DE3516529C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Anlage zur turbidimetrischen Mes­ sung und Regelung von Mikroorganismen nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Zur Bestimmung der Zell- bzw. Individuendichte in Zell-, Bakterien-, Hefe- und Algenkulturen in wäßriger Kulturlösung sind mehrere photometrische, insbesondere turbidimetrische Verfahren verwendbar. Bei Laborkulturen von großem Volumen ist hierfür im allgemeinen die Entnahme einer Probe mit Über­ führung in ein Meßgefäß erforderlich.

Dies kann zu erheblichen Störungen führen, insbesondere dann, wenn die Kultur unter sterilen und/oder anaeroben Bedingungen gehalten werden muß. Die kontinuierliche Überleitung in han­ delsübliche Photometer mit Durchflußkuvetten wäre mit langen Wegen verbunden, und mit erheblichen Aufwuchsproblemen be­ haftet.

Sollen die Kulturen trotzdem in kontinuierlichem Betrieb bei konstanter Zell-/ Individuenzahl gehalten werden, ist dies möglich, indem permanent mit einer entsprechenden Menge der zuzugebenden Nährlösung verdünnt wird (sog. Chemostatbetrieb) . Hierfür ist es bisher erforderlich, die entsprechende Nährlösungsmenge aus den Wachstumskurven der Individuen und deren Nährstoffbedarf zu errechnen. Diese Nähr­ lösungsmenge wird dann kontinuierlich, z. B. mit Schlauch­ pumpen zugegeben. Der Förderstrom ist dabei konstant. Dadurch können bereits geringfügige Störungen im Pumpen- und/oder Thermostatisierungsbereich oder Veränderungen der Belichtung zu erheblichen Veränderungen der Individuenzahlen führen.

Dies macht eine ständige Kontrolle mit häufigen manuellen Korrekturen der Wachstumsfaktoren erforderlich.

Bei den bisherigen Meßverfahren wird ein mehr oder weniger durchmischter Teil des Gesamtvolumens in einer Momentmessung bestimmt. Zur Vermeidung von Fehlern, die z. B. aus lokalen Konzentrationsunterschieden herrühren können, sind i. d. R. Mehrfachmessungen und Parallelproben erforderlich.

In der DE-U1 85 16 344 ist eine optische Meßzelle zur Beobach­ tung und Aufzeichnung der Entwicklung von Kulturen beschrie­ ben. Dabei wird ein vom Medium durchströmter Meßkanal an sei­ nen Enden durch optische Elemente abgeschlossen und der Meß­ strahl wird entlang der Kanalachse von der Lichtquelle zum De­ tektor geführt.

Des weiteren ist aus der DE-AS 20 51 189 eine Vorrichtung zum Messen der optischen Dichte von Mikrokulturen beschrieben. Da­ bei sind optische Elemente in einer optischen Meßkammer inte­ griert. Die beiden Vorrichtungen können diese Fenster jedoch verschmutzen und die Messung verfälschen.

Die der Erfindung gestellte Aufgabe besteht darin, eine Anlage zu bieten, mit der eine kontinuierliche, automatische und von Veränderungen der Außenbedingungen unabhängige Steuerung von Chemostatkulturen und darüber hinaus auch eine empfindliche Meßung und Aufzeichnung, unab­ hängig von Veränderungen durch Mikroorganismenbewuchs, ermöglicht wird.

Die Lösung ist in den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruches 1 beschrieben.

Die übrigen Ansprüche geben vorteilhafte Weiterbildungen und Ausführungsformen der Erfindung wieder.

Es handelt sich somit bei der Erfindung um eine Anlage aus mehreren, örtlich getrennt arbeitenden Komponenten, die die permanente turbidimetrische Messung von Zell-, Bakterien-, Hefen- und Algenkulturen in wäßrigem Nährmedium bei voll­ kommen geschlossenem Kultursystem erlaubt. Sie gestattet neben der Ablesung der momentanen Kulturdichte auch die kontinuier­ liche Registrierung des Verlaufs der Wachstumskurven und die Überwachung aller für die Kultur notwendigen Betriebsabläufe mittels der Meßzelle. Die Messung erfolgt nicht als Moment­ messung, sondern in einer Durchflußzelle während eines wähl­ baren Zeitintervalls, wobei der ermittelte Meßwert über das Zeitintervall integriert wird. Lokale Konzentrations­ unterschiede in der Kulturlösung stören folglich nicht.

Die Regelfunktion wird zunächst dadurch erfüllt, daß die Anlage die Zudosierung wählbarer Mengen von Nährlösung in wählbarem Zeitabstand steuert. Durch wählbare Schwellwerte der Zell-/Individuendichte kann das System darüber hinaus nach jeder Messung eine gesteigerte Verdünnung der Kultur oder ein Aussetzen der Nährlösungsversorgung bewirken. Damit wird es möglich, eine Chemostatkultur allein nach ihrer momentan realen Dichte unabhängig von schwankenden Umgebungs­ bedingungen und ohne manuelle Eingriffe konstant zu halten.

