AT390845B - Schnelldiagnostikum fuer die blutgruppenbestimmung - Google Patents
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Description
Nr. 390 845
Die Erfindung betrifft ein Schnelldiagnostikum für die Blutgruppenbestimmung und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die Blutgruppenbestimmung gehört zur Routinearbeit der Gesundheitsfürsorge, ist aber keine einfache Aufgabe, die durch strenge Vorschriften reguliert wird. Es gibt Umstände (Katastrophen-Situationen, Kriege usw.), wenn eine große Anzahl der Blutgruppenbestimmungen (sterile Ausrüstungen, Geräte, Maschinen usw.) nicht zur Verfügung stehen. In mehreren Ländern wurden Schnelldiagnostika für die schnelle Blutgruppenbestimmung vom Reihenuntersuchungscharakter am Krankenbett entwickelt, deren gemeinsames Prinzip besteht darin, daß die Bestimmungssera auf einem mit speziellen Imprägniermitteln durchtränkten Papierträger getrocknet werden. Solche Schnelldiagnostika sind z. B. das von Nordisk Insulinlaboratorium (Dänemark) in Verkehr gebrachte "ABO-D Kit" und "Eldoncard CDE", das von Biotest Diagnostics (Deutsche Bundesrepublik) in Verkehr gebrachte "Serafol" und das von Germed, Berlin (Deutsche Demokratische Republik) in Verkehr gebrachte "Bed-side ABO" Trockenreagenzien. Diese sind einfach und schnell anwendbar, ihr Nachteil ist aber, das sie nur zur einfachen Blutgruppenbestimmung geeignet sind.
Es wurde ein neues Schnelldiagnostikum entwickelt, dessen Verwendung einfach und zuverlässig ist und verhältnismäßig lange auf bewahrt werden kann.
Die Erfindung betrifft also ein Schnelldiagnostikum für Blutgruppenbestimmung, das aus anti-A, anti-B, anti-AB und gegebenenfalls anti-D, anti-C und anti-E Reagenzien besteht, die in den auf oberflächenbehandelten Aluminiumplatten ausgestalteten Aushöhlungen fixiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des obigen Schnelldiagnostikums, indem man anti-A, anti-B, anti-AB und gegebenenfalls anti-D, anti-C und anit-E Reagenzien in die Aushöhlungen der oberflächenbehandelten Aluminiumplatte tropft und die Reagenzien an der Aluminiumplatte durch eine zweistufige Vakuumtrocknung fixiert.
Als Trägermaterial des erfindungsgemäßen Schnelldiagnostikums wird eine Aliuminiumplatte verwendet, deren Dicke zweckmäßig 0,25 bis 0,5 mm beträgt. Auf dieser Platte werden Aushöhlungen mit einem Durchmesser von 10 - 30 mm und mit einer Tiefe von 0,3 bis 0,6 mm durch Pressung ausgebildet. Die Anzahl der auszubildenden Aushöhlungen hängt davon ab, wievielerlei Reagenzien auf das Trägermaterial aufzutragen erwünscht ist; eine weitere Aushöhlung ist für die Prüfprobe notwendig. Die Trägerplatte, die gepreßt und auf die entsprechende Größe abgeschnitten wird, wird in einem Kaliumhydroxid-Bad und danach mit einer ausgiebigen Spülung durch warmes und kaltes Wasser und dann durch Alkohol oberflächlich behandelt
Zu dem erfindungsgemäßen Schnelldiagnostikum werden anti-A, anti-B und anti-AB Reagenzien der Hauptblutgruppe, weiterhin gegebenenfalls anti-D, anti-C, anti-E usw. Reagenzien des Rh-Systems verwendet.
Die Reagenzien der Hauptblutgruppen werden hergestellt, indem man das Serum bzw. das von Fibrinogen befreite Plasma des Blutes A (anti-B), B (anti-A) und 0 (anti-AB), die eine günstige Avidität haben (das heißt eine binnen 2 bis 5 Sekunden beginnende und binnen 3 Minuten vierkreuzige Agglutination geben) unter aseptischen Bedinungen je nach den Blutgruppen mischt, durch Wärmebehandlung inaktiviert, präserviert, adjuviert und steril filtriert.
Die Inaktivierung wird durch eine etwa 30 Minuten lang dauernde Wärmebehandlung auf 50 bis 60 °C ausgeführt. Die warmbehandelten Reagenzien werden z. B. mit Natriumazid präserviert und ein Lyophilisierungshilfsmittel, z. B. Saccharose wird als Adjuviermittel in einer Menge von etwa 3 % zugegeben.
Die Reagenzien des Rh-Systems werden aus dem Serum bzw. Plasma von anti-D, anti-C, anti-E usw. enthaltendem Blute ähnlicherweise wie die Reagenzien von den Hauptblutgruppen hergestellt, die Agglutination fördernde Adjuviermittel, z. B. Ficoll, Clycin und Methylcellulose werden aber auch den Reagenzien zugegeben.
