DE3319360A1

DE3319360A1 - Pepsinartiges human-leukozyten-enzym, verfahren zur herstellung des enzyms und therapeutische zusammensetzung, welches dasselbe als wirkstoff enthaelt, sowie verwendung der zusammensetzung zur bekaempfung allergischer stoerungen, immunkomplex-erkrankungen und von tumoren

Info

Publication number: DE3319360A1
Application number: DE19833319360
Authority: DE
Inventors: Mochida Tokyo Ei; Ohnishi Funabashi Chiba Haruo; Kosuzume Yokohama Kanagawa Hiroshi; Suzuki Kawaguchi Saitama Yasuo
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-05-31
Filing date: 1983-05-27
Publication date: 1983-12-01
Also published as: NL8301934A; AU1507283A; IT8348383A0; US4591504A; CA1207262A; BE896895A; FR2527630B1; GB8314727D0; AU8459882A; GB2125046A; GB2125046B; IT1172264B; WO1983004260A1; SE8303050D0; FR2527630A1; AU547166B2; DE3319360C2; SE8303050L

Description

33T936Q

_ 4 —

Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo /Japan

Pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym, Verfahren zur Herstellung des Enzyms und therapeutische Zusammensetzung, welche dasselbe als Wirkstoff enthält, sowie Verwendung der Zusammensetzung zur Bekämpfung allergischer Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und von Tumoren

Die Erfindung betrifft ein pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und ein therapeutisches Mittel bzw. therapeutische Zusammensetzung zur Bekämpfung allergischer Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und Tumore, wobei das genannte Mittel das vorstehend erwähnte Enzym als Wirkstoff enthält.

Allergische Störungen werden durch eine allergische Reaktion verursacht, die als Ergebnis einer Antigen-Antikörper-Realction zu einer Pathogen.ese in einem lebenden Organismus führt. Es wird angenommen, dass der Hechanismus der Pathogenese allergischer Störungen den folgenden Verlauf hat. Bei Einwirkung eines pathogenen Antigens entwickelt ein lebender Organismus Antikörper. Der zweite Angriff des gleichen Antigens bewirkt eine Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei als Ergebnis chemische Mediatoren aus den Zeilen freigesetzt werden. Diese Mediatoren schädigen das Gewebe und/oder die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe werden .auf den Geweben abgelagert, wodurch allergische Störungen oder Autoimmunstörungen verursacht werden. Zu den verschiedenen pathogenen Antigenen gehören xenogene Antigene, wie z.B. inhaliertes Allergen, Nahrungsmittelallergen, Arzneimittel, Kontaktallergen und allogene oder autologe Antigene, die von .autologen Komponenten der Gewebe oder Organe herrühren, die.aus irgendeinem Grunde denaturiert sind und deshalb wie Fremdsubstanzen wirken.

Sogenannte allergische Störungen, die von xenogenen Antigenen verursacht werden, wie z.B. Bronchialasthma, Nahrungsmittelallergie oder Urticaria, werden nach ihren Symptomen oder Ursachen in vier Typen klassifiziert. D.h. sie werden eingeteilt in Allergien vom Typ I (anaphylaktischer Typ), der sich durch gewebsniederschlagende Antikörpern ergibt und durch eine erhöhte Kapillarpermeabilität und Weichmuskelkontraktion charakterisiert ist, den Allergien vom Typ II (cytotoxischer Typ), der die Anwesenheit von

Komplementen verursacht und durch Zellschaden bzw. Zeilzerstörung charakterisiert ist, Allergien vom Typ JII (Arthus-Typ), der von der Ablagerung von Anfcigen-Antikörper-Komplexen auf Gefässwänden und darftuffolgender Partizipierung von Komplementen und polymorphonuklearen Leukozyten herrührt, und durch Entzündungsreaktionen charakterisiert ist, und Allergien . vom Typ IV, die durch zellvermittelte! Immunität verursacht und durch das Auftreten einer verzögerten

J.Q Überempfindlichkeit, wie z.B. die Tuberkulin-Reaktion, charakterisiert wird. Von den allergischen Reaktionen verursachen die Allergien vom Typ I, III und IV z.B. Bronchialasthma; jede dieser Reaktionen kann unabhängig oder in Kombination miteinander zu einer Asthmaattacke führen. Der pathogene Mechanismus dieser allergischen Störungen wird wie folgt angenommen.

Ein Antigen, das in einen lebenden Organismus eindringt, wird von Makrophagen aufgegriffen, wobei die immunologische Information auf dem Antigen auf das T-Zellen-B-Zellen-System übertragen wird. Die B-Zellen, die diese Information erhalten haben, produzieren Immunoglobulin (IgE-Antikörper wird in der Hauptsache bei Allergien vom Typ I und IgG-Antikörper wird in der Hauptsache bei Allergien vom Typ II und III produziert) und der IgE-Antikörper bindet an die Basophile in der Zirkulation oder an die Mastzellen in den Geweben, wobei ein Zustand der Sensibilisierung erzeugt wird. Die gleichen Antigene, die in den sensibilisierten Organismus eindringen, binden an Zellgebundene Antikörper, worauf diese chemische Mediatoren, wie Hystamin und langsam-reagierende Substanzen

5 φ

ύ ι « β ο

der Anaphylaxe (SRS-A) freisetzen. Die freigesetzten chemischen Mediatoren induzieren allergische Symptome, wie Erythem, Ödem oder eine Zunahme der Drüsensekretion, verursacht durch Kontraktion der Weichmuskel und Erhöhung der Kapillarpermeabilität. Andererseits bindet IgG-Antikörper an polymorphonukleare Leukozyten, wobei eine Sensibilisierung erzielt wird und ebenfalls eine nachfolgende Sekretion von SRS-A als chemischer Mediator angenommen wird.

