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Die Erfindung betrifft ein Filtrationsgefäß mit einem
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Außenrohr, insbesondere Zentrifugenröhrchen, und einer darin schwimmend
angeordneten zum Luftraum hin offenen Filtereinheit, wobei das zu filtrierende Medium
unter einem überdruck in Kontakt mit dem Filter steht und äußere Beschleunigungen
von der zu filtrierenden Probe aus zusehen keinen Vektor in Richtung des Filters
aufweisen.
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Die statische Filtration ist das einfachste Filtrationsverfahren#.
Hierbei steht das zu filtrierende Medium ohne erzwungene Strömungen unter einem
Überdruck mit der Membrane in Kontakt. Sie kann nach dem Stand der Technik dann
mit Erfolg angewandt werden, wenn nur sehr geringe Substanzmengen aus der Suspension
oder Lösung abgeschieden werden müssen, wie dies beispielsweise bei der Gewinnung
von sterilen Filtraten aus schwach verkeimten Lösungen der Fall ist.
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Je höher jedoch die Konzentration der anzutrennenden gelösten oder
suspendierten Substanzen ist, um so mehr werden bei der statischen Filtration die
erzielbaren Filtrationsraten (Filtratmenge pro Fläche und Zeit) durch die Anreicherung
der abzutrennenden Komponenten an der Membranoberfläche beeinträchtigt.
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Die Verwendung entsprechend größerer Filterflächen ist jedoch nicht
nur wegen des höheren technischen Aufwands vielfach undurchführbar. Insbesondere
bei anaiytischen Filtrationsaufgaben, bei denen es auf eine möglichst vollständige
Gewinnung von Konzentrat oder Filtrat und auf deren unverfälschte Zusammensetzung
ankommt, müssen möglichst kleine Filterflächen angewandt werden.
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Es ist selbstverständlich, daß große Filterflächen auch entsprechend
große Verluste an anhaftendem Filtrat oder Konzentrat zur Folge haben. Darüber hinaus
kann aber auch deren Zusammensetzung durch das Filtermaterial in unerwünschter Weise
verändert werden. Einerseits enthalten die meisten Filtermaterialien, insbesondere
Ultrafiltrationsmembranen, auswaschbare Hilfsmittel (Netzmittel, Weichmacher, Glycerin,
Bactericide u.a.), die in höheren Konzentrationen stören können, deren vorherige
Auswaschung aber zur Verdünnung der Probe führen würde.
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Andererseits können Filtermaterialien durch spezifische oder unspezifische
Adsorptionseffekte die Zusammensetzunq der Probe sowohl in ihrer Gesamtkonzentration
als auch im Konzentrationsverhältnis der einzelnen Komponenten zueinander verändern.
Beispiele hierfür, auf die später noch eingegangen wird, sind die Adsorption von
ungebundenen Pharmaka bei der Ultrafiltration von Serum und die partielle Proteinadsorption
bei der Aufkonzentrierun@ der Proteine in Harn.
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Die Nachteile der statischen Filtration können zwar durch das Prinzip
der tangentialen überströmung unter Verwendung von Pumpen weitgehend behoben werden,
dieses ist jedoch im Bereich kleiner und kleinster Volumina wegen der auftretenden
Verluste nicht anwendbar.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in einfacherer W@ise als
bisher auch bei kleinsten Mengen Verfälschungen
@@@ @@@@@@@@ @@@
@@@@@@@@@@ @@@ @@@@@@@@ @@ @@@@@@@@@ und die Automatisierung der Filtervorgänge
zu ermöglichen.
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Erreicht wird dies bei einem Gerät der eingangs genannten Art überraschend
dadurch, daß für die statische Membranfiltration auf der Außenseite des schwimmenden
Hohlkörpers eine Membran mit der filtrationswirksamen Schicht nach außen angebracht
ist.
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Vorzugsweise wird als treibende Kraft der Filtration der sich aus
dem Niveauunterschied zwischen Filtrationsmedium und Filtrat sowie der Zentrifugalbeschleunigung
ergebende hydrostatische Druckunterschied von mindestens 0,5 bar ausgenutzt, wobei
das Gerät so ausgelegt ist, daß die Zentrifugalbeschleunigung von der zu filtrierenden
Lösung aus gesehen keinen Vektor in Richtung der Membran aufweist.
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Bei der Maßnahme nach der Erfindung erregt die apparative Umkompliziertheit
Erstaunen, die insbesondere auch im Hinblick auf die Fertigung von Einweggeräten
von Bedeutung ist.
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.Die statische Filtration im Beschleunigungsfeld einer Zentrifuge
oder der Gravitation wird so ausgenutzt, daß die Wanderungseinrichtung des Filtrats
von der Richtung# der Beschleunigung verschieden ist.
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Zum Unterschied von bekannten Vorrichtungen für die statische Filtration,
bei denen ebenfalls die Zentrifugalbeschleunigung zur Erzeugung der wirksamen hydrostatischen
Druckdifferenz herangezogen wird (beispielsweise deutsche Patentschrift 19 06 179)
weist bei der Maßnahme nach der Erfindung die Zentrifugalbeschleunigung keinen Vektor
in Richtung der Membran auf. Dadurch wird vermieden, daß vorhandene sedimentierbare
Bestandteile auf
der Membran abgelagert werden oder sich das. gebildete
Konzentrat, das im allgemeinen eine höhere Dichte aufweist, als die Ausgangslösung,
auf der Membran anreichern kann. Gleiches gilt, wenn die Filtration unter Einwirkung
der Erdbeschleunigung im Vakuumbetrieb ausgeführt wird, wobei selbstverständlich
der Effekt entsprechend weniger ausgeprägt ist.
