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Verfahren zur Gewinnung von Toxinen, die
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nach Verbrennungen und bzw. oder Strahleneinwirkungen bzw. nach chemischen
Noxen entstehen.
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Beschreibung: Das Verfahren dient zur Gewinnung von Toxinen, wie sie
nach Schädigungen von Gesamtorganismen in vivo durch ionisierende Strahlen, Verbrennungen
und chemische Noxen entstehen. Die Gewinnung solcher Toxine aus Gesamtsorganismen
stößt auf Schwierigkeiten, insbesondere wenn es sich um humane Faktoren handelt.
Es wurde gefunden, daß solche Toxine auch in vitro durch entsprechende Schädigung
von explantierten Zelitn und Geweben, die insbesondere in Kultur gezüchtet werden,
wie auch von Blut- oder Körperflüssigkeiten gewonnen werden können. Dadurch wird
es möglich, auch humane Ausgangsstoffe zu verwenden und unterteilte Proben von einem
gleichen Spender unterschiedlichen Dosierungen-der Noxe bzw. verschiedenartigen
Schädigungen zum Beispiel Bestrahlung, Hitzeeinwirkung oder chemische Stoffe, zum
Beispiel Kampfstoffe, auszusetzen. Die weitere Verarbeitung kann dann ge-' trennt,
oder aber in Mischung erfolgen.
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Von. der Dosis bzw. der Intensität und zeitlichen Einwirkung einer
Schädigung hängt Art und Menge der entstehenden Toxine ab, Diese können in gesunden
Organismen zur prophylaktischen Immunisierung gegen eine etwaige später einwirkende
entsprechende Schädigung verwendet werden.(Vergl.
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K.TH£URER: Immunbiologische Prophylaxe und Therapie des akuten Strahlensyndroms:
Atompraxis A 9, S.327-330,1958).
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Es ist zweckmäßig, dazu ein möglichst weites Spektrum von Toxinen
anzuwenden. Die Wirkung besteht in der Neutralisation und Inaktivierung von biologisch
aktiven Toxinen, die nach der Einwirkung entsprechender Schädigungen entstehen .analog
der Wirkung einer Toxin-Antitoxin-Bindung auf Grund einer aktiven Immunisierung,
wie zum Beispiel beim Diphtherie-Toxin.(Vergl.: H. SCHMIDT: Fortschritte der Serologie;
E.Steinkopf+Verlag-Darmstadt; STEWART SELL: Immunologie, Immunpathologie und Immunität:
Verlag Chemie Weinheim.NewYork. -1977).
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Als Toxine wirken denatürierte und heterozyklisch veränderte körpereigene
Moleküle, insbesondere aus Proteinen, Nukleinsäuren, Polysacchariden und Lipiden
und deren Kombinationen, sowie neue Kombinationen von molekularen Fragmenten, die
durch die Noxen entstehen. Der Grad der Schädigung ist sowohl für die Qualität als
auch für die Quantität maßgeblich. Eine genaue Begrenzung ist deshalb nicht möglich.
Sie kann von einer geringgradigen Noxe, die das Weiterleben der Zellen und Gewebe
zuläßt bis zum Zelltod reichen, der innerhalb einer gewissen Zeitspanne von einigen
Tagen eintritt Eine vollständige Zerstörung der Gewebe und molekularen Bestandteile
ist jedoch nicht beabsichtigt. Bei überlebenden Zellen und Gewebekuituren kann das
Kulturmedium zur Gewinnung der Toxine verwendet werden, s können aber auch die Zellen
und Gewebe homogenisiert und Homogenate nach bekannten Trennungsverfahren aufgearbeitet
werden. Die Entnahme der Zellen und Gewebe und ihre Züchtung erfolgt nach bekannten
Methoden. (Vergl.
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D. MAUERSBERGER : Aktuefle Probleme der Zellzüchtung: Gustav Fischer-Verlag,
Stuttgart 1971).
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Blutzellen können als Sediment,das in physiologischen Lösungen aufgenommen
ist, als Vollblut oder als Hämolysat der Noxe ausgesetzt werden.
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Zellfreie Körperflüssigkeiten wie Blutserum-Plasma, Exsudate oder
Transsudate, Liquor können direkt oder auch Bestandteile aus ihnen;der jeweiligen
Noxe ausgesetzt werden. Bei Vorhandnsein von Blutgruppen-Antigenen muß die jeweilige
Blutgruppe dem späteren Empfänger entsprechen oder Blutgruppe O als Ausgangsmaterial
verwendet werden.
