DE3342807T1

DE3342807T1 - Verfahren und Analysesatz zur Diagnose von Krebs im Menschen

Info

Publication number: DE3342807T1
Application number: DE19833342807
Authority: DE
Inventors: Barbara Schneider Menlo Park Calif. Vold
Original assignee: Stanford Research Institute
Current assignee: SRI International Inc
Priority date: 1982-04-23
Filing date: 1983-04-18
Publication date: 1984-05-03
Anticipated expiration: 2003-04-19
Also published as: DE3342807C2; EP0106894A1; EP0106894B1; EP0106894A4; GB8334051D0; SE8306661D0; SE455824B; SE8306661L; GB2129934A; GB2129934B; WO1983003903A1

Description

Verfahren und Analysekoffer zum Nachweis von Krebs

in Menschen

Die nachstehend zu beschreibende Erfindung wurde zum Teil im Verlauf von Arbeiten gemacht, die von den National Institutes of Health, dem Department of Health and Human Services und der National Science Foundation finanziell unterstützt werden.

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Krebsdiagnose, insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs unter Bestimmung der Menge bestimmter modifizierter Nukleoside im Urin durch Immunoassay.

Ribonukleinsäuren (kurz: RNS), insbesondere Transfer-RNS, enthalten eine Vielzahl von modifizierten Nukleosiden, die nach der Transkription des Makromoleküls gebildet werden. Wenn diese RNS abgebaut werden, scheint der größte Teil der modifizierten Nukleoside in Tieren oder Menschen nicht signifikant abgebaut zu werden und wird in erheblichen Mengen im Urin ausgeschieden. Da die Transfer-RNS die höchstmodifizierte Klasse von RNS ist, wurde angenommen, daß der Transfer-RNS-Umsatz die Quelle für die abgeschiedenen modifizierten Nukleoside ist. Es wurde bereits der Nachweis einer höheren Transfer-RNS-Umsatzrate in Tumorgewebe sowie der Nachweis für eine intrazelluläre Reinigung von Transfer-RNS mit strukturellen Abnormalitäten erbracht (E. Borek et al., Cancer Res (1977), 37:3362-3366, und Y. Nomura, FEBS Lett (1974), 45:223-227). Ferner wurde über größere Mengen bestimmter modifizierter Nukleoside berichtet, die durch Hochleistungs-Flüssigchromatografie nachgewiesen wurden (J. Speer et al.. Cancer (1979 ) , 44:2120-2123, und E.Borek, Cancer Markers (1980), Ed. Sell, S., Humana Press).

Radioimmunoassays bestimmter modifizierter Nukleoside einschließlich N-[9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyl3-L-Threonin (t^A) wurden dazu benutzt, die Pegel solcher Nukleoide in bakteriellen Transfer-RNS auszuwerten (Milstone et al., Nucl Acids Res (1978) 5:3439-3455; B. Void, Nucl Acids Res (1979) 7:193-204; und B. Void et al., Nucl Acids Res (1979) 7:971-980). Über mittels Radioimmunoassay bestimmte Serumpegel von N^N^-Dimethylguanosin und Pseudouridin in Krebspatienten wurde ebenfalls berichtet (Levine et al., J Natl Cancer Inst (1975) 54:341-343).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines reproduzierbaren, nichtinvasiven Verfahrens zur Diagnostizierung von Humankrebs auf der Grundlage der Pegel modifizierter Nukleoside in physiologischen Fluiden. Dabei wird Urin als physiologische Testflüssigkeit und ein Immunoassay zur Bestimmung der Menge modifizierter Nukleoside im Urin angewandt. Weiterhin soll ein Verfahren zur Diagnostizierung von Humankrebs angegeben werden auf der Basis von N- |j)-( ß-d-Ribof uranosyl) pur in-6-ylkarbamyrj-L-Threonin im Urin. Schließlich soll ein bei einer solchen Diagnosje einsetzbarer neuer monoklonaler Anti-t^A-A-ntikörper angegeben werden. _j

Das Verfahren nbch der Erfindung zum Nachweis von Krebs in Menschen ist gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen der Menge an N-[9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyl]-L-Threonin im Urin eines Patienten; und

(b) Vergleichen dieser Menge mit der Standardmenge an

N-[9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamy1}-L-Threonin im Urin normaler Menschen zur Feststellung, ob die Menge wesentlich größer als die Standardmenge ist.

