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Bei
zahlreichen präparativen
und analytischen Anwendungen der Flüssigchromatographie kann das
Sammeln der eluierten Substanzen erforderlich sein. Dies ist bei
der Analytik insbesondere dann der Fall, wenn die an den Detektoren
erfassten Peaks chemisch nicht identifiziert sind oder mehrere Stoffe
enthalten, die mit einem zusätzlichen
Trennverfahren analysiert werden müssen. Obwohl für die automatische
Aufteilung des Eluatstromes kommerzielle Fraktionssammler zur Verfügung stehen,
wird die Folge-Analytik häufig
dadurch erschwert, dass der chromotographische Trennprozess mit
Verdünnung
verbunden ist oder dass die zur Elution verwendeten gelösten Substanzen
störend
wirken. Hierdurch können
Substanzverluste entstehen, die den Einsatz größerer Säulen oder einen höheren Aufwand
bei der Probenvorbereitung erforderlich machen.
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Die
in
DE 1.9913416 A1 vorgestellte
Vorrichtung zum Filtrieren von Flüssigkeiten kann diesen Nachteil
auch nicht abstellen, da hier von außen in eine Hohlfaser filtriert
und primär
auf kleine Druckdifferenzen bei großen Volumenströmen abgestellt wird,
welche erfahrungsgemäß in der
Chromatographie nicht realisiert werden.
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Aus
diesen grundsätzlichen
technischen Problemen ergibt sich als Aufgabe der Erfindung die Bereitstellung
einer Vorrichtung, die das Sammeln der eluierten Zielsubstanz mit
der Abtrennung des flüssigen
Elutionsmittels und dem Aufkonzentrieren verbindet. Die Aufgabe
wird durch ein Verfahren und eine Vorrichtung, die in den unabhängigen Ansprüchen 1 und
5 dargestellt sind, gelöst.
Vorteilhafte Ausführungen
des Verfahrens und der Vorrichtung sind Gegenstand abhängiger Unteransprüche.
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Dem
Verfahren liegt der Gedanke zugrunde, die aus. der Säule austretenden
Flüssigkeitsportionen,
welche die interessierende Substanz enthalten, in ein Hohlfasersegment
und nachfolgend durch dessen Membran zu leiten. Durch den Anschluss
eines verschlossenen Hohlfasersegmentes an die chromatographische
Fließstrecke
gelingt es so bei richtiger Wahl der Größenausschlussgrenze der Hohlfasermembran,
beim Sammeln der chromatographisch abgetrennten Substanz das Elutionsmittel
und gegebenenfalls weitere permeable Stoffe von der interessierenden
Substanz zu trennen und letztere zu konzentrieren. Besonders vorteilhaft
ist die Vorrichtung für
die chromatographische Isolation von Polymeren, weil in diesem Fall
ein zusätzlicher
Reinigungsprozess, nämlich
die Abtrennung etwa noch vorhandener niedermolekularer Begleitstoffe,
mit dem Konzentrationsprozess kombiniert werden kann. Entweder wird
der Eluatstrom aus einer Säule
mit Hilfe eines Mehrkanalschalters portioniert und in einer bestimmten
Reihenfolge durch die Membran von mehreren Hohlfasersegmenten geleitet,
oder eine definierte Portion des Eluatstromes, der das Zielprodukt
enthält,
wird durch die Membran eines Hohlfasersegmentes bewegt. Im Allgemeinen
wird das Lumen der Hohlfaser zum Sammeln genutzt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung
kombiniert die hohe Druckbelastbarkeit, die hohe Volumenflussleitfähigkeit
und die günstige
Oberflächen/Volumen-Relation
kommerzieller Hohlfasern für
die Umkehr-Osmose, die Nanofiltration, Ultrafiltration oder die
Mikrofiltration mit den leistungsfähigen Pumpsystemen und Trennverfahren moderner
Chromatographie-Geräte.