Anti-allergische Agentien können therapeutisch wirken, indem sie einen der Schritte dieses Prozesses unterdrücken.

Bisher hat man Xanthin-Derivate, ß-adrenergische Stimulantien (ß-Stimulantien) oder Corticosteroide zur Behandlung von Asthma verwendet. Es wurde jedoch häufig beobachtet, dass diese Arzneimittel unerwünschte Nebenreaktionen verursachen. Unter diesen sind z.B.

Herzklopfen, Tachycardia, etc., im Hinblick auf Xanthin-Derivate und ß-Stimulantien zu nennen. Ausserdem verursachen Corticosteroide Nebenreaktionen, wie Magengeschwüre und Komplikationen bei bakteriellen Infektionen. Darüber hinaus können Antihistamihmittel Schwierigkeiten beim Auswerfen des Luftröhrensekrets verursachen, statt dass sie bei einem Asthmaanfall wirksam wären, so dass sie manchmal den klinischen Zustand von Asthma verschlechtern.

Immunkomplex-Erkrankungen oder Autoimmunstörungen, bei denen der pathogene Antikörper ein Auto-Antigen darstellt, exemplifiziert durch rheumatoide Arthritis, syst em i schein Lupus-Erythematosus (SLE) und Lupus-Nephritis, stellen entsprechend ihrem Namen Störungen dar, die von Komplexen aus Antigen und Antikörper herrühren, nämlich den Immunkomplexen. Obwohl der pathogene Mechanismus von Immunkomplex-Erkrankungen kompliziert und in vieler Hinsicht noch nicht aufgeklärt ist, nimmt man im allgemeinen an, dass er folgenden Verlauf hat. Wenn die Gewebe durch Bakterien- oder Vireninfektionen geschädigt sind, werden gegen die frisch produzierten Auto-Antigene oder Virus-infizierten Zellen Antikörper produziert, und diese reagieren mit den korrespondierenden Antigenen unter Bildung von Immunkomplexen. Da diese Immunkomplexe das Komplementsystem und die Plättchen aktivieren, werden vasoaktive Substanzen, wie z.B. Histamin und Serotonin freigesetzt, und die Permeabilität der Blutgefässe ist erhöht. Dann dringen die Immunkomplexe im Kreislauf in die Gefässwände ein, die ein erhöhte Permeabilität besitzen, und setzen sich entlang der Fundamentmembran ab. Es sammeln sich polymorphonukleare Leukozyten auf den Alagerungsstellen der Immunkomplexe infolge der Wirkung der Leukozyt-chemotaktischen Faktoren, die durch die Wirkung des Komplements auf die niedergeschlagenen Immunkomplexe produziert wurden. Die polymorphonuklearen Leukozyten, die mit den Immunkomplexen reagieren, setzen verschiedene gewebsschädigende Substanzen frei, wie z.B. Cathepsin D und E, Collagenase, Elastase und Permeabilitätsfaktoren; diese Substanzen schädigen

schliesslich .das Gewebe. Der Kompleinentgehalt im Serum eines Patienten mit einer Immunkomplex-Erkrankung, wie z.B. SLE, ist im allgemeinen niedrig und die Verschlimmerung der Krankheitszustände korreliert eng mit der Abnahme des Komplementgehaltes. Es wird angenommen, dass diese Abnahme des Kamplementgehaltes auf einen starken Verbrauch des Komplements an der Reaktionsstelle zwischen Antigen und Antikörper zurückgeht, die z.B. in den Nieren und in den Blutgefassen stattfindet- Ausserdem wird auch angenommen, dass die Immunkomplexe in Beziehung zu den Blutkoagulierungssystemen stehen und man glaubt, dass diese infolge mannigfaltiger Mechanismen, wie der Beschleunigung der Fibrinoidablagerung auf den geschädigten Geweben, zu ernsthafteren Zuständen führen.

Zur·Behandlung von Immunkomplex-Erkrankungen verwendet man gegenwärtig entzündungshemmende Mittel und immun-suppressive Mittel, einschliesslich Steroiden, ' um das ubersensibilisierte Immunsystem zu unter*· drücken und lokale Entzündungen und Schmerzen zu hindern, oder es werden Antikoagulantien und Antiplättchen-Mittel zur Verbesserung der Anomalien des Koagulierungs-Fibrinolyse-Systems in den Blutgefässen zu verbessern. Da diese Arzneimittel jedoch eine geringe Wirksamkeit zeigen, und mit starken Nebenreaktionen assoziiert sind, besteht ein dringender Bedarf nach der Entwicklung eines Arzneimittels, das sowohl sicher als auch in hohem Masse bei der Behandlung dieser Erkrankungen wirksam ist.