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Auch Histokompatibilitats-Antigene von Zellen und Geweben spielen
deshalb eine entsprechende Rolle Oberkreuz- Immunisierungen durch Iso-Antig-ene
müssen vermieden werden. Bei Vorhandensein von Iso-Antigenen würde der Empfänger
gegen seine eigenen Körperbestandteile sensibilisiert werden Dies könnte sich pathogen
in Form einet Iso- Szw. Autosensibilisierung auswirken und den Impfschutz gegen
die Toxine beeinträchtigen. Die im Empgängerorganismus bestehende Immuntoleranz
gegen körpereigene Bestandteile darf nicht durchbrochen werden. Die Toxine werden
hingegen als körperfremd empfunden und wirken immunogen.
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Die Beseitigung von Iso-Antigenen kann bei löslichem Ausgangsmaterial;wie
auch nach der Einwirkung der Noxe durch immunologische Methoden der Affinitätschromatographie
an Antikörpern erflgn,die fr,e gen die Iso-Antigene gerichtet sind. Bei einer entsprechenden
Behandlung der Toxine lassen sich dadurch auch LTberkreflz'eaktionen mit nativen
Körperbestandteilen vermeiden. Bei Verwendung von Ausgangsstoffen vor der Einwirkung
von Noxen.
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die immunologisch histo- bzw. molekularkompatibel sind1 können die
Rohprodukte ohne weitere IsolierUng der Toxine als Impfvaccine verwendet werden.
Diese lassen sich aber auch durch bekannte Methoden anreichern, isolieren und insbesondere
nach den Verfahren der DPA 3437357.3 und DPA 3438777.3 weiterverarbeiten.
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Als AUsgangsprodukte eignen sich foetale Gewebe und -Flüssigkeiten
besonders allogenen Ursprungs, weil in diesen noch weniger immunologisch inkompatible
Faktoren enthalten sind, als in adulten Geweben. Ideal wäre die Verwendung von autologen
Geweben und Körperflüssigkeiten.In allogenen Geweben können jedoch während der Züchtung
in Kulturen die inkompatiblen Faktoren verringert werden. Auch ist es möglich beimimpfänger
gegen die immunhisto- und molekularinkompatiblen Faktoren durch entsprechende Vorbehandlung
vor der eigentlichen Vaccination mit den Toxinen eine Toleranz gegen inkompatible
Faktoren des späteren -Impfstoffes zu erzeugen.(Vergl.
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DPA 82100130.2) Es müssen dazu die Präparationen aus nicht geschädigten
Geweben und Körperflüsssigkeiten zur Verfügung stehen. Die Toleranz gegen die inkompatiblen
Faktoren sollte als Lowzone-Toleranz induziert werden. Ideal für die Gewinnung von
Toxinen sind Gewebe und Körperflüssigkeiten autologen Ursprungs , auch aus isogenen
Organismen, Diese sind weitgehend immunologisch kompatibel. Bei Verwendung von xenogenen
Geweben und Körperflüssigkeit müssen jedoch die immunologisch inkompatiblen Faktoren
durch Absättigung an entsprechenden Antikörpern aus der Toxinpräparatin beseitigt
werden. Auch kann die Verträglichkeit durch eine Vorbehandlung des Empfängers mit
diesen Faktoren vor der eigentlichen Vaccination mit den Toxinen gewährleistet werden.
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Die Schädigung der Gewebe oder Körperflüssigkeiten durch ionisierende
Strahlen kann mit verschiedenen Strahlenqualitäten, so zum Beispiel durch Alpha,
Beta-oder Gamma-, wie auch durch Neutronenstrahlen aus unterschiedlichen Strahlenquellen
erfolgen. Auch ist eine Kombination verschiedener Strahlenarten möglich.
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Die Schädigung durch Hitze kann durch direkte Erwärmungtwie auch durch
Wärmestrahlung mit unterschiedlichen Wellenlängen erfolgen, ;iie darf nicht zur
Verkohlung der Gewebe führen.
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Die Schädigung durch chemische Einwirkungen erfolgt durch Zusatz der
chemischen Substanzen zu den biologischen Geweben und Körperflüssigkeiten; insbesondere
werden dazu die gängigen chemischen Kampfstoffe (Gelbkreuz, Grünkreuz, Blaukreuz)
verwendet, -ann aber auch Industriegifte, denen Arbeiter ausgesetzt sein können.
Die verwendeten chemischen Substanzen können gegebenenfalls nach einer gewissen
Einwirkungszeit vom Reaktionsprodukt abgetrennt werden. Die Dosisfindung erfolgt
durch Vorversuche zwischen einer LD 10 bis L1) 100 in einer zeitlichen Begrenzung;
gegenüber Kontrollen.
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Der Nachweis der Wirksamkeit der Toxine, die nach Schädigungen in
biologischen Geweben entstehe, erfolgt durch ioassay in lebenden Individuen und
bzw. oder iii vitro an Zellkulturen.
