DE3541355A1 - Schnelldiagnostikum fuer blutgruppenbestimmung - Google Patents

Schnelldiagnostikum fuer blutgruppenbestimmung

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DE3541355A1
DE3541355A1 DE19853541355 DE3541355A DE3541355A1 DE 3541355 A1 DE3541355 A1 DE 3541355A1 DE 19853541355 DE19853541355 DE 19853541355 DE 3541355 A DE3541355 A DE 3541355A DE 3541355 A1 DE3541355 A1 DE 3541355A1
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István Masek
József Budapest Szokol
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HUMAN OLTOANYAGTERMELO
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
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Description

S CHJiELLDIAGNOSTIKUM FÜR BLUTGRUPPENBESTIMMUNG
Die Erfindung betrifft ein Schnelldiagnostikum' für Blutgruppenbestimmung· und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die Blutgruppenbestimmung gehört zur Rutinearbeit der Gesundheitsfürsorge, ist aber keine einfache Aufgabe, die durch strenge Vorschriften reguliert -wird. Es gibt Umstände (Katastrophen-Situationen, Kriege usAv.), wenn eine grolae Anzahl der Blutgruppenbestimmungen (sterile Ausrüstung, Geräte, Maschinen usw. ) nicht zur Verfugung stehen. In mehreren Ländern wurden Schnelldiagnostika für die schnelle Blutgruppenbestimmung vom Reihenuntersuchungscharakter am Krankenbett entwickelt, deren gemeinsames Prinzip besteht darin, daß die Bestimmungssera auf einem mit spezialen Impregn!ermitteln durchtränkten Papierträger getrocknet werden. Solche Sehnelidiagnostika sind z.B. das von Nordisk Insulinlaboratorium (Dänemark) in Verkehr gebrachte "ABO-D Kit" und "Eldoncard CDE", das von Biotest Diagnostics (Deutsche Bundesrepublik) in Verkehr1 gebrachte "Serafol" und das von Germed, Berlin (Deutsche Demokratische Republik) in Verkehr1 gebrachte "Bed-side ABO" Trockenreagenzien. Diese sind einfach und schnell anwendbar, ihr1 Nachteil ist aber, das sie nur zur einfachen Blutgruppenbestimmung geeignet sind.
Es wurde ein neues Schnelldiagnostikum entwickelt, dessen Verwendung einfach und zuverlässig ist
und verhältnismäßig dauernd aufbewahrt -werden kann·
Die "Erfindung betrifft also ein Schnelldiagnostikum für Blutgruppenbestimmung, das aus anti-A, anti-B, anti-AB und gegebenenfalls anti-D, anti-C und anti-E Reagenzien besteht? die in den auf oberflächenbehandelten Aluminiumplatten ausgestalteten Aushöhlungen fixiert sind· Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des obigen Schnelldiagnostikums, indem man anti-A, anti-B, aqti-AB und gegebenenfalls anti-D, anti-C und anti-E Reagenzien in die Aushöhlungen der oberflächenbehandelten Aluminiumplatte tropft und die Reagenzien an der Aluminiumplatte durch eine zweistufige Vakuumtrocknung fixiert« Als Trägermaterial des erfindungsgemäßen Schnelldiagnostikums wird eine Aluminiumplatte verwendet, deren Dicke zweckmäßig 0,25 bis 0,5 mm beträgt. Auf dieser Platte werden Aushöhlungen mit eine Durchmesser von 10 bis 30 mm und mit einer Tiefe von 0,3 bis 0,6 mm durch Pressung ausgebildet. Die Anzahl der auszubildenden Aushöhlungen hängt davon, wievielex'lei Reagenzien auf das Trägermaterial aufzutragen erwünscht ist; eine weitere Aushöhlung ist für die Prüfprobe notwendig. Die Trägerplatte, die gepreßt und auf die entsprechende Größe abgeschnitten wird, wird in einem Kaiiumhydroxid-
-Bad und danach mit einer ausgiebigen Spülung durch warmes und kaltes Wasser und dann durch Alkohol oberflächlich behandelt.