- ίο -

Ausserdem wurden viele Arzneimittel zur Behandlung bösartiger Tumore entwickelt. Diese Antitumor-Arzneimittel können grob in die zwei folgenden Typen eingeteilt werden. Der erste Typ umfasst die sogenannten Cytotoxine, die das Tumorwachstum direkt unterdrücken. Der zweite Typ umfasst solche Arzneimittel, die indirekt das Tumorwachstum kontrollieren, indem sie den Tumor durch Aktivierung immunologischer Schutzfunktionen des Wirtes als Fremdsubstanz erkennen. Arzneimittel, die zum ersteren Typ gehören, besitzen jedoch keine ausreichende selektive Toxizität gegen Tumorzellen, und sind gegen Normalzellen des Wirtes ebenfalls toxisch. Demzufolge ist ihre Gesamtdosis deutlich beschränkt. Andererseits zeigt der letztere Typ, nämlich die Immunopotentiatoren, im Vergleich zu ersteren weniger häufig unerwünschte Nebenreaktionen,, so dass diese im allgemeinen sicher angewendet werden können. Letztere weisen jedoch insofern ein essentielles Problem auf, dass manche Immunopotentiatoren keine ausreichende Antitumor-Wirkung besitzen, da ein Tumor als solcher seinen Ursprung in den normalen Zellen eines Patienten hat und durch die immunologischen'Schutzfunktionen nicht in ausreichendem Masse als Fremdsubstanz erkannt werden 5 mag.

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym mit einer Aktivität gegen allergische Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und Tumore zur Verfügung zu stellen.

- li -

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung eines pepsinartigen Human-Leukozyten-Enzyms z-u liefern.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein therapeutisches Mittel gegen allergische Störungen, Iiaisiunkom-' plex-Erkrankungen und Tumore an die Hand zu geben, das ein pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym als

• . Wirkstoff enthält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. l ' ist ein Diagramm, das die Ergebnisse des experimentellen Beispiels 1 zeigt.

Fig. 2 und 3 sind Diagramme, die die Ergebnisse des experimentellen Beispiels 3 zeigen.

Fig. 4 ist ein Diagramm welches die Ergebnisse

der Messung von Harnprotein im experimentellen Beispiel 4 zeigt, wobei der Gehalt an Harnprotein auf der Grundlage der Färbung von Testpapier gemessen wurde . und als DurchSchnittsindex einer Gruppe

i ausgedrückt ist. Dieses Index-System besteht aus den Zahlen 0, 1, 2, 3 und 4, entsprechend den Färbungen (-), (+), (++)# (+++) und (++++).

Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen über einen längeren Zeitraum, um ein wirksameres therapeutisches Mittel gegen allergische Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und Tumore zu entwickeln, haben die Erfinder gefunden, dass ein pepsinartiges bzw. pepsinähnliches Enzym, das in menschlichen Leukozyten vorkommt (im folgenden wird es als pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym bezeichnet), eine starke antiallergische Wirkung und einen deutlichen suppressiven Effekt ge-

•10 gen verschiedene Immunkomplex-Erkrankungen besitzt, und gleichzeitig eine ausgezeichnete Antitumor-Wirkung aufweist. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen. Erkenntnissen.

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym existiert nicht nur in menschlichen Leukozyten, sondern auch in Zellen, wie z.B. dem promyelocytisehen Leukämie-Zellstamm HL-60, der mit einer Substanz zur Differenzierungsinduzierung behandelt wurde, wie Actinomycin D, und kann aus der überstehenden Flüssigkeit eines Homogenates dieser Zellen durch geeignete Kombination üblicher Methoden, wie sie bei der Reinigung von Proteinen angewendet werden, wie z.B. Aussalzen,- Adsorp-•tionschromatografie auf einem anorganischen Adsorptionsmittel, Ionenaustausch-Chromatografie auf einem Ionenaustauschharz und Gelchromatografie mit einem Molekularsiebeffekt erhalten werden. Darüber hinaus kann das Enzym in grossen Mengen aus kultivierten Zellen erhalten werden, die hergestellt wurden durch Verschmelzen von Tumorzellen mit Zellen, die ein pepsinartiges Enzym produzieren, wie z.B. Human-Leukozyten, oder durch ein gentechnologisches Verfahren,

- 13 -

z.B. durch Herstellen komplementärer DNA mit Hilfe einer reversen Transkriptase unter Verwendung der Messenger-RNA für pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym als Schablone und anschliessendes Integrieren · dieser DNA in E. coli, um das Enzym zu produzieren.

Die 'pharmakologische Wirkung und Toxizität dieses pepsinartigen Human-Leukozyten-Enzyms wird im folgenden unter Hinweis auf die experimentellen Beispiele beschreiben.

Experimentelles Beispiel 1:

Suppressive Wirkung auf die Produktion von Anti-Ovalbumin-IgE-Antikörper

Gruppen von jeweils 10 männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 180 bis 200 g wurden verwendet. 1/10 mg Ovalbumin wurde zusammen mit 20 mg Aluminiumhydroxidgel intraperetoneal injiziert. Vom nächsten Tag an wurde pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym einmal am Tag, 14 Tage lang, intravenös injiziert. 7, 10 und 14 Tage nach der· Verabreichung von Ovalbumin wurden Blutproben genommen und auf ihren Gehalt an Anti-Ovalbumin-IgE-Antikörper im Serum mittels der homologen PCA-Rattenreaktion untersucht (H. Maruyama, et al., Folia Pharmacologica Japonica, 7_4, 179, 1978). Die Ergebnisse werden in Fig. 1 wiedergegeben.

Die .Produktion von Anti-Ovalbumin-IgE-Antikörper wurde durch Verabreichung von pepsinartigem Human-Leukozyten-Enzym signifikant unterdrückt.