Ein weiterer Aspekt des Verfahrens zum Nachweis von Krebs in Menschen ist gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen· der Menge eines modifizierten Nukleosids, das von krebskranken Menschen normalerweise in höheren Mengen ausgeschieden wird, in einer Urinprobe des Patienten durch ein quantitatives Immunoassay der Probe, und

(b) Vergleichen der in Schritt (a) festgestellten Menge mit der Standardmenge an modifiziertem Nukleosid im Urin normaler Personen.

Der Analysenkoffer gemäß der Erfindung zum Bestimmen der Menge an N- [9-(ß-d-ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamylJ -L-Threonin im menschlichen Urin ist gekennzeichnet durch folgende Kombination:

(a) markiertes N-[9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyI]-L-Threonin und

(b) einen monoklonalen Antikörper gegen N-[9-(ß-d-Ribofuranosyl )purin-6-ylkarbamyr]-L-Threonin.

Schließlich betrifft die Erfindung einen monoklonalen Antikörper gegen N- Q9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyl}-L-Threonin.

Die Verfahren nach der Erfindung können zur Diagnose jeglicher Art von Zelltumoren wie Karzinomen, Myelomen und Lymphomen angewandt werden. Beispiele von Krebserkrankungen, deren Zuordnung zu erhöhten Pegeln modifizierter Nukleoside nachgewiesen wurde, sind Leukämie, Lungenkrebs, Burkittsches Lymphom, Melanom, Eierstockskrebs, metastatischer Brustkrebs, die Hodgkinsche Krankheit, Dickdarmkrebs, Blasenkrebs und bronchogenes Karzinom.

Die bei den Verfahren verwendeten Urinproben können willkürlich oder über einen bestimmten Zeitraum, üblicherweise während 24 h, entnommen werden. Merkliche Änderungen der Pegel modifizierter Nukleoside relativ zu den Probenentnahmevorschriften wurden nicht beobachtet. Einer der wesentlichen Vorteile der Erfindung gegenüber dem bekannten Hochleistungs-Flüssigchromatografieverfahren besteht darin, daß die Urinproben vor der Analyse nicht behandelt werden müssen. Bei der Hochleistungs-Flüssigchroma-

tografie werden die Nukleoside durch Affinitäts-Chromatografie von der Probe getrennt, bevor sie analysiert werden. Die bei den hier angegebenen Verfahren verwendete Urinmenge liegt üblicherweise im Bereich von ca. 1 ul bis ca. 20 ul in Abhängigkeit von dem speziellen betroffenen Nukleosid.

Die modifizierten Nukleoside, die die Grundlage für die Diagnose bilden, treten im Urin von Patienten mit der zu diagnostizierenden Krebsart in merklich erhöhten Mengen auf. Unter den modifizierten Nukleosiden, von denen berichtet wurde, daß sie in erhöhten Mengen von Krebspatienten ausgeschieden werden, sind 1-Methylinosin, N^,N^-Dimethylguanosin, Pseudouridin, 1-Methylguanin, 7-Methylguanin und 8-Hydroxy-7-methylguanin. Es wurde nun gefunden, daß t^A ebenfalls in größeren Mengen von Krebspatienten ausgeschieden wird. t^A ist ein besonders interessierendes modifiziertes Nukleosid, weil es nur in Transfer-RNS auftritt.

Die Mengen dieser modifizierten Nukleoside im Urin werden durch ein quantitatives Immunoassay bestimmt. Dabei können verschiedene Arten quantitativer Immunoassays eingesetzt werden, z. B. kompetitive Immunoassays, direkte Immunoassays und indirekte Immunoassays. Bei diesen Assays müssen Immunkomplexe mit einer

