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Biokulturverfahren und Vorrichtung zu seiner
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Ausübung" Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten biologischer
Zellen, insbesondere diploider Fibroplasten oder ähnlicher biologischer Gewebe.
Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Ausübung des Verfahrens. Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Züchten solcher Kulturen, deren Wachsen
an die Oberfläche fester Körper gebunden ist.
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Es ist bereits vorgeschlagen worden, diploide Fibroplasten an Grenzflächen
zu züchten, die aus Glaskugeln bestehen, und dabei den pH-Wert durch Austausch des
Mediums zu steuern.
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Abgesehen von dem allzu hohen Verbrauch an Nährflüssigkeit in diesem
Verfahren fehlt dem Vorschlag auch die Wiederholbarkeit,
weil dem
Fachmann wesentliche Parameter fehlen.
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Mit der Erfindung wird ein rationelles Verfahren zur Schaffung optimaler
Kulturbedingungen angegeben, dessen Wiederholbarkeit gewährleistet ist. Unter optimalen
Kulturbedingungen sind dabei vorzugsweise aber nicht ausschließlich günstige Wachstumsbedingungen
zu verstehen. Außer diesem Sonderfall des günstigen Wachstums können aber auch solche
Bedingungen als optimal angesehen werden, die je nach der gestellten Aufgabe die
Wachstumsgeschwindigkeit oder die Änderung des Wachstums vorgeben. Es sind auch
noch andere Bedingungen als optimal vorstellbar.
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Das erfundene Verfahren besteht aus einer Regelung auf optimale Kulturbedingungen
für biològische Kulturen durch sowohl Aufbereitung als auch Austausch des Kulturmediums,
beides in Abhängigkeit von seinem pH-Wert. Insbesondere entscheidet die Regelung
selbsttätig und abhängig vom pH-Wert darüber, die Aufbereitung des Mediums fortgesetzt
oder ob ein Teil des Mediums ausgetauscht werden soll. Durch dieses Verfahren,/das
auf viele verschiedene Kulturen angewendet werden kann und nicht an Gewebekulturen
auf festen Oberflächen gebunden ist, wird eine erhebliche Einsparung an Nährmedium
erzielt, denn die Regelung läßt sich so einstellen, daß ein Teilaustausch des Mediums
erst vorgenommen wird, wenn eine weitere Aufbereitung nicht mehr möglich ist. Die
Leitgröße bei der Regelung ist also der pH-Wert. Die Kultur wird optimal nach dem
pH-Wert und auf einen gewünschten pH-Wert geregelt. Somit kann erreicht werden,
daß das Kulturmedium in der Kultur denselben pH-Wert unabhängig von seiner Verweildauer
in der Kultur behält.
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Die Aufbereitung wird vorzugsweise durch eine vom pH-Wert abhängige
Begasung des Mediums mittels zweier unterschiedlicher
Gasgemische
vollzogen, und zwar mittels Gasgemischen, die den pH-Wert des Mediums gegensinnig
beeinflußt. Die Gemische sind vorzugsweise vorwählbar. Durch diese Begasung sind
in den Medien unbeschränkt flüchtige Puffer verwendbar.
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In dem weiter unten beschriebenen Sonderfall werden zwei CO2-Luft-Gemische
mit unterschiedlichem CO2-Gehalt als Begasungsgemische verwendet, wodurch unbeschränkt
bikarbonatgepufferte Medien benutzt werden können.
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Die Vorrichtung zur Ausübung des obigen Verfahrens und auch anderer
Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß alle Gefäßwandungen, die mit dem Nährmedium
in Berührung kommen, hydrolytisch inert und dampfsterilisierbar sind. Insbesondere
werden diese Stoffe beschränkt auf Borosilikatglas, Silikongummi bzw. -kautschuk,
Polytetrafluoräthylen, Butadien-Acrylnitril-Copolymerisate (nämlich das von den
Farbenfabriken Bayer in den Handel gebrachte Perbunan), Perfluorpropylen-Vinylidenfluorid-Mischpolmerisat
(im Handel unter der Bezeichnung 'Viton" von der Fa. Dupont) und '7Thermanox't (ein
Handelsname für ein Erzeugnis der Lux Scientific Corporation).