Experimentelles Beispiel 2:

Suppressive Wirkung auf Bronchialasthma

Gruppen von jeweils 10 männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 180 bis 200 g wurden verwendet. 1/10 mg Ovalbumin wurde zusammen mit 20 mg Aluminiuiahydroxidgel intraperetoneal injiziert, und vom nächsten Tag an pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym einmal am Tag, 14 Tage lang, intravenös injiziert. Nach 14 Tagen wurden 25 mg/kg Ovalbumin intravenös·verabreicht, um Bronchialasthma zu induzieren, und die resultierende Luftröhrenkontrakion nach der Methode von Konzett und Rössler (Arch. Exptl. Path. Pharmacol. 195, 71, 1940) gemessen. Die relative Kontraktionsrate der Trachea wurde für jede Gruppe berechnet, wobei die Kontraktion der Kontrollgruppe als 100 genommen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Kontraktionsrate der Trachea.(%)

Kontrolle	0,	05	mg/kg	. 10
pepsinartiges	0,	5	mg/kg
Human-Leukozyten-	5		mg/kg
Enzym			73
			49
			23

Durch Verabreichung von pepsinartigem Hunan-Leukozyten-Enzym wurde die Luftröhrenkontraktion signifikant unterdrückt.

Experimentelles Beispiel 3:

Suppressiver Effekt auf Masugi nephritis

Nach der Methode von Suzuki et al (Folia Pharmacologica Japonica, 6£, 572, 1972) wurde Kaninchen-Anti-Ratten-Nierenserum intravenös an Gruppen von jeweils 10 männlichen Wistar-Ratten in einer Dosis von 5 ml/kg verabreicht, um eine Nephritis zu induzieren. Nach dem Auftreten der Nephritis wurden in regelmässigen Zeitabständen Blut- und Urinproben genommen, um den Gehalt an Serum-Immunkomplex und Harnprotein zu bestimmen. Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym wurde einmal am Tag nach Verabreichung des Ant'i-Ratten-Nieren-Antikörpers intravenös injiziert; der Kontrollgruppe wurde in ähnlicher Weise inaktiviertes pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym verabreicht. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 und 3 wiedergegeben.

In den Gruppen, die mit pepsinartigem Human-Leukozyten-Enzym behandelt wurden, wurden Abnahmen an Harnprotein und Blutimmunkomplex beobachtet.

Experimentelles Beispiel 4?

Suppressiver Effekt auf spontane Nierenstörung

Die Messung erfolgte nach der Methode von Abe et al (The Ryumachi, 14, 43, 1974).

Gruppen aus jeweils sechzehn 16 Wochen alten weiblichen Mäusen (NZB χ NZVi) F-,, wurden mit pepsinartigem Human-Leukozyten-Enzym bei einer Dosis von 10 mg/kg einmal am Tag intravenös injiziert. Einer Kontrollgruppe wurde in gleicher Weise inaktiviertes pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym intravenös verabreicht. Jede vierte Woche wurde das Harnprotein der Mäuse mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Testpapiers (Combisticks) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben. Darüber hinaus wurden 6 Mäuse jeder Gruppe im Alter von 32 Wochen getötet und die Zellinfiltration in die Nxerenglomeruli beobachtet.

Die restlichen 10 Mäuse jeder Gruppe erhielten fortgesetzt die tägliche Verabreichung; die Überlebensrate wurde bei einem Alter von 50 Wochen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Es wurde festgestellt, dass durch Verabreichung von pepsinartigem Human-Leukozyten-Enzym die Zunahme an Harnprotein signifikant unterdrückt wurde; die Zeil- ' Infiltration nach 32 Wochen war gering und die Überlebensrate bei 50 Wochen war in den mit papsinartigen Human-Leukozyten-Enzym behandelten Gruppen höher.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die spontanen Nierenstörungen in Mäusen durch pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym unterdrückt wurden.

β ■*

- 17 -

Tabelle 2

Kontrollgruppe mit pepsiriartigem

Human-Leukozyten-Enzym behandelte .Gruppe

Zellinfiltration starke Infiltra- leichte Infiltra-■ . tion in Mikro- .tion um'die Ge-

lymphozyten und fässwand Plasmozyten
Überlebensrate 20 %' 80 %*

* p<0,05

Experimentelles Beispiel 5:

Suppressiver Effekt an. Thyroiditis ■ ■ "

Dieses Experiment wurde nach dem Verfahren von Kotani et al (Clinical Immunology, 9_». (⁸)' ⁶³⁵' ¹⁹⁷⁷) durchgeführt. Gruppen von jeweils 10 männlichen BUF/HDK-Ratten (6 Wochen alt), wurden einer Thymectomie unterworfen und daraufhin einer Röntgenbestrahlung von jeweils 200 Rad, die viermal im Zeitintervall von 2 Wochen wiederholt wurde, ausgesetzt. 14 Wochen nach der Thymectomie wurden die Ratten durch Ausbluten getötet. Die Schilddrüsen wurden isoliert und in einen Paraffinblock eingebettet und daraufhin mit Hämatoxylin-Eosin oder mit Azan angefärbt. Die Schwere der Thyroiditis wurde auf der Basis der Infiltration von mononuklearen Zellen, Zerstörung des

endoplasmatisehen Retikulums und Drüsenfibrose mit Hilfe der Grade 0 bis 4 abgeschätzt. Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym wurde den Tieren einmal am Tag intravenös verabreicht; der Kontrollgruppe wurde in ähnlicher Weise inaktiviertes pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe war bei den mit pepsinartigem Human-Leukozyten-Enzym behandelten Gruppen sowohl das Auftreten als auch der Schweregard der Thyroiditis dosisabhängig vermindert.