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Im übrigen wird durch die Maßnahme nach der Erfindung erreicht, daß
im Lauf der Filtration die bewegliche Membran dem sinkenden Probenniveau folgen
kann und bis zur Beendigung des zude s Kot Konzentrierungsvorgangs in voller Fläche
vom Filtrationsmedium benetzt wird; d.h. die wirksame Filtrationsfläche bleibt während
des gesamten Vorgangs unverändert.
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Bedingt durch den einfachen Aufbau der Vorrichtung werden -die Produktionskosten
niedrig gehalten.
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Zweckmäßig weist der Filtereinsatz anschließend an die aufgeklebte
Membran eine Bohrung auf, von der aus der Filtereinsatz sich innen bis auf die Wandstärke
des dünnen hohlen Filtrateinsatzes erweitert.
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Als besonderer Vorteil ist das bei einigen Ausführungsformen verwirklichte
Baukastensystem zu nennen, wobei erstaunlich ist, wie wenige Teile für eine vielseitige
Verwendbarkeit lediglich notwendig sind, was eine kostensparende Fertigung ermöglicht.
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Sowohl im Betrieb mit Vakuum als auch bei Zentrifugenbetrieb wird
das Gerät allein durch Außendruck ohne Gewinde etc. zusammengehalten.
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Vorzugsweise sind für größere Probenmengen Schwimmer mit herausnehmbarer
Filterunterstützung und auswechselbarer
Membran vorgesehen, wobei
der Boden des Schwimmers offen mit Fortsatz zum Einschieben der Filterunterstützung
ausgebildet ist.
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Die der Erfindung zugrundeliegende Problemstellung kommt häufig in
der biochemischen bzw. medizinischen Analytik und in der pharmazeutischen Forschung
vor.
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Ein Beispiel ist die Abtrennung von Proteinen vor der säulenchromotographischen
Bestimmung von Aminosäuren (Proteine machen die Säulenfüllung durch irreversible
Bindung unbrauchbar. Enzymatische Proteinhydrolysate -und biologische Flüssigkeiten
müssen daher vor der Aminosäureanalyse von Proteinen befreit werden).
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Ein weiterer Anwendungsfall ist die Bestimmung von freien (nicht proteingebundenen)
Substanzen (z.B. Pharmaka) in Patientenblut.
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Weitere Anwendungsbeispiele sind die Anreicherung von Enzymen, -Pyrogenen
oder Viren zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit.
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Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen durch Verwendung eines
Konzentratgefäßes ein hoher und definierter Konzentrierungsfaktor erreicht wird,
können zur Aufkonzentr#ierung der Proteine im Harn oder Liquor cerebrospinalis vor
ihrer elektrophoretischen Untersuchung, die in der medizinischen Diagnostik von
Bedeutung ist, verwendet werden.
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Die Maßnahme nach der Erfindung führt zusätzlich zu den oben genannten-
Vorteilen zu einer kleinen Filterfläche, wodurch Adsorptionsverluste vermieden werden.
Es ergibt sich eine hohe Filtrationsgeschwindigkeit durch w-irksame Vermeidung der
Konzentrationspolarisation. Die
Makromoleküle werden mechanisch
nicht beansprucht. Es stellt sich ein minimaler Luftkontakt der Probe und dadurch
praktisch kein Gasaustausch mit der Atmosphäre ein.
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Die Filtration kann mit einer Labor zentrifuge ohne weitere Hilfsmittel
durchgeführt werden. Die gleichzeitige Filtration einer Vielzahl von Proben ist
möglich.
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Der Schwimmer taucht also im allgemeinen teilweise in die Probe im
Zentrifugenröhrchen ein. Dadurch ergibt sich an der Membran ein hydrostatischer
Druck, der unter dem Einfluß der Zentrifugalbeschleunigung mehrere bar erreicht.
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In diesem Falle.sammelt sich das Filtrat im Innern des Schwimmers.
Während normalerweise Winkel- und Schwingkopf zentrifuge gleichermaßen verwendbar
sind, muß in Gegenwart emulgierter Lipide, wie beispielsweise bei Milch, eine Winkelkopfzentrifuge
verwendet werden, um die Belegung der Membran zu vermeiden.
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Beispielsweise Ausführungsformen der Erfindung sollen nun mit Bezug
auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen in Fig. 1 eine
erste Ausführungsform; Fig. 2 eine zweite Ausführungsform; #Fig. 3 eine Variante;
Fig. 4 eine Variante mit einem zusätzlichen Element; Fig. 5 eine Variante für einen
besonderen Zweck; Fig. 6 eine Ausführungsform für Vakuumbetrieb; Fig. 7 eine besondere,
für die Praxis besonders geeignete Ausführungsform mit minimalem Restvolumen;
Fig.