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Markierung gebildet werden, und solche Komplexe müssen über die Markierung nachgewiesen werden. Bei kompetitiven Assays wird die Probe mit einem! Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid und einer bekannten Menge von markiertem nodifiziertem Nukleosid inkubiert. Jedes modifizierte Nukleosid (nichtmarkiert) in der Probe tritt mit dem markierten Nukleosid in Konkurrenz für den Antikörper. Die resultierenden Immunkomplexe werden abgetrennt, und die darin enthaltene Markierungsmenge wird bestimmt. Der Gehalt an modifiziertem Nukleosid wird durch Vergleich mit dem Effekt von Standardproben bestimmt. Bei direkten Immunoassays wird die Probe mit einem markierten Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid inkubiert, und alle sich bildenden Immunkomplexe werden abgetrennt. Die darin enthaltene Markierungsmenge wird bestimmt, und die Menge an modifiziertem Nukleosid in der Probe wird durch Vergleich mit dem Effekt von Standardproben

bestimmt. Bei einem indirekten Immunoassay, ζ. B. einem enzymgebundenen Immunosorbenz-Assay (ELISA), wird der Antikörper an eine feste Phase gebunden, die Probe wird zugegeben, und ein zweiter markierter Antikörper wird zugegeben. Immobilisierte Immunkomplexe werden über die Markierung nachgewiesen.

Die jeweils in den quantitativen Immunoassays verwendete Markierung ist nicht kritisch. Die Markierung sollte so sein, daß sie Empfindlichkeiten bis herunter zu wenigstens ca. 1-10 pmol modifiziertes Nukleosid erlaubt. Beispiele für einzusetzende Markierungen sind Radiomarkierungen wie 32p_/ 125-j-^ 3_{H un}^ 14^^ Fluoreszenzmarkierungen wie Fluoreszein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl und Umbell iferon, ferner Chemilumineszenzstoffe wie Luciferine und 2,3-Dihydrophthalazindione sowie Enzyme wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Lysozym und Glukose-6-phosphat-Dehydrase. Der Antikörper oder das Nukleosid können mittels bekannter Methoden mit solchen Markierungen versehen werden. Z. B. können Haftmittel wie Aldehyde, !Carbodiimide, Dimaleinimide, Imidate, Sukzinimide, bis-diazotiertes Benzadin u. dgl. eingesetzt werden, um die Antikörper mit Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Enzymmarkierungen zu versehen.

Die bei diesen Immunoassays eingesetzten Antikörper gegen die modifizierten Nukleoside können polyklonal (heterolog) oder monoklonal (homolog) sein. Polyklonale Antikörper können dadurch hergestellt werden, daß man Wirtstiere wie Mäuse, Kaninchen und Schafe dadurch immunisiert, daß man als Immunogen ein modifiziertes Nukleosid-Protein-Carrierkonjugat verwendet. Die Immunisierung ist typischerweise mit wiederholten Impfungen mit dem Immunogen verbunden, und zwar charakteristisch wenigstens zwei in Abständen von etwa einer Woche. Eine solche Impfung ruft eine Immunantwort gegen das Immunogen hervor und hat die Erzeugung von Antikörpern gegen das modifizierte Nukleosid im Immunsystem des geimpften Wirtstiers zur Folge. Serum des immunisierten Wirtstiers wird üblicherweise etwa 3-10 Tage nach der letzten Impfung entnommen. Immunglobuline können aus dem

Serum durch Ammoniumsulfat-Ausfällung, Gel-Elektrophorese, Dialyse, Chromatografie oder andere konventionelle Abscheidungs-und erwünschtenfalls Reinigungsverfahren gewonnen werden.