	Tabelle 3	01	Schweregrad
	Auftreten (%)		3,5 _:
Kontrolle	90
pepsinartiges Human-
Leukozyten-Enzym		3,0 j
1 mg/kg	80	1,9 -
3 mg/kg	60	1,3 H
10 mg/kg	40*
p^0,05 * ρ <0,	H 0,4


h 0,5
l· 0,2*
r 0,1**

- 19 -

Experimentelles Beispiel 6:
Hydrolyse von Human-Immunkomplex

Serum- von Patienten mit rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus-Erythematosus und Hepatitis, von denen bewiesen war, dass sie Immunkomplex in ihrem Serum aufwiesen, wurde gesammelt. Pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym wurde zu 1 ml Serum in einer Menge von 10,30 oder 100 /ug zugegeben und das Serum bei ■37°C 60 Minuten lang inkubiert. Nach der Reaktion wurde die Menge an immunkomplex im Serum mit Hilfe hämolytischer Reaktion von Schaf-Erythrocyten in Gegenwart von Meerschweinchen-Komplement nach der Methode von Fust et al (Atherosclerosis, 2_9, 181, 1978), wobei aggregiertes Human-IgG als Standardsubstanz verwendet wurde, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgezeigt.

Tabelle 4

Erkrankun- Serum gen Nr.

zugegebene Menge Immunkoraplex-

an pepsinartigem gehalt

Human-Leukozyten ( ,ug/ml) Enzym

Rheumatoide Arthritis

10

100

78 65 53

unter 50 234 180 150 123

Systemischer Lupus Erythematosus

420.

352

211

124

125

. 70

56

unter 50

Hepatitis

65 58

unter 50 unter 50 70-66

■ 55 51

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym reduzierte die Menge an Immunkomplex im Serum von Patienten, die . an chronischem Rheumatismus, systemischem Lupuseryt-hematosus und Hepatits litten, in Abhängigkeit von der Dosis.

Experimentelles Beispiel 7:

Wirkung auf das Wachstum von menschlichem Brustkrebs-MX-1-Zellkulturen und Maus-Leukämie-Zellen-Ll210

■ Menschliche Brustkrebszellen MX-I bzw. Maus-LeukämieT-Zellen-Ll210 wurden in Eagle' s-Medium, das 10 % Kälberserum und Testsubstanzen enthielt, mit einer Zellkonzentration von 10 /ml suspendiert. Die Zellen wurden bei 37⁰C unter 5 % CCU 48 h lang gezüchtet. Im Anschluss daran wurde die Anzahl lebensfähiger Zellen nach Färbung mit Tripanblau gezählt. Die Wachstums-Inhibitionsrate wurde gemäss der folgenden Gleichung berechnet, die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Anzahl lebensfähiger Zellen in

Wachstums-Inhibitionsrate =(1 - der behandelten Gruppe

^ Anzahl lebensfähiger Zellen in

'. ' d^er Kontrollgruppe

Tabelle 5

Zugegebene Kon Wachstums-Inhibizentration (/ug/ml) tionsrate (%)

MX-I L1210

pepsinartiges-Human	30
Leukozyten-Enzym	100
	300
Mitomycin.C	100

16	32	7	22
55	29
48	61

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym inhibierte
das Wachstum von Tumorzellen sogar bei niedriger
Konzentration.

20 Experimentelles Beispiel 8:

Wirkung auf Leukämiezellen P388 an Mäusen

10 Leukämiezellen P388 wurden intraperitoneal auf
eine Gruppe von 5 männlichen BDF,-Mäusen transplantiert. Beginnend am nächsten Tag wurde pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym den Mäusen'zweimal täglich intravenös injiziert, bis die Tier starben. Die Durchschnitt siebensspanne wurde berechnet und in % ausgedrückt,.bezogen auf Kontrollgruppe = 100 %. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.

ψ 9 ♦ · *· β ο ·. O *

- 23 -

durchschnittliche Überlebensspanne der behandelten Gruppe

Durchschnittliche

Lebens spanne (%) = : X 100

5 durchschnittliche Überlebens

tage der Kontrollgruppe

. . Tabelle 6

10 .

Dosis Durchschnittslebensspanne {%)

Kontrolle 100 + 5

pepsinartiges Human 0,3 109 + 5

Leukozyten-Enzym ' 1,0 120 +8

3,0 124 + 8*

20 Mitomycin C 0,5· 135 + 16

*: ρ <p, 05
25

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym erhöhte die Durchschnittslebensspanne klar.

Experimentelles Beispiel 9:
30

Wirkung auf menschlichen Brustkrebs MX-I, transplan-tiert in eine Nacktmaus

Quadratische 2mm Stücke mit menschlichem Brustkrebs 35 MX-I, die auf Hacktmäuse (BALB/C, nu/nu) übertragen worden' waren, wurden- subkutan auf den Rücken der Tie-

* ♦ 4

- 24 -

re in Gruppen von jeweils 5 Nacktmäusen des genannten Stammes transplantiert. Von dem zwei Wochen darauffolgenden Zeitpunkt an wurde pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym zweimal täglich, 18 Tage lang, intravenös verabreicht. 18 Tage nach der ersten Verabreichung von pepsinartigem Human-Leukozy.ten-Enzym wurden die Tumore isoliert und gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.