Je nach Aufgabenstellung läßt sich die Häufigkeit der Meß­ zyklen in weitem Bereich variieren. Je häufiger die Messungen ausgelöst werden, um so größer ist die Auflösung der aufzu­ zeichnenden Wachstumskurven. Dadurch kann die Anlage neben der Regelung und Überwachung konstanter Chemostatkulturen auch andernorts Wachstumskurven z. B. von Algen mit höchster Ge­ nauigkeit und Präzision vollautomatisch aufzeichnen. Da das Meßsystem mit dem Kulturgefäß eine geschlossene Einheit bildet, alle vom Kulturmedium benetzten Geräteteile jedoch leicht von den elektrischen Einheiten zu trennen sind, ist eine Sterilisierung auch im Autoklaven problemlos. Darüber hinaus ist das System dadurch auch besonders für anaerobe Arbeiten geeignet.

Die Ausgestaltung der einzelnen Anlagenelemente erlaubt den Aufbau von Kulturanlagen mit kürzesten Wegen für den Transfer der Probenlösung zum Meßsystem.

Äußerst vorteilhaft ist auch die Anordnung von Meßsystem und zuführenden Nährlösungskanälen, die eine permanente Selbst­ reinigung aller mit der Kulturlösung benetzten Teile erzwingt, wodurch Aufwuchsprobleme ausgeschaltet werden.

Die Erfindung stellt ein kompaktes, kostengünstiges und ein­ fach zu handhabendes Anlagensystem dar, das neben den o. g. Eigenschaften die Möglichkeit bietet, eine Mikroorganismenkultur nach dem Animpfen ohne weitere Manipulationen bis zu einem vorwählbaren Dichtegrad anwachsen zu lassen und diesen Zustand weitgehend unabhängig von äußeren Schwankungen und Störungen über beliebig lange Zeit aufrechtzuerhalten, wobei alle Meß­ werte und Betriebsabläufe protokolliert werden können.

Darüber hinaus ist das Meßsystem auch für die ausschließliche Messung von Kulturen und anderen Flüssigkeiten ohne Regelaufgaben geeignet, wobei die Vorteile der Meßzellenanordnung ja gerade bei wiederholten Messungen über längere Zeiträume zum Tragen kommen, z. B. für die Aufzeichnung von Wachstumskurven. Dabei kann das Meßsystem mit beliebigen Gefäßen kombiniert werden. Voraussetzung ist lediglich die Bereitstellung eines Gases, mit dem ein ge­ ringfügiger Überdruck aufgebaut werden kann, nicht jedoch die kontinuierliche Zufuhr von Nährlösung. Auch ist es in der Lage, die Messungen für die Regelung konstanter, insbesondere steriler Kulturen durchzuführen zu können.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbei­ spiels mittels der Fig. 1 und 2 näher dargestellt.

Fig. 1 zeigt hierbei einen Schnitt durch eine Meßzelle und Fig. 2 eine Ansicht der technischen Anlage.

Die Durchflußmeßzelle 1 nach Fig. 1 besteht im wesentlichen aus einem langgestreckten Zylindergehäuse 27 mit einem koaxial geführten Kanal 28 und verdickten Stirnseiten 29, 29′. Die Kanalachse 30 bildet zugleich die optische Achse des Meßsystems.

An die Stirnseiten 29, 29′ werden mittels den beiden Armen eines C-förmig ausgebildeten Trägers 10 die Gehäuse 6, 6′ für den Detektor 8 bzw. die Lichtquelle 7, einschließlich dem Referenz-Empfangselement 9, gegen die Linsenhalter 5, 5′ angepreßt und in deren Aufnahmebohrungen zentriert. Die Öffnungen des Kanals 28 werden von Linsen 3 bzw. 3′ einschließlich deren Linsen­ haltern 5, 5′ verschlossen. Die Dichtungsringe 4, 4′ sind derart ausgebildet bzw. ausgerichtet, daß sie Zentralbereiche 31, 31′ der Sammellinsen 3, 3′ freilassen, durch die der Meß­ strahl 32 hindurch- bzw. eintritt.

Die Zu- und Ableitungen 2′, 2 für die Medien sind bezüglich der Kanalachse 30 im Winkel derart am Gehäuse 27 bzw. der Meßzelle 1 angeordnet, daß ihre Austrittsöffnungen 33, 33′ auf diese Zentralbereiche 31, 31′ ausgerichtet sind. Zusätzlich sind sie als Düsen ausgebildet, so daß ein gezielter Medium­ strahl auf die Linse 3′ gerichtet bzw. ein scharfer Strömungs­ wirbel an der Linse 3 erzeugbar ist. Diese Strömungen ver­ hindern den Bewuchs der Zentralbereiche 31, 31′, so daß von dieser Seite her keine Verfälschungen des Meßstrahls 32 ent­ stehen.