8 eine Variante ohne jeden Substanzverlust im Restvolumen: Fig. 9 eine Ausführungsform
für intermittierende Zentrifugation; Fig. 10 eine Ausführungsform für größere Probenmengen;
Fig. 11 eine Variante zu Fig. 10; Fig. 12. eine Ausführungsform, die besonders für
Diafiltration geeignet ist; Fig. 13 eine Ausführungsform zur Aufkonzentrierung mit
Vakuumbetrieb; Fig. 14 eine besonders einfache Variante; Fig. 15 eine Ausführungsform
mit Auftriebskörper; und Fig. 16 eine Ausführungsform für Diafiltration und Vakuumbetrieb.
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Eine Ausführungsform zur direkten Gewinnung von Ultrafiltrat aus Blut
ist in Fig. 1 dargestellt (Zustand nach Beginn der Filtration). Die geformten Bestandteile
(Blutkörperchen) 2 befinden sich bereits am Boden des Zentrifugenröhrehens 1, der
Filtrationseinsatz (Hohlkörper/ Schwimmer) 4 mit Membran 8 schwimmt auf dem Plasma
3.
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Der seitliche Abstand 140 zwischen Einsatz 4 und Röhrchen 1 ist zur
Verdeutlichung übertrieben groß dargestellt und beträgt etwa 0,1 mm. (Bei den meist
konischen Röhrchen ist das Innenmaß im unteren Teil maßgebend). Die Abdrehung 15
dient als Speicher für aufsteigende Flüssigkeit und unterbindet die Kapillarwirkung
nach Abschalten der
Zentrifuge. Die Membrane 8, vorzugsweise eine
asymmetrische Ultrafiltrationsmembrane mit einer Trenngrenze von 20 000 Daltons,
ist mit der aktiven (filtrationswirksamen) Seite nach außen mittels eines SchweiB-
oder Fleberandes 9 derart mit dem Einsatz 4 verbunden, daß die Querdurchströmbarkeit
der Membrane in diesem Bereich unter bunden ist. (Asymmetrische Ultrafiltrationsmembranen
wei.-sen bekanntlich unter der filtrationswirksamen Schicht eine relativ grobporige
proteindurchlässige Stütz schicht auf.- Wenn also der Stanzrand der Membrane offen
bleibt, was bei Verwendung von Klebern, die nicht in die Stützschicht eindringen,
der Fall ist, kann die aktive Schicht durch die Proteinlösung "unterwandert" werden.
Bei dem bevorzugten Verfahren, der thermischen Verschweißung, ist die Dichtigkeit
gewährleistet.
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Das Filtrat 6 durchströmt nach Passieren der Meinbrane 8 ein in bekannter
Weise ausgeführtes System von einen Kanälen 10 und die Bohrung 11 und sammelt sich
im Innenraum des Einsatzes 4. Der untere Teil des Innenraums ist zur Erleichterung
der vollständigen Filtratentnahme sorzugsweise konisch ausgebildet.
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Die treibende Kraft der Filtration ist die hydrostatische Druckdifferenz,
die sich aus dem Niveauunterschied 13 zwischen Plasmaniveau 7 und Filtratniveau
5 unter dem Einfluß der Zentrifugalbeschleunigung ergibt. Mit Fortschreiten der
Filtration wird die Druckdifferenz zwar immer niedriger, doch wird davon die Filtrationsgeschwindigkeit
nicht in diesem Maße beeinflußt, weil bei asymmetrischen Ultrafiltrationsmembranen
eine Steigerung der filtrationswirksamen Druckdifferenz über ein gewisses Maß hinaus,
das von der Trennqrenze der verwendeten Membran abhängt, keine nennenswerte Steigerung
der Filtrationsleistung bewirkt. (Ein Niveauunterschied von 3 mm entspricht bei
einer Zentrifugalbeschleunigung von 3000 g einer Druckdifferenz von 0,9 bar).
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Eine Anreicherung des aufkonzentrierten Proteins an der Membranoberfläche
wird dadurch vermieden, daß das Konzentrat infolge seiner höheren Dichte (eine Erhöhung
der Proteinkonzentration um 1 g/100 ml entspricht etwa einer Dichtezunahme von 0,004
g/ml) in Richtung der-Zentrifugalbeschleunigung Z durch Konvektion zurück in die
Ausgangslösung wandert und sich mit ihr vermischt.
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In dem hier beschriebenen Anwendungsfall ist es wünschenswert, möglichst
viel Ultrafiltrat aus möglichst wenig Blut zu bekommen. Bei Blut ist hier der limitierende
Faktor der im aufkonzentrierten Plasma auftretende onkotische (ko-lloidosmotische)
Druck, weil die Filtration dann zum Stillstand kommt, wenn onkotischer Druck des
Konzentrats und wirksame hydrostatische Druckdifferenz gleich sind.
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In der Praxis liegt die obere Grenze des Anteils an ultrafiltrierbarer
Flüssigkeit hier bei etwa 50% des Ausgangsvolumens, wobei dieser Wert selbstverständlich
von Hämatokritwerten, Proteinkonzentration der Probe, der Umdrehungszahl der Zentrifuge
sowie der Geometrie von Vorrichtung und Zentrifuge abhängig ist.
