DE3308004A1

DE3308004A1 - Verwendung von dibenzocycloheptenyliden-verbindungen zur modulation der immunreaktion

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Publication number: DE3308004A1
Application number: DE19833308004
Authority: DE
Inventors: Richard P. Lansdale Pa. Carlson; Richard L. Plymouth Meeting Pa. Fenichel; Alan J. Audubon Pa. Lewis; Milton West Chester Pa. Wolf
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1982-03-08
Filing date: 1983-03-07
Publication date: 1983-09-15
Also published as: GB8306040D0; GB2116038A; ATE18993T1; US4376124A; EP0089759B1; BE896098A; AU557880B2; AU1174383A; IT1161210B; JPS58164507A; PH17757A; DE3362876D1; EP0089759A1; ZA831193B; IT8319939A0

Description

POSTFACH 7βΟ. Οβοοο MÜNCHEN 43 ZUGELASSENE VERTRETER BEIM

EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

TELEFONE (OBB) 2 71 β β 83 TELEX: OS21S2O8 ISAR D

BAUERSTRASSE 22. D-BOOO MÜNCHEN 4O

VNR 104 523

7.März 1983

UNSERE AKTE: OUR REF:

:: M/24016

BETREFF· RE

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685 Third Avenue

New York, N. Y. 10017, USA

Verwendung von Dibenzocycloheptenyliden-Verbindungen zur Modulation der Immunreaktion

POSTANSCHRIFT: D-βΟΟΟ MÜNCHEN 43. POSTFACH 78Ο

ι · ο

β ο *

A 1 Μ/24 016 -^

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Dibenzocycloheptenyliden-Verbindungen zur Modulation der Immunreaktion bei Mensch und Tier.

Die US-PS 4 267 192 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungen bei Säugetieren, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung von Verbindungen der allgemeinen Formel

worin R ein Wasserstoffatom oder ein© Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoff atomen und R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, und der pharmazeutisch verträglichen Salze davon, überraschenderweise wurde nun gefunden, daß diese Verbindungen auch signifikante immunmodulierende Aktivität gegenüber der humoralen und zellulären Immunreaktion besitzen.

Die gegenwärtig verfügbaren, nicht-steroiden, antiinflammatorischen Arzneimittel, wie Indomethacin, Naproxen, Sulindac, Flurbiprofen, Aspirin und Piroxicam, sind in gewissem Maße in der Lage, die zur Schwächung führenden Auswirkungen des Entzündungsprozesses zu verringern. Sie modifizieren jedoch nicht

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die den Entzündungsprozessen zugrundeliegenden Autoiramun-Prozesse, von denen man annimmt, daß sie direkt verantwortlich sind für die Auslösung der Entzündungsprozesse bei Krankheiten, wie rheumatischer Arthritis. Der fehlende Einfluß auf das gestörte immunologische Gleichgewicht erlaubt die Bildung und die Ablagerung von Immunkomplexen und erlaubt eine fortgesetzte, unkontrollierte Hyperaktivität der zelllulären Immunreaktion. Die Fortdauer der Entzündungsreaktion führt zur allmählichen Zerstörung der befallenen Gelenke. Dementsprechend ist das Auffinden und die Entwicklung solcher Arzneimittel von höchster Wichtigkeit, die in der Lage sind, die den Entzündungsprozessen zugrundeliegenden, immunologischen Ursachen zu modifizieren, um auf diese Weise zu versuchen, den Verlauf entzündlicher Erkrankungen, wie rheumatischer Arthritis, systemischem Lupus erythematodes usw., zu beeinflussen.

Wie oben bereits angedeutet, wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die in der US-PS 4 267 192 beschriebenen Verbindungen neben ihrer signifikanten antiinflammatorischen Wirkung auch signifikante iramunmodulierende Eigenschaften besitzen, so daß diese Verbindungen auch zur Behandlung von solchen Erkrankungen und Störungen brauchbar sind, bei denen die Modulierung der Immunitätsreaktion angezeigt ist.