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Es
ist vorteilhaft, dass die stark aufkonzentrierte Substanz verlustfrei
und bequem aus dem Hohlfaserlumen entnommen und sofort für ein weiteres
Trennverfahren in konzentrierter Form eingesetzt werden kann. Wird
beispielsweise Elektrophorese oder Elektrofokussierung angeschlossen,
können
Ionen oder andere störende
Substanzen bequem entfernt oder ausgetauscht werden. Hierzu wird
das beidseitig verschlossene Hohlfasersegment mit der für die Trennung
optimalen Flüssigkeit
gewaschen.
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Die
Hohlfasersegmente können
entweder in trockener, gasgefüllter
Form an die Fließstrecke
angeschlossen werden, oder sie sind bereits vor dem Einstrom des
Eluates mit Flüssigkeit
gefüllt.
Bei einem kontinuierlichen Elutionsprozess kann eine Fraktionierung
des Eluates mit Hilfe eines Mehrkanalschalter geschehen. Bei diskontinuierlicher
Elution ist es vorteilhaft, nur den Teil der eluierten Flüssigkeit,
der die Zielsubstanz enthält,
durch die Hohlfasermembran zu leiten. Um den Sammel- und Konzentrierungsvorgang
zu starten, wird das Eluat in eine Fließstrecke gelenkt, die durch
die semipermeable Membran des Hohlfasersegmentes führt. Dies kann
durch den Anschluss des bereits verschlossenen Hohlfasersegmsegmentes
an die Fließstrecke oder
durch Anbringen eines Verschlusses an ein offenes Hohlfasersegment,
das sich in der Fließstrecke befindet,
erfolgen.
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Wird
der wasserhaltige Eluatstrom in eine bereits an ihrem Ablauf verschlossene
hydrophile Hohlfaser geleitet, ist es von Bedeutung, dass eingeschlossenes
Gas vollständig
verdrängt
werden kann. Erfindungsgemäß dient
hierzu ein gasdurchlässiger Verschluss,
der eine hydrophobe, poröse
Membran enthält.
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In
einer erfindungsgemäßen Variante
der Vorrichtung werden die Hohlfasersegmente als Sammelgefäße in einen
Fraktionssammler integriert. Hierdurch entsteht ein Fraktionssammler,
der konzentrierend und selektierend wirkt. Sein Konstruktionsprinzip
besteht in der druckfesten, dichten und schaltbaren Verbindung der
dem Säulenausgang nachgeschalteten
Fließsstrecke
mit mehreren Hohfasersegmenten. Es wird beispielsweise durch einen elektronisch
gesteuerten Vielkanalschalter realisiert. Ein Vorteil dieses Fraktionssammlers
besteht neben der Selektion der unpermeablen Eluatbestandteile und
der konzentrierenden Wirkung auch in einem geringen Gewicht und
einem geringen Platzbedarf.
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In
einer weiteren Variante der Vorrichtung werden die Hohlfasersegmente
mit Chromatographiesäulen
für die
Ausschlusschromatographie verbunden, um nur eine Eluatfraktion
mit einem Zielprodukt, beispielsweise die im Ausschlussvolumen eluierte
DNA, in konzentrierter Form zu sammeln. Für derartige und zahlreiche
weitere Anwendungen in der Analytik und Probenvorbereitung können bekannte
Vorrichtungen zum Parallelbetrieb mehrerer gleichartiger Säulen eingesetzt
werden. In diesen Vorrichtungen werden gleichzeitig durch jedes
Bett gleiche Portionen einer Flüssigphase
mit der gleichen Kraft bewegt. Entsprechende Zentrifugations- und
Saugvorrichtungen werden seit langem für den Parallelsäulenbetrieb
in chromatographischen Verfahren eingesetzt. Sie eignen sich in
der bisher bekannten Form vor allem für hochselektive Trennprozesse,
bei denen ein Sorptionsvorgang, ein Waschvorgang und ein Desorptionsvorgang
aufeinander folgen. Bei diesen Trennprozessen spielt die Effizienz
(Trennstufenhöhe,
Trennstufenzahl) keine Rolle und es kommt nicht darauf an, einzelne
Eluatportionen abzutrennen.
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Es
ist vorteilhaft, wenn beim Parallelbetrieb mehrer Chromatographiesäulen in
jeder Säule
nur der Teil des Elutionsmittelflusses durch die Hohlfasermembran
geführt
wird, der die Zielsubstanz enthält.