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Bei der Filtration von verdünnten Pröteinlösungen kann die Filtration
schon vorzeitig zum Stillstand kommen, wenn, wie in Fig. 1 dargestellt, ein Röhrchen
mit rundem Boden benutzt wird, weil der Einsatz 4 an der Rundung anstößt. Da die
meisten handelsüblichen Zentrifugenröhrchen einen runden Boden aufweisen, muß in
diesen Fäl- -len ein halbkugeliger Verdrängungskörper mit ebener Oberseite auf den
Boden des Röhrchens gelegt werden, wenn ein Maximum an Filtratvolumen erzielt werden
soll.
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Fig. 2 zeigt eine Ausführungsform mit flachem Schwimmer 4 und flachbödigem
Zentrifugenröhrchen 100. Der Schwimmer sinkt durch Filtrataufnahme immer tiefer;
auch wenn zuviel Ausgangslösung vorhanden ist, fließt diese nicht
über
den Rand des Schwimmers ins Filtrat, wenn der Schwimmer aus einem Material von einer
Dichte, die geringer als die der Lösung ist, hergestellt ist. Wenn das nicht der
Fall ist, muß die Menge der vorhandenen Probe begrenzt werden. Bei konzentrierten
Lösungen, wie beispielsweise Blut oder Serum, kommt die Filtration schon bei einer
bestimmten Proteinkonzentration zum Stillstand, so daß eine größere Probenmenge
gewählt werden kann.
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-In Fig. 3 ist wie in Fig. 1 im oberen Teil des Schwimmers,-wo keine
Druckfestigkeit erforderlich ist, die Wandstärke #durch die Abdrehung 15 vermindert.
Dadurch ist im Zeitpunkt des Aufsitzens am Boden noch Ausgangslösung vorhanden,
die noch filtriert werden kann, ohne daß etwas über den Rand steigt Nach Fig. 4
erfüllt den gleichen Zweck der Stopfen 16, der mittig über eine Entlüftungsbohrung
verfügt und in der rohrförmigen Verlängerung 17 endet. Der Schwimmer kann nach Beendigung
der Filtration zur Gänze gefüllt sein. Bei dieser Ausführungsform steigt der. hydrostatische
Druckunterschied nach dem Absinken des Schwimmers zum Boden des Zentrifugenröhrchens
noch einmal abrupt an, bis er im Verlauf der weiteren Filtration schließlich zu
null wird.
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-Nach der Variante der Fig. 5 ist das maximale Filtratvolumen vorgegeben.
Der Stopfen ist an sich hohl (nach oben offener Hohlraum 19); das mittige Entlüftungsröhrchen
20 ist wieder vorhanden. Hierbei muß auch nicht die Dichte des Wandwerkstoffs niedriger
als die der zu filtrierenden Lösung gewählt werden, Der Schwimmer ist also immer
schwimmfähig. Sobald im Rohr das Filtrat das Außenniveau der Probe erreicht hat,
kommt die Filtration zum Stillstand.
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Nach1 Fig. 6 arbeitet man im Schwimmer mit Unterdruck als treibende
Kraft für die Filtration. Man wird eine größere Anzahl von Geräten gleichzeitig
beiSpielsweise in einem Vakuumtrockenschrank evakuieren und Rückschlagventile 210
auf den anson#sten unveränderten Stopfen 16 aufsetzen.
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Nach Belüften des Schranks beginnt die Filtration. Als Beispiel für
ein Rückschlagventil könnte nach Art eines Bunsenventils (einseitig verschlossener
Schlauch mit Einschnitt in Längsrichtung. In diesem Fall bevorzugt eine Kappe aus
Siliconkautschuk mit Einschnitt inlängsrichtung verwendet werden. Zum Unterschied
vom Betrieb in der Zentrifuge muß kein Restvolumen an Ausgangslösung in Kauf genommen
werden Eine besonders wichtige Ausführungsform zeigt Fig. 7.
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Unter der Membran kann auf den Schwimmer ein eigenes Konzentratgefäß
21 aufgesteckt werden. Die Zielsetzung dieser Ausführungsform ist es, die Verluste
an gelöster Substanz, #die in erster Linie von der Größe der durch das Konzentrat
benetzten Oberfläche abhängen, klein zu halten. Das wird dadurch e-rreicht, daß
die Aufkonzentrierung nicht im .Probenbehälter erfolgt, sondern in einem mit diesem
in Verbindung stehenden Konzentratbehälter, dessen Volumen der gewünschten Konzentratmenge
entspricht. Dabei ergibt sich gleichzeitig der Vorteil, daß nicht irrtümlich zu
weit aufkonzentriert werden kann. Um trotz dieser Maßnahme zu niedrigen Filtrationszeiten
zu kommen, muß die Probe an die Membran gelangen, ohne sich mit dem bereits gebildeten
Konzentrat zu vermischen. Das Konzentratgefäß wird aus einem Material niedriger
Dichte als der des zu filtrierenden Mediums, im allgemeinen eine. wäßrige Lösung,
hergestellt und wird somit durch seinen eigenen Auftrieb an den Schwimmer gepreßt,
so daß es keiner festen Verbindung bedarf. Das Konzentrat sammelt sich im Hohlraum
23, dessen Volumen das zu erreichende Konzentratvolumen bestimmt. Die Seitenwand
22 des Gefäßes ist über das Niveau der Membran 8 hochgezogen, wodurch vermieden
wird,
daß gebildetes Konzentrat, das im Fall von Proteinlösungen
eine höhere Dichte aufweist, entweichen kann. Für den Zufluß der Ausgangslösung
brauchen keine besonderen Maßnahmen getroffen werden, sofern das Konzentratgefäß
nicht absolut dicht mit dem Schwimmer .verbunden ist.
