl Cyanoborhydrit-Lösung auf 1 mg/ml 0,2 m Borat-Puffer (pH 8,0)

Dieses Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 37°C inkubiert. In der Produktion erfolgt nun sehr aufwendig die Abtrennung des IMM-CE von den anderen Bestandteilen, so daß beim Fertigpräparat nur mit ca. bis zu 7,4 MBq (200 µCi) ²²⁴Ra über ca. eine Stunde inkubiert werden muß, um das fertige Produkt zu erhalten. Die dazu erforderlichen Maßnahmen sind Gelchromatographien.

Nach der oben genannten Inkubation wird zum Reaktionsgemisch ²²⁴Radium als ²²⁴RaCl₂-Lösung bis 7,4 mBq (200 µCi) gegeben und bei Raumtemperatur ca. eine Stunde abgewartet. Die erhaltene Lösung wird auf eine Superrose^TH-FPLC-Säule gegeben. Als Laufmittel wird 50 mM Kaliumphosphat-Puffer von pH 6,8 in 0,1 m NaCl-Lösung (wäßrig) + 1 ml/min, Schreiber 12 cm pro Stunde, λ=214 nm, verwendet.

Zum Vergleich dient wäßrige Immunmodulator-Lösung (0,5 mg/ml). Das Reaktionsprodukt und der Immunmodulator weisen das gleiche Anfangsspektrum auf. Die fraktionierte Entnahme des IMM-CE-Ra erlaubt die Abtrennung von den übrigen Komponenten des Reaktionsgemisches, da sie die Messung der Aktivität mit dem Bohrloch ermöglicht. Die Fraktionen, die nach dem An­ fangsspektrum im gegenüber der Immunmodulator-Lösung veränderten Schulterverlauf austreten, sind zu verwerfen, da sie zwar noch viel Radioaktivität, aber auch bereits die sehr toxische Cyanoborhydrit-Lösung enthalten.

Da IMM-CE²²⁴Ra nicht nur an Krebszellenoberflächen ange­ reichert wird (wo bei Gabe von ca. 185 kBq (5 µCi i.v. ca. 1 g Krebsgewebe zerstört wird), sondern auch, wie das immun­ stiumulierende reine Immunmodulatormolekül, in Monozyten, Makrophagen, Mikrophagen und Knochenmarkstammzellen geht, muß vor der Verabreichung von IMM-Ce-²²⁴Ra i.v. darauf geachtet werden, daß diese Zellen das Produkt nicht aufnehmen können. Eine Beschränktung der Aufnahme von IMM-CE-²²⁴Ra in immunkompetente und Knochenmarkstammzellen ist mit hohen Dosen Cortisol i.v./i.m. in dem Fachmann geläufigem Abstand vor der Gabe der Aktivität erforderlich.

Dosis (Stöchiometrie):
Zum Einsatz in der Diagnostik kommen zum Beispiel ca. 740 MBq (20 mCi) ^99mTechnetium bzw. 74-111 MBq (2 bis 3 mCi) ¹¹¹Indium.

Die Markierung von Immunmodulatoren mit einem radioaktiven Strahler ist in der Literatur beschrieben (vgl. beispielsweise M.P. Osborne, V.J. Richardson, K. Jeyasingh und B.E. Ryman, Int. J. Nucl. Med. Biol. 6, 75 (1979)).

Beispiele für radioaktive Strahler sind die Strahler, die man üblicherweise auf dem Gebiet der Diagnose verwendet, wie beispielsweise ^99mTechnetium, ¹¹¹Indium, ¹²⁵Iod, ¹³¹Iod und ²²⁴Radium. Die Radioaktivität kann beispielsweise 185 MBq-7,4 GBq (5 bis 200 mCi) betragen.

