NL8301934A - Menselijk leukocyt pepsineachtig enzym, werkwijze voor het bereiden van het enzym, en werkwijze en therapeutisch middel voor het behandelen van allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren, in welk middel dit als werkzaam ingredient aanwezig is. - Google Patents

Description

glS ...........

Γ vo U871

Menselijk leukocyt pepsineachtig enzym, werkwijze voor het "bereiden van het enzym, en werkwijze en therapeutisch middel voor het "behandelen van allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren, in welk middel dit als werkzaam ingredient aanwezig is»

De uitvinding heeft "betrekking op een menselijk leukocyt pepsineachtig enzym, een werkwijze voor het bereiden van het enzym, en een werkwijze en een therapeutisch middel voor het behandelen van allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren, welk middel het enzym als een werkzaam 5 ingrediënt bevat.

Allergiekwalen worden veroorzaakt door een allergische reactie die als gevolg van een antigeen-antilichaamreactie in een levend organisme een pathogene oproept. Het mechanisme van pathogenese van allergiekwalen wordt geacht de volgende loop te hebben. Bij blootstelling aan 10 een pathogeen antigeen, produceert een levend organisme antilichamen.

De tweede aanval van hetzelfde antigeen veroorzaakt een antigeen-antilichaamreactie en als resultaat komen uit de cellen chemische mediators vrij. Deze mediators beschadigen weefsels en/of worden de gevormde antigeen-antilichaamcamplexen op de weefsels afgezet, waardoor aller-15 giekwalen of auto-immuunonregelmatigheden worden veroorzaakt. Tot de verscheidene pathogene antigenen behoren xenogene antigenen, zoals geïnhaleerde allergenen, voedingsallergenen, geneesmiddelen, contactaller-genen, en allogene of autologe antigenen die afkomstig zijn van autolo-ge componenten van de weefsels of organen die om een of andere reden 20 ontaard zijn en zich daarbij als vreemde stoffen gedragen.

Zogenaamde allergiekwalen, veroorzaakt door xenogene antigenen zoals bronchiaie astma, voedingsallergie of urticaria, worden ingedeeld in vier typen volgens hun symptomen of oorzaken. D.w.z. dat ze ingedeeld worden in allergieën van type I.'(anafylactische type), die resul-25 teren uit het afzetten van antilichamen op weefsels en gekarakteriseerd worden door een verhoogde capillaire permeabiliteit en contractie van gladde spieren; allergieën van type II (cytotoxische type) die resul- 8301934 » 'i - 2 - teren in de aanwezigheid van complementen en gekarakteriseerd worden door celles chadiging, allergieën van type III (Arthus-type), die een gevolg zijn van de afzetting van antigeen-antilichaamcomplexen op vaat-wanden en daaropvolgende participatie van complementen en polymorfohu-5 cleaire leukocytes en gekarakteriseerd worden door inflammatoire reacties, en allergieën van het type IV die een gevolg, zijn van door tussenkomst van cellen ontstane immuniteit en gekarakteriseerd worden door het verschijnen van een vertraagde hypergevoeligheid zoals tuberculine-reacties. Van de allergische reacties participeren typen I, III en IV 10 allergieën in b.v. hronchiale astma en elk van deze reacties wordt onafhankelijk of in combinatie geacht astma-aanvallen te veroorzaken. Het pathoge mechanisme van deze allergiekwalen kan geacht worden als volgt te werken.

Een antigeen dat. in een levend organisme binnendringt, wordt be-15 handeld door macrofagen, en de immunologische informatie op het antigeen wordt doorgegeven aan het T cel-B cel-systeem. De B cellen die de informatie hebben gekregen, produceren immunoglobuline (IgE-antilichaam wordt hoofdzakelijk geproduceerd in allergieën van type I en IgG anti-liehamen worden hoofdzakelijk geproduceerd in allergieën van de types 20 II en IH) en de IgE-antilichamen binden aan de basofielen in de circulatie of aan de mastocyten in de weefsels, waardoor de toestand van sensi-bilisatie wordt gecreëerd. Dezelfde antigenen die in het gesensibiliseerde organisme binnendringen, binden aan celgebonden antilichamen, waardoor deze in staat worden gesteld om chemische mediators zoals his-25 tamine en langzaam reagerende stoffen van anafylaxis (SRS-A) vrij te maken. De vrijgekomen chemische mediators roepen allergische symptomen op zoals erythema, edema of verhoging van de kliersecretie veroorzaakt door contractie van gladde spieren en verhoging van capillaire permeabiliteit. Anderzijds binden IgG-antilichamen aan polymorfonucleaire 30 leukocyten waarbij sensibilisatie wordt bereikt en ook wordt de daaropvolgende secretie van SRS-A als chemische mediator verwacht.

Anti-allergische middelen kunnen een therapeutisch doel bereiken door een van de stappen in deze processen te onderdrukken.

Conventioneel zijn xanthinederivaten, β-adrenergische stimula-35 tors -stimulators) of corticosteroïden voor de behandeling van astma 8301934 V · - 3 - t gébruikt. Deze geneesmiddelen.blijken echter vaak ongewenste nadelige reacties te -vertonen. B.v. zijn -voor xanthinederivat en en -stimulators palpitatie, tachycardie enz. vermeld. Verder veroorzaken cortico-steroiden nadelige reacties zoals peptische zweren en complicaties van 5 bacteriële infectie. Bovendien kunnen anti-histaminemiddelen moeilijkheden veroorzaken in de expectoratie van luchtpijpsecretie, in plaats van werkzaam- te zijn tegen astma-aanvallen, zodat ze soms door klinische conditie van astma verslechteren.