Monoklonale Antikörper gegen die modifizierten Nukleoside können erhalten werden durch das somatische Zellenhybridisierungsverfahren nach Köhler und Milstein (Nature (1975) 265:495) unter Einsatz von Antikörper erzeugenden Zellen, z. B. Milz- oder lympheähnlichen Zellen, des immunisierten Wirtstiers, bevorzugt einer Maus, als einem der Hybridisierungspartner. Die Antikörper erzeugenden Zellen werden mit einer geeigneten Krebszellenlinie (Myelomzellenlinie) hybridisiert (verschmolzen), und zwar unter Verwendung einer Verschmelzungssubstanz wie Polyethylenglykol mit einer relativen Molekülmasse von 1000-6000 Dalton. Es wird eine Myelomzellenlinie verwendet, die für ein selektives Medium wie HAT-Medium (Littlefield, Science (1969) 145:709-710) empfindlich ist, mit gutem Wirkungsgrad verschmilzt und die eine stabile Antikörperauspressung und -Sekretion auf hohem Niveau durch ihren Hybridisierungspartner unterstützt. Zwar können Myelomzellen jeder Spezies eingesetzt werden, jedoch sind derzeit mäuseartige Myelomlinien mijt diesen Eigenschaften verfügbar und werden bevorzugt eingesetzt. Beispiele für solche Linien sind die von den originalen MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren gewonnenen, die über das SaIk Institute Cell Distribution Center in San Diego erhaltlich sind. Ein Verhältnis der Myelomzellen und der Antikörper erzeugenden Zellen im Bereich von etwa 1:10 und etwa 10:1 wird dabei normalerweise angewandt. Die einzelnen Zellenkonzentrationen liegen typischerweise; im Bereich von ca. 10^ bis 10**, bevorzugt 1x10^ bis 5 χ 10? Zellen pro ml Verschmelzungsmedium. Als Verschmelzungsmedium können im Gleichgewicht befindliche Salzlösungen mit ca. 30-60 Gew.-%, bevorzugt 35-50 Gew.-%, Verschmelzungssubstanz eingesetzt werden. Nach der Verschmelzung werden die Zellen mit Verschmelzungssubstanzfreiem Medium gewaschen, um die Verschmelzungssubstanz zu entfernen. Sie werden dann in das selektive Medium eingeimpft und kultiviert, um nichthybridisierte Mutterzellen zu eliminieren und nur Hybride zu

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belassen, die gegenüber dem selektiven Medium resistent sind und die Unsterblichkeit der Myelom-Mutterzelle aufweisen. Die Kultivierung dauert normalerweise etwa 3-5 Wochen.

Überlebende Hybridome können auf die Erzeugung von Antikörpern gegen das modifizierte Nukleosid durch Immunoassay untersucht werden. Positive Hybridomklone können durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels bekannter Verfahren entweder in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Der durch die Subklone ausgeschiedene monoklonale Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid kann aus dem Kulturmedium oder Bauchwasser, wenn er in vivo gezüchtet wurde, mittels bekannter Verfahren abgetrennt werden, z. B. durch Ammoniumsulfat-Ausfällung, DEAE-Zellulosechromatografie oder Affinitäts-Chromatografie. Eine weitere ■--,. Reinigung der Antikörper kann erwünschtenfalls durch ültrazentrifugierung und Mikrofiltration erreicht werden.

Die Inkubationen der Immunoassays werden unter Bedingungen durchgeführt, die eine Reaktion zwischen dem Antikörper und dem modifizierten Nukleosid erlauben. Die Temperatur, der pH-Wert und die Dauer sind die wichtigsten Verfahrensbedingüngen bei der Inkubation. Dabei werden charakteristisch Temperaturen im Bereich von ca. 5-40 ⁰C, bevorzugt ca. 37 ⁰C, angewandt. Der pH-Wert liegt normalerweise bei ca. 6-9, bevorzugt ca. 7, und die Bindungsreaktion erreicht den Gleichgewichtszustand normalerweise innerhalb von 10 min bis zu 2 Tagen je nach den betroffenen speziellen Antikörpern und Nukleosiden. Antikörper werden üblicherweise im Überschuß eingesetzt. Immunkomplexe können aus dem Inkubationsgemisch durch Zentrifugierung oder andere konventionelle Verfahren abgeschieden werden. Die Abtrennung braucht nicht notwendigerweise in Assays wie etwa dem homogenen Enzymimmunoassay (EMIT) zu erfolgen.

Die für das Immunoassay verwendete Markierungs-Nachweisvorrichtung hängt von der jeweils eingesetzten speziellen Markierung ab. Z. B. können Radiomarkierungen mit Szintillationszählern, Fluoreszenzmarkierungen mit Fluoreszenzmikroskopen (Fluorometern)

und Enzymmarkierungen mit Kolorimetern nachgewiesen werden, die die Größe der Farbänderung erfassen, die durch die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat hervorgerufen wird.