Der Immunmodulator kann auch mit einem Farbstoff markiert sein. Als Farbstoffe eignen sich beispielsweise marktübliche, im Menschen ungiftige, Aminogruppen markierende Farbstoffe, wie unter anderem Fluoresceinisothiocyanat.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Gemische aus Immunmo­ dulator und seinen mit einem radioaktiven Strahler oder einem Farbstoff markierten Derivaten zu verwenden.

Der Immunmodulator und seine Derivate können in freier Form verwendet werden. Bevorzugt werden sie jedoch in oder auf Liposomen oder in lipidierter Form eingesetzt.

Da der Immunmodulator auf dem Blutwege im Körper verteilt wird und über Nieren, Leber, Lungen, in Urin, Galle und abgeatmeter Luft ausgeschieden wird, sind bei entsprechender Markierung des Immunmodulators bzw. seiner Derivate mit radioaktiven Isotopen bei Darstellung mittels γ-Kamera außer Krebs und seinen Metastasen in Weichteilen und Knochen auch Funktions- bzw. Clearance-Untersuchungen bei diesen Passagen durchführbar.

Lipisomen sind kugelförmige Gebilde aus einer oder mehreren Lipiddoppelschichten mit einem Innenraum. Derartige Bläschen lassen sich durch mechanische Feinstverteilung von Phospho­ lipiden, wie zum Beispiel Lecithin, in wäßrigen Medien her­ stellen.

Erfindungsgemäß werden Liposomen verwendet, die einzelne unilamellare Bläschen (SUV) sind und vorzugsweise aus Phos­ phatidylcholin, Phosphatidylserin und Cholesterol im molaren Verhältnis von 8 : 2 : 10 bestehen und durch Sonication hergestellt werden. Die Lipide, aus denen sie hergestellt werden, sind im Handel erhältlich. Sie werden durch Säulenchromatographie gereinigt, in Ether gelöst, unter N₂ verdampft, mit dem Immunmodulator bzw. dem bestickten Immunmodulator vermischt, in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), beispielsweise bei pH 7,4, wieder supendiert und dann beispielsweise 25 Minuten bei +2°C mit einem pulsierenden Sonicator beschallt (sonicated). Die Sonication wird im allgemeinen unter N₂ durchgeführt.

Nach der Sonication werden die Liposomen auf einer Sepharose®- 4-B-Säule chromatographiert und vorzugsweise die Fraktionen der Population mit Radii unter 300 Å benutzt (C. Huang, Biochemistry 15, 2362 (1969)). Diese Liposomen werden dann zur Diagnositik in an sich bekannter Weise mit vorzugsweisen ^99mTechnetium an Immunmodulator markiert entsprechend Osborne et al. (M.P. Osborne, V.J. Richardson, K. Jeyashingh und B.E. Ryman, Int. J. Nucl. Med. Biol. 6, 75 (1979)).

Um die radioaktive Markierung zu prüfen, wird ein Aliquot der Liposomen auf eine Sepharose®-4-B-Säule gegeben und chro­ matographiert. Man stellt fest, daß die Präparation eine spezifische Aktivität von 99,2% an den Immunmodulator gebundener Radioaktiviät und 0,8% von freiem Pertechneat hat.

Die Liposomen können mit dem Immunmodulator bzw. seinen Derivaten beschickt sein, die mit einem radioaktiven Tracer, mit einem Farbstoff, einem Cytostatikum oder mit Gemischen dieser Verbindungen beschickt sind. Diese Liposomen sind besonders gut für die Diagnose geeignet.