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Die Filterunterstützung 10 ist bei dieser Ausführungsform vorzugsweise
leicht konvex ausgeführt, wodurch verhindert wird, daß sich unterhalb der Membran
8 eine Luftblase ausbildet. Es ist dann nicht erforderlich, daß das Konzentratgefäß
vor-der Filtration mit Flüssigkeit gefüllt wird, weil die Luft am Rand vollständig
entweichen kann. Dadurch, daß die Ausgangslösung eine niedrigere Dichte als das
bereits gebildete Konzentrat aufweist, breitet sie sich unmittelbar unterhalb der
Membran 8 aus und wird dort aufkonzentriert, ohne sich vorher mit dem bereits gebildeten
Konzentrat vermischt zu haben. Um das Abnehmen des Konzentratgefäßes 21 nach Beendigung
der Filtration zu erleichtern und das Verschütten von Konzentrat bei abruptem Abziehen
vom Schwimmer zu vermeiden, kann der Rand 22 bei 222 mit sägezahnartigen Abziehschrägen
versehen sein, die mit entsprechenden Ausnehmungen in der Wand des Schwimmers in
Eingriff stehen. Das Abziehen des Konzentratgefäßes erfolgt in diesem Fall durch
eine Drehbewegung. Die Abziehschrägen können auch in der Weise ausgebildet sein,
die einen Eingriff in verschiedenen Stellungen ermöglicht, wodurch unterschiedliche
Konzentratvolumina vorgewählt werden können. Die Pfeile verdeutlichen den Strömungsverlauf,
wobei sich eine Aufkonzentrierung in einem bestimmten Verhältnis aufgrund des Zulaufs
aus der Probe 211 ergibt. Bei sämtlichen Ausführungsformen bezeichnen gleiche Bezugszeichen
gleichwirkende Teile. in Ausführungsform ähnlich Fig. 6 für Vakuumbetrieb unter
Verwendung des Rückschlagventils 210 zeiqt Fig. 8, insbesondere des Konzentratgefäßes
24.
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Die Ausgangslösung wird hier nicht von oben, sondern von unten über
die Bohrung 25 zugeführt. Die vorhandene Probe kann somit restlos filtriert werden.
Der Konzentratraum ist hier als ringförmige Vertiefung 26 ausgeführt, während die
Bohrung 25 für die Zufuhr der Ausgangslösung bis unmittelbar an die Membran 8 geführt
wird.
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Ein Substanzverlust im Restvolumen tritt nicht ein.
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Beim Arbeiten mit intermittierend laufender Zentrifuge, wie bereits
oben erwähnt, kann die Ausführungsform der Fig. 9 Vorteile bringen. Bleibt noch
bei Fig..7 eine kleine Menge der Ausgangslösung unfiltriert im Spalt zwischen Schwimmer
und Außenröhrchen, kann es wünschenswert sein, die in der Lösung befindlichen hochmolekularsn
Substanzen vollständig zu gewinnen. Dies wird dadurch erreicht, daß mit einer geeigneten
Flüssigkeit nachgespült wird. Wird dazu bereits gebildetes Filtrat benutzt, so ist
eine Verfälschung der Probe durch Anwesenheit zusätzlicher niedermolekularer Komponenten
oder das Fehlen von vorhan#denen auszuschließen. Es wird beispielsweise der Stopfen
der Fig. 4 benutzt, der zusätzlich auf der Unterseite im Filterraum über das Steigrohr
27 verfügt. Füllt sich das Innere des Schwimmers mit Filtrat, kann die vorhandene
Luft solange ungehindert entweichen, bis das Filtratniveau das untere Ende des Steigrohrs
27 erreicht hat. Schreitet die Filtration fort, so wird die restliche Luft bei 28
zu einem Luftkissen komprimiert. Fällt der hydrostatische Druck durch Abstellen
der Zentrifuge fort; es expandiert das komprimierte Luftkissen 28 und verdängt jenen
Teil des Filtrats, der sich über dem unteren Ende des Steigrohrs 27 befindet. Das
Filtrat steigt nun durch das Steigrohr und die Bohrung 29 im Stopfen zurück in die
Ausgangslösung. Bei neuerlichem Einschalten der Zentrifuge gelangt ein weiterer
Teil der gelösten Substanz in das Konzentratgefäß. Bei öfterem intermittierendem
Lauf kann die
in der Lösung vorhandene gelöste Substanzmenge mit
beliebiger Vollständigkeit in das Konzentratgefäß überführt werden. D-ie Verhältnisse
bei Stillstand sind durch den Pfeil 213 verdeutlicht.
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Ging es bisher um besonders kleine Probenmengen, so ist die Ausführungsform
der Fig. 10 für größere Probemengen geeignet. Der Schwimmer 30 verfügt über einen
unten offenen Boden und einen ringförmigen Fortsatz 36, in den die Filterunterstützung
31 eingeschoben wird. Darauf wird die Membran 33 und sodann ein O-Ring 34 gelegt.