ïmmuuncamplexziekten of auto-immune onregelmatigheden waarbij 10 het pathogene antilichaam een auto-antigeen is, waarvan rheumatoxde artritis, systemische lupus erythematosus (SLE) en lupus nefritis typerende voorbeelden zijn, zijn, zoals de namen impliceren, onregelmatigheden die het gevolg zijn van complexen van antigenen en antilichamen, nl. immuuncomplexen . Hoewel het pathogenetische mechanisme van de immuun-15 complexziekten gecompliceerd is en in vele opzichten nog niet is opgelost, wordt algemeen aangenomen dat zij als volgt verlopen. Wanneer de weefsels worden beschadigd door bacteriële of virale infecties, worden antilichamen geproduceerd tegen de vers geproduceerde auto-antigenen of viraal geïnfecteerde cellen en deze reageren met de overeenkomstige 20 antigenen onder vorming van immuuncomplexen. Omdat deze immuuncomplexen het complementsysteem en bloedplaatjes activeren, komen vasoactieve stoffen zoals histamine en serotonine vrij en stijgt de permeabiliteit van de bloedvaten. Vervolgens penetreren de circulerende immuuncomplexen in de vaatwanden met toegenomen permeabiliteit en zetten zij zich af 25 langs de basement-membranen. Polymorfonucleaire leukocyten worden verzameld op de afgezette plaatsen van de immuuncomplexen door de werking van de leukocytchemotactische factoren die door de actie van het complement op de afgezette immuuncomplexen worden geproduceerd. De polymorfonucleaire leukocyten die met de immuuncomplexen reageren maken verschei-30 dene weefsel beschadigende stoffen vrij zoals cathepsine D en E, colla-genase, elastase en permeabiliteitfaetoren, en deze stoffen beschadigen uiteindelijk het weefsel. Het complementniveau in het serum van een patiënt met een immuuncomplexziekte zoals SLE is in het algemeen laag en verzwaring van de ziektecondities vertoont een nauwe correlatie met 35 ie afname van het complementniveau. Deze daling van het complementniveau 8301934 - \ -k - • wordt geacht te wijten zijn aan een grootscheeps verbruik van complement op de plaats waar de reactie tussen antigenen en antilichamen plaatsvindt zoals nieren en bloedvaten. Bovendien wordt gemeend dat de immuuncomplexen ook verband houden met bloedcoagulatiesystemen en 5 gemeend wordt dat ze door diverse mechanismen zoals de versnelling van fibrinolde afzetting op de beschadigde weefsels tot ernstige condities leiden.

Voor de behandeling van immuuncomplexziekten, worden momenteel anti-inflammatoire middelen en immunosuppresieve middelen met inbegrip 10 van steroiden gebruikt om het hypergevoelig gemaakte immuunsysteem te onderdrukken en om lokale ontstekingen en pijnen te verminderen, of worden anti-coagulatiemiddelen en anti-bloedplaatj esmiddelen gebruikt om abnormaliteiten van het coagulatie-fibrinolysesysteem in de bloedvaten te verbeteren. Omdat deze geneesmiddelen echter een zwakke werk-15 zaamheid vertonen en verbonden zijn met sterke nadelige reacties, is het zeer gewenst dat geneesmiddelen worden ontwikkeld die veilig en zeer werkzaam in de behandeling van deze ziekten zijn.

Verder zijn nog: velegeneesmiddelen ontwikkeld voor de behandeling van kwaadaardige tumoren. Deze anti-tumorgeneesmiddelen worden 20 ruwweg ingedeeld in de volgende twee typen: Het eerste type omvat de zogenaamde cytotoxinen die direct de groei van tumoren onderdrukken.

Het tweede type omvat die geneesmiddelen, die indirect de groei van tumoren beheersen door ze als vreemde stoffen te herkennen door middel van de activering van immunologische beschermende functies van de gast-25 heer. Tot het eerstgenoemde type behore:nd.e geneesmiddelen hebben echter niet voldoende selectieve toxiciteit voor tumorcellen, en zijn evenzeer'toxisch tegen normale cellen van de gastheer. Derhalve is een totale dosering in sterke mate beperkt. Anderzijds vertonen die van het laatstgenoemde type, d.w.z. immunopotentiators, ongunstige nadelige 30 reacties minder frequent in vergelijking tot die van het eerstgenoemde type, zodat deze in het algemeen veilig kunnen worden gebruikt. Zij hebben echter een essentieel probleem doordat sommige immunopotentiators, omdat een tumor op zichzelf ontstaat uit normale cellen van een patiënt en wellicht niet voldoende als vreemde stof door de immunolo-35 gische beschermende functies wordt herkend, niet voldoende anti-tumor- 8301934 9 - 5-- werking tentoon spreiden.

Doel van de uitvinding is om een menselijk leukocyt pepsineachtig enzym te verschaffen met werkzaamheid tegen allergiekvalen, immuuncomplexziekten en tumoren.

5 Een ander doel van de uitvinding is om werkwijzen te verschaffen voor het bereiden van een menselijk leukocyt pepsineachtig enzym.

Een ander doel van de uitvinding is om een therapeutisch middel te verschaffen voor aller gi ekvalen, iimmiuncomplexziekten en tumoren, welk middel als actief ingredient een menselijk leukocyt pepsineachtig 10 enzym bevat.

Weer een ander doel van de uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het behandelen van allergiekvalen, immuuncomplexziekten en tumoren door toediening van een menselijk leukocyt pepsineachtig enzym.