Wie oben erwähnt, ist bekannt, daß ein Gemisch aus Acetaldehyd und Ethanol eine cancerotoxische Wirkung hat. Über­ raschenderweise wurde jetzt gefunden, daß das erfindungsgemäße diagnostische Mittel eine besonders gute Wirkung entfaltet, wenn es zusammen mit einem Hilfsmittel, welches als "Cocktail" bezeichnet wird, verabreicht wird. Das Hilfsmittel enthält ein Aldehyd der Formel I

RCHO (I)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoff­ atomen bedeutet, und gegebenenfalls einen Alkohol der Formel II

R¹CH₂OH (II)

worin R¹ die für R gegebene Bedeutung besitzt. Das Hilfsmittel enthält gegebenenfalls übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel. Es ist besonders bevorzugt, daß das Hilfsmittel zusätzlich zu dem Aldehyd einen Alkohol enthält. Bei gleichzeitiger oder zeitlich abgestufter Verwendung des Hilfsmittels zusammen mit dem erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel wird der Wirkungsgrad des erfindungsgemäßen Mittels wesentlich verbessert.

Das Hilfsmittel wird bevorzugt oral in Form der wäßrigen Lösung verabreicht und vom Patienten getrunken. Das Hilfsmittel kann jedoch auch parenteral, zum Beispiel durch Infusion, verabreicht werden. Die Zubereitung von Infusionslösungen ist dem Fachmann geläufig und kann auf einfache Weise erfolgen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des mikrobiellen Extrakts

Nocardia opaca (ATCC 21 953 bzw. DSM 43 202) werden auf DST-(Oxoid-) oder Traubenzucker-Agar (2%, Merck) in Platten­ technik auf 3 bis 4 Platten 5 bis 8 Tage kultiviert. Nach dem Abernten werden die Bakterien auf ca. 100 ml normale Nährbouillon verimpft und über Nacht bei 30 bis 37°C bebrütet.

Ernten der Nocardia-Bakterien durch zum Beispiel Abfiltern mit Glasfilter oder ähnlichem, vorzugsweise Abzentrifugieren, beispielsweise bei 4000 Umdrehungen/Minute, 5 bis 10 Minuten lang in einer Kühlzentrifuge (oder anderen geeigneten) mit einem Rotor von 40 cm Durch­ messer, und den erhaltenen Bodensatz (die 5 g Bakterien) in 100 ml beispielsweise 0,01m Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), vor­ zugsweise mit EDTA-NA₂ (0,06%) suspendieren (Waschvorgang), zum Beispiel abzentrifugieren (wie oben angegeben) und den Bodensatz in ca. 100 ml zum Beispiel 0,01m Tris-HCl-Puffer von pH 7,4 mit vorzugsweise 0,06% EDTA-Na₂ und mit 10% Glucose suspendieren. Hier kann ca. 2 Stunden bei 30 bis 37°C bebrütet werden und dann, wie oben angegeben, abzentrifugiert werden. Der Bodensatz kann in 100 ml 0,01m Tris-HCl- Puffer mit 0,06% EDTA-Na₂ resuspendiert werden und erneut, wie oben angegeben, abzentrifugiert und im selben Medium re­ suspendiert werden. Dieser Waschvorgang kann unterbleiben, aber durch ihn wird mehr Wandmaterial der Bakterien aus dem abschließend verwendeten Überstand entfernt.

Nach ca. 30 Minuten werden 10 g Lysozym und vorzugsweise zur Entfernung der Nucleinsäuren und zur Herabsetzung der Viskosität 3 mg Desoxyribonuclease zugesetzt. Diese Phase mit Glucose und Fermenten dauert 2 Stunden und findet bei 30 bis 37°C statt.

Danach werden die Zellen zerstört. Dies kann mit allen geeigneten Methoden geschehen, bevorzugt wird Ultraschall über 1 Minute.

