DE3404937C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Einfrieren von Biopsiematerial für die Tieftemperatur-Ultramikrotomie mit einem mit einem Einfriermedium füllbaren, eine Einfüllöffnung aufweisenden Einfrierbehälter aus einem wärmeleitenden Material, der im Inneren im seitlichen Abstand von den Innenwänden eines mit einem Kühlmittel, insbesondere flüssigem Stickstoff, füllbaren, nach außen wärmeisolierten Kühlmittelbehälter angeordnet ist.

Eine derartige Vorrichtung ist aus der DE 29 44 464 A1 bekannt, mit der kleine biologische Objekte kryosubstituiert werden können. Dabei wird das in den biologischen Proben enthaltene Eis gegen eine organische Flüssigkeit oder Lösung ausgetauscht, welches in den Behältern mit den Proben eingefüllt ist. Dieser Behälter wird in dem Dewargefäß oberhalb des Spiegels des flüssigen Kryogens eingehängt, so daß er nicht von diesem berührt wird. Er erhält seine Temperatur dadurch, daß er von dem laufend abrauchenden Gas des Kryogens umspült ist. Der Dewar weist zur besseren Ausnutzung der Wärmekapazität des abrauchenden Kryogens eine flache breite Gestalt sowie eine äußere Schraubennut auf, entlang der das Gas entweichen kann. Weiterhin ist in dem Dewar ein Propeller vorgesehen, durch den die Konvektion erhöht werden kann.

Aus der US 36 62 566 ist ein Kryostat bekannt, der zwei kryogenische Kammern aufweist. Die die tiefere Temperatur aufweisende Kammer verfügt über ringförmige Konvektionskanäle, die an ihrem oberen Ende verschlossen sind, so daß ein geschlossener Kühlkreislauf entsteht. Zwischen den zwei Kammern ist ein wärmeisolierendes Material angeordnet, um geringe Wärmeverluste in die das kältere Kühlmittel enthaltende Kammer zu vermeiden.

Aus der DE 30 42 578 A1 ist eine weitere Kryosubstitutionseinrichtung zur Entwässerung biologischer Proben bekannt, bei der eine zweite Kammer oberhalb einer ein Kryogen enthaltenden Kammer angeordnet ist. Diese zweite Kammer umfaßt eine abgeschlossene Vorrichtung zum Umspülen der biologischen Proben mit der Substitutionsflüssigkeit. Mit dieser Vorrichtung ist es nicht möglich, biologische Proben zu kryofixieren, da die - bereits vorgefrorenen - Proben über einen längeren Zeitraum das in ihnen enthaltene Wasser verlieren sollen.

Die DE 30 24 029 A1 lehrt einen Tieftemperaturkryostaten zur Untersuchung des Verhaltens von lebenden Zellen bei sehr niedrigen Temperaturen, der über eine Kammer verfügt, in die das Kryogen unter Entspannung eingespritzt wird. Daraus folgt eine Herabsetzung der Temperatur in der die Probe aufweisenden Kammer, die gegenüber dem umgebenden Raum durch Überdruck gegen ein Eindringen von Umgebungsluft abgesichert ist.

Aus der DE 27 44 346 A1 ist ein Kryostat bekannt, mit dem es möglich ist, Proben in kurzer Zeit zu wechseln. Die Probe ist in einem langen Rohr bis in die untere, die tiefere Temperatur aufweisende Kryostatkammer eingeführt, wobei im oberen Bereich der Vorrichtung eine Destille vorgesehen ist, die einen ringförmig um das Probenrohr angeordneten Kamin aufweist.

Aus der FR 25 30 004 ist eine Vorrichtung zum Einfrieren von biologischen Proben bekannt, bei der ein Einkammerdewar vorgesehen ist, wobei im unteren Bereich der Kammer oberhalb des Flüssigkeitsstandes des Kryogens die Proben in einem zylindrischen Rohr angeordnet sind. Am oberen Ende des zylindrischen Rohrs ist eine Turbine vorgesehen, mit der das gasförmige Kryogen durch die Proben und das Rohr hindurch zu der Turbine gesaugt werden kann und es im Anschluß daran aus seitlichen Öffnungen des Rohres heraustritt und in einem ringförmigen Kamin nach unten zum flüssigen Kryogen hin abfließt.

Diese Vorrichtungen sind nicht dazu geeignet, Proben in nativer Form für die Betrachtung in einem Elektronenmikroskop vorzubereiten. Um Schnitte von etwa 50 Nanometer Dicke zu erzeugen, sind die bekannten Schnellfrostverfahren nicht geeignet, da eine Temperaturabsenkung von mehr als 10° pro Millisekunde nicht erreicht werden kann, so daß die Gefahr besteht, daß sich Eiskristalle im Gewebe bilden.