Auf die vorbereiteten Platten werden Tropfen von 0,03 bis 0,05 ml der Reagenzien unter aseptischen Bedingungen aufgetragen. Zur Bestimmung durch Enzymmethode wird neben die Reagenzien von dem Rh-System 0,03 bis 0,05 mil 1 %-ige, durch Cystin und Cystein aktivierte Papainlösung getropft und die Reagenzien werden durch eine zweistufige Vakuumtrocknung auf dem Trägermaterial eingetrocknet. Die Vakuumtrocknung wird in einem Lyophilisierungsapparat oder in einer Vakuumtrockenkammer ausgeführt. In der ersten Stufe arbeitet man unter einem Druck von 0,133 - 0,4 bar (100 bis 300 mmHg), bevorzugt unter einem Druck von 200 Hgmm bei einer Temperatur von 15 bis 25 °C, bevorzugt bei 20 °C; in der zweiten Stufe arbeitet man unter einem Druck von höchstens 0,67 mbar (0,5 mmHg), bevorzugt unter einem Druck von 0,133 mbar bis 0,067 mbar (0,1 bis 0,05 mmHg), bei einer Temperatur von 30 bis 50 °C, bevorzugt bei 40 °C. Die ganze Zeitdauer der Trocknung beträgt etwa 3 bis 5 Stunden.
Bei Anwendung werden die Reagenzien in je einem Tropfen von Leitungswasser gelöst und die zu prüfende Blutprobe wird in die bezeichnete Aushöhlung eingetropft. Die Bestimmung kann auch mit dem unmittelbar der Fingerspitze entnommenem Blut, ausgeronnenem Blut oder mit einer ein gerinnungshemmendes Mittel enthaltenden Blutprobe ausgeführt werden. Die zu prüfende Blutprobe wird mit einem geeigneten Gerät - zweckmäßig mittels Polystyrol-Stäbchen, die mit dem Diagnostikum zusammen in einer Packung enthalten sind - mit den Reagenzien in Berührung gebracht. Nach einigen Kippen wird die Platte auf eine horizontale Oberfläche gelegt und nach 3 Minuten ausgewertet.
Das erfindungsgemäße Schnelldiagnostikum weist die Vorteil auf, daß das Trägermaterial eine oberflächenbehandelte Aluminiumplatte ist, wodurch irgendeine Imprägnierung, spezielle Bedeckung und Isolierschicht überflüssig werden. Die ausgebildeten Aushöhlungen erleichtern sowohl die Auftragung der Reagenzien als auch die Blutgruppenbestimmung. Die Reagenzien haften fest an der Oberfläche der -2-
Nr. 390 845
Aluminiumplatte, bei der Anwendung können die Reagenzien mit Leitungswasser gelöst werden und das Lösen findet sofort statt. Auf der Aluminiumplatte ist die Reaktion außerordentlich gut wahrnehmbar. Das erfindungsgemäße Schnelldiagnostikum enthält auch anti-AB Reagenz, wodurch die Fehlermöglichkeiten sich vermindern und die Blutgruppenbestimmung mit Sicherheit ausgeführt werden kann. Falls man auf diese Weise arbeitet, so ist die Bestimmung mit einer unter Laboratoriumsbedingungen durchgeführten Bestimmung gleichwertig. Infolge der günstigen Wärmeübertragungsfähigkeit der Aluminiumplatte kann der Feuchtigkeitsgehalt der Reagenzien durch Vakuumtrocknung minimalisiert werden, wodurch das Diagnostikum verhältnismäßig lange Zeit (2 bis 5 Jahre lang) ohne Qualitätsänderung sogar bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden kann.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Schnelldiagnostika wird an Hand des folgenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel
Die Herstellung der Reagenzien von den Haunthlutgnipnen
Die Blutsera mit einem Titer von mindestens 1:64 anti-A oder anti-B, bzw. von mindestens 1:32 anti-AB, die eine günstige Avidität haben (das heißt eine binnen 2 bis 5 Sekunden beginnende und binnen 3 Minuten vieikreuzige Agglutination geben), werden unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen gemischt, mit 0,1 % Natriumazid präserviert, 3 % Saccharose werden zugegeben, dann werden sie durch eine bei 56 °C 30 Minuten lang dauernde Wärmebehandlung inaktiviert, und dann durch ein klärendes und entkeimendes Filter filtriert.
Die Blutplasmen mit einem Titer von mindestens 1:128 anti-A oder anti-B, bzw. von mindestens 1:64 anti-AB, die eine günstige Avidität haben, werden unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen gemischt, mit 0,1 % Natriumazid präserviert, mittels Calciumlävulinat oder Calciumchlorid-dihydrat von dem Fibrinogen befreit und dann auf die selbe Weise, wie die Sera behandelt.