Erfindungsgemäß wird der
Fluss durch jede Säule
automatisch auf Grund der Kapillarspannung des Elutionsmittels im
feinporigen oberen Abschluss jedes Bettes unterbrochen, nachdem
die Probeflüssigkeit
oder eine bestimmte Portion des Elutionsmittels vollständig in
das Bett eingeströmt
ist. Dies ermöglicht
es, parallel in zahlreichen Säulen
die gleichen Volumenfraktionen durch das Bett zu bewegen, auch wenn
die Fließgeschwindigkeit
in den einzelnen Säulen
variiert. Zum parallelen Sammeln und Aufkonzentrieren der Zielsubstanz
wird ein definiertes Elutionsmittelvolumen auf das Bett geschichtet
und danach eine ebenso große
definierte Portion des Eluatstromes durch die Hohlfasermembran gelenkt.
Die dargestellten Verfahren und Vorrichtungen erweitern den Anwendungsbereich
der bekannten Vorrichtungen zum Parallelsäulenbetrieb. Sie ermöglichen
das parallele selektive und konzentrierende Sammeln chromatographisch
getrennter unpermeabler Stoffe aus einer eng begrenzten Volumenfraktion
des Eluatstromes. Dies ermöglicht
die Nutzung der Vorrichtungen zum Parallelbetrieb zahlreicher Chromatographiesäulen auch
zur Durchführung
solcher Verfahren wie der Größenausschlusschromatographie
oder der Umkehrphasenchromatographie, in denen eine hohe Trennstufenzahl
ausgenutzt werden kann.
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Die
Erfindung wird im folgenden an Hand von Anwendungsbeispielen erläutert.
- 1. Die Erfindung wird zur Bereitstellung eines
selektiv und konzentrierend wirkenden Fraktionssammlers eingesetzt.
Ein Vielkanalschalter mit 20 Schalterstellungen ist über 20 Kapillaren
und ebenso viele Ansatzstücke
druckdicht mit Hohlfasersegmenten verbunden. Er wird mit seinem
Eingang an den Detektorausgang einer HPLC-Anlage angeschlossen.
Es werden beispielsweise Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie
getrennt. Die Hohlfasersegmente wurden aus einer kommerziellen Ultrafiltrationsfaser
mit hoher Permeabilität
für Salzlösungen und
einer Molmassenausschlussgrenze von ca. 10 kDa hergestellt und sind
durch einen nadelförmigen
Teflonstopfen verschlossen. Jedes Segment wird nach aussen durch
ein offenes mit Flüssigkeit
gefülltes
Rohr aus Acrylglas vor dem Austrocknen geschützt. Unten sind die Rohre mit
einem gemeinsamen Abfluss verbunden. Der Abfluss führt in einen
Siphon, der verhindert, dass die Flüssigkeit aus den Acrylglasrohren
vollständig
ausläuft.
Der Vielkanalschalter wird manuell oder in geeigneter Weise automatisch,
z.B. mit Hilfe eines Schrittmotors betätigt. So ist es möglich, den
Eluatfluss zeitgesteuert in festgelegter Reihenfolge oder in Abhängigkeit
von der Detektion durch unterschiedliche Hohlfasersegmente zu bewegen.
Nach dem Abschluss der Elution werden die Hohlfasersegmente nacheinander
von den Anschlusskapillaren getrennt und an ihrem Ansatzstück aus den
Acrylglasröhren
herausgezogen. Zur Identifizierung der in den Hohlfasersegmenten
gesammelten Proteine sollen Verfahren angeschlossen werden, bei
denen die hohe Salzkonzentration des Elutionsmittels stört, z.B. Gelelektropherese
oder Elektrofokussierung. Daher wird das Hohlfasersegment vor der
Entnahme der aufkonzentrierten Proteinfraktion am oberen Ansatzstück durch
einen passenden Stopfen verschlossen und mit dem Elektrophorese-Puffer oder
mit einer verdünnten
Neutralsalzlösung
gewaschen. Um die Entnahme der Proteinlösung zu erleichtern, ist das
Ansatzstück
so beschaffen, dass es auf eine kommerzielle Pipettenspitze aufgesteckt
werden kann. Die Entnahme kann so vor sich gehen, dass der Stopfen
nach dem Ansetzen der Kolbenhubpipette abgenommen wird, und der Inhalt
des Hohlfasersegmentes in ein Röhrchen ausgepresst
wird. Alternativ kann die Pipette in der Saugposition angesetzt
werden. Nach dem Herausziehen des Stopfens strömt die Proteinlösung in
die Pipettenspitze.