Danach wird bei 4 bis 6°C in der Kühlzentrifuge (wie oben be­ schrieben) bei 4000 UpM 10 bis 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand, dessen UV-Spektrum in Fig. 1a dargestellt ist, wird vorzugsweise in fünf Teile geteilt und auf fünf vorbereitete Sephadex®-G-75-Säulen zu je einem Teil gegeben. Die Säulen sind 80 cm lang, Innendurchmesser 2,5 cm, und die Sephadex®-Füllungshöhe beträgt 60 cm. Bei Verwendung einer Säule werden die übrigen Portionen bei -25°C bis zur Verwendung eingefroren. Die Fraktion hat ca. 4500 bis 900 Dalton. Sie tritt beim Eluieren zum Beispiel mit 0,01m Tris-HCl- Puffer (pH 7,4) beispielsweise mit 0,06% EDTA-Na₂ bei ca. 900 bis 980 ml durch, bei einer Tropfgeschwindigkeit von etwa 2 Tropfen pro Sekunde (über Nacht) nach ca. 12 Stunden in 1 bis 2 Stunden. Diese Fraktion enthält das gewünschte Produkt 2b*.

• - Fraktionierung unter UV-Detektion bei 214 nm
• - Lyophilisieren, danach 1 Stunde bei 80°C (zur Zer­ störung der Proteasen) inkubieren, wenn nicht liophilisiert wird, dann sind die verdünnten Lösungen bei -20°C, besser bei -40°C bzw. -80°C, eingefroren aufzubewahren.

Der mikrobielle Extrakt wird durch Umsetzung von Fraktion 2b* (angenommenes mittleres Molekulargewicht 4000) mit Acet­ aldehyd im molaren Verhältnis von 2b : Acetaldehyd wie 1 : 2 erhalten. Danach muß erneut lyophilisiert werden, gegebenenfalls (siehe oben) eingefroren.

Die Ausbeute für 5 g Bakterien beträgt 50 mg (bis 75 mg) reines Produkt. Das Produkt ist sehr hygroskopisch. Das Produkt zeigt das in Fig. 1 dargestellte UV-Spektrum.

Beispiel 2 Herstellung von Tc-99-Immunmodulator

Der Immunmodulator lag in einer Konzentration von 3,255  g/ml vor. Davon wurden 250 µl in ein Reaktionsgefäß überbracht. Dazu wurden 1,8 ml einer 1×10^-6 m SnCl₂×H₂O-Lösung gegeben. Die Zinn(II)-chlorid-Lösung wurde hergestellt, indem 22,5 mg SnCl₂×2 H₂O in 10 ml H₂O gelöst wurden und von dieser Lösung 1 ml in 99 ml H₂O überführt wurde.

Nach einer halben Stunde Inkubationszeit wurden 185 MBq (5 mCi) Tc-99m-Pertechnetat, gelöst in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung, eluiert aus einem Spaltmolybdängenerator hinzugefügt. Nach wiederum 30 Minuten Inkubationszeit wurde das Volumen mit physiologischer Koch­ salzlösung auf 8 ml aufgefüllt. Die Endkonzentration betrug somit 100 µg Immunmodulator/ml und 50 µg SnCl₂×2H₂O/ml. Sämtliche angegebene Lösungen wurden zuvor mit gereinigtem Stickstoff durchsprudelt, jeglicher Kontakt mit Sauerstoff wurde vermieden.

Beispiel 3 Pharmakologische Untersuchungen a) Vorbereitung der Tierversuche

Verwendet wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 220 g. 4 Tage vorher war ein Walker-Carcinosarkom 256 subkutan in die rechte Flanke implantiert worden. Die Tiere wurden ad libidum mit Wasser und Altromin versorgt.

Vor Versuchsbeginn wurde eine Narkose mit 5 mg/100 g Lebendgewicht Pentobarbital (Nembutal) eingeleitet. 30 Minuten vor Applikation der Aktivität wurden 1,25 ml/ 100 g Lebendgewicht der folgenden Lösung intraperitoneal appliziert: 22,5 ml physiologische Kochsalzlösung, 2,4 ml Ethanol und 0,26 ml Acetaldehyd. 11,1 MBg (300 µCi) Tc-99m-Immunmodulator wurden in 0,5 ml (= 50 mg Immunmo­ dulator und 2,5 ·µg SnCl₂×H₂O) intravenös verabfolgt, zusätzlich wurde 1 ml physiologische Kochsalzlösung injiziert, um eine einheitliche Diurese zu gewährleisten.