Die Grundbestandteile des Analysenkoffers zur Durchführung des t^A-Assays nach der Erfindung sind markiertes t^A und monoklonaler Antikörper gegen t*>A. Diese Bestandteile befinden sich typischerweise in Lösung in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel und sind in zweckmäßigen Vorratsbehältern enthalten. Der Analysenkoffer kann ferner einen geeigneten Puffer, Trägerprotein, nichtmarkiertes t^A zur Herstellung von Standards, Behälter zur Verwendung der Reagenzien sowie Anweisungen zur Durchführung des Assays enthalten. Die Bestandteile des Analysenkoffers können in konventioneller Weise verpackt sein.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Verfahren nach der Erfindung.

Beispiel 1 Urinproben

24-h-Urinproben wurden von Patienten beschafft, die an ver-

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schiedenen fortgeschrittenen bösartigen Tumoren erkrankt, vorher nicht chemotherapeutisch behandelt worden und normale Freiwillige im Krebszentrum der Universität von New Mexico waren. Die Urinproben wurden von jedem einzelnen Patienten während 24 h in Kunststoffbehältern entnommen und bis zum Ende der Beschaffungszeit gekühlt gehalten. Dann wurde das Urinvolumen bestimmt, und ein aliquoter Teil wurde bis zum Tag der Analyse tiefgekühlt aufbewahrt. Die Kreatininmenge jeder Probe wurde mittels des kolorimetrischen Verfahrens bestimmt, das in Sigma Technical Bulletin Nr. 555 1-12, 1977, beschrieben ist.

Antikörper-Herstellung

Immunogen wurde hergestellt, indem t6_{A m}j._t Rinderserumalbumin unter Anwendung des Verfahrens nach Erlanger und Beiser (PNAS (1964) 52:68-74) konjugiert wurde. Antikörper wurden in Kaninchen

erzeugt, wobei insgesamt 5 mg Immunogen (vermischt mit komplettem Freundschem Adjuvans) pro Kaninchen mittels drei Injektionen in die Hinterbeine an den Tagen 0, 14 und 21 eingeführt wurden. Den immunisierten Kaninchen wurde am Tag 28 Blut abgenommen. Serum wurde zweimal bei 0 ⁰C mit 50 % gesättigtem Ammoniumsulfat mit einem pH von 7,0 ausgefällt und dann gegen 0,14 mol NaCl, 10 mmol Natriumphosphat, pH 7,0 (phosphatgepufferte Salzlösung) dialysiert.

Mit Tritium behandeltes Antigen

Mit Tritium behandeltes Antigen t^A wurde durch Tritiumgas-Substitution von Moravek Biochemicals hergestellt. [³H] t*>A, , 0,84 Ci/mmol, war 88 % rein gemäß der 2D-Dünnschicht-Chromatografieanalyse unter Einsatz des Lösungsmittelsystems nach Rogg et al. (Nucleic Acids Res (1976) 3:285-295), und es wurden 6,9 pmol je Assay eingesetzt.

Radioimmunoassay

Hier wurde das von B.S. Void (Nucleic Acids Res (1979) 7:193-204) beschriebene Radioimmunoassay mit gesättigtem Ammoniumsulfat (SAS-RIA) für t^A angewandt. Assays wurden in 12 χ 75 mm-Polypropylenröhrchen mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 300 «1 mit 75 mmol NaCl, 0,1 mol Borsäure, 25 mmol Natriumtetraborat und pH 8,3 durchgeführt. Es wurde normales Kaninchen-IgG eingesetzt, um die Gesamtproteinkonzentration jedes Assays auf 600 jug einzustellen. Der Puffer, Antikörper, Trägerprotein, [³H]Jt⁶A und der unbehandelte Urin wurden gründlich vermischt, bei 37 ⁰C für 1 h inkubiert und dann auf Eis während 5 min gekühlt. Die Urinmenge war so gewählt, daß Normalurin Hemmungswerte zwischen 10 und 40 % ergeben würde. Somit wurden in jedem Assay 2 μΐ Urin eingesetzt. Ein gleiches Volumen eiskaltes gesättigtes Ammoniumsulfat wurde jedem Röhrchen zugesetzt, gründlich vermischt und für 30 min bei 0 ⁰C inkubiert. Dann wurden die Röhrchen mit 1800 χ g während 20 min bei 4 ⁰C zentrifugiert, und der Oberstand wurde durch eine Kapillarpipette abgesaugt. Die Pellets wurden in 200 μΐ 50 %igem gesättigtem Ammoniumsulfat in boratgepufferter Salzlösung erneut in Suspension gebracht, vermischt, zentri- , fugiert und wie vorher abgezogen. Dann wurden die gewaschenen