- 2. Die Erfindung wird zur Isolation konzentrierter, reiner DNA
aus einem proteinhaltigen Rohextrakt durch Größenausschlusschromatographie
eingesetzt.
Eine 4 ml fassende, nach unten konisch verengten
Säule aus
Polypropylen endet unten in einem kapillaren Ausgang, der von einer
kreisförmigen Filterplatte
aus porösem
Polypropylen mit einem Durchmesser von 3 mm abgedeckt ist. Auf dieses Filter
wird ein 60 mm hohes Bett aus Sporopollenin-Mikrokapseln entsprechend WO 03/078048 geschichtet.
Eine 100 mm lange Ultrafiltrationsfaser der Firma Membrana GmbH
aus Polyethersulfon mit einem Außendurchmesser 1 mm, einem Lumendurchmesser
0.7 mm und einer nominellen Ausschlussgrenze für Proteine von 70 kDa ist mit Hilfe
einer Silikongummi-Dichtung in einen Kunststoff-Adapter eingedichtet.
Mit Hilfe des konischen Adapters wird das Hohlfasersegment an die
konisch verengte Säule
angeschlossen. Das Bett wird oben durch eine 2 mm dicke Schicht
aus Glaskugeln mit einem Durchmesser von ca. 5 μm abgeschlossen. Das Bettvolumen
beträgt
1,5 ml. Die Mikrokapseln sind für
Proteine und andere Polymere bis zu einem Stokesschen Radius von ca.
50 nm hoch permeabel. DNA und andere extrem große Makromoleküle mit einem
Stokesschen Radius über
100 nm werden dagegen vollständig
ausgeschlossen. Zum Transport der Flüssigphase wird die konische
Säule mit
dem angeschlossenen Hohlfasersegment in die passende Bohrung eines
Silikongummistopfens, der sich auf einer Saugflasche befindet, eingebracht.
Wird Wasser oder eine wässrige
Lösung
mit dem Unterdruck von 0,6 bar durch die Säule gesaugt, kommt der Fluss
zum Stehen, nachdem die aufgetragene Flüssigkeit vollständig in
das Bett gesaugt wurde, weil die Adhäsion des Wassers und seine
Oberflächenspannung
in den feinen hydrophilen Poren zwischen den Glaskugeln den Durchtritt
von Luft durch diese Schicht verhindert.
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Zur
Reinigen und zum Aufkonzentrieren der DNA aus dem Rohextrakt werden
nacheinander folgende Arbeitsschritte durchgeführt. 1. Waschen der Säule mit
2 ml der als Elutionsmittel dienenden wässrigen Lösung (50 mM Ammoniumhydrogencarbonat), 2.
Verschließen
der Hohlfaser mit einer passenden Nadel aus Teflon, 3. Auftragen
und Einsaugen von 0,1 ml eines proteinhaltigen partikelfreien Rohextraktes,
4. Auftragen und Einsaugen von 0,6 ml des Elutionsmittels. Das Verschließen der
Hohlfaser führt dazu,
dass das Eluat durch die Membran strömen muss. Dabei bleibt die
Fließgeschwindigkeit
unverändert,
weil die hydraulische Leitfähigkeit
des chromatographischen Bettes weit unter der hydraulischen Leitfähigkeit
der Hohlfaser liegt. Hochmolekulare DNA, die nicht in die Mikrokapseln
diffundiert, wird mit einem relativen Elutionsvolumen von 0,3 bis
0,4 eluiert und befindet sich nach dem 4. Arbeitsschritt in dem
Hohlfasersegment. Das bisher aufgetragene Volumen reicht jedoch
für die
Elution der Proteine und der Komponenten des Lysepuffers nicht aus,
da diese Stoffe durch den Austausch mit dem Lumen der Mikrokapseln
verzögert
werden. Die konzentrierte Lösung
der gereinigten DNA wird mit Hilfe einer an den Adaptor passenden
Kolbenpipette in das Analysengefäß abgepresst.