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Dabei wird das Borosilikat insbesondere für diejenigen Körper verwendet,
die durchsichtig sein sollen, jedoch auch für den Fall, daß die Kultur auf festen
Oberflächen eines Füllkörpers gezüchtet werden soll, für diese Füllkörper.
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Soweit die-Gasdurchlässigkeit nicht stört oder sogar gewünscht ist,
wie im Falle der Verwendung des Permeators, wird dafür Silikonkautschuk benutzt.
Die genannten synthetischen Nitrilkautschuktypen (Butadien-Acrylnitril-Copolimerisate)
dienen als Dichtkörper, insbesondere als Dichtringe. Bei Anwendung einer CO2-Begasung
werden diejenigen
Schläuche, die für dieses Gas undurchlässig sein
müssen, vorzugsweise aus Perfluorpropylen-Vinylidenfluorid-Mischpolimersat (Viton)
gefertigt.
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Für den Sonderfall, daß das Wachstum der zu züchtenden Zellen an feste
Oberflächen gebunden ist und daß der Füllkörper im Kulturgefäß aus Glasstücken besteht,
wird mit der Erfindung vorgeschlagen, nur Glas stücke mit glatter Oberfläche zu
verwenden, vorzugsweise also Borosilikatglas.
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Bevorzugt werden für den Füllkörper kleine Glasrohrabschnitte benutzt,
die an den Enden flammenpoliert oder feuerpoliert sind. Die günstigsten Bedingungen
erhält man, wenn man all diese Maßnahmen gleichzeitig abwendet, also flammenpolierte
Rohrabschnitte aus Borosilikatglas benutzt.
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Das den Gasaustausch bewirkende Gerät ist ein Gaspermeator, der aus
einem mit Einlaß und Auslaß für das Kulturmedium versehenen Borosilikatrohr besteht,
dessen Enden von vielfach durchbohrten Stopfen verschlossen sind, deren jede Bohrung
das Ende eines sich längs durch das Glasrohr erstreckenden Gasaustauschschlauches
abgedichtet aufnimmt. Die Schläuche bilden also insgesamt ein Schlauchbündel; von
den beiden Enden jedes Schlauches endet das eine in dem einen und das andere in
dem anderen Stopfen. Die Außenseite jedes Stopfens ist von einer Kammer begrenzt,
die die Anschlüsse an den Gaskreislauf enthalten. Die Werkstoffe, die im Gaspermeator
verwendet werden, sind der Kultur und dem Nährmedium anzupassen. Vorzugsweise wird
für das Glasrohr Borosilikatglas verwendet, für die Gasaustauschschläuche Silikonkautschuk
und für die Stopfen ebenfalls Silikonkautschuk. Da Silikonkautschuk besonders durchlässig
für CO2 ist, eignet er sich insbesondere für einen Austausch von CO2 in einem Gemisch,
das mehr oder weniger C02 enthält.
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Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Beschreibung eines Ausführungsbeispieles.
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In der Beschreibung ist auf die beigefügte Zeichnung Bezug genommen.
Die Zeichnung zeigt die Kreisläufe und die Einzelaggregate eines Gewebekulturgerätes.
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Das zu beschreibende Gerät dient der Ausübung eines Verfahrens zur
Züchtung von an Grenzflächen wachsenden Zellen.
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Eine Reihe von in Kultur wachsenden Zellen wachsen nur einschichtig
an Grenzflächen, insbesondere Flächen zwischen festen Stoffen, wozu auch Glas zu
rechnen ist, und einer für die Nahrungszufuhr erforderlichen Flüssigkeit, nämlich
einem sogenannten Nährmedium. Die Ausbeute an Zellen wird durch die Größe der verfügbaren
Oberfläche begrenzt. Der in der Zeichnung dargestellte Füllkörper 2, der von dem
Kulturgefäß 1 aufgenommen wird, besteht aus kurzen Rohr stücken aus Borosilikatglas,
die eine völlig glatte Oberfläche haben.