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Pellets wieder in 200 μΐ von 1X boratgepufferter Salzlösung in Suspension gebracht, vermischt, und 75 μΐ wurden 5 ml Aquasol-Szintillationsflüssigkeit zugesetzt. Dann wurde die Radioaktivität in einem Szintillationszähler bestimmt. Unter den für die korapetitive Hemmung angewandten Bedingungen war die Zählung pro Minute am Filter ohne Hemmstoff und mit (oder ohne) Antiserum 1133 (66) für t⁶A. Nachdem Urin als kompetitiver Hemmstoff zugesetzt und das gleiche Assay zu vier verschiedenen Zeiten wiederholt wurde, betrug die Standardabweichung +3,1 %.

Die Hemmungskonzentration in jeder Urinprobe wurde aus einer Grafik der prozentualen Spurenbindung für den Antikörper interpoliert, nachdem das verwandte modifizierte Nukleosid als kompetitiver Hemmstoff eingesetzt worden war. Diese Konzentrationen wurden dann in Form von ausgeschiedenen mg je 24-h-Periode ausgedrückt und auf den Kreatininpegel in jeder Probe normalisiert in Form von nmol Nukleosid/umol Kreatinin (Speer et al., Cancer (1979) 44:20-2123).

Urinproben von acht Normalpatienten, vier Hodgkin-Patienten, vier Nicht-Hodgkin-Lymphompatienten, fünf Lungenkrebspatienten (kleinzellig, Drüsenkrebs, schuppenzellig und großzellig) sowie acht "anderen" Krebspatienten (Brust-, Kopf- und Hals-, Darmkrebs) wurden untersucht. Keiner der Patienten war vorher chemotherapeutisch behandelt worden. Die Assay-Ergebnisse der an Krebs erkrankten Patienten wurden gruppenweise mit den Assay-Ergebnissen der Normalpatienten verglichen. Eine Änderungs-Signifikanz P der t^A-Pegel in den Proben wurde unter Verwendung eines t-Tests erhalten, bei dem jede Krebsgruppe mit der Normalgruppe verglichen wurde. Ein unter 0,05 liegender P-Wert wurde als signifikante Änderung angesehen. Die Vergleichsergebnisse waren wie folgt:

Änderungs-Signifikanz (P) Lymphome feste Tumore Hodgkins Nicht-Hodgkins Lunge andere

insignifik. P<0,05 P< 0,001 P<0,02

Daß diese Daten erhöhte t^A-Pegel im Urin anzeigen, ist ein deutliches Zeichen für sämtliche untersuchten Krebserkrankungen ^N mit Ausnahme vielleicht der Hodgkinschen Krankheit. Die Abwesenheit einer signifikanten Änderung bei den Hodgkins-Patienten ist eventuell der geringen Anzahl Patienten zuzuschreiben.

Beispiel 2

Monoklonale Antikörper-Herstellung und Analyse Eine Balb/C-Maus wurde mit dem t^A-Rinderserumalbumin-Konjugat von Beispiel 1 (100 /ig) in komplettem Freundschem Adjuvans am Tag 0 intraperitoneal immunisiert. Am Tag 7 wurde die Maus intravenös mit 100 jug des Konjugats in phosphatgepufferter Salzlösung aktiviert. Die Milz der Maus wurde am Tag 10 entfernt. Milzzellen wurden mit )P3/63/Ag 8,653-Myelomzellen von Mäusen gemäß dem Verschmelzungsprotokoll von Kennet verschmolzen (Kennet et al. (1979) Cell Fusion in Methods, in Enzymology, Academic Press, New York, S. 345-357). Die Verschmelzungssubstanz war Polyethylenglykol (relative Molekülmasse 1540) mit 38 % (Gew./Volumen).