Die hohe Reinheit und der isolierten DNA wird durch das hohe Verhältnis der
Extinktionen E250/E280 (> 1,7) belegt. Die Anwendung
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
hat in Verbindung mit der ausschlusschromatographischen Wirkung der
Sporopollenin-Mikrokapseln den Vorteil, dass das Zielprodukt, hier
bestehend aus extrem großen DNA-Molekülen, in
gereinigter und gleichzeitig konzentrierter Form vorliegt. Außerdem ist
vorteilhaft, dass die Flüssigkeit,
in der die DNA in der Hohlfaser gelöst ist, in Abhängigkeit
von der anschließenden analytischen
oder präparativen
Verwendung (z.B. PCR, Pulsfeldelektrophorese, e.t.c.) bestimmt werden
kann. Dies kann entweder durch die Wahl des vor der Probe aufgetragenen
Laufmittels oder nachträglich
durch Einlegen des beidseitig verschlossenen Hohlfasersegmentes
in die gewünschte
Lösung geschehen.
Enthält
der Rohextrakt außer
Proteinen z.B. hochmolekulare RNA, kann eine kleine Menge eines
RNAse-haltiger Elutionspuffer vor der Probe auf die Säule aufgetragen
werden. Hochmolekulare RNA, die ohne diese Maßnahme gemeinsam mit der DNA
eluiert würde,
kommt auf diese Weise in Kontakt mit dem hydrolytisch wirkenden
hochaktiven Enzym, wird gespalten und gemeinsam mit den Proteinen eluiert.
- 3. Die Erfindung wird in einer Saugvorrichtung zum
Parallelbetrieb mehrerer Säulen
eingesetzt, um ein abgetrenntes Protein selektiv zu sammeln und
zu konzentrieren.
Es werden Hohlfasersegmene für die Ultrafiltration
mit einer Länge
von 10 cm, einem Außendurchmesser
von 1 mm und einem Lumendurchmesser von 0,6 mm verwendet. Sie sind
in einen Silikongummi-Adapter eingeklebt. Das Molmassen-Cut-off
für Proteine
beträgt
ca. 10 000 Da. Für jedes
der Hohlfasersegmente ist für
den Verschluss des Ablaufes eine Teflon-Nadel vorgesehen. Jedes Hohlfasersegment
wird mit Hilfe des Adapters dicht an den Ausgang einer 5-ml-Einwegspritze
angeschlossen, die ein gequollenes 1-ml Bett- aus Superdex 200 HR
enthält.
Das Bett ist oben mit einer feuchten Zellulose-Mikrofiltrationsmembran abgeschlossen.
Letztere bildet eine Gasdurchbruchsbarriere bei Druckdiffeenzen
unter 1 bar. Zwölf
derartige Chromatographie-Säulen
mit angeschlossenen Hohlfasersegmenten werden an eine käufliche
Saugvorrichtung zum Parallelbetrieb von Chromatographiesäulen angeschlossen.
Der Auslauf der Hohlfasern ist zunächst offen.
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Die
Vorrichtung wird eingesetzt, um den Gehalt verschiedener gepufferter
Extrakte an α-Glucose-bindender
Lektinen (Kohlenhydrate-bindende Proteine) quantitativ zu ermitteln.
Der pH-Wert und die Elektrolytzusammensetzung des Bindungspuffers
ermöglichen
die Bindung der Lektine an die terminalen, in α-1/6-Bindung vorliegenden Glukosemoleküle des Dextrans,
das in den Superdex-Partikeln in vernetzter Form vorliegt. Zunächst werden
3 ml des Puffers, danach 3 ml jeden Extraktes durch die Säulen bewegt.