15 In de bijgaande tekening is

Fig.1 een grafiek waarin de resultaten van experimenteel voorbeeld 1 worden getoond;

Fig.2 en fig.3 grafieken die de resultaten van experimenteel voorbeeld 3 tonen; 20 Fig.lt· een grafiek die de resultaten toont van de meting van ei wit in de urine in experimenteel voorbeeld h, waarin het eiwitgehalte van urine werd gemeten op basis van de verkleuring van het testpapier en werd uitgedrukt in termen van een gemiddelde indices van een groep.

Dit indexsysteem bestaat uit de cijfers 0, 1,2, 3 en k, die resp. cor-25 responderen met de verkleuringen (-1, (+),“(++), (+++) en (++++).

Als resultaat van een intensief langdurig onderzoek naar de ontwikkeling van een werkzaam therapeutisch middel tegen allergi ekvalen, immuuncomplexziekten en tumoren, hebben de uitvinders van de onderhavige uitvinding gevonden dat een pepsineachtig enzym dat aanwezig is 30 in menselijke leukocyten (verder aangeduid als menselijk leukocyt pep-sineachtige enzym] een sterke anti-allergische werking heeft en een opmerkelijk onderdrukkend effect heeft tegen verscheidene immuuncomplexziekten, en tegelijkertijd een uitstekende anti-tumorverking vertoont.

De onderhavige uitvinding is gedaan op basis van de bovenstaande bevin-35 dingen. * 8301934 • 1 t - β -

Het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym bestaat niet alleen in menselijke leukocyten, maar ook in cellen zoals promyelocytische leukemische cellen stam, HL-60 , behandeld met een stof om differentiatie op te roepen zoals actinomycine D, en. kan worden verkregen uit een 5 bovenstaande vloeistof van een homogenaat van deze cellen door een geschikte combinatie van normale -in de zuivering van eiwitten toegepaste . methoden, b.v. uitzouten, adsorptiechromatografie op een anorganisch adsorbens, ionenuitwisselingschromatografie op een ionenuitwisselings-hars en gelchromatografie met een moleculaire zeef-effect. Verder kan 10 het enzym in grote hoeveelheden worden verkregen uit gekweekte cellen bereid door fusie van tumorcellen met pepsineachtig enzym producerende cellen, zoals menselijke leukocyten of door een genetische manipulatietechniek, b.v. door bereiding van complementair DM met behulp van een reverse transcriptase onder toepassing van het boodschapper EM voor 15 menselijk leukocyt pepsineachtig enzym als matrijs en daaropvolgende integratie van dit DM in E. coli teneinde het enzym te produceren.

De farmacologische werking 'en toxiciteit van dit menselijke leukocyt pepsineachtige enzym zal thans aan de hand van de volgende· experimentele voorbeelden nader worden toegelicht.

20 Experimenteel voorbeeld 1:

Onderdrukkend effect op de produktie van anti-ovalbumine IgE-antilicha-men.

Groepen die elk bestonden uit 10 mannetjes ratten van de Wistar-starn met elk een gewicht van 180 - 200 g, werden gebruikt. Intraperito-25 neaal werd 1/10 mg ovalhumine samen met 20 mg aluminiumhydroxydegel geïnjecteerd. Vanaf de volgende dag werd intraveneus eenmaal per dag gedurende 1U' dagen lang het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym geïnjecteerd. Ha 7, 10 en 1^ dagen vanaf de toediening van ovalbumine werden bloedmonsters genomen en gemeten op het gehalte aan anti-ovalbu-30 mine IgE-antilichaam in het serum door de homologe PCA-ratreactie (H.Maruyama, et al., Folia Pharmacologica Japonica, 7^s 179, 19781. De resultaten worden getoond in fig.1.

De produktie van anti-ovalbumine IgE-antilichaam werd in significante mate door toediening van het menselijke leukocyt pepsineachti-35 ge enzym onderdrukt. * 3301934 m - 7 - \

Experimenteel voorbeeld 2:

Onderdrukkend effect op bronchiale astma.

Groepen die elk bestonden uit 10 mannet j esratten van de Wistar-stam» met elk een gewicht van 180 - 200 g, werden gebruikt. Intraperi-5 toneaal werd 1/10 mg ovalbumine samen met 20 mg *.1 irm·? τνί imhyAyn-xyHegel geïnjecteerd en vanaf de volgende dag werd intraveneus eenmaal per dag gedurende ik dagen lang het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym geïnjecteerd. Ha 1k dagen werd 25 mg/kg ovalbumine intraveneus toegediend om bronchiale astma op te wekken» en de resulterende contractie 10 van de luchtpijp werd gemeten met de methode van Konzett en Ros sier (Arch. Exptl. Path. Pharmacol. 195» Tl» 19^0). De relatieve contractie-snelheid van de luchtpijp van elke groep werd berekend waarbij de contractie van de controlegroep op 100 werd gesteld. De resultaten worden in onderstaande tabel A getoond .

15 Tabel A

Contractiesnelheid van de luchtpijp (£}

Controle 100 menselijk leukocyt'; 0,05 mg/kg 73 20 pepsineaehtig enzym 0>5 ag/kg kg 5 mg/kg 23

De luchtpijpcontractie werd in significante mate onderdrukt door toevoeging van het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym. Experimenteel voorbeeld 3: 25 Onderdrukkend effect op Masugi nefritis.

Volgens de methode van Suzuki et al. (Folia Pharmacologica Japonica, 68, 572, 1972} werd konijnen anti-rattenierenserum intraveneis toegediend aan groepen die elk bestonden! uit 10 mannetjesratten van de Wistar-stam in een dosis van 5 cm^/kg om nefritis op te wekken. Ha het 30 optreden van nefritis, werden bloed en urinemonsters genomen met regelmatige tussenpozen om de niveaus van het serum immuuncomplex en eiwitgehalte in de urine te meten. Het menselijke leukocyt pepsiheachti-ge enzym! werd intraveneus eenmaal per dag na de toediening van de anti-rattenierenantilichamen geïnjecteerd» en de controlegroep kreeg op 35 soortgelijke wijze geïnactiveerd menselijk leukocyt pepsineachtig en- 8301934 « c - 8 - zym toegediend. De resultaten worden getoond in de fig.2 en 3.