Zu dem erfindungsganäßen Schnelldiagnostikum werden anti-A, anti-B und an ti-AB' Reagenzien der Hauptblutgruppe, weiterhin gegebenenfalls anti-D, anti-C, anti-E usw. Reagenzien des Rh-Systems verwendet.
Die Reagenzien der Hauptblutgruppen werden hergestellt, indem man das Serum bzw. das von Fibrinogen befreite Plasma des Blutes A (anti-B), B (anti-A) und 0 (anti-AB), die eine günstige Avidität haben (das heißt eine binnen 2 bis 5 Sekunden beginnende und binnen 3 Minuten vierkreuzige Agglutination geben) unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen mischt, durch Wärmebehandlung inaktiviert, präserviert, adjuviert und zu steril filtriert.
Die Inaktivierung wird durch eine etwa 30 Minuten lang dauernde Wärmebehandlung auf 50 bis 60 C ausgeführt« Die warmbehandelten Reagenzien werden z«B. mit Natriumazid präserviert und ein Lyophilisierungshilfsmittel, z.B. Saccharose wird als Adjuviermittel in einer Menge von etwa 3 ί° zugegeben.
Die Reagenzien des Rh-Systems werden aus dem Serum bzw. Plasma von anti-D, anti-C, anti-E uaw. enthaltendem Blute ähnlicherweise wie die Reagenzien von den Hauptblutgruppen hergestellt, die Agglutination befördernde Adjuviermittel, z«Be Ficoll, Glycin und Methylcellulose werden aber auch den Reagenzien zugegeben.
Auf die vorbereiteten Platten werden Tropfen von 0,03 bis 0,05 Tnl der Reagenzien unter aseptischen Bedingungen aufgetragen. Zur Bestimmung durch. Enzymmethode wird neben die Reagenzien von dem Rh-System 0,03 bis 0,05 ml I^-ige, durch Cystin und Cystein aktivierte Papainlösung getropft und die Reagenzien werden durch eine zweistufige Vakuumtrocknung auf dem Trägermaterial eingetrocknet« Die Vakuumtrocknung wird in einer Lyophilisierungsapparat oder in einer Vakuumtrockenkammer ausgeführt· In der ersten Stufe arbeitet man unter einem Druck von 100 bis 300 Hgmm, bevorzugt unter einem Druck von 2Q0 Hgmm bei einer Temperatur von 15 bis 25 °C, bevorzugt bei 20 C; in der zweiten Stufe arbeitet man unter einem Druck von höchstens 0,5 Hgmm, bevorzugt unter einem Druck von 0,1 bis 0,05 Hgmm, bei einer Temperatur von 30 bis 50 C, bevorzugt bei kO C, Die ganze Zeitdauer der Trocknung beträgt etwa 3 bis 5 Stunden.
Bei Anwendung werden die Reagenzien in je einem Tropfen von Leitungswasser gelöst und d.ie zu prüfende Blutprobe wird in die bezeichnete Aushöhlung eingetropft. Die Bestimmung kann auch mit dem unmittelbar aus der Fingerspitze ausgenommenen Blut, ausgeronnenen Blut oder· aus einer gerinnungshenrnendes Mittel enthaltenden Blutprobe auageführt· Die zu prüfende Blutprobe wird mit einem geeigneten Gerät - zweckmäßig mittels Polystyrol-Stäbchen,
die mit dem Diagnostikum zusammen in einem Gepäck gelegt sind - mit den Reagenzien in Berührung gebracht. Fach einigen Kippen wird die Platte auf eine hox'izontale Oberfläche gelegt und nach 3 Minuten ausgewertet.