Die Dichtkraft wird durch einen Klemmring 32 aufgebracht, der den O-Ring gegen die
Membran 33 und die Innenwand des Fortsatzes 36 drückt. Der Klemmring 32 seinerseits
wird durch die Reibung zwischen seiner Außenfläche 35 und der Innenfläche des Fortsatzes
36 in seiner Lage gehalten. Natürlich ist auch ein einschraubbarer Klemmring möglich.
Klemmring 32 und Filterunterstützung 31 werden aus einem Material einer Dichte-niedriger
als der der Ausgangslösung gefertigt, so daß sie während der Zentrifugation infolge
ihres Auftriebs gegen den Schwimmer 30 gedrückt werden.
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Das Grundgerät der Fig. 10 läßt sich in vielfacher Weise variieren:
eine Ausführung-sform für Vakuumbetrieb zeigt Fig. 11, die zusätzlich zu den in
Fig. 10 gezeigten Teiden über einenDeckel 37, der mit dem O-Ring 38 gegen den Schwimmer
30 abgedichtet ist und ein ~Überdruckventil 39 der vorbeschriebenen Art verfügt.
Es ergeben sich Ausführungen mit auswechselbarem Filter im Baukastensystem für mehrere
Anwendungszwecke unter Verwendung einer intermittierend laufenden Zentrifuge (erläutert
auch in Fig. 9).
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Fig. 12 ist besonders für die Diafiltration mit intermittierender
Zentrifuge, wieder mit Steigrohr und Proben-
oder adsorptive Abtrennung
niedrig molekularer Anteile möglich. Außen' am Schwimmer 30 ist ein analog aufgebautes
weiteres Gefäß (Schwimmer) 40 angeordnet, der aus einem Material niedrigerer Dichte
als des zu filtrierenden Mediums gefertigt ist. Dieser verfügt unten wieder über
eine Filterunterstützung mit Membran 41. Der kleine Schwimmer 40 enthält jetzt die
Probe und wird durch die Membran 33 in den großen Schwimmer hinein filtriert.
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Die abnehmbare Filterunterstützung isthier entscheidend wichtig, da
man das Gerät umdrehen kann; dann ist der Schwimmer 40 oben offen; die Probe kann
von oben eingefüllt werden und dann Filterunterstützung, Membran aufgesteckt werden,
ohne daß sich innen eine Luftblase befindet. Beim Ausführungsbeispiel trägt der
Schwimmer 40 eine Membran 41 mit einem cut-off von 20 000 Dalton, die Membran 33
am Schwimmer 30 100 000 Dalton. Wenn also die Probe Proteine mit einem Molgewicht
von weniger als 100 000 Dalton enthält, können diese die Membran 33 passieren und
gelangen ins Filtrat. Das Filtrat wird nach dem Mechanismus der intermittieren laufenden
Zentrifuge bei Stillstand nach außen gedrückt und gelangt auf diesem Weg zur Membran
41 und wird beim Passieren der Membran 41 von den Proteinen mit einem Molgewicht
von mehr als 20 000 befreit; reines Wasser bzw. Lösungsmittel wandert zurück in
die Probe. Wird dieser Vorgang oft genug wiederholt, so wird durch Diafiltration
das betreffende Protein aus der Probe ausgewaschen und bleibt im Außenraum zurück.
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Es liegt auf der Hand, daß zwischen dem Gefäß 30 und dem Schwimmer
40 in gleicher Weise noch weitere Gefäße 30 angeordnet werden können, wenn die Probe
in mehrere Fraktionen aufgetrennt werden soll. Die Anordnung der Membranen wird
dann zweckmäßig so gewählt, daß die Probe zunächst durch die Membran mit dem höchsten
cut off fil-
triert wird und in den folgenden Gefäßen die Membranen
mit den jeweils nächst niedrigen cut offs eingesetzt werden. Die für die Aufnahme
der einzelnen Fraktionen vorgesehenen Gefäße werden vor Beginn der Zentrifugation
luftfrei mit einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt.
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Beim Entsalzen einer Eiweißprobe beispielsweise kann der Filtratraum
des Schwimmers 30 teilweise mit einem Mischbettionenaustauscher gefüllt werden.
Das Filtrat durchsteigt dann den Ionenaustauscher, bevor es bei Stillstand der Zentrifuge
durch das Steigrohr wieder nach außen gelangt; d.h. das Filtrat, das in den Außenraum
gelangt, ist entsalzt und dringt bei neuerlicher Zentrifugation durch die Membran
41 wieder in die Probe ein. Man kann auch Aktivkohle statt dem Ionenaustauscher
in den Schwimmer 30 einführen.
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Bei der Ausführungsform der Fig. 13 geht es um die Aufkonzentrierung
mit Vakuumbetrieb. Hier sind Vorkehrungen getroffen, daß dann, wenn die Probe vollständig
verbraucht ist, verhindert wird, daß in das Konzentratgefäß 42 Luft nachsteigt.
Im Unterschied zu Fig. 11- steckt in dem Fortsatz 36 des Schwimmers nicht der Klemmring,
sondern ein Konzentratbehälter 42, der zunächst die gleiche Klemmfunktion wie der
Klemmring ausübt, darüber hinaus aber noch ein Volumen, nämlich das Konzentratvolumen
definiert.