Diese Verbindungen können deshalb bei der Behandlung von entzündlichen Autoimmunerkrankungen, wie systemischen Lupus erythematodes, verwendet werden. Es ist wichtig festzuhalten, daß nicht-steroide, anti-35

• · « β * 09 O ** © * 4 « β·0 O

• · β«*» * 0 O

1 Μ/24 016

inflaramatorische Arzneimittel (NSAID), die gegenv/Mrtig für die Therapie derartiger inflammatorischer Erkrankungen, wie rheumatischer Arthritis, verwendet werden, keine signifikanten, imrounmodulierenden Eigenschaften besitzen, so daß die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen nicht in der gleichen Weise wie herkömmliche HSAID wirken. Vielmehr ist man der Meinung, daß die Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen auf einem bisher unbekannten und nichtdefinierten Mechanismus beruht.

Die erfindungsgemäS verwendeten Verbindungen können gemäß üblichen, allgemeinen Verfahren hergestellt werden, beispielsweise mit Hilfe d@r Wittig-Horner-Reaktion, die von CD. Bergmann und A. Solomonovici, Synthesis 1970, Seiten 183-188, beschrieben ist. Gemaß diesem Verfahren setzt man 5H-Dibenzo[a,d]cyclohepten-5-on mit einem Trialkyl-phosphonoalkanoat und Natriumhydrid in einem organischen Lösungsmittel umj verseift das erhaltene Alkyl-5H-dibenzo[a,d]-cyclohepten-5-yliden-alkanoat mit einer Base und isoliert die Verbindung dann als Salz oder in Form der freien Säure. Die Ester können entweder direkt gemäß dem ©bon beschriebenen Verfahren oder durch Veresterung der freien Säur© hergestellt werden. Darüber hinaus können die Verbindungen aus 5H-Dibenzo-

30 [a,d]cyclohepten-5-on mit Hilfe der Reformatsky-

Reaktion oder mit Hilf© der modifizierten Reförmatsky-Reaktion unter Verwendung von Lithiumsalzen der α-Lithiocarbonsäuren hergestellt werden. Die Ausgangsverbindung 5K-Dibenzo[a₉d]cyclohepten-5-on ist eine

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handelsübliche Verbindung oder kann gemäß dem von W. Treibs und H.J. Klinkhammer, Chem.Ber.., 84, 671 (1951)» beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die pharmazeutisch verträglichen Salze der freien Säure umfassen beispielsweise Natrium-, Kalium-Ammonium- und Niedrigalkylamin-Salze, die gemäß üblichen Verfahren hergestellt und isoliert werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen sind immunmodulierende Mittel mit signifikanter Aktivität bei der Behandlung von solchen Erkrankungen und Störungen, die eine Modulation der Immunreaktion erfordern. In dieser Hinsicht kann man diese Verbindungen zur Behandlung von auto immunen Erkrankungen, wie systemischem Lupus erythematödes, autoimmuner

20 hämolytischer Anämie, rheumatischer Arthritis,

Spondylitis ankylosans, Reiter's Syndrom usw., sowie bei Störungen verwenden, die in engem Zusammenhang mit der Autoimmunitat stehen, wie Multipler Sklerose. Da die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen darüber hinaus nicht durch Stimulierung der bei Säugetieren natürlich vorkommenden Steroide wirken und selbst bei hohen Dosen keine Magensekretion hervorrufen, und da diese Verbindungen zudem keine allgemeine pharmakologische Aktivität aufweisen, sind sie insbesondere brauchbar für die Langzeitbehandlung chronischer, immunologischer Störungen, wie sie beispielsweise bei systemischem Lupus erythematödes und anderen Binde gewebs störungen vorliegen.