Das erfindungsgemäße Schnelldiagnostikum weist die Vorteile auf, daß das Trägermaterial ist eine oberflächenbehandelte Aluminiumplatte, wodurch irgendeine Imprägnierung, speziale Bedeckung und Isolierschicht überflüssig werden. Die ausgebildeten Aushöhlungen erleichtern sowohl die Auftragung1 der Reagenzien als auch die BlutgruppenbeStimmung. Die Reagenzien haften fest an der Oberfläche der Aluminiumplatte, bei der Anwendung können die Reagenzien mit Leitungswasser gelöst werden und das Lösen findet sofort statt. Auf der Aluminiumplatte ist die Reaktion außerordentlich gut wahrnehmbar. Das erfindungsgemäße Schnelldiagnostikum enthält auch anti-AB Reagenz, wodurch die Fehlermöglichkeiten sich vermindern und die Blutgruppenbestimmung mit Sicherheit ausgeführt werden kann· Falls man auf diese Weise arbeitet, so ist die Bestimmung mit einer unter Laboratoriumsbedingungen durchführten Bestimmung gleichwertig« Infolge der günstigen ¥ärmeüberti"agungsfähigkeit der Aluminiumplatte kann der Feuchtigkeitsgehalt der Reagenzien durch Vakuumtrocknung minimalisiert werden^ wodurch das Diagnostikum verhältnismäßig
lange Zo it (2 bin 5 JaI iro lang) ο htm Qual it ät sändcrung sogar bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden kann·
Die Herstellung der erf indungsgemäßen Schnelldiagnostikum wird an Hand des folgenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel
Die Herstellung der Reagenzien von der Hauptblutgruppen
Die Blutsera mit einem Titer von mindestens 1:64t anti-A oder' anti-B, bzw, von mindestens 1:32 anti-AB, die eine günstige Avidität haben (das heißt eine binnen 2 bis 5 Sekunden beginnende und binnen 3 Minuten vierkreuzige Agglutination geben), werden unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen gemischt, mit 0,1 fo Natriuinazid präserviert, 3 f> Saccharose werden zugegeben, dann werden sie durch eine bei 56 C 30 Minuten lang dauernde Wärmebehandlung inaktiviert, und dann durch ein klärendes und entkeimendes Filter filtriert.
Die Blutplasmen mit einem Titer von mindestens 1:128 anti-A oder anti-B, bzw. von mindestens 1:64t anti-AB, die eine günstige Avidität haben, werden unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen gemischt» mit 0,1 % Natriumazid präserviert, mittels CaIciumlävulinat oder Calciumchlorid-dihydrat von dem Fibrinogen befreit und dann auf die selbe Weise, wie die Sera behandelt»
Die Herstellung der Reagenzien_des Rh-Systems
Die Blutsera mit einem Titer von mindestens 1:128 anti-D oder anti-C oder· anti-E usw. werden durch. 0,1 fo Natriumazid präsorviert, unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen gemischt und bei 56 °C 60 Minuten lang inaktiviert. Die irregulären Agglutinine werden durch Absorption entfernt, 3 f° Saccharose, 2 fo Glycin sowie 0,3 bis 0,5 ^o Ficoll zur Beförderung der Agglutination und 0,01 bis 0,02 <fo Methylcellulose werden zugegeben und dann werden sie durch Filtrieren entkeimt«
Die Plasmen werden ähnlich mittels 0,1 fo Natriumazid präserviert, durch Calciumchlorid—dihydx'at oder Thrombin von dem Fibrinogen befreit und dann ebenso wie die Sera behandelt«
Die Avidität von einem Reagenz ist geeignet, indem die Reaktion nach einer Minute beginnt und nach 3 Minuten bis zum Maximum erhöht wird.
Zum Nachweis der inkompletten Hämagglutinine ist auch eine l^b-ige Papainlösung notwendig, die durch L-Cystin und L-Cystein-hydrochlorid aktiviert und mit einem Phosphatpuffer von I/15 Mol/Liter hergestellt wird und 0,0125 $> Methylcellulose enthält.