Medium aus überlebende Zellen enthaltenden Vertiefungen wurde auf Anti-t^A-Antikörper durch Radioimmunoassay untersucht. Zellen aus einer der positiven Vertiefungen (Nr. G8) wurden durch Grenzverdünnung in Vertiefungen, die normale Mäusemilzzellen als Nährzellen enthielten, subkloniert. Subklone wurden auf die Erzeugung von Antikörpern durch Radioimmunoassay untersucht, und einer, nämlich G8-3, wurde als Ausgangsstoff für monoklonale Anti-t^A-Antikörper ausgewählt.

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Zellen des Klons G8-3 wurden dann tiefgefroren, wieder in eine Kultur eingesetzt und wiederum in vitro subkloniert, und zwar gemäß dem Vorgehen bei der ersten Subklonierung. Zwei Klone aus der zweiten Subklonierung wurden zurückbehalten (Nr. 9D4 und Nr. 5C4).

Die Reihenuntersuchung der Klone erfolgte unter Einsatz eines Festphasenassays. Ein Konjugat von t^A zu Humanserumalbumin wurde hergestellt und dazu verwendet, Vertiefungen einer Mikrotitrierplatte zu beschichten. Dann wurde Kulturflüssigkeit zugefügt, gefolgt von einem zweiten Antikörper, der mit 125j markiert war und der Mäuse-IgG nachweist.

Antikörper aus der Kulturflüssigkeit wurden durch einen Affinitäts-Säulenchromatografie-Vorgang unter Einsatz von Protein A-Sepharose CL-4B isoliert. Die gebundene Fraktion aus dieser Säule wurde dann in dem Radioimmunoassay mit gesättigtem Ammoniumsulfat auf t^A analysiert (wie vorher beschrieben), wobei eine Bindung von \?ft\ t^A beobachtet wurde.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis von Krebs in Menschen, gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen der Menge an N-|9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6^-ylkarbamyl] -L-Threonin im Urin eines Patienten; und

(b) Vergleichen dieser Menge mit der Standardmenge an

N-[9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyl]-L-Threonin im Urin normaler Menschen zur Feststellung, ob die Menge wesentlich größer als die Standardmenge ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, .

daß der Krebs ein Nicht-Hodgkinsches Lymphom oder ein fester Tumor ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

daß die Bestimmung gemäß Schritt (a) durch ein quantitatives kompetitives Immunoassay erfolgt, wobei eine Urinprobe des Patienten mit einem Antikörper gegen N- 1J>-( ß-d-Ribof uranosyl )purin-6-ylkarbamyl^-L-Threonin inkubiert und als N-j_9-( ß-d-Ribof uranosyl) pur in-6-ylkarbainyl^j -L-Threonin markiert wird

4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, .

dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung fitrium ist.

6. Verfahren zum Nachweis von Krebs in Menschen, gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen der Menge eines modifizierten Nukleosids, das von krebskranken Menschen normalerweise in höheren Mengen ausgeschieden wird, in einer Urinprobe des Patienten durch

ein quantitatives Immunoassay der Probe, und

Cb) Vergleichen der in Schritt (a) festgestellten Menge mit der Standardmenge an modifiziertem Nukleosid im Urin normaler Personen.

7. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,

daß das Assay ein Radioimmunoassay ist.

8. Analysenkoffer zum Bestimmen der Menge an

N-I9-(ß-d-ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyl|-L-Threonin im menschlichen Urin,

gekennzeichnet durch folgende Kombination:

(a) markiertes N- [9-(ß-d-Ribofuranosyl)purin-6-ylkarbamyl]-L-Threonin und

(b) einen monoklonalen Antikörper gegen N- JJ)- ( ß-d-Ribof uranosyl )purin-6-ylkarbamyr]-L-Threonin.

9. Monoklonaler Antikörper gegen

N- [β- ( ß-d-Ribof uranosyl) purin-6-ylkarbamyl"] -L-Threonin.

10. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 9,

I ■ ^:

dadurch gekennzeichnet, j

daß dieser ein Mäuse-Antikörfjer der IgG-Klasse ist.