In de met hèt menselijke leukocyt pepsineachtige enzym "behandelde groepen-werden dalingen van het eiwitgehalte in de urine en het immuuncomplexgehalte in het bloed waargenomen.

5 Experimenteel voorbeeld

Onderdrukkend effect op spontane nierkwaal.

Er werd een meting uitgevoerd volgens de methode van Abe et al. (The Ryumachi. 1^, 1*3, T97^).

Groepen die elk bestonden uit 16 vrouwtjesmuizen van 16 weken 10 oud (ïïZB x EZW) werden intraveneus met het menselijke leukocyt'pepsineachtige enzym geïnjecteerd in een dosis van 10 mg/kg, en wel eenmaal per dag. Een controlegroep kreeg op soortgelijke wijze geïnactiveerd menselijk leukocyt pepsineachtig enzym intraveneus toegediend. Elke vierde week werd het eiwitgehalte in de urine van de muizen geme-15 ten met een commercieel testpapier (Combisticks). De resultaten worden getoond in fig.1*. Verder werden 6 muizen uit elke groep op de leeftijd van 32 weken gedood en werd de celinfiltratie in de nierglomeruli geobserveerd. De overblijvende 10 muizen van elke groep bleef men dagelijks toedienen, en de overlevingsscore op de leeftijd van 50 weken 20 werd vastgesteld. De resultaten worden getoond in tabel B.

Waargenomen werd, dat door toediening van het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym, dertoename van het eiwitgehalte in de urine in significante mate werd onderdrukt, de celfiltratie na 32 weken gering was en de overlevingsscore na 50 weken hoger was in de met mense-25 lijk leukocyt pepsineachtig enzym behandelde groepen. Deze resultaten tonen dat de spontane nierkwalen in muizen werden onderdrukt door het menselijke leukocyt pepsineachtig enzym.

Tabel B

Controlegroep Met het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym behan-_ delde groep_

Celinfiltratie zware infiltratie lichte infiltratie rond de in microlymfocyten vaatwand en plasmocyten 35 Overlevingsscore 20$ 8o$* * P < 0,05 8301934 > ·Μ - 9 -

Experimenteel voorbeeld 5: _

Onderdrukkend effect op thyroiditis.

Dit experiment werd uitgevoerd volgens de methode van Kotani et al. (Clinical Immunology, £, (81, 635, 197T). Groepen die elk bestonden 5 uit 10 mannetjesratten EUE/EDK (6 weken oud) werden onderworpen aan thymectomie en daarna werden ze elk bestraald met röntgenstraling van 200 rad hetwelk met een tussenpoze van 2 weken viermaal werd herhaald.

Na 1k weken vanaf de thymectomie werden de ratten gedood en bloed afgetapt. De thyroideklieren werden geïsoleerd en ingebed in een parafflne-10 blok en daarna met hematoxyline-eosine of met azan gevlekt. De ernst van de thyroiditis werd geschat overeenkomstig de schaalverdeling van 0 tot k op basis van infiltratie van mononucleaire cellen, destructie van endoplasmisch reticulum eaEEerfibrosis. Het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym werd eenmaal per dag intraveneus aan de dieren 15 toegediend, en de controlegroep kreeg op soortgelijke wijze geïnactiveerd menselijk leukocyt pepsineachtig enzym toegediend. De resultaten worden getoond in tabel C.

Vergeleken met de controlegroep waren in de met het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym behandelde groepen zowel het optreden 20 als de ernst van de thyroiditis op een dosisafhankelijke wijze verminderd.

Tabel C

Optreden (%} Ernst_ controle 90 3,5 + 0»^ 25 menselijk leukocyt pepsineachtig enzym 1 mg/kg 80 3,0 + 0,5 3 mg/kg 60 1,9 + 0,2* 1Q mg/kg kQ* 1,3 + 0,1** 30 * p < 0,05 i* p < 0,01

Experimenteel voorbeeld 6:

Hydrolyse van menselijk immuuncomplex.

Serum werd verkregen van patiënten met rheumatoïde artritis, sys-temische lupus erythematosus en hepatitis, waarvan bewezen was dat ze 35 Immuuncomplex in hun serum droegen. Het menselijke leukocyt pepsineach- 8301934 - TO - . ' 3 .

txge enzym werd aan 1 err van het serum toegedxend xn een ^oeveelhexd van 10, 30 of 100 yg, en het serum werd gedurende 60 minuten bij 37° C gexncubeerd. Ha de reactie werd de hoeveelheid immuuncomplex in het serum gemeten door de hemolytische reactie van schape-erythrocyten in 5 tegenwoordigheid van caviacomplement volgens de methode van Fust et al. (Atherosclerosis, 29. 181, 1978), waarin geaggregeerd menselijk'IgG als standaardstof werd gebruikt . De resultaten worden getoond in tabel D.

Tabel D

Ziekten Serum Toegevoegde hoeveelheid men- Gehalte aan im- •^q Ho. selijk leukocyt pepsineach- muuncomplex tig enzym (ug/cm3) ___Wcm3i_ ^_

Rheumatoxde 1 0 78 arthritis „ 10 65 30 53 15 100 beneden 50 2 0 23b 10 180 30 150 100 123 20 Systemische lupus 1 0 b20 erythematosus ^ 30 211 100 . 12h 2 0 125 25 10 70 30 56 100 beneden 50 '

Hepatitis 1 0 65 10 58 30 30 beneden 50 100 beneden 50 2 0 70 10 66 30 55 35 100 51 8301934 - 11 - # Het menselijke leukocyt pepsineaehtige enzym verlaagde de hoeveelheid imnruuncomplex in het serum van de patiënten die leden aan chronische rheumatisme, systemische lupus erythematosus en hepatitis op een dosisafhankelijke wijze.