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Insbesondere sind auch die Kanten feuerpoliert und dadurch glatt.
Glaskörper dieser Form, Oberfläche und chemischen Struktur führen zu einer besonders
hohen Ausbeute an Zellen, da auoh die Innenflächen der Glas körper bewachsen werden.
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Das Kulturgefäß 1 ist von einem Außenmantel 4 umgeben, der mit dem
Kulturgefäß eine Doppelwand bildet, die einen Wassermantel 3 aufnimmt. Das Wasser
des Mantels 3 ist in engen Grenzen temperiert und in einem eigenen Kreislauf mit
der Pumpe 5 und einer Temperaturvorrichtung, insbesondere Heizvorrichtung 7 geführt
Das den Mantel 3 durchfließende Wasser durchfließt außerdem den Wassermantel 8 eines
pH-Elektrodengefäßes 9. In den letztgenannten Wassermantel 8 taucht ein einschraubbarer
Thermofühler 6 ein.
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Das Nährmedium des Kulturteiles ist in einem Sterilkreislauf geführt,
der außerdem Kulturgefäß eine Mediumpumpe 10, einen
Gaspermeator
11 und die pH-Meßvorrichtung 9 (letztere mit der pH-Elektrode 12) enthält. An diesen
Sterilkreislauf ist über eine einzige Austauschpumpe 13, 14 eine Vorratsflasche
15 für frisches Kulturmedium und eine sterile Flasche 16 für verbrauchtes Medium
angeschlossen Die von temperiertem Wasser umströmten Gefäße 1 und auch 9 bestehen
aus Borosilikatglas. Ihre Mantel Li und 17 sind beide aus Glas.
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Das Kulturgefäß 1 einschließlich des gesamten Sterilkreislaufes kann
leicht aus einer entsprechenden Halterung genommen und in toto dampfsterilisiert
werden.
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Der Füllkörper 2 mit der Kultur wird vom Kulturmedium perfundiert.
Als Mediumpumpe zur Perfusion dient eine stoßfrei und kontinuierlich arbeitende,
magnetgekuppelte Kreiselpumpe. Die Stbßfreiheit ist wegen der schwachen Haftung
der ellen an den Glaskörper wichtig. Die Pumpe wiederum besteht aus Antrieb und
Pumpenkopf. Der leicht abnehmbare, stopfbuchsenlose Pumpenkopf ist aus Glas und
Teflon gefertigt und arbeitet verschleißfrei und lecksicher. Im einzelnen besteht
er aus einem Gehäuse aus Borosilikat entsprechender Form, in dem das Pumpenrad rotiert.
Letzteres enthält einen Magneten, der in Drehrichtung durch ein von außen durch
die Glasgehäusewand hindurchgreifendes Magnetfeld mitgenommen undlgedreht wird.
Das drehende Magnet- und Mitnahmefeld kann durch einen Permanent- oder Elektromagneten
gebildet sein, der von einem Elektromotor gedreht wird. Das Pumpenrad ist insgesamt
oder wenigstens auf der von dem Magneten angezogenen Seite, mit der es auf der Gehäusewand
gleitet, mit einer Schicht aus Polytetrafluoräthylen überzogen. Vorzugsweise ist
auch die Gehäuseinnenwand auf der Lagerfläche mit GTFE überzogen, so daß zwei PTFE-Flächen
verschleißfrei und praktisch reibungsfrei aufeinandergleiten.