Die Vorbereitung des Treigermateriala
Im Falle der Verwendung von anti-A, anti-B, anti-AB und anti-D Reagenzien werden fünf Aushöhlungen
durch. Pressung auf einer Aluminiumplatte mit einer Dicke von 0,25 bis 0,5 mm ausgebildet. Die Tiefe dieser Aushöhlungen beträgt 0,3 bis 0,6 mm. Der Durchmesser von vier Aushöhlungen beträgt 15 mm, der der fünften ist größer, z.B. 30 mm. Die gepreßten und auf die geeignete Größe abgeschnittenen Platten werden 3 Minuten lang in einem 20/o-igen Kaliumhydroxid-Bad bei 90 C gehalten, dann ausgiebig mit warmem und kaltem Wasser und zuletzt mit Alkohol abgespült.
Die Herstellung des Diagnostikums
In drei von den kleineren Aushöhlungen der vorbereiteten, oberflächenbehandelten Platten werden der Reihe nach 0,03 ml anti-A, anti-B und anti-AB Reagenz getropft, die vierte, kleinere Aushöhlung bleibt für die Blutpx'obe leer. In die größere Aushöhlung werden 0,03 ml anti-D Reagenz und ein bischen ferner 0,05 ml aktive Papainlösung getropft. Das Reagenz von dem Rh-Systevn kann auch auf eine andere Platte aufgetragen werden.
Nun werden die Platten in eine Lyophilisierungsmaschine gelegt und die zweistufige Vakuumtrocknung wix'd begonnen. In der ersten Stufe werden ein niedriges Vakuum (etwa 200 Hgmra) und eine niedrige Temperatur' (20 c), in der zweiten Stufe ein höheres Vakuum (0,1 bis 0,05 Hgmm) und eine erhöhte Temperatur (^O 0C) verwendet« Durch diese Methode wird der Stoff ohne
Refrigeration bei einem verhältnismäßig niedi'igen Temperatur getrocknet, wodurch die Änderung der Eiweiß-Struktur, bzw. die begleitende Aktivitätsverminderung, die bei der Refrigeration auftreten, vermieden werden können«
Das so hergestellte Diagnostikum wird mit Polystyrol-Stabchen zusammen in Aluminiumfolie-Beutel gepackt und luftdicht abgeschlossen»

Claims (3)

  1. SCHNELLDIAGNOSTIKUM PUR BLÜTGRUPPENBESTIMMÜNG Patentansprüche
    : 1. Schnelldiagnostikurn für Blutgruppenbestimmung dadurch gekennzeichnet , daß es aus anti-A, anti-B, anti-AB und gegebenenfalls anti-D, anti-C und anti-E Reagenzien besteht, die in den auf einer oberflächenbehandelten Aluniiniumplatte ausgebildeten Aushöhlungen fixiert sind.
  2. 2. Verfahren zur· Herstellung eines Schnelldiag-
    nostikums für· Blutgruppenbestimmung dadurch gekennzeichnet, daß anti-A, an ti-B, anti-AB und gegebenenfalls anti-D, anti-C und anti-E Reagenzien in die Aushöhlungen einer oberflächenbehandelten Aluminiumplatte getropft werden und die Reagenzien an der Aluminiumplatte durch eine Vakuumtrocknung fixiert werden·
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet , daß man in der ersten Stufe der Vakuumtrocknung unter einem Druck von 100 bis 300 Hgmm und bei einer Temperatur von I5 bis 25 C, in der zweiten Stufe unter einem Druck von höchstens 0,5 Hgmm und bei einer Temperatur von 30 bis 50 C arbeitet.
    ^. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet , daß die Reagenzien aus den anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, anti-C oder anti-E enthaltenden Blutsera bzw. aus den von Fibrinogen befreiten Plasmen hergestellt werden, indem man die gemäß den Blutgruppen
    vorbereiteten Sera bzw, von Fibrinogen befreiten
    Plasmen präserviert, inaktiviert und nach, der Zugabe von Adjuviermitteln zu steril filtriert.
    5· Verfahren nach Anspruch k dadurch gekennzeichnet , daß Agglutination befördernde Mittel zu den Reagenzien van dem Rh-System gegeben werden.
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