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In diesem Konzentratbehälter 42 steckt herausnehmbar ein Einsatz 43,
der durch die Dichtung 44 gegen den Konzentratbehälter 42 abgedichtet ist und über
einen rohrförmigen Fortsatz 51 bis mmittelbar unter die Membran reicht. Zur Entnahme
des Konzentrats wird das Gerät umgedreht und der Einsatz 43 herausgezogen. Für Vakuumbetrieb
ist noch ein zusätzlicher Filter 45 vorgesehen, das in der oben beschriebenen Weise
festgeklemmt ist, aber ein Porenfilter darstellt und beispielsweise über eine Porengröße
von 0,2 4 verfügt. Filter dieser Art haben die
Eigenschaft, im
nassen Zustand Luft erst bei einem höheren Druck passieren zu lassen. Wenn keine
Probe mehr vorhanden ist, wird die Filtration somit beendet Diese Anordnungkann
auch in der Zentrifuge benutzt werden, wobei das Filter 45 dann zwar überflüssig
ist, jedoch auch zur Vorfiltration oder Sterilfiltration herangezogen werden kann.
Das überdruckventil 39 fällt fort.
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Eine besondere einfache Ausführungsform läßt Fig. 14 erkennen, wo
funktionsmäßig gleiche aber anders gestaltete Bauteile wieder gleiche Beziehungen,
jedoch mit Index "a" tragen. Der Anschluß des Deckels 37a geschieht hierbei allerdings
direkt an einen Vakuumschlauch. Im Deckel sitzt ein Ultrafilter 50, unterhalb des
Konzentratgefäßes 43a ein Porenfilter 45a. Das Konzentratgefäß 43a is-t auf seiner
Unterseite als Filterunterstützung mit Kanälen in Richtung zur mittigen Bohrung
52 ausgebildet. Die Zufuhr der Probe kann durch Einlegen des Geräts in einen Probenbehälter
oder durch einen in die Bohrung 54 eingesteckten Schlauch aus einem beliebigen Gefäß
erfolgen.
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Das Andrücken des O-Ringes 56 erfolgt durch das Gehäuse 53. Die Entnahme
des Konzentrats erfolgt nach Abnehmen des Gehäuses 53 und Herausziehen des Gummistopfens
55.
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Diese Anordnung kann in Verbindung mit dem Schwimmer 30, und Rückschlagventil
39 analog zu Fig. 13 im Vakuumbetrieb ohne geschlossenen Vakuumschlauch oder in
Verbindung mit Schwimmer 30 in der Zentrifuge benutzt werden.
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Eine weitere bevorzugte Anwendungsmöglichkeit unter geringfügiger
Abwandlung der Bauteile von Fig. 14 und zusätzlicher Verwendung des Auftriebskörpers
58 ist in Fig. 15 dargestellt. Die erwähnten Modifikationen betreffen die zusätzlich
angebrachten Bohrungen 61 und 60 im Deck#el 37b und die Bohrung 62 im Gehäuse 53.
Anstelle
der Porenmembrane 45a von Fig. 14 befindet sich die Ultrafiltrationsmembrane
601, und zwar mit der filtrationswirksamen Seite nach innen. Ferner dichtet die
O-Ringdichtunq 57 den Spalt zwischen Deckel 37b und Zentrifugenglas 63 gleitend
ab. Der erwähnte .Auftriebskörper 58 weist vorzugsweise keine feste Verbindung mit
dem Gehäuse 53 auf, kann aber auch als Teil davon ausgeführt sein. Der Auftriebskörper
58 kann ein allseitig dichter, luftgefüllter Hohlkörper sein, der einem Außendruck
von mindestens 3 bar zu widerstehen vermag oder zur Gänze aus geschäumtem, nach
außen dichtem, gegen Außendruck beständigem Material bestehen. Die mittlere Dichte,
d.h. Masse durch Außenvolumen, liegt niedriger als die des zu filtrierenden-Mediums,
vorzugsweise unter 0,7 g/cm3, ganz besonders bevorzugt sind mittlere Dichten unter
0;5 g/cm3. Die mittlere Dichte des Auftriebskörpers wird so mit seinen Dimensionen
abgestimmt, daß er, bezogen auf die Querschnittsfläche des Zentrifugenglases einem
Auftrieb von mindestens 1 g/cm2 ausübt, was einer Druckdifferenz von 1 cm Wassersäule
entspricht.
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Der Zusammenhang zwischen den genannten Größen wird im folgenden mathematisch
verdeutlicht: V - Außenvolumen des Auftriebskörpers 58 (cm3) F = Innere Querschnittsfläche
des Zentrifugenglases 63 (cm2) A = mittlere Dichte des Auftriebskörpers 58 (g/cm3)
g = Dichte des zu filtrierenden Mediums (g/cm2) A = Auftrieb (g)
Das gewählte Volumen muß also der Beziehung
entsprechen.
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Je kleiner also die mittlere Dichte des Auftriebskörpers gewählt wird,
umso kleiner kann sein Volumen sein und umso größer das Volumen der zu filtrierenden
Probe.
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Die Anwendung des Geräts erfolgt in folgender Weise: Auftriebskörper
58 und die in der dargestellten Anordnung montierten, Teile werden bis zum Boden
des Zentrifugenglases 63 geschoben. Die vorhandene Luft entweicht dabei über das
Überdruckventil 39. Um das Totvolumen klein zu halten, ist der untere Teil des Auftriebskörpers
vorzugsweise der Innenraum des Zentrifugenglases angepaßt. Nun wird die Ausgangslösung
64 eingefüllt. Sie befindet .sich also zu Beginn der Filtration oberhalb des Geräts.