	Tabelle 7	(mg/kg)	Gewicht	34	des	Tumors	(g)
	Dosis		1,	76	+ 0,	10
Kontrolle		r3	o,		± °'	12*
pepsinartiges	O₁			66
Human-Leuko-		,0	0,		+ o,	13*
zyten-Enzym	3,

* ρ <C0,05
20

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym zeigte selbst bei der geringeren Dosis einen signifikanten Antitumor-Effekt.

Experimentelles Beispiel 10;
Akute Toxizität

- 25 -

An Gruppen von jeweils 10 ddY-Mäusen, mit einem Gewicht von 20 +1 g, wurden intravenös oder intraperitoneal 2 g/kg pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, verabreicht. Daraufhin wurden die Mäuse eine Woche lang täglich im Hinblick auf toxikologische Symptome beobachtet. Innerhalb dieser Periode konnte kein Zeichen irgendeiner Toxizitat beobachtet werden.

Wie in den vorstehenden experimentellen Beispielen beschrieben wurde, stellt das pepsinartige Human-Leukozyt en-Enzym einen wirksamen Bestandteil des pharmazeutischen Mittels der vorliegenden Erfindung dar, unterdrückt deutlich die Produktion von IgE-Antikörper und zeigt einen ausgeprägten therapeutischen Effekt gegen experimentelles Asthma. Darüber hinaus unterdrückte das Enzym deutlich die Manifestation und Entwicklung einer Reihe von Erkrankungen, von denen man annimmt, dass sie durch Immunkomplexe induziert werden, wie z.B. Thyroiditis und Nephritis. Darüber hinaus zeigte das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym einen starken Antitumor-Effekt.

Auf der Basis der vorstehenden Ergebnisse zur Untersuchung der akuten Toxizität liegt die Dosis zur Erzielung dieser Wirkungen innerhalb einem ausreichend sicheren Bereich. Es ist anzunehmen, dass aufgrund der Tatsache, dass dieses pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym ein Protein menschlichen Ursprungs darstellt, wenig Gefahr besteht, aufgrund von Antigenizität ernsthafte Nebenreaktionen hervorzurufen, wie

z-B. anaphylaktischer Schock. Aus diesem Grunde stellt es ein in hohem Masse geeignetes therapeutisches Mittel gegen verschiedene allergische Störungen dar, wie Bronchialasthma, Urticaria, Heufieber, Kontaktdermatitis, Nahrungsmittelallergie, Drogenallergie, allergische Rhinitis, hypersensitive Pneumonitis, verschiedene Immunkomplex-Erkrankungen, wie systematischen Lupus Erythematosus, Glomerulonephritis mit Immunkomplex, Periarteritis nodosa, rheumatoide Arthritis, Immunkomplex-Hepatitis, Thyroiditis, Serumkrankheit, Myastenia gravis und verschiedene Tumore, wie Magen-, Lungen-, Leber-, Dickdarm-, Brust-, Prostata-, Gebärmutter-, Blasenkrebs, Leukämie, Esophagalkrebs, Lymphoma.

Bevorzugtes Ausführungsbeispiel gemäss der Erfindung

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym kann wie folgt hergestellt werden. Der Überstand von Horaogenat menschlicher Leukozyten wird durch eine DEAE-Cellulose-Säule, die mit 0,1 M Acetat-Pufferlösung (pH 5,3) equilibriert ist, gegeben, um das Enzym zu adsorbieren. Das adsorbierte Enzym wird mit der gleichen Pufferlösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthält, eluiert.

Das Eluat kann konzentriert und durch Gelchromatografie auf einer Sephadex-G 100-Säule, gequollen mit 0,.9 % physiologischer Kochsalzlösung, weiter gereinigt werden. Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym besitzt ein Molekulargewicht von 35.000 bis 41.000, bestimmt durch Gelchromatografie auf Sephadex G-100; einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 2,5 bis 3,5, bestimmt durch Isoelektrofokussierung an .Ampholin; ein Adsorptionsmaximim bei 278 mn; zeigt eine

positive Reaktion gegenüber Ninhydrin; und ist leicht löslich in Wasser und unlöslich in Ether und Chloroform. Darüber hinaus zeigt das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym eine hohe hydrolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin im sauren Bereich unterhalb pH 7,0; sein pH-Optimum ist bei 2,0 bis .3,5.

Das Mittel der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen hergestellt in Form einer injizierbaren Lösung und wird intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraartikular oder am örtlichen Sitz des Tumors- injiziert. Es kann jedoch auch in Form eines oralen Mittels, Inhalierungsmittels oder Rektalsuppositoriums verwendet werden. Die tägliche Dosis des pepsinartigen Human-Leukozyten-Enzyms beträgt 1 bis 1.000 mg, vorzugsweise 50 bis 500 mg; diese kann jedoch in geeigneter Weise erhöht oder erniedrigt werden in Abhängigkeit vom Alter, den Symptomen und der Verabrei chungswei se.

Das pepsinartige Human-Leukozyten-Enzym kann zu einem pharmakologisehen Mittel nach üblichen Methoden zusammen mit beliebigen konventionellen pharmazeutischen Trägern oder Excipienten formuliert werden.