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Bei Verwendung der Dibenzocycloheptenyliden-Verbindüngen als immunmodulierende Mittel kann .man sie zu oralen Dosierungsformen, wie Tabletten, Kapseln und dergl., formulieren. Diese Verbindungen können allein oder zusammen mit üblichen Trägern, wie Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker, Lactose, Pectin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulos©, Na triumcarboxyme thy !cellulose, niedrigschmelzendem Wachs, Kakaobutter und dergl., verwenden. Verdünnungsmittel,, Geschmacksstoffe, Solubilisierungsmittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Bindemittel, Tabletten-Desintegrationsmittel und dergl, können zur Anwendung kommen. Di© Verbindungen können mit oder ohne weitere Träger verkapselt werden. In allen Fällen ist die Menge an festen oder flüssigen Wirkstoffen in den Mitteln zumindest ausreichend, um diesen Mitteln bei oraler Verabreichung immunmodulierende Aktivität zu verleihen. Die Verbindungen können auch parenteral indiziert werden, wobei sie in Form einer sterilen Lösung verwendet werden, die weitere gelöste Bestandteile enthält, beispielsweise genügend Kochsalz oder Glucose _s um die Lösung isotonisch zu machen.

Die Dosierung variiert mit den speziellen, zur Anwendung kommenden Mitteln, der Art der Verabreichung, dem Ausmaß der vorliegenden Symptome und dem zu behandelnden Patienten. Die Behandlung beginnt im allgemeinen mit kleinen Dosen, die geringer sind als die

• · β

1 Μ/24 016

optimale Dosis. Danach erhöht man die Dosis, bis unter den gegebenen Umständen der optimale Effekt erreicht wird. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen am bevorzugtesten in einer Menge verabreicht, die üblicherweise zu effektiven Ergebnissen ohne schädliche oder nachteilige Nebenwirklingen führt. Bei großen Tieren (etwa 70 kg Körpergewicht) und bei oraler Verabreichung liegt die Dosis bei etwa 10 mg bis etwa 200 mg/Tag. Die Verbindungen werden entweder in Form einer einzelnen Dosiseinheit oder gewünschtenfalls in geeignete Untereinheiten unterteilt, zu geeigneten Zeiten während des Tages oder auf der Basis von einer oder zwei Wochen verabreicht.

Die immunmodulierenden Wirkungen der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können anhand von pharmakologischen Standardverfahren, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben sind, gezeigt werden.

Diese Verfahren dienen dazu, die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen, einen immunmodulierenden Effekt auszuüben, gemessen anhand des Murin-methylierten Rinderserumalbumin-Assays (MBSA), des Tuberculin-induzierten, verzögerten Hypersensitivitäts-Tests an Meerschweinchen, des Jeme-Plaque-Assays, des experimentellen, allergischen Encephalomyelitis-Tests an Ratten, sowie die Fähigkeit der Verbindungen zu zeigen, die T- und B-Lymphozyte"n-Proliforation in Gegenwart sowohl suboptimaler als auch höherer Konzentrationen an dem Mitogen Concavalin A und an Lipopolysaccharid.

ad· ti

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Beispi

5 (5H-Dibenzo[a _f d Icyclohepten-ft-yliden) -essigsäure

Ein Mischung von 65,24 g (0,291 Mol) Triäthylphosphonacetat und 13,967 g (0,291 Mol) Natriumhydrid in Öl (50%) in 750 ml trockenem Dimethylsulfoxid wird über Nacht bei Umgebungstemperatur in einer Stickstoffatmo-Sphäre gerührt. Man gibt 60,00 g (0,291 Mol) 5H-Dibenzo[a,d]cyclohepten-5-on zu dieser Mischung/erhitzt diese Mischung nach 1stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur unter Rühren 30 h auf 100 + 1°C. Man destilliert das Dimethylsulfoxid im Vakuum ab und er-

15 hitzt den öligen Rückstand mit einer Lösung von

Natriumhydroxid in 5Obigem Äthanol (400 ml von 12,5%) 16 1/2 h unter Rückfluß. Man destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab und verdünnt den Rückstand mit 100 ml Wasser. Die Mischung wird nacheinander mit 200 ml Toluol/Heptan (1:1) und 200 ml Toluol extrahiert. Die dunkle, wäßrige Schicht wird mit Darco G60 entfärbt und anschließend durch Gelite filtriert. Die klare, dunkle Lösung des Natriumsalzes gibt man unter Rühren zu 400 ml 6N Chlorwasserstoffsäure. Die Titelverbindung scheidet sich in Form eines gelben Feststoffes ab. Die Ausbeute an Rohprodukt beträgt 67,7 g (93,8%). Umkristallisation dieses Materials aus Tetrahydro furan/Toluol (unter Entfärbung mit Darco G60) ■ ergibt ein® Ausbeute von 40,2 g (55,7%) schmutzigweißer