Die Strömungsgeschwindigkeit des Probemediums innerhalb der Meßzelle 1 kann durch Querschnittsverengung erhöht und durch die düsenartige Ausbildung der Zuflußkanäle 2, 2′ eine direkte Anströmung der optischen Fenster im Binnenraum der Zelle er­ zielt werden. Der gemessene Lichtwert wird über eine vorwähl­ bare Zeitdauer integriert, wobei die Probe während des gesamten Integrationsintervalls die Meßzelle 1 durchströmt. Die Häufig­ keit der Meßperiode ist in einem Zeitbereich zwischen 1 und 300 Minuten vorwählbar. Durch die Wahl des spektralen Bereichs der Lichtquelle 7 ist bei der Messung pflanzlicher Zellen eine Chlorophyll-abhängige oder -unabhängige Methode wählbar.

Die Fig. 2 zeigt die perspektive Ansicht der gesamten Anlage, wie sie mit den pneumatischen Elementen (hier ein Ausführungs­ beispiel mit elektrischen Magnetventilen) auf einer gemeinsamen Trägerkonsole 12 in der Nähe des Kulturgefäßes 15 montiert sein kann. Alle Einzelteile, das Befestigungselement 11 für die Meß­ zelle 1, die Trägerkonsole 12, das Ausgleichsgefäß 13, die Zuflußöffnung 14 des Kulturgefäßes 15, das Kulturgefäß 15 selbst, das Ausgleichsventil 16, das Eingangsventil 17 und das Ausgangsventil 18 sowie der Zuflußsammler 19, die Zuflußlei­ tung 20, die Ausgangsöffnung 21 des Kulturgefäßes 15, die Abflußleitung 22, die Bypassleitung 23, das Zuflußrohr 24, die Ausgleichsöffnung 25 und das Luftfilter 26 sind auf dem gleichen Träger 12 befestigt.

Die vollständig montierte Durchflußmeßzelle (1 bis 5) mit den auf ihr abnehmbar befestigten Meßelementen (6 bis 10) ist in dem Befestigungselement 11 lösbar mit der Trägerkonsole 12 verbunden. Das Düsenrohr 2 ist mit einem Ausgleichsgefäß 13 verbunden, das gegenüberliegende Düsenrohr 2′ mit der Zu­ flußöffnung 14 des Kulturgefäßes 15.

Weitere wesentliche Elemente sind die Ventile 16, 17 und 18, in diesem Ausführungsbeispiel als Magnetventile dargestellt. Das Eingangsventil 17 ist ein 3/2-Wege-Ventil. Bei normalem Kulturbetrieb wird der Zufluß von Gasen (z. B. Luft) und/oder Flüssigkeiten (z. B. Nährlösung) von einem Zuflußsammler (19) aufgenommen und vom Eingangsventil 17 über die Zuflußleitung 20 zum Ausgleichsgefäß 13 geleitet. Von dort aus passieren die zuströmenden Gase und Flüssigkeiten die Durchflußmeßzelle 1 und gelangen über das Düsenrohr 2′ in das Kulturgefäß 15. Über­ schüssige Gas- und Flüssigkeitsmengen werden bei normalem Be­ trieb über die Ausgangsöffnung des Kulturgefäßes 21 und das normalerweise offene Ausgangsventil 18 aus dem Kulturgefäß 15 zur Abflußleitung 22 geführt.

Für die Durchführung einer Meßphase werden die Ventilstellungen umgeschaltet:
Das Ausgangsventil 18 wird geschlossen und das Eingangsventil 17 führt den Gas- und/oder Flüssigkeitsstrom jetzt über die Bypassleitung 23 zum Kulturgefäß 15. Schon bei geringfügigem Zufuhr-Überdruck wird das Kulturmedium durch das in die Flüs­ sigkeit eintauchende Zuflußrohr 24 in die Durchflußzelle 1 zurückgedrückt. Dieser Vorgang wird unterstützt, indem das normalerweise geschlossene und mit der Ausgleichsöffnung 25 des Ausgleichsgefäßes 13 verbundene Ausgleichsventil 16 für eine bestimmte Zeit geöffnet wird. Das Kulturmedium kann die Durchflußmeßzelle 1 solange durchströmen und im Ausgleichs­ gefäß 13 aufsteigen, bis die integrierende Meßphase abgeschlos­ sen ist. Eine Kontaminierung der Leitung durch Luftkeime kann durch ein Luftfilter 26 unterbunden werden.