b) Szintigraphie

Ein statisches Szintigramm von zwei Tieren wurde zwischen der 30. und 45. Minute p.i. mit einer 40-cm-Großfeld-γ- Kamera und ultrahochauflösenden Parallellochkollimator angefertigt. Die Tiere lagen hierzu mit dem Bauch auf dem Kollimator.

c) Messung der Organaktivitäten

Eine Stunde nach Injektion wurden die Tiere dekapitiert und das arteriovenöse Mischblut aufgefangen. Nach voll­ ständigem Ausbluten wurden die in Tabelle II aufgeführten Organe entnommen, gewogen und die Aktivität nach entsprechender Wartezeit in einem automatischen Proben­ wechsler gemessen. Die Ergebnisse der Organverteilung, ausgedrückt als Prozent der gegebenen Aktivität/g Organ­ frischgewicht und bezogen auf das gesamte Organ, sind in Tabelle II zusammengefaßt. Das mittlere Tumorgewicht betrug 1,48 g, die Einzelwerte 2,14, 0,93, 2,00, 1,39 und 0,93 g.

d) Beurteilung der Ergebnisse

Eine Stunde nach Applikation des mit Tc-99m markierten Immunmodulators war die Aktivitätskonzentration im Tumor um den Faktor 6 größer als im Muskel (45% des Körpergewichts) 3× größer als im Knochen (6% des Körpergewichts) und doppelt so hoch wie in der Leber.

Szintigraphisch konnte der Tumor bereits 30 Minuten nach Applikaiton von Tc-99m-Immunmodulator deutlich vom Untergrund abgegrenzt werden. Extrapoliert auf die Verhältnisse beim Menschen, kann erwartet werden, daß hier eine Tumorszintigraphie bereits 3 Stunden nach Applikation möglich sein wird.

In-vivo-Verteilung von Tc-99m-Immunmodulator in der tumortragenden Ratte eine Stunde nach intravenöser Applikation (n=5, Sprague-Dawley, Walker-Carcinosarkom 256)
Organ
% der Dosis/g
Blut
0,46±0,01
Leber	0,17±0,05
Milz	0,09±0,01
Magen	0,14±0,02
Nieren	3,34±0,29
Herz	0,16±0,02
Lunge	0,24±0,02
Muskel	0,05±0,01
Thymus	0,11±0,04
Femurknochen	0,09±0,02
Tumor, Blase	0,32±0,05

Beispiel 4 Herstellung von Immunmodulator-DTPA-Markierungen mit ^99mTc bzw. ¹¹¹In i. Herstellung von mit ^99mTc markiertem Immunmodulator

150 µg des Immunmodulators-DTPA, gelöst in 0,3 ml phosphat­ gepufferter 0,9%-Kochsalzlösung PBS, pH 7,4, mit 37 MBq (1 mCi)^99mTc markiert, Reduktion von ^99mTcO₄ in 1,1 ml 0,9% NaCl mit SnCl₂×2H₂O-Lösung 0,015 mM 0,2 ml. N₂ durch­ blasene Lösungen, Mischung unter Stickstoff. Vor Ver­ wendung 5 Minuten stehenlassen.

ii. Herstellung von mit ¹¹¹In markiertem Immunmodulator

600 µg des Immunmodulators-DTPA in 1,2 ml PBS, pH 7,4, c 8501/09.01.85 mit ca. 37 MBq (1 mCi)¹¹¹In wie folgt markiert:
5 Teile Immunmodulator-DTPA (1,2 ml)
+ 2 Teile Kaliumphosphat-Puffer 0,1m, pH 7,0 (0,48 ml)
+ 1 Teil ¹¹¹In-Lösung (0,24 ml)

In dieser Reihenfolge gemischt. 5 Minuten stehen gelassen, dann auf 3,2 ml verdünnt mit 0,9% NaCl.