Jedes Bett wird anschließend
mit 3 ml des Bindungspuffers gewaschen und so von den nicht bindenden
Proteinen befreit. Nun wird jede Säule aus der Dichtung herausgenommen,
der Hohlfaserausgang wird verschlossen, und die Säulen werden
wieder in die Saugvorrichtung eingepasst. Anschließend werden
durch jedes Bett 3 ml eines zur Desorption des Lektins geeigneten
maltosehaltigen Puffers und zuletzt 3 ml entionisierten Wassers
gewaschen.
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Befanden
sich Lektinmoleküle
mit der gesuchten Spezifität
in dem Extrakt, wurden diese nun in gereinigter und konzentrierter
Form in der an diese Säule
angeschlossenen Ultrafiltrationsfaser vor. Nachdem der Adapter von
der Spritze genommen wurde, kann der Inhalt des Faserlumens mit
geringem Luftdruck in ein Probenröhrchen entleert werden. Die
Saugvorrichtung für
den Parallelbetrieb mehrerer Säulen
kann in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Sammelvorrichtung und dem
erfindungsgemäßen feinporigen
Abschluss des chromatographischen Bettes für die parallele Durchführung verschiedenster
chromatographischen Prozesse eingesetzt werden. In allen Fällen erleichtert
die Ventilwirkung der feinporigen Membran oder der feinporigen Schicht
das parallele Handling der Säulen,
da in allen Säulen
der Flüssigkeitsstrom
nach dem vollständigen
Einsaugen der auf diese Membran oder Schicht aufgetragenen Flüssigkeitsportion
beendet wird.
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Im
dargestellten Beispiel wird der Eluatstrom vor der Elution des Lektins
axial durch die Hohlfaser geleitet. Erst bei der spezifischen Elution
des Lektins mit Hilfe des Zuckerliganden wird das Hohlfasersegment
unten verschlossen, wodurch das eluierte Lektin konzentriert und
vom Überschuss
des Elutionsmittels befreit wird.
- 4. Die Saugvorrichtung
zum Parallelbetrieb wird für
die chromatographischen Reinigung von DNA durch Ausschlusschromatographie
eingesetzt. Dabei kommen Säulen
zum Einsatz, die bereits unter 1. beschreiben wurden. An die Säulen wird vor
dem Auftragen des proteinhaltigen Rohextraktes ein am Ende verschlossenes
Hohlfasersegment mit Hilfe des Adapters angeschlossen. Damit beim
Einströmen
des Eluates die Luft aus dem Hohlfasersegment entweichen kann, besitzt
das Hohlfasersegment an seinem unteren Ende einen gasdurchlässigen,
für wässrige Lösungen undurchlässiger Verschluss.
Der Verschluss besteht aus einer 10-μl-Pipettenspitze aus Polypropylen mit
kapillarem Ausgang, in den das einseitig verschlossene Segment einer
feinporigen Hohlfaser aus Polypropylen (Typ Accurel PP 50/280, Firma Membrana
GmbH, Wuppertal) mit einem Außendurchmesser
von 0,280 mm eingeklebt wurde. Die konische verjüngte Pipettenspitze endet nun in
dem verschlossenen Polypropylen-Membranschlauch. Sie wird als Stopfen
in das Hohlfasersegment eingeführt
und bildet einen gasdurchlässigen
Verschluss für
die Flüssigkeitsbewegung. Nach
der Elution der DNA wird das Hohlfasersegment von den Säulen abgenommen
und die konzentrierte und gereinigte DNA-Lösung mit Hilfe einer an den
gasdurchlässigen
Verschluss passenden Kolbenpipette verlustarm in ein Gefäß oder eine
weitere Trennvorrichtung abgepresst.
- 5. Die Erfindung wird in einer Zentrifugationsvorrichtung zum
Parallelbetrieb mehrerer Säulen
eingesetzt.
Am Swing-out-Rotor einer programmierbaren Zentrifuge
befinden sich in den Metallbechern des Rotors zylindrische Kunststoff-Einsätze mit
einem Außendurchmesser
von 100 mm. Jeder Einsatz besteht aus zwei zylindrischen Teilen,
die genau in den Metallbecher passen und in diesem aufeianander
gestellt werden können.