Präparationen zur Injektion können lyophilisierte Präparat ionen, die zum Zeitpunkt der Verabreichung aufgelöst werden, und flüssige Präparationen einschliessen; Präparationen mit kontrollierter Freisetzung sind ebenfalls bevorzugt, um eine verlängerte wirksame Konzentration aufrechtzuerhalten.

• «

- 28 -

Orale Präparationen können in Form von Kapseln, Tabletten, Granalien, Pulver oder flüssigen oralen Präparationen vorliegen; zur Verbesserung der Absorption liegen sie vorzugsweise in Form von Liposomen-Ein-Schlusskörpern vor.

Die Inhalierungsmittel sind vorzugsweise in Form lyophilisierter Präparationen; zur rektalen Verabreichung ist die Form als Suppositorium bevorzugt. 10

Es folgen Beispiele gemäss der Erfindung.

Beispiel 1

HL-60-Leukämiezellen (10 Zellen), die vorher mit Actinomycin D behandelt worden waren, wurden in 1 0,9%iger physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und dann in einem Homogenisator zerstört. Der durch Zentrifugation (10.000 UpM, 30 Minuten) erhaltene Überstand wurde konzentriert und unter Verwendung eines Ultra-Konzentrators (Millipore, Diaflow Model-202) entsalzt. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule (10x50cm), equilibriert mit 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), aufgebracht.

Die Säule wurde mit 4 1 der gleichen Pufferlösung, die 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und eine aktive Fraktion mit der gleichen Pufferlösung, die 0,4 M NaCl enthielt, eluiert. Dann wurde die aktive Fraktion auf eine Sephadex G-100-Säule (10x90cm), equilibriert mit pyrogenfreier 0,9%iger physiologischer Kochsalzlösung, aufgebracht und einer Gelfiltration unterworfen, wobei 50 mg pepsinartiges Enyzm erhalten

wurden. Die spezifische Aktivität des pepsinartigen Enzyms betrug 1.930 u/mg, wenn die Enzymaktivität nach der Methode von Anson (J. Gen. Physiol. , 2_2_, 79, 1938) unter Verwendung von Schweinepepsin als Standardsubstanz und denaturiertem Hämoglobin als ein Substrat bestimmt wurde.

Beispiel 2

Humän-Leukozyten (10 Zellen) wurden in 20 iaM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4), welche 1 % Triton-X-100, 10 mM Vanadylkomplex, 3 mM Magnesiumacetat, mM NaCl und 5 % Sucrose enthielt, suspendiert und die Zellen in einem Teflon-Homogenisator zerstört. Die Polysomenfraktion wurde aus dem Homogenat durch Zentrifugation gesammelt und m-RNA mit Phenol aus der Polysomenfraktion extrahiert und anschliessend mit Ethanol ausgefällt. Zu diesem Niederschlag wurde

0,2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9,0), welche 0,5% SDS, 0,01 M EDTA und 50 mM NaCl enthielt, zugegeben, und das Gemisch 3 Minuten lang bei 70°C inkubiert. Diese m-RNA-Lösung wurde an einer Oligo(dT)-Cellulose-Säule adsorbiert. Die Säule wurde gewaschen und dann mit 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4), welche 0,5% SDS und 1 mM EDTA enthielt, eluiert, um eine m-RNA-Fraktion zu erhalten, die Poly A enthielt. Diese m-RNA wurde durch einen Sucrose-Dichtegradienten bei einer Konzentration von 5 bis 25 % weiter fraktioniert. Die Fraktionen wurden auf m-RNA-Aktivität entsprechend dem pepsinartigen Enzym im Proteinsynthese-System der Ovozyten von Xe'nopus überwacht und eine aktive Fraktion erhalten. 5 /ug der Pepsin-Enzym-m-RNA, die auf diese Weise hergestellt wurde,

- 30 -

wurden zu 100/ul 40 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), welche 1/ug 01igo(dT)_l0, 5 mM Mercaptoethanol, 0,5 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP und 10 Einheiten an reverser Transkriptase (AMV-RT) enthielten, Zugegeben und 90 Minuten lang bei 42°C inkubiert.

Nach der Inkubationsdauer wurde RNA durch Deproteinisierung und eine alkalische Behandlung entfernt, um komplementäre DNA zu erhalten. Diese DNA wurde dann in dem gleichen Medium, wie dies in der Präparation der vorstehenden komplementären DNA verwendet wurde (vorausgesetzt, dass 01igo(dT)_1Q nicht enthalten war) inkubiert, um eine doppelsträngige komplementäre DNA zu erhalten. Nach Behandlung mit 0,25 Einheiten Nuclease SI wurde die doppelsträngige komplementäre DNA zu 30 /ul von 140 mM Cacodylsäure-Lösung (pH 7,6), welche 5 Einheiten terminaler Transferase, 1 mM dATP, 0,1 mM Dithiothreitol, 30 mM Trihydroxylamin und 1 mM Cobaltchlorid enthielt, zugegeben, und 15 Minuten lang bei 37.°C inkubiert, um die Addition von Desoxyadenin-Ketten zu bewirken.