Pharmakologische Untersuchungen

Mit den in (i) und (ii) erhaltenen Materialien wurden Tierversuche wie folgt durchgeführt.

a) Tiermaterial

6 SD-Ratten mit transplantiertem Walker-Carcinosarkom im Bereich der rechten Hinterpfote (transplantiert am 16. 1. 1985, DFfZ, Heidelberg).

b) Versuchsdurchführung

1 ml Cocktail (Ethanol + Acetaldehyd) allen 6 Tieren oral appliziert.

Nach 30 Minuten 2 Tieren den ^99mTc-markierten Immunmodulator und 4 Tieren den ¹¹¹In-markierten Immunmodulator über eine Schwanzvene injiziert (keine Paravasate), Volumen 0,8 ml
1 Tier mit ¹¹¹In-Immunmodulator verstarb 5 Minuten p.i.; es erfolgte sofort eine Szintigraphie aus dorsaler Sicht.

Die übrigen 5 Tiere wurden 2 Stunden bzw. 24 Stunden p.i. mit Chloralhydrat narkotisiert und jeweils aus dorsaler Sicht szintigraphiert.

c) Ergebnisse

Verhältnis tumortragende Hinterpfote zu nichttumortragender Hinterpfote 24 Stunden p.i.
¹¹¹-In-Immunmodulator
4,1 : 1
7,9 : 1
3,6 : 1
(bei dem 5 Minuten p.i. verstorbenen Tier: 2 : 1)
^99mTc-Immunmodulator
4,2 : 1
6,4 : 1

Der Tumor war bei allen Tieren deutlich abgrenzbar. Das oben angegebene Verhältnis Tumor-Gewebe entspricht einem unteren Grennzwert und dürfte bei einem echten Vergleich je Gewebeeinheit eher einem Verhältnis von 10 : 1 entsprechen.

Beispiele für Kits und ihre Anwendung

Die im folgenden genannten Bestandteile der Kits liegen in Durchstechflaschen steril, pyrogenfrei und unter Stickstoff vor. Zum Mischen der angegebenen Trockensubstanzen: Immunmodulator, seinen Derivaten und den Liposomen, die lyophilisiert (gefriergetrocknet) sind, mit den entsprechenden Lösungsmitteln sind Doppelmoleküle beigegeben.

Der Cocktail, bestehend aus Ethanol 96%, 50 g, und reinstem Acetaldehyd, 1 g, ist in einer Schraubdeckelflasche, er soll mit 450 ml Wasser verdünnt werden und 30 Minuten vor der Anwendung der anderen Mittel der Kits vom Patienten getrunken werden.

Die Kits sind im Lichtschutzkarton verpackt.

1.) Zur Krebsdiagnostik mit ^99mTechnetium:
Immunmodulator-Tech enthält: eine Durchstechflasche 30 µg Immunmodulator lyophilisiert; eine Durchstechflasche 5 ml phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, pH 7,4 (im folgenden als PBS bezeichnet); Cocktail als Trink­ ampulle, zusätzlich eine Durchstechflasche 2 ml, 0,3 mM SnCl₂×2H₂O-Lösung.
Anwendungsanweisung: Cocktail s.o., 740 MBq (20 mCi) ^99mTechnetium in physiologischer NaCl mit der Spritze ohne Luftblasen aufziehen und in die Durchstechflasche mit der SnCl₂-Lösung geben, Spritze drauflassen und schwenken, Lösung mit der Spritze entnehmen und in die Durchstechflasche Immunmodulator geben, Spritze darauf­ lassen, schwenken, klare Lösung mit der Spritze entnehmen, falls gewünscht, mit Inhalt Durchstechflasche PBS strecken, intravenös verabreichen zur Diagnostik mit der γ-Kamera.