5 Experimenteel voorbeeld 7:

Effect op de groei van gekweekte menselijke borstkankercellen MX-1 en muisleukemiecellen L1210.

Menselijke horstkankercellen MX-1 en muisleukemiecellen L1210 5 3 werden resp. gesuspendeerd in een celconcentratie van 10 /cm in 20 Eagle-medium dat 10% kalfsserum en teststoffen bevatte. De cellen werden bij 37°C gekweekt onder 5% C02 gedurende U8 uren. Daarna werd het aantal levenskrachtige cellen geteld nadat met Tripan Blue was gevlekt. De groei-inhibitiescore werd berekend volgens de volgende vergelijking en de resultaten worden getoond in tabel E.

15 Aantal levenskrachtige cellen

Groei-inhibitiescore = (1 - groep-) x 100

Aantal levenskrachtige cellen in controle groep *

Tabel E

20 Toegevoegde con- Groei-inhibitiescore centratie (%) (yg/cm3) MX-1 L1210 menselijk leukocyt pepsine- 30 16 7 achtig enzym 100 32 22 25 300 55 29

Mitomycine C 100 U8 61

Het menselijk leukocyt pepsineaehtige enzym remde de groei van tumorcellen zelfs bij lage concentraties*.

Experimenteel voorbeeld 8: 30 Effect op leukemiecellen P388 dragende muizen.

105 leukemiecellen P388 werden intraperitoneaal getransplanteerd in een groep van vijf 3DF^-mannetjesmuizen. Het menselijke leukocyt pepsineaehtige enzym werd intraveneus tweemaal per dag in de muizen geïnjecteerd, beginnend op de volgende dag totdat de dieren stierven.

35 De gemiddelde levensduur werd berekend en uitgedrukt als een percentage 8301934 - 12 - ·Λ

X

van de controle. 33e resultaten worden getoond in tabel F.

Gemiddeld aantal overlevings-

Gemiddelde levensduur (%) = " - x 100 — Gemiddeld aantal overlevings- dagen van controle groep

5 Tabel F

Dosis Gemiddelde levensduur (mg/kg) (%) controle 100 + 5 menselijk leukocyt pepsine- 0,3 109 i 5 10 achtig enzym 1>0 120 ± 8 3,0 12k + 8*

Mtomycine C 0,5 135 + 16 a p < 0,05.

Het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym verhoogde duidelijk 15 de gemiddelde levensduur.

Experimenteel voorbeeld 9:

Effect op menselijke borstkanker MX-1 getransplanteerd in een naakte muis.

2 .

Twee stukjes menselijke borstkanker MX-1 van :1 mm die m sub-20 cultuur op naakte muizen (BALB/C, nu/nu) waren gekweekt , werden subcu-taan getransplanteerd op de ruggen van dieren in groepen die elk bestonden uit 5 naakte muizen van genoemde stam. Vanaf 2 weken later werd het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym tweemaal per dag gedurende 18 dagen intraveneus toegediend. Ha 18 dagen na de eerste toediening 25 van het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym werden de tumoren geïsoleerd en gewogen. De resultaten worden getoond in tabel G.

Tabel G

Dosis Tumorgewicht (g).

(mg/kg) 30 Controle 1, 3k + 0,10 menselijke leukocyt 0,3 0,76 + 0,12* pepsineachtig enzym 3>0 0,66 + 0,13* * p < 0,05

Het menselijk leukocyt pepsineachtig enzym vertoonde een signifi-35 cante anti-tumorwerking zoals bij de lagere dosis.

8301934 - 13 -

Experimenteel voorbeeld 10:

Acute toxiciteit.

Aan groepen die elk bestonden uit 10 ddY-muizen met een gewicht van 20 + 1 g werden intraveneus of intraperitoneaal 2 gjkg toegediead - 5 van het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym, opgelost in een fysiologische zoutoplossing. Daarna werden de muizen gedurende 1 week onder een dagelijkse observatie voor eventuele toxicologische symptomen gehouden. Gedurende deze periode werden geen tekenen van enige toxiciteit waargenomen.

10

Zoals beschreven in de bovenstaande experimentele voorbeelden werd door het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym, dat een werkzaam ingrediënt van het farmaceutische middel volgens de onderhavige uitvinding is, duidelijk de produktie van IgE-antilichamen onderdrukt en een 15 duidelijk therapeutisch effect tegen experimentele astma getoond. Boven dien werd door het enzym duidelijk het ontstaan en de ontwikkeling van een aantal ziekten onderdrukt, waarvan men aanneemt-dat ze door-immuun-complexen worden opgeroepen, b.v. thyroiditis en nefritis. Verder vertoonde dit menselijk leukocyt pepsineachtige enzym een sterke anti-20 tumorwerking.