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In Fig. 15 ist der Zustand nach Beginn der Zentrifugation dargestellt.
Die Vorrichtung hat sich infolge ihres Auftriebs nach oben bewegt, unterhalb befindet
sich bereits gebildetes Filtrat 65. Die Filtration ist dann beendet, wenn die Vorrichtung
ganz nach oben gestiegen ist.
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Die Funktionsweise des Geräts ist die folgende: Infolge de.s Auftriebskörpers
58 bildet sich zwischen dem Filtrat 65 (unterhalb der Dichtung 57) und der Ausgangslösung
64 ein hydrostatischer Druckunterschied aus, der gegeben ist durch die Beziehung:
RZB = relative Zentrifugalbeschleunigung.
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Selbstverständlich muß auch der Dichteunterschied der übrigen Bauteile
zu der Ausgangslösung berücksichtigt werden, der jedoch bei Verwendung von Kunststoffen
nicht qroß ist.
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Die Ausgangslösung 64 tritt durch die Durchtrittsbohrung 60 (es werden
vorzugsweise mindestens drei derartige Bohrungen in gleichen Abständen angebracht)
in das Gerät ein und strömt an der Membrane 601 entlang zu der Durchtrittsbohrung
52 im Konzentratgefäß. Dabei tritt bereits eine Teilfiltration ein, weil auch die
Innenseite.des Deckels 53 als Filterunterstützung ausgebildet ist. Das Filtrat entweicht
durch die Bohrung 54 auf die Filtratseite. Die bereits teilweise aufkonzentrierte
Ausgangslösung fließt nun vom Mittelpunkt der Membrane 33 nach außen und wird weiter
aufkonzentriert. Das Konzentrat 66 sammelt sich im ringförmigen Konzentratraum des
Konzentratbehälters.
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Das an der Membrane 33 gebildete Filtrat fließt durch die Bohrung
61 im Deckel 37b und die Bohrung 62 im Gehäuse 53 in den Filtratraum (auch diese
Bohrungen können mehrfach vorhanden sein).
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Die Ausnehmung 59 an der Unterseite des Auftriebskörpers 58 umschließt
eine Luftglocke, die durch den hydrostatischen Druck des Filtrats komprimiert wird.
In bereits beschriebener Weise expandiert dieses Luftkissen, wodurch ein entsprechendes
Volumen durch die Bohrungen 62 und 61 sowie das überdruckventil 39 zurück auf die
Oberseite des Gerätes befördert wird (infolge der-Reibung zwischen der Dichtung
57 und dem Zentrifugenglas 63 wird nicht das ganze Gerät nach oben gedrückt, sondern
es öffnet sich zuvor das überdruckventil 39) bei neuerlicher -Zentrifugation können
in der Bohrung 60 und unterhalb des Konzentratgefäßes 43a verbliebene Reste nachgespült
werden.
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Auf die Ausnehmung 59 kann auch verzichtet werden. In diesem Fall
kann man durch manuelles Zurückdrücken der Vorrichtung Filtrat zum Nachspülen nach
oben befördern.
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An der Membran 601 stimmen Beschleunigungsrichtung und Filtrationsrichtung
wie in konventionellen Filtrationsgeräten überein. Konzentrat kann sich daher an
der Membrane anreichern. In den bevorzugten Anwendungen ist das jedoch von geringerer
Bedeutung, weil sehr verdünnte Lösungen filtriert werden und hohe Konzentrationen
erst an der Membrane 33 erreicht werden. Die Membrane 601 soll nur die erforderliche
Filtrationszeit vermindern und kann, wenn das nicht erforderlich, auch wegbleiben,
sofern auch die Bohrung 54 nicht vorhanden ist.
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Nach Abnahme des Überdruckventils 39 kann die Vorrichtung aus dem
Zentrifugenglas 63 herausgezogen und das Konzentrat wie bei Fig. 14 beschrieben,
entnommen werden.
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Die vorbeschriebenen Vorrichtungen, die mit Konzentratgefäßen arbeiten,
müssen in einer Schwinkopfzentrifuge betrieben werden, weil in einer Winkelkopfzentrifuge
das Konzentrat über den Rand hinauslaufen würde.
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Geht es nur -um die Filtratgewinnung oder eine nur geringe Aufkonzentrierung
der Probe wie bei den Ausführungsformen 1 und 10, so kann grundsätzlich auch eine
Winkelkopfzentrifuge benutzt werden, allerding#s bei geringerem Füllniveau.
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Eine Ausführungsform für Diafiltration mit Vakuumbetrieb gibt im übrigen
noch Fig. 16, wo die Teile lediglich anders zusammengesteckt sind. Vakuum wird wieder
angelegt, die Spülflüssigkeit dringt von unten über die Membran 33 ein. Unter dem
Deckel 37 ist ein Klemmring 54 vorgesehen; der untere Teil des Deckels 37 ist wie
der Fortsatz 36
in den früheren Figuren ausgebildet. Die Probe
befindet sich innerhalb des Schwimmers 30, die Spülflüssigkeit im Außengefäß.
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