2.) Zur γ-Kameradiagnostik mit ^99mTechnetium über Inha­ lation:
enthält: Eine Durchstechflasche 30 µg Immunmodulator lyophilisiert, eine Durchstechflasche Liposomen 5 mg lyophilisiert (aus Phosphatidylcholin : Phosphatidylserin : Cholesterol im Molverhältnis 8 : 2 : 10), eine Durchstech­ flasche 5 ml PBS; Cocktail in Trinkampulle und zusätzlich eine Durchstechflasche 2 ml 0,3 mM SnCl₂×2H₂O- Lösung.
Anwendungsweise: Cocktails s. o. wie bei 1.), aber anstelle der i.v.-Verabreichung in Durchstechflasche Liposomen geben, umschütteln und in geschlossenes Inhalations­ system einfüllen, inhalieren lassen. - Nur zur Lungendiagnostik und bei disseminierten kleinen Tumoren im Weichgewebe geeignet.

3.) Zur γ-Kameradiagnostik mit ¹¹¹Indium, intravenös: enthält: eine Durchstechflasche 30 µg (M 15 : 10) Immun­ modulator-DTPA lyophilisiert, eine Durchstechflasche 5 ml PBS, eine Durchstechflasche 2 ml 0,1m Kaliumphosphat- Pufer pH 7,0, Cocktail.
Anwendungsanweisung: Cocktail s.o.; Durchstechflasche Immunmodulator-DTPA über Doppelkanüle mit Durchstech­ flasche PBS verbinden, schwenken, 1 ml mit der Spritze aus der Durchstechflasche Immunmodulator-DTPA entnehmen (Rest gegebenenfalls bei -20°C einfrieren) und 0,2 ml aus der Durchstechflasche Kaliumphospat-Puffer dazu aufziehen, danach 74-111 MBq (2 bis 3 mCi)¹¹¹In aus der Indium-Lösung dazu aufziehen, 5 Minuten warten, i.V. verabreichen.

4.) Zur γ-Kameradiagnostik und zur lokalen Krebstherapie mit ¹³¹Jod bzw. ¹²⁵Jod, intravenös: Immunmodulator-J, Immunmodulator-J/Tyrosin, Immunmodulator-J/Thyronin enthält: Immunmodulator-J: Cocktail s.o., eine Durch­ stechflasche 30 µg lyophilisiertes Immunmodulator-Uridin (Kombination Immunmodulator : Uridindialdehyd im Molverhältnis 1 : 5, chemisch gebunden vorliegend), eine Durchstechflasche PBS.
Immunmodulator-J/Tyrosin: Cocktail s.o., eine Durch­ stechflasche 30 µg lyophiliertes Immunmodulator-Tyrosin (Verbindung von Immunmodulator : α-Amino-β-[p-hydroxy- phenyl]-propionaldehyd im Molverhältnis 1 : 5), eine Durch­ stechflasche PBS.
Immunmodulator-J/Thyrosin: Cocktails s.o., eine Durch­ stechflasche 30 µg lyophilisiertes Immunmodulator-Thyro­ sin (Verbindung von Immunmodulator : α-Amino-β-[p-hydroxy- phenyl-(p-hydroxy-phenyl-ether)]-propionaldehyd im Molverhältnis 1 : 5), eine Durchstechflasche PBS.
Anwendungsanweisung: Die Markierung mit radioaktivem Jod führen dafür eingerichtete Institutionen durch. Nach der Markierung des entsprechenden Immunmodulator- Derviates kann dieses mit dem PBS (Durchstechflasche) gestreckt und i. v. verabreicht werden.

5.) Zur intra-operationem-Farbdiagnostik von Krebsgewebe
intravenös: Cocktail s.o., eine Durchstechflasche 30 µg Immunmodulator-Fluorescein lyophilisiert (Verbindung von Immunmodulator : Fluoresceinisothiocyanat im Molverhältnis 1 : 5), eine Durchstechflasche PBS.
Anwendungsanweisung: wie 1), Diagnostik im UV-Licht!