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Das Medium wird im Sterilkreislauf durch den Permeator 11 hindurch
und an der pH-Elektrode 12 vorbei in das Gefäß 1 zurückgepumpt. Der Permeator 11
besteht aus einem Borosilikatglas, in dem kapillare Silikongummischläuche so untergebracht
sind, daß sie an den Enden des Glasrohres dicht abschließen. Die Außenwand der Kapillaren
ist gegen das Lumen des inneren Glasrohres fest verschlossen. Das innere Lumen der
Silikongummischläuche ist von den Stirnenden her frei zugänglich. Die Kapillaren
sind gegeneinander und gegen das Glasrohr an den Rohrenden mit Silikonkautschuk
vergossen und demnach abgedichtet. Der Raum zwischen der Glasrohrinnenwand und den
Außenwänden der Silikonkapillaren ist durch Zu- und Ablaufstutzen mit dem Sterilkreislauf
verbunden. Da der Permeator ausschließlich aus Borosilikatglas und Silikonkautschuk
besteht, kann er in heißem Dampf sterilisiert werden. Das Glasrohr des Permeators
hat an seinen Enden Außengewinde, auf die Kappen aufgeschraubt sind, die die Stirnkammern
für die Zu- und Abfuhr des Gases erlauben. Der Permeator enthält somit im wesentlichen
zwei Räume, nämlich die Lumina der Silikonkapillaren, die von einem Gas durchströmt
werden, und den Raum zwischen den Außenwänden der Kapillaren und der Glasrohrinnenwand,
der vom Kulturmedium durchströmt wird. Die Gasdurchlässigkeit des Silikongummis,
die insbesondere für Kohlendioxyd groß ist, gestattet eine schaumfreie Begasung
des Kulturmediums. Da Silikongummi für größere Moleküle und insbesondere Keime undurchlässig
ist, bleibt der Sterilkreislauf trotz der Begasung steril gegen die Außenwelt abgeschlossen.
Der beschriebere Permeator gestattet die Verwendung flüchtiger Puffersubstanzen
in Perfusionskulturen.
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Die Pumpe 10, der Permeator 11 und das pH-Elektrodengefäß 9 sind von
einem Nebenkreislauf 19 überbrückt, der ein
Drosselventil 18 enthält.
Diese Anordnung erlaubt es, die Strömung im Haupt zweig 20 des Sterilkreislaufes
weitgehend von der im Aufbereitungskreislauf 11, 9 zu entkoppeln.
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Dazu wird das Kulturmedium aus dem Gefäß 1 hinter der Drossel angesogen
und in den Hauptkreislauf 20 aus dem Nebenkreislauf 19 vor der Drossel 18 abgegeben.
Die Drossel 18 wird so eingestellt, daß die eben notwendige Durchflußgeschwindigkeit
im Hauptkreislauf durch die Druckdifferenz am Drosselventil 18 erreicht wird. Damit
wird eine schnelle Zirkulation des Mediums im Nebenkreislauf durch den Gaspermeator
11 über die pH-Elektrode 9, das Drosselventil 18 und die Pumpe 10 zurück zum Permeator
11 erreicht. Dies führt zu einer kurzen Ansprechzeit der Elektrode 9 und einem schnellen
Nachregulieren der Begasung im Permeator 11. Der Nebenkreislauf 19 bildet also einen
Regelkreis, der nicht voll an den Hauptregelkreis 20 angekoppelt ist, aber den Vorteil
einer kurzen Totzeit hat. Das im Nebenkreislauf 18, 19, 11, 9 enthaltene Medium
wird in kurzer Zeit auf die gewünschten Werte aufbereitet, so daß es jederzeit für
die Abgabe in den mit geringerer Geschwindigkeit durchströmten Hauptkreis lauf 20
bereitsteht und eingegeben wird.
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Auch die pH-Elektrode ist dampfsterilisierbar.