Andererseits wurden 3/ug E. Coli-Plasmid ■ PBR 322 DNA mit 0,25 Einheiten EcoRI 20 h bei 37⁰C behandelt und weiter mit 17,5 Einheiten an·Exonuclease 90 Minuten bei 0⁰C inkubiert. Nach Inkubation wurde Desoxythymidin-Ketten-Plasmid-DNA.auf die gleiche Weise erhalten, wie in der Präparation der vorstehenden Desoxyadenin-Ketten-DNA (vorausgesetzt, dass dTTP anstelle von dATP verwendet wurde).

mo *

- 31 -

Die Desoxythymidin-Ketten-Plasmid-DNA, die auf diese Weise hergestellt wurde, und die vorstehende Desoxyadenin-Ketten-DNA wurden durch folgende Behandlung assoziiert: 2 Minuten bei 65°C, 120 Minuten bei 46°C, 60 Minuten bei 37⁰C und 60 Minuten bei 23⁰C, in 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), welche 5 mM EDTA und 0,1 M NaCl enthielt.

Dann wurde E. CoIi-NIHJ C-2 unter Verwendung rekombinierter Plasmid-DNA tranformiert und aus Ampici !Unbeständigem Stamm 5000 geklont. Die klonierte DNA wurde in E. CoIi durch Bindung an die Promotorstelle des Trypthophan-Operons nach der Methode von Goeddel et al (Nature, 287, .411, 1980) eingebracht. Ein Stamm (E-931), der die Produktion von pepsinartigem Enzym in hohen Konzentrationen bewirkte, wurde in LB-Medium, welches 20 mg/1 Ampicillin enthielt, kultiviert. Aus der überstehenden Flüssigkeit, die aus dem Homogenat von 17 kg kultivierter Zellen erhalten wurde, wurden 3,5 g pepsinartiges Enzym auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gewonnen.

Beispiel 3

Ig pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym wurde in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und aseptisch durch ein Membranfilter filtriert. 1 ml-Portionen des Filtrates wurden in sterilisierte Glasbehälter gegeben und nach Lyophilisation versiegelt, um lyophilisierte Pulverpräparationen zu erhalten.

* ♦ w

fc *

- 32 -

Beispiel 4

1 g des lyophilisierten pepsinartigen Human-Leukozyten-Enzyms, 7 g Lactose und 3 g Magnesiumstearat wurden jeweils ausgewogen und gleichmässig vermischt.

Dann wurden 200 mg-Portionen dieses Gemisches in Gelatinekapseln Nr. 2 abgepackt und mit einem enterischen Überzug unter Erhalt enterischer Kapseln versehen.

Beispiel 5

Eidotterlecithin, Cholesterol und Diacetylphosphat wurden im molaren Verhältnis von 7:2:1 vermischt und 100 mg des Gemisches in 12,5 ml Chloroform aufgelöst. Mit dieser Lösung wurde ein dünner Film auf der Wand eines Kolbens gebildet. Es wurde eine Dispersion durch Mischen dieses Films mit 25 ml Phosphatpufferlösung, welche 100 mg pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym enthielt, hergestellt. Nach Ultraschallbehandlung wurde die Dispersion bei 110.000g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und sterilisiert, wobei eine Liposomen-Einschlusspräparation von pepsinartigem Human-Leukozyten-Enzym erhalten wurde.

Claims

HOFFMATSJN · EtTLLE Ä PARTNER 3 319

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE · DIPL.-INC3. W. EtTLH · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-INQ. W. LEHN

DIPL.-INQ. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ■ DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ING. K. GDRG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

38 170 n/fg

Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo /Japan

Pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym, Verfahren zur Herstellung des Enzyms und therapeutische Zusammensetzung, welche dasselbe als Wirkstoff enthält, sowie Verwendung der Zusammensetzung zur Bekämpfung allergischer Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und von Tumoren

Patentansprüche

1. Pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym, das die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht von 35.000 bis 41.000, b) isoelektrischer Punkt von pH 2,5 bis 3,5,

c) Absorptionsmaximum bei 278 niti,

d) positive Ninhydrinreaktion, und

e) leicht löslich in V/asser und unlöslich in Ether und Chloroform.

2. Verfahren zur Herstellung des pepsinartigen Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass menschliche Leukozyten angewandt werden.

3. Verfahren zur Herstellung des pepsinartigen Enzyms nach Anspruch 1, dadurch. gekennzeichnet , dass ein Gen-Engineering-Verfahren angewandt wird.

4. Therapeutische Zusammensetzung, insbesondere zur Bekämpfung von allergischen Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und Tumoren, dadurch gekennzeichnet , dass es als Wirkstoff ein pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym enthält.

5. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass das genanntes pepsinartiges Human-Leukozyten-Enzym die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht von 35.000 bis 41.000,

b) isoelektrischer Punkt von pH 2,5 bis 3,5,

c) Absorptionsmaximum bei 278 nm, d) positive Ninhydrinreaktion,

e) leicht löslich in Wasser und unlöslich in Ether und Chloroform.

f) weisses pulvriges Aussehen, und

g) antiallergische, Anti-Immunkomplex-Erkrankungens- und Antitumor-Aktivität.

δ. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 4, dadurch gekennzeichnet , dass sie durch Vermischen von einem oder mehreren Excipienten und/oder Adjuvantien mit einem pepsinartigen Human-Leukozyten-Enzym hergestellt ist.

7. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzei chnet , dass die Zusammensetzung in Form einer Injektion, einer oralen Präparation, eines Suppositoriums oder eines Inhalierungsmittels vorliegt.

8. Therapeutische Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzei chnet, dass die Dosierung des Wirkstoffes 1 bis .1*000 mg beträgt.

9. Therapeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet ,' dass die Dosierung des Wirkstoffes 50 bis 500 mg beträgt.

10 Verwendung der therapeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 9 zur Bekämpfung allergischer Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und von Tumoren.