Das Unterteil hat die Form eines Bechers. Es ist 50 cm hoch, besitzt eine
8 mm starke Wand und einen 5 mm starken Boden. Das obere Teil ist
auf einer kreisrunden 30 mm starken Platte 1 aufgebaut. In dieser
Platte befinden sich radiärsymmetrisch
angeordnete 20 mm tiefe Bohrungen, welche als Halterung für die Säulen dienen.
Als Säulen
dienen Einwegspritzen mit konischem exzentrischem Ausgang. Jede Bohrung
besitzt zwei exzentrische Abflusskanäle, in welche der Ausgang der
Säulen
eingesteckt werden kann. Außerdem
besitzt das Oberteil drei 40 mm lange Füße, die 10 mm von seinem äußeren Rand
befestigt sind und einen zentral gelegenen Griff, mit dem es im
auf das Unterteil gesetzt werden und wieder herausgenommen werden kann.
Sowohl das Unterteil als auch das Oberteil des Kunststoffeinsatzes
besitzen am Rand eine 1 mm tiefe und 1 mm starke axiale Kerbe, die
dem Druckausgleich beim Einsetzen in den Metallbecher oder beim
Herausnehmen aus dem Metallbecher dient. Einer der Abflusskanäle führt über einen
Schraubadapter in das 30 mm langes unten verschlossenes Segment
einer Ultrafiltrationsfaser Der Außendurchmesser der Ultrafiltrationsfaser
beträgt
2 mm, der Innendurchmesser 1 mm. Die Säulen können in zwei Positionen in
die Halterung eingesetzt werden. In einer Position ist der Ausgang
der Säule
mit dem offenen Abfluss, in der anderen mit dem unten verschlossenen
Hohlfasersegment verbunden. Jede Säule enthält unten ein chromatographisches
aus einem feinkörnigen,
druckfesten Trennmaterial für
die Reinigung von Proteinen oder Polymeren durch Ionenaustausch-Chromatographie.
Das Bett ist oben durch eine hydrophile Mikrofiltermembran abgeschlossen.
Das über
dem Bett liegende Säulenvolumen dient
der Aufnahme der Flüssigkeit,
die durch das Bett bewegt werden soll. Die feinporige hydrophile Membran
verhindert das Eindringen von Luft in das Bett. Um das Trockenlaufen
der Säulen
zu vermeiden, wird darauf geachtet, dass die Zentrifugalbeschleunigung
einen kritischen Wert nicht überschreitet.
Bei einer Gasdurchbruchsspannung der Membran von 1 bar darf beispielsweise auf
Grund der 70 mm langen Strecke zwischen der Bettoberkante und dem
Ende der Hohlfaser bei einer Elutionsmitteldichte von 1,1 die Zentrifugalbeschleunigung
den Wert von 900 xg nicht überschreiten.
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Mit
Hilfe dieser Vorrichtung ist es möglich, die für das Abtrennen
und Aufkonzentrieren eines Proteins erforderlichen Elutionsschritte
parallel in zahlreichen Säulen
vorzunehmen. Zum Waschen der chromatographischen Betten, zu ihrer
Sättigung
mit dem gewünschten
Laufmittel, zum Auftragen der Probeflüssigkeit und Elution von Substanzen,
die vor der Zielsubstanz das Bett verlassen, wird das Eluat am Hohlfasersegment
vorbeigeführt.
Anschließend werden
die Säulen
in die Position gesteckt, in welcher das Eluat durch die Hohlfasermembran
strömt. Nach
dem anschließenden
Zentrifugationsschritt wird das Oberteil aus dem Metallbecher herausgenommen
und die Hohlfasersegmente werden abgenommen, um das gereinigte und
konzentrierte Protein zu entnehmen. Falls das Elutionsmittel vollständig entfernt
oder ausgetauscht werden soll, können
die Hohlfasersegmente beidseitig verschlossen werden, um das Elutionsmittel
durch Dialyse zu entfernen. Es kann auch vorteilhaft sein, die mit
dem Zielprodukt beladenen Hohlfasersegmente zu lyophilisieren oder in
Ethanol zu fixieren.