Afgaande op de resultaten van het acute toxiciteitsonderzoek, is de dosering die vereist is voor het bereiken van deze effecten, binnen een voldoende veilig gebied. Omdat dit menselijk leukocyt pepsineachtige enzym een eiwit van menselijke oorsprong is, wordt gemeend dat 25 dit weinig gevaar voor het opwekken van ernstige nadelige reacties als gevolg van antigeniciteit, b.v. een anafylactische shock inhoudt. Daarom kan het een zeer bruikbaar therapeutisch middel verschaffen tegen verscheidene allergiekwalen zoals bronchiale astma, urticaria, hooikoorts, contactdermatitis, voedingsallergie, geneesmiddelallergie, al-30 lergische rhinitis, hypergevoeligheidspneumonitis, verscheidene immuun-complexziekten zoals systemische lupus erythematosus, glomerulo-neiritis met immuuncomplex, periarteritis nodosa, rheumatoxde artritis, im-muuncomplex hepatitis, thyroiditis, serumziekte, myasthenia gravis, en verscheidene tumoren zoals maagkanker, longkanker, leverkanker, kartel-35 darmkanker, borstkanker, prostaatkanker, uteruskanker, blaaskanker, 8301934 - 1¾ - slokdarmkanker,. lymfoma' s.

Beste wijze voor het üitvoeren van de uitvinding.

Eet menselijk leukocyt pepsineachtige enzym kan als volgt worden Bereid: De bovenstaande vloeistof van menselijk leukocyt homoge-5 naat wordt door een met 0,1 M acetaatbufferoplossing (pH 5,3) geëquili-breerde DEAE-cellulosekolom gevoerd om het enzym te adsorberen. Het geadsorbeerde enzym wordt met dezelfde buff er oplos sing, die 0,5 M natrium-chloride bevat, geëlueerd. Dit eluaat kan worden geconcentreerd en verder worden gezuiverd door gelchromatografie op een kolom van Sephadex 10 G-100, die met 0,9% fysiologische zoutoplossing is opgezwollen. Gevon den is dat het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym een molecuulge-wicht bezit van 35.000 tot M .000 door gelchromatografie op Sephadex G-100; een isoëlektrisch punt in het gebied van pH 2,5 - 3,5 heeft door isoëlektrófocussing op amfoline; een maximum adsorptie bij 278 nm 15 heeft; een positieve reactie op ninhydrine vertoont, en gemakkelijk oplost in water en onoplosbaar is’ in ether en chloroform. Verder vertoont het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym een hoge hydrolytische werkzaamheid voor hemoglobine in het zure gebied beneden pH 7,0 en zijn optimale pH is 2,0 - 3,5.

20 Het middel volgens de onderhavige uitvinding wordt in het alge meen bereid in de vorm van een injecteerbare oplossing en wordt intraveneus, subcutaan, intramusculair of intra-articulair of op de lokale . plaats van een tumorcel geïnjecteerd. Het kan echter ook worden gebruikt in de vorm van een oraal middel, inhaleringsmiddel of rectaal supposito-25 rium. De dagelijkse dosis van het menselijke leukocyt pepsineachtige enzym is 1 - 1000 mg,bij voorkeur 50 - 500 mg, maar deze kan geschikt worden vergroot of verkleind afhankelijk van de leeftijd, symptomen en de wijze van toepassing.

Het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym kan worden samenge-30 steld tot een farmacologisch middel volgens een conventionele methode, samen met eventuele conventionele farmaceutische dragers of excipiëntia.

Injectiepreparaten kunnen gelyofiliseerde preparaten omvatten, die op het moment van toediening worden opgelost, en vloeibare preparaten; preparaten met geregelde afgifte worden eveneens geprefereerd om 35 een langdurig werkzame concentratie in stand te houden.

8301934 - 15 -

Orale preparaten kunnen de vorm fretten van capsules, tabletten, grandes, poeders of vloeibare orale preparaten; ze zijn bij voorkeur in de vorm van liposoominclusielicframen om absorptie te bevorderen.

De infraleringsmiddelen frebben bij voorkeur de vorm van gelyofili-5 seerde preparaten; voor rectale toediening beeft de vorm van supposito-ria de voorkeur.

Tfrans volgen voorbeelden van de uitvinding.

Voorbeeld I

Vooraf met actinomycine D behandelde HL-60 leukemiecellen (10 10 cellen) werden gesuspendeerd in 1 dar 0t9% fysiologische zoutoplossing en daarna in een fromogenisator vernietigd. De bovenstaande vloeistof die-door centrifugeren (30 minuten met 10.000 omv./min) werd verkregen, werd geconcentreerd en ontzout onder toepassing van een ultra-concentrator (Millipore, Diaflow lfodel-202). De geconcentreerde oplossing 15 werd op een DEAE-cellulosekolom gebracht (10 x 50 cm), die met 0,01 M fosfaatbufferoplossing (pïï 7,0) was geëquilibreerd. De kölom werd ge-

O

wassen met 1» dm van dezelfde bufferoplossing die 0,1 M NaCl bevatte en er werd een actieve fractie met dezelfde bufferoplossing, die 0,1»- M NaCl bevatte, geëlueerd. Daarna werd de actieve fractie gebracht op 20 een kolom Tan Sephadex G-100 (10 x 90 cm), die met pyrogeenvrije Qy9%'s fysiologische zoutoplossing was geëquilibreerd, en werd aan gelfiltra-tie onderworpen, waarbij 50 mg van het pepsineachtige enzym werd verkregen. De specifieke activiteit van het pepsineachtige enzym bedroeg 1930 u/mg wanneer de enzymactxviteit gemeten werd volgens de methode 25 van Anson (J. Gen. Physiol., 22, -79, 1938) gebruikmakend van Swine-pepsine als standaardstof en gedenatureerd hemoglobine als substraat. Voorbeeld II