Ein weiteres Problem bei den bekannten Vorrichtungen ergibt sich dadurch, daß die Proben festfrieren. Schließlich sind umständliche Peripheriegeräte, wie Vakuumpumpen, Preßluftversorgungen und dergleichen, notwendig.

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, die einfach aufgebaut ist und leicht handzuhaben ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Kühlmittelbehälter ein Dewar ist, dessen Tiefe ein Mehrfaches seiner lichten Weite beträgt, daß sich im Innern des Dewars parallel zu dessen Längsachse mit seinem oberen Rand gegenüber dem oberen Rand des Dewars nach innen versetzt ein Rohrteil erstreckt, das durch einen Zwischenboden in eine kürzere als Einfrierbehälter dienende erste, bei Betriebsstellung obere Kammer und eine zweite, bei Betriebsstellung untere Kammer aufgeteilt ist und einen Außendurchmesser aufweist, der kleiner als der Innendurchmesser des Dewars ist, wobei von der Innenwand des Dewars und der Außenwand des Rohrteils ein Ringraum gebildet wird, daß die untere Kammer unterhalb des Zwischenbodens mit in den Ringraum um das Rohrteil mündenden radialen Auslaßöffnungen und am unteren Ende mit wenigstens einer radialen Einlaßöffnung versehen ist, daß eine zum Boden des Dewars weisende Öffnung des Rohrteils durch einen Silikonstopfen verschlossen ist, durch den das Rohrteil auf dem Boden des Dewars abstützbar ist, und daß in der als Einfrierbehälter dienenden oberen Kammer des Rohrteils ein herausziehbares Auffangdrahtnetz mit einem über den Rand des Kühlmittelbehälters hinausragenden Drahtnetzstiel angeordnet ist.

Durch die erfindungsgemäße Anordnung erfolgt eine Durchströmung und Umströmung des beispielsweise als Rohrteil ausgebildeten Hohlzylinders durch den wieder gasförmig gewordenen flüssigen Stickstoff, so daß trotz einfachsten Aufbaus und trotz Fehlens einer gesteuerten elektrischen Gegenheizung eine konstant tiefe Temperatur im Einfrierbehälter gewährleistet ist.

Der Einfrierbehälter ist nicht in den flüssigen Stickstoff eingetaucht, sondern mit diesem nur noch über die Rohrwandung wärmeleitend verbunden. Eine weitere Kühlung erfolgt über die Konvektion des abrauchenden Stickstoffes.

Infolge der großen Falltiefe des länglich ausgebildeten Einfrierbehälters ergeben sich günstige Einfrierbedingungen. Ein Festfrieren der Proben am Boden des Einfrierbehälters wird auf einfache Weise mit einem V₂A-Drahtnetz mit einem Drahtnetzstiel verhindert.

Zweckmäßige Weiterbildungen des Gegenstandes sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Das in der Zeichnung dargestellte Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Einfrieren von Biopsiematerial für die Tieftemperatur-Ultramikrotomie weist einen Kühlmittelbehälter in Gestalt eines Glasdewars 1 auf, dessen Boden 2 vom oberen Rand 3 einen Abstand von etwa 215 mm hat. Das Glasdewar 1 ist in üblicher Weise als doppelwandiges Glasgefäß ausgebildet, dessen Zwischenraum möglichst luftleer ausgepumpt ist, um es gegen Wärmeaufnahme zu schützen. Durch Versilbern der Innenwand wird die Einstrahlung von Wärme verhindert. In üblicher Weise verfügt das Glasdewar 1 über einen Blechmantel 5. Die lichte Weite des Glasdewars 1 beträgt bei dem in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiel 60 mm.

Im Innern des Glasdewars 1 ist gegenüber der Mittellängsachse seitlich versetzt ein Rohrteil 6 aus Aluminium mit einem Außendurchmesser von 30 mm und einem Innendurchmesser von 16 mm angeordnet. Das Rohrteil 6 hat eine Länge von 200 mm und ist durch einen Zwischenboden 7 in eine erste obere Kammer 8 und eine zweite untere Kammer 9 aufgeteilt.

Die obere Kammer 8 dient zur Aufnahme eines Einfriermediums. Dies kann beispielsweise flüssiges Propan oder ein Trifluormethan-Abkömmling, wie Freon 22, sein. Die Tiefe der oberen Kammer 8, die als Einfrierbehälter dient, beträgt bis zum Zwischenboden 7 etwa 60 mm.

Wie man aus der Zeichnung erkennt, ist der obere Rand 10 der oberen Kammer 8 gegenüber dem oberen Rand 3 des Glasdewars 1 um etwa 10 mm nach innen versetzt.