30 Kristalle, Fp. 210°C (Zers.)(unkorrigiert).

Elementaranalyse: ^c^7^Hi2°2 berechnet: C 82,24% H 4,87%

gefunden : 81,96 4,91. 35

Q 1 M/24 016 ._Λο

Beispiel 2

2-( 5H-Dibenzo Fa, d ]cyclohepten»5-yliden) -propionsäure 5H-Dibenzo[a,d]cyclohepten-5-on wird gemäß Beispiel 1 mit Triäthyl-2-phosphonopropionat umgesetzt, wobei man die Titelverbindung erhält, Fp. 235 bis 236°C (unkorr.)·
Elementaranalyse: C₁₈H₁^O₂

berechnet: C 82,4250 H 5,38# gefunden : 82,33 5,77

15 Beispiel 5

Äthyl- ( 5H-dibenzo fa «d icvclohepten-S-vliden) -acetat Eine Lösung von Triäthylphosphonoacetat (44,838 g; 0,200 Mol) in 100 ml trockenem Dimethylsulfoxid wird unter Rühren rasch zu einer Lösung von Kalium-t-butoxid (23,005 g; 0,205 Mol) in 400 ml trockenem Dimethylsulfoxid in einer Stickstoff atmosphäre gegeben. Die Innentemperatur steigt von 23 auf 33°C. Nach halbstündigem Rühren bei Umgebungstemperatur gibt man 5H-Dibenzo[a,d]cyclohepten-5-on (41,248 g; 0,200 Mol) auf einmal zu. Die erhaltene, tiefweinrote Lösung erhitzt man 22 h unter Rühren auf 100 + 1°C. Das Lösungsmittel destilliert man im Vakuum ab und verdünnt den Rückstand mit Wasser. Die erhaltene Mischung wird mit Methylenchlorid (1 χ 2ßO ml; 3 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden nacheinander mit Wasser (2 x~100 ml), gesättigter Salzlösung (1 χ 100 ml) gewaschen, durch wasserfreies Natriumsulfat filtriert und anschließend im Vakuum konzentriert, wobei man ein öl erhält, das beim Aufbewahren bei Raum-

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* β * S · 6 O Ο» ·*

-41-

temperatur fest wird. Die Ausbeute an braunen Kristallen beträgt 50,4 g (91,1%), Fp. 61 bis 66°C (unkorr.).

Eine Teilmenge davon (20,08 g) wird mit einer Ausbeute von 13,80 g (69,Ο5ό) umkristallisiert. Eine zusätzliche Kristallisation aus Methylenchlorid/Pentan liefert farblose Prismen, Fp. 72,5 bis 73,5⁰C (unkorr.). Elementaranalyse: C^g

berechnet; C 82,58% H 5,84% 0 11,58% ¹⁰ gefunden : 82,54 5,85.

Beispiel 4

Methyl-j^SH-dibenzo Γ a. d lcyclohepten-^-yliden) -acetat Man gibt Oxalylchlorid (2,665 g; 1,79 ml; 0,021 Mol) zu einer Suspension von (5H-Dibenzo[a,d]cycloh©pten-5-yliden)-essigsäure (5,000 gj 0,020 Mol) in trockenem Benzol (70 ml). Es erfolgt eine exotherme Reaktion und der Feststoff löst sich allmählich. Nach vollständiger Lösung wird die Mischung 1 h unter Rückfluß erhitzt, anschließend im Vakuum konzentriert, wobei man ein bernsteinfarbenes öl erhält, das beim Aufbewahren bei Umgebungstemperatur kristallisiert. Zu dem festen Säurechlorid gibt man 75 sal absolutes Methanol. Die Mischimg wird mit einem Magnetrührer gerührt, bis die Lösung vollständig ist_s und anschließend 45 min unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft, wobei man einen kristallinen Feststoff erhält. Die Ausbeute an rohem Ester, Fp. 83,5 bis 84,5°C (unkorr.), beträgt 5,210 g (99,31%). Umkristal- !isation dieses Produktes aus Methanol liefert farblose Stäbchen, Fp. 86,0 bis 86,5⁰C (unkorr.), in eX-ner Ausbeute von 3,508 g (66,86%).