Menselijke leükocyten (10^ cellen) werden gesuspendeerd in 20 mM tris-HCl-bufferoplossing (pH 7,1») die \% Triton X-10Q, 10 mM van een 30 vanadylcomplex, 3 mM magnesiumacetaat, 10 mM HaCl en 5% sucrose bevatte en de cellen werden in een Teflon-homogenisator vernietigd. De polysome fractie werd van het homogenaat verzameld door centrifugeren en m-BHA werd met fenol geëxtraheerd uit de polysoomfractie, gevolgd door precipitatie met ethanol. Aan dit neerslag werd 0,2 M tris-HCl-buffer-35 oulossing (pH 9,0), die 0,5% SDS, 0,01 M EDTA en 50 mM HaCl bevatte, '8301934 -16.- toegevoegd, en het mengsel werd gedurende 3 minuten hij T0°C gexncubeerd. Deze oplossing van m-RNA werd geadsorbeerd op een oligo (dT) cellulose-kolom. De kolom werd gewassen en daarna geëlueerd met 1Ö mM tris-HCl-bufferoplossing (pH 7»*0, die 0,5% SDS en 1 mM EDTA bevatte, teneinde 5 een fractie van m-RNA, dat poly A bevat, te verkrijgen. Dit m-RNA werd verder gefractioneerd door een sucrosedichtheidsgradiënt'bij een concentratie van 5 - 25%. De fracties werden op m-RNA-activiteit die correspondeert met het pepsineachtige enzym in het eiwitsynthesesysteem van de ovocytes van Xenopus onderzocht, en men verkreeg een actieve 10 fractie. Men voegde 5 yg van het aldus bereide pepsineachtige enzym m-RNA toe aan 100 ydm^ van een kO mM tris-HCl-bufferoplossing (pH 7*5) die 1 yg oligo (dT) 5 mM mercaptoëthanol, 0,5 mM van dATP, dTTP, dGTP en dCTP en 10 eenheden reverse transcriptase (AMV-RT) bevatte, en incubeerde gedurende 90 minuten bij k2°C'. Ha de incubatieperiode werd 15 RNA verwijderd door deproteinatie en een alkalibehandeling om complementair DNA te verkrijgen. De DNA werd daarna in hetzelfde medium als gebruikt werd in de bereiding van het bovenstaand genoemde complementaire DNA gexncubeerd (met dien verstande dat geen oligo(dT)1Q aanwezig was) teneinde een dubbelstrengs complementair DNA te verkrijgen. Na 20 behandeling met 0,25 eenheden nuclease SI werd het dubbelstrengs comple-

O

- mentaire DNA toegevoegd aan 30 ydnr van een 1^0 mM cacodylzuuroplossing (pH 7,6) die 5 eenheden terminaal transferase, 1 mM dATP, 0,1 mM dithio-trextol, 30 mM trihydroxylamine en 1 mM kobalt chloride bevatte, en gedurende 15 minuten bij 37°C gexncubeerd om de additie van deoxyadenine-25 ketens te bewerken.

Anderzijds werd 3 yg van E. coli plasmide pBR 322 DNA-behandeld met 0,25 eenheden van EcoRI gedurende 20 uren bij 37°C en verder gexncubeerd samen met 17,5 eenheden van een exonuclease gedurende 90 minuten bij 0°C. Na de incubatie werd plasmide DNA met deoxythymidineketen ver-30 kregen op soortgelijke wijze als in de bereiding van het bovenstaand genoemde DNA met deoxyadenineketen (met dien verstande dat dTTP gebruikt werd in plaats van dATP).

Het aldus geproduceerde plasmi de DNA met deoxythymi dineket en en het bovengenoemde DNA met deoxyadenineketen werden door behandeling ge-35 durende 2 minuten bij 65°C, gedurende 120 minuten bij k6°C, gedurende 8301934 - 1T - βΟ minuten bij 37°C en gedurende 6o minuten bij 23°C in een 50 mM tris-ICl-bufferoplossing (pH 7,5) die 5 mM EDTA en 0,1 M NaCl bevatte, met elkaar verbonden.

Daarna verden E. coli NIHR C-2 getransformeerd door bet gerecom-5 bineerde plasmide DNA te gebruiken en gedoneerd van de ampicilline-resistente stam 5000. Het gedoneerde DNA werd in E. coli geïntroduceerd door verbinding aan de promotorplaats van bet tryptofaanoperon volgens de methode van Goeddel et al. (Nature, 28?, fcll, 1980). Een stam (E-931) die de produktie van het pepsineacbtige enzym met hoge *9 10 concentraties vertoonde, werd gekweekt in LB-mediua dat 20 mg/dar ampi-cilline bevatte. Van de bovenstaande vloeistof, verkregen van het homo-genaat van 17 kg van de gekweekte cellen, werd 3,5 g van het pepsine-achtige enzym verkregen op dezdfde wijze als in voorbeeld I.

Voorbedd III

15 Men loste 1 g menselijk leukocyt pepsineachtig enzym op in 100 cm fysiologische zoutoplossing en filtreerde aseptisch door een mem-braanfilter. Men bracht porties van 1 cm^ van het filtraat in gesteriliseerde glasvaten en sloot deze na lydfxlisering af, waardoor gelyofi-liseerde poederpreparaten werden verkregen.

20 . Voorbeeld IV

Men woog 1 g van het gelyofiliseerde menselijk leukocyt pepsine-achtige enzym, T g lactose en 3 g magnesiumstearaat af en vermengde deze uniform. Daarna werden porties van dit mengsel van 20G mg verpakt in No.2 gelatinecapsules en voorzien van een enterische bekleding ten-25 ' einde enterische capsules te verkrijgen.