6.) Zur intro-operationem-Farbdiagnostik von Krebsgewebe
oder inhalationem: Immunmodulator-Aer-Color
entält: Cocktail s.o., eine Durchstechflasche 30 µg Immunmodulator-Fluorescein lyophilisiert (wie in 5.), eine Durchstechflasche PBS, eine Durchstechflasche Lipo­ somen 5 mg lyophilisiert (Liposomen durch Sonication hergestellt).
Anwendungsbeispiel: Diagnostik im UV-Licht!

7.) Zur intraoperativen Labordiagnostik von Krebsgewebe in vitro:
enthält: wie 5.) ohne Cocktail
Anwendungsanweisung: Lösungsherstellung wie 1.), dann Gewebsbröckel für 5 Minuten in der Lösung inkubieren bei Raumtemperatur. - Im Anschnitt des Gewebsbröckels zeigt sich im ultravioletten Licht mit Lupe oder Mikroskop das Tumorgewebe hell, das gesunde dunkel.

Claims (10)

1. Diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es einen mikrobiellen Extrakt, erhalten durch

• a) Züchtung von Rhodococcus rhodochrous (DSM 43 202 bzw. ATCC 21 953) auf einem Nährmedium,
• b) Gewinnung der Zellen,
• c) Suspendierung der Zellen in einem Puffer und 15 Minuten bis einige Stunden Stehenlassen der Suspension,
• d) Behandlung der Suspension mit einem murolytischen Enzym,
• e) Zerstörung der Zellen,
• f) Trennung des erhaltenen Materials in Bodensatz und Überstand,
• g) Trennung des Überstands an Sephadex-Säulen unter Verwendung von Puffer als Eluierungsmittel,
• h) Gewinnung der aktiven Fraktionen, die im UV-Spektrum eine Absorption bei 214 nm zeigen,
• i) Umsetzung der aktiven Fraktionen mit Acetaldehyd in einem Molverhältnis von 1 mol aktiver Fraktion (angenommenes mittleres Molekulargewicht 40000) mit 1,8 bis 2,2 mol Acetaldehyd, gegebenenfalls gekoppelt mit einem Molekül, das einen radioaktiven Strahler und/oder einen Farbstoff binden kann,

enthält.

2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als Molekül, das einen radioaktiven Strahler und/oder einen Farbstoff binden kann, Diethylentriaminpentaessigsäure oder 4,7,13,16,21,24-Hexa- oxo-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan (Kryptofix 222®) ein­ setzt.

3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Zellen in einem Puffer und einem Glucose enthaltenden Medium suspendiert.

4. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Suspension mit einem murolytischen Enzym und mit Desoxyribonuclease behandelt.

5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Trennung des Überstands an Sephadex-Säulen unter Verwendung eines Puffers, der 0,1 bis 0,05% Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat enthält, durchführt.

6. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man den mikrobiellen Extrakt nach Anspruch 1 durch 5- bis 8tägiges Anzüchten der Bakterien auf Traubenzucker-Agar-(2%)-Platten unter Verwendung von Nährbouillon als Nährmedium und Durchführung der Züchtung während einer Zeit von 10 bis 20 Stunden bei einer Temperatur von 30 bis 37°C erhält.

7. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man den mikrobiellen Extrakt nach der Gewinnung der Zellen ein oder mehrere Male mit Puffer pH 7,4, der gegebenenfalls 0,1 bis 0,05% EDTA-N₂ enthalten kann, wäscht.

8. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als radioaktiven Strahler, der von dem Molekül gebunden werden kann, ^99mTechnetium, ¹¹¹Indium, ¹²⁵Iod, ¹³¹Iod oder ²²⁴Radium einsetzt.

9. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es den mikrobiellen Extrakt, markiert mit ^99mTechnetium, enthält.