Abschließend werden alle Ventile wieder in die Ausgangsstel­ lung zurückgeschaltet. Das Kulturmedium aus dem Ausgleichs­ gefäß 13 wird wieder in das Kulturgefäß 15 zurückgeführt, wobei es erneut die Durchflußzelle 1 passiert. Durch die düsenförmige Ausbildung und den Anströmwinkel der Rohre 2, 2′ werden die Glaslinsen 3, 3′ der Durchflußmeßzelle 1 bei jedem Meßzyklus jeweils einmal in beiden Richtungen kräftig ange­ strömt und gespült.

Darüber hinaus wird im Falle der Zugabe von frischer Nährlösung diese stets über die Wände des Ausgleichsgefäßes 13 und durch die Durchflußmeßzelle 1 geleitet, so daß die Bildung von Ab­ lagerungen auch hierdurch wirkungsvoll unterbunden wird.

Die gesamte Einheit aus Meßzelle 1, Ausgleichsgefäß 13 und verbindenden Kanälen bestehen ausschließlich aus wasser-, lösungsmittel- und insoweit temperaturbeständigen Materialien, daß diese gesamte Einheit bei ca. 135°C autoklaviert werden kann. Ein nicht näher dargestelltes Meß- und Regelgerät nimmt die Ansteuerung von motorbetriebenen Hubkolbenpumpen (insbe­ sondere Motor-Dispensetten), Membran- oder Schlauchpumpen in der Art vor, daß ein vorwählbares Volumen in vorwählbaren Zeitabständen als Minimal-Nährlösungszugabe kontinuierlich erfolgt. Der ermittelte Meßwert bis zum Beginn der folgenden Integrationsphase wird auf einem Display angezeigt. Das Meß- und Regelgerät bewirkt bei Über- oder Unterschreiten eines vorwählbaren Schwellwertes eine Erhöhung oder Aussetzung der Nährlösungszugabe. Durch die Anschlußmöglichkeit eines Mehr­ kanalschreibers ist die kontinuierliche Aufzeichnung der Meß­ werte, sowie der Pumpen- und Ventilaktivität möglich. Die Regelung der Belichtung der Kultur kann durch das Meß- und Regelgerät ebenfalls vorgenommen werden.

Neben der in Fig. 2 dargestellten Anordnung der Anlage mit pneumatischen Elementen kann die Anlage auch in einen ge­ schlossenen Pumpenkreislauf eingegliedert werden, wobei die Pumpe bei jedem Meßzyklus oder kontinuierliche Kulturmedium der Meßzelle 1 zugeführt.

In diesem Fall führt die Ableitung direkt in das Kulturgefäß 15 zurück um den Kreislauf zu schließen.

Claims (6)

1. Anlage zur turbidimetrischen Messung und Regelung von Mikroorganismen wie Zell-, Bakterien-, Hefen- und/oder Al­ genkulturen in wäßrigem Medium unter Verwendung einer Meß­ zelle, die einen langgestreckten Kanal (28) aufweist, an dessen Stirnseiten (29, 29′) optische, den Kanal (28) ab­ schließende Elemente (3, 3′) angeordnet sind, durch die ein Meßstrahl (32) entlang der Achse (30) des Kanals (28) von einer Lichtquelle (7) zu einem Detektor (8) gerichtet wird, nach dem Prinzip einer Durchflußmeßzelle, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sowohl die Zuleitung (2′) als auch die Ablei­ tung (2) des Mediums in bzw. aus dem Kanal (28) im Winkel zur Achse (30) des Kanals (28) derart ausgerichtet sind, daß die Oberfläche (31, 31′) der optischen Elemente (3, 3′) kontinuierlich vom Medium umströmt ist.

2. Anlage nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (1) mit einem Ausgleichsbehälter (13) der über die Ableitung (2) mit der Meßzelle (1) verbunden ist, Schalt­ ventilen (16 bis 18) und/oder einem Kulturgefäß (15), das mit der Meßzelle (1) über die Zuleitung (2′) in Verbindung steht, an einer Trägerkonsole (12) befestigbar und somit gemeinsam autoklavierbar sind.

3. Anlage nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnungen (33, 33′) der Zu- und Ableitungen (2, 2′) zum Kanal (28) als Düsen ausgebildet sind.

4. Anlage nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die die Lichtquelle (7) bzw. den Detektor (8) aufnehmenden Gehäuse (6, 6′) auf einem gemeinsamen Träger (10) ange­ ordnet und in Ausnehmungen an den Stirnseiten (29, 29′) der Meßzelle (1) einrastbar sind.

5. Anlage nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (10) federelastisch ausgebildet ist.

6. Anlage nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (1) alternierend in bei­ den Richtungen durchströmbar ist.