ία

Μ/24 016 '

Elementaranalyse: ^c<j8^Hi4°2

5 berechnet: C 82,1*2% H 5,38% 0 12,20% . gefunden : 82,43 5,37.

Unter Verwendung dieses allgemeinen Verfahrens können weitere Ester, z.B. n-Propyl-, Isobutylester und dergl., hergestellt werden.

Beispiel 5

Die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen, die zeilvermittelte und humorale Immunreaktion auf spezifische Antigene zu modulieren, wird anhand des Murin-methylierten Rinderserumalbumin(MBSA)-Assays bestimmt, wobei das MBSA dazu verwendet wird, die verzögerte Hypersensitivitat bei Mäusen zu induzieren.

Der Assay wird folgendermaßen durchgeführt. Gruppen von 8 bis 10 männlichen C57B1/6 Mäusen (8 Wochen alt),

(Charles River) , werden durch eine subkutane Injektion von 0,1 ml einer 0,25%igen (normalen) oder 0,0025%igen (subliminalen) MBSA-Emulsion in Freund's komplettem Adjuvans (complete adjuvant) (Tag 0) in die Abdominalgegend sensibilisiert. 7 Tage nach der Sensibilisierung wird die rechte Hinterpfote subkutan mit MBSA (0,05% in 0,05 ml einer 0,9%igen Kochsalzlösung) gereizt, während an der linken Hinterpfote nur 0,9%ige Kochsalzlösung verabreicht wird, 24 h nach der MBSA-challenge werden die Volumina der Hinterpfoten durch Quecksilber-Plethysmographie ge-

Ή 1 Μ/24 016 - /ί2> .

messen.Das MBSA-induzierte ödem wird durch die Differenz zwischen dem linken und dem rechten Pfotenvolumen ausgedrückt. Arzneimittel oder Arzneimittelträger (Methylcellulose) verabreicht man oral in einem Volumen von 0,5 ml entweder einen Tag vor der Sensibilisierung, am Tag 2 nach der Sensibilisierung, 1 h vor der MBSA-Reizung oder 6 h nach der Reizung. Die Änderung (%) im Vergleich zu den Kontrolltieren wird aufgezeichnet und statistisch analysiert (ungepaart, Student's t-Test).

Im obigen Verfahren wurden die folgenden Verbindungen getestet: (5H-Dibenzo [a,d ]cyclohepten-5-yliden) -essigsäure (DCHA), Levamisol, Aspirin und Indomethacin. Bei subliminal sensibilisierten Mäusen ergab DCHA (0,1 bis 100 mg/kg) eine dosisabhängige Stimulierung (nicht signifikant) der verzögerten Hypersensitivität 1 h vor der Antigen-Reizung. Levamisol erhöhte das Ansprechen signifikant nur bei 1 mg/kg, wobei kein dosisabhängiger Effekt zu beobachten war. Indomethacin und Aspirin stimulierten das Ansprechen nicht; Indomethacin inhibierte das Ansprechen um 35% bei 0,33 mg/kg. Bei normal sensibilisierten Mäusen unter Verwendung ähnlicher Dosen stimulierten DCHA und Levamisol (1 mg/kg; -1 Std.-Behandlung) das verzögerte Ansprechen, wobei in diesem Fall die Erhöhung des An-Sprechens durch DCHA nicht dosisabhängig war. Indomethacin und Aspirin führten zu einer Inhibierung bei allen getesteten Dosen. Bei 10 und 100 mg/kg stimulierte DCHA das verzögerte Ansprechen sowohl