In der Wand 11 der oberen Kammer 8 ist eine Sacklochbohrung 12 eingebracht, in die ein Thermofühler eingesetzt werden kann, um laufend die Temperatur des flüssigen Einfriermediums zu überwachen. Gegenüber der Sacklochbohrung 12 befindet sich in der Wand 11 der oberen Kammer 8 eine Haltebohrung 13 für einen Injektor zum Einschießen einer Probe in das Einfriermedium.

Um ein Festfrieren der Proben am Boden der oberen Kammer 8 sicher zu verhindern, ist ein Drahtnetz 14 mit einem Drahtstiel oder Drahtnetzstiel 15 vorgesehen. Vorzugsweise ist das Drahtnetz zu einer Art Kelle oder Schaufel geformt.

Die untere Kammer 9 im Rohrteil 6 unterhalb des Zwischenbodens 7 verfügt in der Nähe des Zwischenbodens 7 über vier radial verlaufende Auslaßöffnungen 16, durch die gasförmiger Stickstoff seitlich in den Ringraum 17 zwischen der Innenwand 4 des Glasdewars 1 und der Außenwand 18 des Rohrteils 6 austreten kann. Dieser gasförmige Stickstoff entsteht durch das Einleiten von Wärme in den flüssigen Stickstoff, dessen Flüssigkeitsspiegel mit dem Bezugszeichen 19 versehen ist.

Die Wand 20 der unteren Kammer 9 reicht bis in die Nähe des Bodens 2 des Glasdewars 1. Am unteren Ende ist die untere Kammer 9 durch einen Silikonstopfen 21 verschlossen, der als Stütze dient. Oberhalb des unteren Randes 22 des Rohrteils 6 sind vier Einlaßöffnungen 23 vorgesehen, durch die flüssiger Stickstoff nach dem Einfüllen in das Glasdewar 1 in die untere Kammer 9 eindringen kann. Die beim Übergang in die gasförmige Phase entstehenden kalten Stickstoffgase verlassen das Glasdewar 1 über den Ringraum 17 in Richtung der Pfeile 24. Dabei hat der Ringraum 17 eine kaminartige Wirkung, so daß in der oberen Kammer 8 eine konstante ausreichend tiefe, aber nicht zu tiefe Temperatur aufrechterhalten werden kann. Die Einlaßöffnungen 23 haben einen Durchmesser von 8 mm, während die Auslaßöffnungen 16 einen Durchmesser von 5 mm aufweisen.

Um das Einfüllen des flüssigen Stickstoffs zu erleichtern, ist im Ringraum 17 ein Einfüllrohr 25 mit einem Durchmesser von 14 mm vorgesehen. Das Einfüllrohr 25 ist mit dem Rohrteil 6 durch Silikonbänder verbunden, die auch als radiale Stütze wirksam sein können. In der Nähe des oberen Randes des Einfüllrohres 25 sind radiale Silikonstützen 26 angeordnet, die dafür sorgen, daß das Rohrteil 6 mit dem daran befestigten Einfüllrohr 25 im Inneren des Glasdewars 1 festgelegt ist.

In der Nähe des unteren Endes 27 des Einfüllrohres 25 ist eine Leuchtdiode 28 angeordnet, die über eine elektrische Leitung 29 mit elektrischem Strom versorgt werden kann. Die Leuchtdiode 28 beleuchtet den Ringraum 17, so daß beim Einfüllen von flüssigem Stickstoff über das Einfüllrohr 25 mit einem Trichter oder Füllschlauch gut erkannt werden kann, wie hoch der Flüssigkeitsspiegel 19 ist. Weiterhin kann der durch die Leuchtdiode 28 fließende Strom, der sich beim Eintauchen in flüssigen Stickstoff ändert, zum Steuern einer automatischen Stickstoff-Fülleinrichtung verwendet werden. Schließlich unterstützt die Leuchtdiode 28 die Konvektion im Ringraum 17 durch die von ihr eingebrachte Wärme.

Oberhalb des unteren Endes 27 des Einfüllrohres 25 ist ein Spritzschutz 30 aus einem Drahtnetz angeordnet. Dieses Drahtnetz besteht ebenso wie das Drahtnetz 14 mit seinem Drahtnetzstiel 15 aus V₂A-Stahl. Das Einfüllrohr 25 besteht ebenso wie das Rohrteil 6 aus Aluminium.

In Sonderfällen, beispielsweise bei sehr kleinen und spröden Präparaten, kann in den Boden des Drahtnetzes 14 eine hochglanzpolierte Kupferscheibe eingesetzt werden.