Die Herstellung der Reagenzien des Rh-Svstems
Die Blutsera mit einem Titer von mindestens 1:128 anti-D oder anti-C oder anti-E usw. werden durch 0,1 % Natriumazid präserviert, unter aseptischen Bedingungen je nach den Blutgruppen gemischt und bei 56 °C 60 Minuten lang inaktiviert. Die irregulären Agglutinine werden durch Absorption entfernt, 3 % Saccharose, 2 % Glycin sowie 0,3 bis 0,5 % Ficoll zur Förderung der Agglutination und 0,01 bis 0,02 % Methylcellulose werden zugegeben und dann werden sie durch Filtrieren entkeimt
Die Plasmen werden ähnlich mittels 0,1 % Natriumazid präserviert, durch Calciumchlorid-dihydrat oder Thrombin von dem Fibrinogen befreit und dann ebenso wie die Sera behandelt
Die Avidität von einem Reagenz ist geeignet, indem die Reaktion nach einer Minute beginnt und nach 3 Minuten bis zum Maximum erhöht wird.
Zum Nachweis der inkompletten Hämagglutinine ist auch eine 1 %-ige Papainlösung notwendig, die durch L-Cystin und L-Cystein-hydrochlorid aktiviert und mit einem Phosphatpuffer von 1/15 Mol/Liter hergestellt wird und 0,0125 % Methylcellulose enthält.
Die Vorbereitung des Trägermaterials
Im Falle der Verwendung von anti-A, anti-B, anti-AB und anti-D Reagenzien werden fünf Aushöhlungen durch Pressung auf einer Aluminiumplatte mit einer Dicke von 0,25 bis 0,5 mm ausgebildet. Die Tiefe dieser Aushöhlungen beträgt 0,3 bis 0,6 mm. Der Durchmesser von vier Aushöhlungen beträgt 15 mm, der der fünften ist größer, z. B. 30 mm. Die gepreßten und auf die geeignete Größe abgeschnittenen Platten werden 3 Minuten lang in einem 20 %-igen Kaliumhydroxid-Bad bei 90 °C gehalten, dann ausgiebig mit warmem und kaltem Wasser und zuletzt mit Alkohol abgespült.
Die Herstellung des Diagnostikums
In drei von den kleineren Aushöhlungen der vorbereiteten, oberflächenbehandelten Platten werden der Reihe nach 0,03 ml anti-A, anti-B und anti-AB Reagenz getropft, die vierte, kleinere Aushölung bleibt für die Blutprobe leer. In die größere Aushöhlung werden 0,03 ml anti-D Reagenz und ein wenig entfernt 0,05 ml aktive Papainlösung getropft Das Reagenz von dem Rh-System kann auch auf eine andere Platte aufgetragen werden.
Nun werden die Platten in eine Lyophilisierungsmaschine gelegt und die zweistufige Vakuumtrocknung wird begonnen. In der ersten Stufe werden ein niedriges Vakuum (etwa 200 Hgmm) und eine niedrige Temperatur (20 °C), in der zweiten Stufe ein höheres Vakuum (0,1 bis 0,05 Hgmm) und eine erhöhte Temperatur (40 °C) verwendet. Durch diese Methode wird der Stoff ohne Gefrieren bei einer verhältnismäßig niedrigen Temperatur getrocknet, wodurch die Änderung der Eiweiß-Struktur, bzw. die begleitende Aktivitätsverminderung, die bei der Refrigeration auftreten, vermieden werden können.
Das so hergestellte Diagnostikum wird mit Polystyrol-Stäbchen zusammen in Aluminiumfolie-Beutel gepackt und luftdicht abgeschlossen. -3-
Claims (5)
- Nr. 390 845 PATENTANSPRÜCHE 1. Schnelldiagnostikum für die Blutgruppenbestimmung, dadurch gekennzeichnet, daß es aus anti-A, anti-B, anti-AB und gegebenfalls anti-D, anti-C und anti-E Reagenzien besteht, die in den auf einer oberflächenbehandelten Aluminiumplatte ausgebildeten Aushöhlungen fixiert sind.
- 2. Verfahren zur Herstellung des Schnelldiagnostikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß anti-A, anti-B, and-AB und gegebenenfalls anti-D, anit-C und anti-E Reagenzien in die Aushöhlungen einer oberflächenbehandelten Aluminiumplatte getropft werden und die Reagenzien an der Aluminiumplatte durch eine Vakuumtrocknung fixiert werden.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Stufe der Vakuumtrocknung unter einem Druck von 0,133 bis 0,4 bar (100 bis 300 mmHg) und bei einer Temperatur von 15 bis 25 °C, in der zweiten Stufe unter einem Druck von höchstens 0,67 mbar (0,5 mmHg) und bei einer Temperatur von 30 bis 50 °C arbeitet.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien aus den anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, anti-C oder anti-E enthaltenden Blutsera bzw. aus den von Fibrinogen befreiten Plasmen hergestellt werden, indem man die gemäß den Blutgruppen vorbereiteten Sera bzw. von Fibrinogen befreiten Plasmen präserviert, inaktiviert und nach der Zugabe von Adjuviermitteln steril filtriert
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Agglutination fördernde Mittel zu den Reagenzien von dem Rh-System gegeben werden. -4-
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