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Der Austausch des Kulturmediums erfolgt durch die im Austauschkreislauf
21 liegendeperistatische Schlauchpumpe 13, 14, die gegenläufig gelagerte, gleich
dimensionierte Schlauchsysteme hat. Dadurch wird die Menge des Kulturmediums im
Kulturgefäß auch über lange Zeiträume konstant gehalten, denn die im Kreislauf durch
das Schlauchsystem 13 entzogene Flüssigkeitsmenge ist gleich der durch Schlauchsystem
14 aus dem Vorratsgefäß 15 zugeführten Menge.
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Der Hauptkreislauf enthält außer den genannten Elementen noch ein
Rückschlagventil 22 und einen Durchflußmengenmesser 23.
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In dem nicht dargestellten Steuerteil des Gerätes sind pH-Meter, sämtliche
Schaltelemente, die Steuerung für Gaszusammensetzung und Mediumaustausch, Druckreduzierventile
und Durchflußregelventile für die Gasdosierung enthalten, ferner Umlaufthermostate
und Anschlüsse für den Kulturteil.
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Die pH-Wertmessung im Steuerteil geschieht durch ein Präzisions-pH-Meter
mit einem Gesamtbereich von pH = 2 bis pH =12, wobei die Meßspanne dpH umschaltbar
ist auf die Bereiche 1, 2, 5 und 10. Ferner ist die Nullpunktverschiebung in allen
Bereichen frei wählbar und reproduzierbar. Dies geschieht im einzelnen dadurch,
daß die Eichschaltung von der Anzeige- und Bereichsumschalteinrichtung getrennt
sind und daß die der jeweils verwendeten Elektrode anzupassende Eichschaltung der
Umschalt-und Anzeigevorrichtung stets vergleichbare elektrische Werte, nämlich vorzugsweise
Spannungen, darbietet. Damit kann ohne Nacheichung der pH-Meßelektrode die Empfindlichkeit
und die Lage des Nullpunktes der Anzeige frei eingestellt werden. Weiterhin hat
das pH-Meßgerät eine reproduzierbare Einstellung für die Asymmetrie und die Steilheit
der pH-Meßelektrode. Die pH-MeRwerte werden durch einen Schreiber fortlaufend aufgezeichnet.
Aus dem so gewonnenen Kurvenverlauf lassen sich Rückschlüsse auf den Wachstums zustand
der Kultur ziehen.
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Der pH-Wert wird mittels zweier parallel geschalteter Zweipunktregler
geregelt, deren Schaltpunkte sich verschiedenen Funktionen des Steuergerätes frei
zuordnen
lassen, beispielsweise der Begasung und dem Mediumaustausch.
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In dem Gasmisch- und Dosierteil, der ebenfalls nicht dargestellt ist,
können zwei verschiedene Gasmischungen, die aus zwei verschiedenen Gasen erzeugt
werden, unabhängig voneinander eingestellt werden. Das Mischungsverhältnis und die
Durchflußrate sind unabhängig vom Strömungswiderstand auf der Verbraucherseite,
in diesem Fall dem Gaspermeator Die Stabilisierung des pH-Wertes des Mediums geschieht
alternativ durch selbsttätige Wahl zwischen Änderung der Begasung oder partiellem
Mediumaustausch. Damit wird der pH-Wert des Mediums optimal stabilisiert; das Medium
behält in der Kultur stets seinen pH-Wert unabhängig von seiner Verweildauer. Durch
Begasung mit zwei unterschiedlichen, den pH-Wert der Kultur in gegenläufiger Weise
beeinflussenden C02-Luftgemischen, deren Durchflußrate und Dosiertakt getrennt einstellbar
sind, kann jeder beliebige, im Pufferbereich des Mediums liegende pH-Wert bis zu
einem Grenzwert konstant gehalten werden. Dieser Wert wird erreicht bei Begasung
mit nur einem der beiden Gasgemische, z.B. bei Erschöpfung des Mediums, wie sie
durch Anhäufung nicht flüchtiger Metabolyte in Zellkulturen auftritt. Damit ist
ein Grenzwert der C02-Konzentration, bei der noch ein optimales Wachstum erreicht
werden kann, durch Einstellen einer Mindestkonzentration des C02 in einer Gaskomponente
vorwählbar.