Zum Betrieb der Vorrichtung zum Einfrieren von Biopsiematerial werden nach dem Zusammensetzen der Einzelteile der Thermofühler und die Leuchtdiode 28 angeschlossen. Der Stromverbrauch der gesamten Elektronik inklusive der Anzeige beträgt etwa 25 mA. Anschließend wird das Drahtnetz 14 in die obere Kammer 8 gesetzt, und danach wird flüssiger Stickstoff über das Einfüllrohr 25 so lange eingefüllt, bis der Flüssigkeitsspiegel 19 die Leuchtdiode 28 berührt. Wenn die Leuchtdiode 28 an eine kommerziell erhältliche automatische Nachfülleinrichtung angeschlossen ist, kann die Änderung des Innenwiderstands der Leuchtdiode 28 beim Eintauchen in den flüssigen Stickstoff als Meßsignal ausgewertet werden. Nach zwei- bis dreimaligem Nachfüllen ist die erforderliche Temperatur zur Verflüssigung des Einfriermediums erreicht, was sich über den Thermofühler kontrollieren läßt. Wenn die Thermometerkontrolle positiv verläuft, wird das Einfriermedium in die obere Kammer 8 eingeblasen, wobei es sich wegen der dort herrschenden Temperatur von etwa -160°C verflüssigt. Diese Temperatur darf trotz der Kühlung durch den -192°C kalten flüssigen Stickstoff nicht unter etwa -170°C bis 180°C absinken, weil sich das Einfriermedium bei dieser Temperatur verfestigt. Die oben beschriebene Anordnung sowie die aufgrund der ausgeklügelten Dimensionierung bewirkte Strömung gestatten die Einhaltung der Temperatur zur Erhaltung des gerade flüssigen Zustandes des Einfriermediums, wobei keinerlei Fremdheizung erforderlich ist.

Claims (7)

1. Vorrichtung zum Einfrieren von Biopsiematerial für die Tiefentemperatur-Ultramikrotomie mit einem mit einem Einfriermedium füllbaren, eine Einfüllöffnung aufweisenden Einfrierbehälter aus einem wärmeleitenden Material, der im Inneren im seitlichen Abstand von den Innenwänden eines mit einem Kühlmittel, insbesondere flüssigem Stickstoff, füllbaren, nach außen wärmeisolierten Kühlmittelbehälter angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Kühlmittelbehälter ein Dewar (1) ist, dessen Tiefe ein Mehrfaches seiner lichten Weite beträgt, daß sich im Innern des Dewars (1) parallel zu dessen Längsachse mit seinem oberen Rand gegenüber dem oberen Rand (3) des Dewars (1) nach innen versetzt ein Rohrteil (6) erstreckt, das durch einen Zwischenboden (7) in eine kürzere als Einfrierbehälter dienende erste, bei Betriebsstellung obere Kammer (8) und eine zweite, bei Betriebsstellung untere Kammer (9) aufgeteilt ist und einen Außendurchmesser aufweist, der kleiner als der Innendurchmesser des Dewars (1) ist, wobei von der Innenwand (4) des Dewars (1) und der Außenwand (18) des Rohrteils (6) ein Ringraum (17) gebildet wird, daß die untere Kammer (9) unterhalb des Zwischenbodens (7) mit in den Ringraum (17) um das Rohrteil (6) mündenden radialen Auslaßöffnungen (16) und am unteren Ende (22) mit wenigstens einer radialen Einlaßöffnung (23) versehen ist, daß eine zum Boden (2) des Dewars (1) weisende Öffnung des Rohrteils (6) durch einen Silikonstopfen (21) verschlossen ist, durch den das Rohrteil (6) auf dem Boden (2) des Dewars (1) abstützbar ist, und daß in der als Einfrierbehälter dienenden oberen Kammer (8) des Rohrteils (6) ein herausziehbares Auffangdrahtnetz (14) mit einem über den Rand (3) des Kühlmittelbehälters (1) hinausragenden Drahtnetzstiel (15) angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Ringraum (17) zwischen der Innenwand (4) des Dewars (1) und der Außenwand (18) des Rohrteils (6) ein bis in den unteren Bereich des Dewars (1) ragendes Einfüllrohr (25) für das Kühlmittel vorgesehen ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß am unteren Ende (27) des Einfüllrohres (25) eine Leuchtdiode (28) angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Ringraum (17) oberhalb des unteren Endes (27) des Einfüllrohres (25) ein Spritzschutz (30) aus einem Drahtnetz angeordnet ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohrteil (6) und das Einfüllrohr (25) radial durch Silikonstützen (26) gegen die Innenwand (4) des Dewars (1) abgestützt sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Wand (11) der als Einfrierbehälter dienenden oberen Kammer (8) des Rohrteils (6) eine axial verlaufende Sacklochbohrung (12) für den Einsatz eines Thermofühlers vorgesehen ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß am oberen Rand (10) der oberen Kammer (8) eine Haltebohrung (13) für einen Injektor vorgesehen ist.