Voorbeeld V

Dooierlecithine, cholesterol en diacetylfosfaat werden in een mol-verhouding van 7:2:1 gemengd, en 100 mg van het mengsel werd o opgelost in 12,5 cm chloroform. Uit deze oplossing werd een dunne 30 film gevormd op de wand van een kolf. Men bereidde een dispersie door deze film te mengen met 25 cm fosfaatbufferoplossxng dxe 100 mg van het menselijk leukocyt pepsineacbtige enzym bevatte. Na ultrasone behandeling werd de dispersie met 110.000 g gecentrifugeerd. Het verkre-gen precxpxtaat werd gesuspendeerd in 3 cm fysxologische zoutoplossing 35 en gesteriliseerd waarbij menselijk leukocyt pepsineachtig enzym bevattend liposoom inclusiepreparaat werd verkregen.

------—- _ 8301934

Claims (19)

1. Menselijk leukocyt pepsineachtig enzym met de volgende eigenschappen: a) molecuulgewicht van 35*000 tot hl.000, b) isoëlektrisch punt hij een pH van 2,5 tot 3,5, 5 c) maximumabsorptie hij .278 nm, d) positieve ninhydrienreactie, e) . gemakkelijk oploshaar in water en onoplosbaar in ether en chloroform, f) wit poedervormig uiterlijk, en 10 g) anti-allergische, anti-immuuncomplexziekte en anti-tumor- activiteit, in nagenoeg gezuivèrde Vorm.

2. Werkwijze voor het produceren van een pepsineachtig enzym uit menselijk leukocyt.

3. Werkwijze voor het produceren van een pepsineachtig enzym langs de weg van gen manipulatietechnieken. k. Therapeutisch preparaat voor het behandelen van allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren, omvattende een menselijk leukocyt pepsineachtig enzym in nagenoeg gezuiverde vorm als werkzame ingrediënt. 20 5* Therapeutisch preparaat volgens conclusie U, waarin het mense- ♦· lijk leukocyt pepsineachtig enzym de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht van 35.000 tot 1+1.000, h) isoëlektrisch punt van pïï 2,5 tot 3,5, c) maximum absorptie hij 278 nm, 25 d] positieve ninhydrienreactie, e) gemakkelijk oplosbaar in water en onoplosbaar in ether en chloroform, fX wit poedervormig uiterlijk, en g) . anti-allergische, anti-immuuncomplexziekte en anti-tumor- 30 activiteit.

6. Therapeutisch preparaat volgens conclusie U, omvattende een mengsel van een of meerdere excipiëntia en/of adjuvantia met genoemd 8301934 ** * - 19 - menselijk leukocyt pepsineachtig enzym·

7. Therapeutisch preparaat volgens conclusie 4 , waarin het prepa-' raat de voim heeft van een injectiepreparaat, een oraal preparaat, een suppositorium of een inhaleringspreparaat.

8. Werkwijze voor het "behandelen van allergiekvalen, immuuncomplex- ziekten en tumoren, waarbij aan een patiënt die behandeling voor aller-giekwalen, immuuncomplexziekten en/of tumoren behoeft, een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een menselijk leukocyt pepsineachtig enzym wordt toegediend.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin het menselijk leukocyt pepsineachtig enzym de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht van 35.000 tot h1.000, b) isoëlektrisch punt van pH 2,5 tot 3,5, c) maximum absorptie bij 278 urn, 15 d) positieve ninhydrienreactie, e) gemakkelijk oplosbaar in water, en onoplosbaar in ether en chloroform, f) wit poedervormig uiterlijk, en g) anti-allergische, anti-immuuncomplexziekte en anti-tumor- 20 activiteit.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het menselijk leukocyt pepsineachtige enzym wordt toegediend in een mengsel met een of meerdere farmaceutisch aanvaardbare excipiëntia en/of adjuvantia.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het menselijk leukocyt 25 pepsineachtige enzym door een of meerdere routes uit de groep injectie, orale toediening, rectale toediening en inhalering, wordt toegediend.

12. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin de therapeutisch werkzame hoeveelheid 1 tot 1000 mg per dag is.

13. Therapeutische werkwijze volgens conclusie 12, waarin de thera-30 peutisch werkzame hoeveelheid 50 tot 500 mg per dag is. 1k. Therapeutisch preparaat volgens conclusie 5, omvattende een mengsel van een of meerdere excipiëntia en/of adjuvantia met genoemd menselijk leukocyt pepsineachtig enzym,

15. Therapeutisch preparaat volgens conclusie 5, waarin het prepa-35 raat de vorm heeft van een injectiepreparaat, een oraal preparaat, een 8301934 4 ' - 20 - 0 suppositorium of een inhaleringspreparaat.

16. Therapeutisch preparaat volgens conclusie 1U, waarin het preparaat de vorm heeft van. een injectiepreparaat, een oraal preparaat, een suppositorium of een inhaleringspreparaat. 5 1T. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het menselijk leukocyt pepsineachtig enzym wordt toegediend in een mengsel met een of meerdere farmaceutisch? aanvaardbare excipiëntia en/of adjuvantia.

18. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het. menselijk leukocyt pepsineachtig enzym wordt toegediend door een of meerdere routes uit 10 de groep injectie, orale toediening, rectale toediening en inhalering.

19. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij het menselijk leukocyt pepsineachtig enzym wordt toegediend door een of meerdere routes uit de groep injectie, orale toediening, rectale toediening en inhalering.

20. Werkwijze volgens conclusie 9, waarin de therapeutisch werkzame 15 hoeveelheid 1 tot 1000 mg per dag is.

21. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin de therapeutisch werkzame hoeveelheid 1 tot 10QQ mg per dag. is.

22. Therapeutische werkwijze volgens conclusie 20, waarin de therapeutisch .werkzame hoeveelheid 50 tot 500 mg per dag is.

23. Therapeutiscbewerkwijze volgens conclusie 21, waarin de thera peutisch werkzame hoeveelheid 50 tot 500 mg per dag is. 8301934