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Die meisten in Kultur wachsenden Zellen können C02 produzieren.
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Für andere Zellen sind entsprechend andere Gemische anzuwenden.
Bei
Zellen, die CO2 produzieren, führt das von ihnen produzierte C02 bei der Verwendung
nicht flüchtiger Puffersubstanzen zu einer Erschöpfung der Pufferkapazität, da das
C02 fest gebunden wird. Die vorliegende Anordnung erlaubt ein 'tAbrauchen" des C02
in einer dem Vorgang in einer Lunge ähnlichen Weise. Bei ber- oder Unterschreiten
des für die Kultur erforderlichen pH-Wertes wird ein vom pH-Wert abhängiger Austausch
des Mediums vorgenommen, und zwar erst nach Ausnutzung der pH-Regelung durch Änderung
der Begasung. Die Regelung sowohl der Begasung als auch des Austausches wird von
ein und demselben Steuergerät selbsttätig ausgeführt. Durch Einstellung der Gasgemische
kann die Ausnutzung des Kulturmediums vorgewählt werden.
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Die Ausnutzung des Mediums ist dann von der Pufferkapazität des Mediums
und den Begasungsparametern abhängig. Das Gerät hält also bei konstantem pH-Wert
die optimalen Wachstumsbedingungen ständig aufrecht. Nach einmaliger und erstmaliger
Einstellung des Gerätes ist während des Kultivierens lediglich das Auswechseln der
Vorratsflaschen für frisches Medium bzw. der AuRnahmoSlaschen für verbrauchtes Medium
erforderlich. Der Zeitpunkt, zu dem die Zellen über die gesamte verfügbare Fläche
ausgewachsen sind, wird an der konstanten Abtauschfrequenz bzw. an einem leichten
Rückgang der Frequenz erkannt.
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Das Gerät dient der automatisch gesteuerten, optimal geregelten Massenzellkultur
von an Grenzflächen wachsenden Zellen. Es ist auch alleine zur Steuerung aller biologischer
Prozesse einsetzbar, die durch Begasung oder alternativ durch Änderung der Zusammensetzung
durch Substanzzugabe oder -abgabe konstant gehalten werden sollen.
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Den Dreipunktreglern werden drei pH-Werte als Auslöseschwellen vorgegeben
und als Ausgangssignale der pH-Elektrode zugeführt. Zwischen dem mittleren und dem
oberen pH-Wert (Alkali-Bereich) sorgt die Regelung für die Zufuhr eines Gasgemisches,
dessen C02-Partialdruck über dem CO2-Partialdruck des Mediums liegt. Dadurch dringt
C°2 durch die Silikonschläuche des Permeators vom CO2-Luftgemisch in das Medium
ein. Bei Unterschreitung des mittleren Bezugspunktes der drei Schwellwerte, der
durch die kombinierte Einwirkung der C02-Zufuhr durch den Permeator und durch C02-Produktion
durch die Zellen erreicht wird, wird das andere Gasgemisch zugeführt, dessen CO
2-Partialdruck unter dem des Mediums liegt. Dies führt zu einem C02-En zug aus dem
Medium, so daß sich der pH-Wert des Mediums wieder dem Soll-Wert nähert. Wenn die
Eigenproduktion an C02 auf diese Weise nicht mehr kompensiert werden kann, also
den Wert des unteren Grenzwertes unterschreitet, wird ein Teil des Mediums ausgetauscht.
Die Regelung der Aufbereitung folgt dann dem durch den Austausch herbeigeführten
neuen pH-Wert.
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Im Zweifel sind alle hier beschriebenen und/oder dargestellten Merkmale
für sich oder in beliebiger sinnvoller Kombination erfindungswesentlich. Schutz
wird begehrt für das, was objektiv schutzfähig ist.
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L e e r s e i t e