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einen Tag vor als auch zwei Tage nach der Sensibilisierung bei subliminal sensibilisierten Mäusen, wobei die Stimulierung bei einer Dosis von 10 mg/kg in beiden Fällen signifikant war. Im Gegensatz dazu zeigte Indomethacin bei Verabreichung einen Tag vor Sensibilisierung nur bei 9 mg/kg insignifikante Stimulierung. DCHA und Indomethacin wirken bei allen Dosen inhibierend, wenn man sie 6 h nach der Reizung subliminal sensibilisierten Mäusen verabreichte.

Diese Ergebnisse zeigen, daß DCHA in ähnlicher Yieise wie Levamisol, ein bekanntes Immunstimulans, in einem Assay wirkt, bei dem der Effekt der Arzneimittel auf zeilvermittelte Immunreaktionen gemessen wird. Die bekannten, nicht-steroiden, antiinf lamma torischen Mittel Aspirin und Indomethacin, zeigten entweder keine Stimulierung der zellvermittelten Immunität oder inhibierten dieses Ansprechen sogar. DCHA besitzt demgemäß neben seiner antiinflammatorischen Aktivität eine signifikante, stimulierende Wirkung auf die zellvermittelte Immunität, wohingegen Levamisol keine antiinflammatorische Aktivität besitzt,und Aspirin und Indomethacin keinen stimulierenden Effekt auf die zellvermittelte Immunität aufweisen.

Beispiel 6

Anhand des Tuberculin-induzierten, verzögerten Hypersensitivitäts-Tests an Meerschweinchen werden die gleichen Effekte wie bei dem in Beispiel 5 beschriebenen MBSA-Test, jedoch an einem anderen Tiermodell, geraessen.

·: 330800A

»β OCO

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Gemäß diesem Verfahren verwendet man Gruppen männlicher Hartley-Meerschweinchen (Charles River) mit einem Gewicht von 350 bis 400 g. Die Tiere werden mit 0,4 ml einer Emulsion sensibilisiert, die 1 Teil IFA (Difco) auf 1 Teil Antigen (M.tuberculosis H37 Ra in 0,9#iger Kochsalzlösung, Difco Labs.) unter Verwendung

enthält unterschiedlicher Antigenmengen (2 bis 200yug)/. Diese Suspension wird an vier verschiedenen Stellen, nämlich an beiden Vorderpfoten (subkutan) und an beiden Hüften (intramuskulär), injiziert. Nach 7 Tagen verabreicht man oral 1 h vor der Reizung in O,5$6iger Methy!cellulose suspendierte oder gelöste Arzneimittel. Die Antigen-Reizung durch 1000 Einheiten eines gereinigten Proteinderivats (PPD, Park Davis), die in 0,1 ml O,9#iger Kochsalzlösung in die rechte Hinterpfote injiziert werden. Die Messungen zur Bestimmung des Pfotenvolumens in ml werden unter Verwendung der Quecksilber-Plethysmographie zur Zeit Null (vor der Reizung) sowie 24 und 48 h später durchgeführt. Die prozentualen Änderungen im Vergleich zu den Kontrolltieren werden berechnet, wobei man den ungepaarten Student's t-Test zur Bestimmung der statischen Signifikanz verwendet.

Bei diesem T$st erhöhte DCHA (bei 10 und 100 mg/kg) signifikant das verzögerte Hypersensitivitätsansprechen nach 24 h bei subliminal sensibilisierten Meerschweinchen mit kleinem Volumina der Kontrollpfoten (etwa 0,1 ml), während es das Ansprechen bei normal sensibilisierten Tieren, deren Kontrollödem nach der

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Reizung > 0,35 ml ist, nicht beeinflußte. Levamisol (bei 10 und 100 mg/kg) zeigte ein variableres Wirkungsmuster unter Stimulierung der verzögerten Hypersensitivität bei 10 mg/kg, wenn das Kontrollödem etwa 0,2 ml betrug, und unter Inhibierung der verzögerten Hypersensitivität, wenn das Kontrollödem etwa 0,35 ml betrug.