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Beispiel 1: Es sollen Toxine durch Bestrahlung mit Gamma-Strahlen
gewonnen werden, es wird dazu allogenes menschlicnes ßiut der i3lutgruppe 0 oder
der Blutgruppe entsprechend dem späteren Empfänger der Präparationen gegebenenfalls
von verschiedenen Individuen gepoolt oder autologes Blut auf vier verschiedene Proben
unterteilt. Diese werden mit 1etalon Strahlendosen von einer Kobalt zum Beispiel
800 , 1000 r 1200 r und 1500 !' kurzzeitbostrnhlt; B
danach werden
die Proben in verschiedenen Zeitabständen von 30 Minuten bis zu 5 Tagen homogenisiert,
bzw. hämolysiert. , kann auch bis zur spontanen Hämolyse abgewartet werden Ein Zusatz
von Konservier?ungsmitteln, zum Beispiel von Kresol, Phenol oder Quecksilbersalzen
ist möglich. Danach werden die Proben zusammengemischt und daraus die entstehenden
Toxine isoliert, oder bei vorhandener immunologischer Kompatibilität mit dem Empfängerorganismus
das Homogenisat unmittelbar zur prophylaktischen Vaccination verwendet. Entsprechend
können auch andere SWrahlenqualitäten, wie zum Beispiel Alpha, Gamma,Beta-oder Neutronenstrahlen
zur Erzeugung der Toxine verwendet werden.
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Beispiel 2: Es sollen Toxine aus in Kultur gezüchteten menschlichen
Fibroblasten gewonnen werden, t werden die in Zellrasen in Monolayer-Kulturen wachsenden
Zellverbände entsprechend Beispiel 1 bestrahlt. Auch hier können die Proben unterteilt
werden. Bis zum Absterben der Zclln wird das Nährmedium wiederholt durch neues ersetzt
und auf Toxine aufgearbeitet. Es können auch die Zellrasen vor oder nach der Strahlenschädigung
enzymatisch von der Unterlage abgelöst, mit physiologischer Lösung gewaschen oder
anch ungewasc-hen homogenisiert werden.
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Aus dem Homogenisat oder auch aus dem medium können affinitätschromatographisch
an Träger g«-bundenen Antikörpern lie gegen histo- bzw. molekulare Kompatibilitätsantigene
des Spenders gerichtet sind, die unerwünschten inkompatiblen Bestandteile entfernt
werden.
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Beispiel 3: Fs werden Toxine nach Bestrahlung aus explantiertën aber
lebenskulturen von Organgewehen, zum 13cispie1 aus Skelettmuskulatur, atu r , Leber,
Drüsenorganen oder Gehirngeweben entsprechend den beiden Methoden des Beispiels
2 aus dem Nährmedium oder als l-iomogenisat gewonnen.
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Beispiel 4: Es sollen Toxine nach Erhitzen von biologischen Geweben
oc£er ,lüssigkeiten gewonnen werden,.r(.nstatt der Bestrahlung werden die Proben
gegebenfalls unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt, die über der tolerierten
Temperaturgrenze von etwa 52"C liegen und andererseits nicht zu einer Verbrennung
oder Verkohlung führen. Die Schädigung kann durch Leitungs- oder. Strahlungswärme
erfolgen, Der Grad der Scnädigung wird an der Uberlebensrate der Zellen bestimmt.
Die Gewinnung der Toxine erfolgt in analoger Weise in Bespiel 1 - 3 Beispiel 5:
Es sollen Toxine nach Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen und Verbrennungen gewonnen
werden. Man kann dabei die Proben wie in den Beispielen 1 - 4 getrennt schädigen
und danach die Toxine poolen oder man kann die Schädigung der einzelnen Proben kombiniert
durchführen.
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Beispiel 6: Es sollen Toxine aus Zellgeweben nach der Exposition mit
chemischen Kampfstoffen (Gelb- Grün- Blau- Kreuz-Kampfstoffen) oder mit Zytostatika,
wie sie in der Onkologie verwendet werden, bzw. mit Industriegiften gewonnen werden.
Dabei muß für jede chemische Substanz die Letaldosis der in Kultur gezüchteten Gewebezellen
ermittelt werden. Diese sollte zwischen einer LD 10 bis LD 100 innerhalb von 10
Tagen betragen. Die Gewinnung der Toxine kann wie in Beispiel 4 sowohl aus dem Kulturmedium
wie auch aus dem Zellhomogenat erfolgen. Eine Kombination von Toxinen,die nach Bestrahlung
oder Verbrennung entstehen, ist möglich. Die zur Schädigung verwendeten chemischen
Substanzen können nach bekannten Trennungsmethoden vor der Anwendung entfernt werden,
ebenso inkompatible immunologisch überkreuz mit dem l,mpfängerorganismus reagierende
Faktoren.