Diese Ergebnisse stimmen mit den Wirkungen auf die zellvermittelte Immunität überein, die anhand des in Beispiel 5 beschriebenen MBSA-Assays für DCHA und Levamisol gefunden wurden.

Beispiel 7

Die Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen auf die ^umqrale Immunität wird anhand des Murin-Jerne-> Plaque-Assays bestimmt.

Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt. Am Tag 0 injiziert man Gruppen von 6 männlichen C57B1/6 Mäusen (Charles River; 8 Wochen alt) intraperitoneal eine 2#ige Suspension roter Blutzellen vom Schaf

(SRBC; 1 χ 10⁸ Zellen) in 0,5 ml einer 0,9#igen Kochsalzlösung. Arzneimittel oder Arzneimittelträger werden oral nach Tagesplan (Tage -1, Oy 2 oder 3) oder -

Mehrtagesplan (Tage 0 bis 3) verabreicht. Am Tag 4 entfernt man die Milz, wiegt sie, bestimmt die Lebensfähigkeit (Trypanblau-Exklusion) und bestimmt die Zahl der direkt Plaque-"bildenden Zellen (PFC) unter

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Verwendung der Methode von Cunningham [immunolgy, 14, 599-6Π1 (1968)]. Am Tag 4 wird das Serum· der Mäuse (behandelt am Tag 1) hinsichtlich der Antikörper gegenüber SRBC unter Verwendung einer Mikrotiter-Hämagglutinationstechnik untersucht. Arzneimittelinduzierte Änderungen werden als prozentuale Änderung gegenüber den Kontrollwerten ausgedrückt, wobei man die Daten unter Verwendung des ungepaarten Student's t-Tests analysiert.

DCHA (1 bis 100 mg Ag; oral) wurde anhand dieses Versuches'nach Tages- und Mehrtagesplänen untersucht. Bei Verabreichung am Tag 1 nach der Sensibilisierung inhibierte DCHA signifikant die Bildung von , Plaque- bildenden Zellen bei 1 mg/kg (31%) und 100 mg/kg (58%). DCHA reduzierte auch die piaque-fzellen signifikant um 25% bei Verabreichung am Tag 3· Bei Verabreichung am Tag 0, Tag 2 oder den Tagen 0 bis 3 war kein signifikantes Ansprechen zu beobachten. Bei Mäusen, denen man DCHA am Tag 1 verabreichte, war keine Änderung der Serum-Antikörper-Titer auf rote Blutzellen vom Schaf am Tag 4 gegenüber den Kontrolltieren zn beobachten.

Diese Ergebnisse zeigen, daß Verbindungen, wie DCHA, die Antikörperproduktion inhibieren, aber die Serum-Anti-rote Blutzellen (von Schaf) -Antikörper nicht be·^· einflussen. Dieses bedeutet, daß diese Verbindungen die humorale Immunität inhibieren, zumindest einen Effekt auf die Milz ausüben, obwohl dieser Effekt auf

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andere Lymphgewebe unklar ist. Es ist festzuhalten, daß Webb und Osheroff [Proceedings of the National Academy of Sciences, 73, 1300-1304 (1976)] zeigten, daß die humorale Immunität an Mäusen erhöht wurde, die mit Indomethacin zum Zeitpunkt der Antigen-Sensibilisierung behandelt wurden. Dieser Effekt wurde der Entfernung von PGEg, dem wichtigsten Arachidonsäure-Metaboliten, der die humorale und zellvermittelte Immunität reguliert, zugeschrieben. Die NSAID-Verbindungen, wie Indomethacin, beeinflussen deshalb sowohl die zelluläre als auch die humorale Immunreaktion bei Tieren durch Reduktion der Prosta-» glandinspiegel, wohingegen Verbindungen, wie DCHA, echte immunmodifizierende Eigenschaften aufweisen.

Beispiel 8

Die Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen auf das autoimmune Ansprechen wird anhand des experimentellen Encephalomyelitis-Allergie (EAE)-Tests bestimmt. Dieses Verfahren mißt die Fähigkeit der Arzneimittel, das autoimmune Ansprechen (T-zellvermittelt) zu inhibieren,und liefert eine Basis, um die Aktivität gegenüber solch neurologischen Autoimmunstörungen, wie Multiple Sklerose, vorauszusagen.

Der Test wird folgendermaßen durchgeführt. Gruppen .

von 10 männlichen Lewis-Ratten (Charles Riverj 170 bis 190 g) injiziert man in die rechte Hinterpfote subkutan 0,1 ml einer Emulsion, die 200 mg isologes Rückenmark und Mycobacterium tuberculosis (2 mg/ml)

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enthält. Die Arzneimittel werden oral in O,5#iger Methylcellulose entweder täglich, beginnend am Tag der Injektion der Emulsion (Tag O) bis zum Tag 14 ohne die Wochenenden, oder periodisch an den Tagen -2, -1 und O verabreicht. Aszendierende, motorische Paralyse ist am Tag 10 zu beobachten. Eine quantitative Bewertung der Paralyse ©rfolgt zwischen den Tagen 11 und 14, wobei die während dieses Zeitraums erzielte höchste Bewertung zur Berechnung der Arzneimittelwirkung unter Verwendung des ungepaarten Student's t-Tests verwendet wird. Folgendes Bewer-

15 tungssystem wird verwendet: O - keine Anzeichen;

1 - Verlust von > 20 g Körpergewicht und mangelnde Körperpflege; 2 - tail flop; 3 - Paralyse der Hinterpfoten; 4 - Paralyse der Vorder- und Hinterpfoten; und 5 - in sterbendem Zustand oder tot,

DCHA und Dexamethason (ein steroides, antiinflaxnmatorisches Arzneimittel) wurden oral an den Tagen 0 bis 14 verabreicht; die Ergebnisse sind in Tabelle

zusammengestellt. 25

ω
οι

ω
ο

to

Behandlung

Orale Dosis
(mg/kg)

normal —·.

Kontrolle (EAE) —
DCHA 10

30
90

Dexamethason O»1

Tabelle

Körpergewicht(g) Paralysebewertung % Änderung

Tag O bis 14 Tag 11 bis 14 gegenüber

Mittelwert +S.A. Mittelwert +S.A. ά.Kontrolle

Paralysefälle

+ 10 32+9 11 +

18 +
41 +

19 +

3 3 6 8

2,1 + 0,4 2,1 + 0,2 2,1 + 0,1 1,4 + 0,3 0,9 + 0,3

^a höchste beobachtete Bewertung während der vier Tage, ^b 10 Ratten für Jede Dosis
⁺ P * 0,05

-33 -57^H

9/10

10/10

7/10

5/10

ro

_Λ

σ»

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Diese Ergebnisse zeigen, daß DCHA (90 mg/kg) eine
nicht signifikante Reduzierung der Paralyse bewirkte und daß die Tiere einen geringeren Gewichtsverlust
erlitten als die EAE-Kontrolltierej Dexamethason inhibierte die Paralyse signifikant, verbunden mit einem größeren Gewichtsverlust gegenüber den Kontrolltieren.

Bei Verabreichung von DCHA, Levamisol und Indomethacin an den Tagen -2, -1 und 0 vor der Antigen-Verabreichung wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse erhalten.

co
σι

ω
O

^c Δ
Körpergew,
Tag 0 bis
Mittelw.+

fcO
O

starben vor '

1-·
σι

►-·
O

6/6

05

Todes
fälle

-

3

*

21+7

Tabelle 2

Tag 7

10/10
9/10
8/10

01
001

0/6

O
cn

Behandlung

Orale Dosis
(mg/kg)

22 + 5
4 + 8
1+4

Paralyse-
,(g) bewertung
14 Tag 11-14
S.A. Mittelw.+S.

% Änderung Paralyse
gegenüber fälle
d.Kontrolle
,A.

10/10
10/10
7/10

0/10
0/10
0/10

Kontrolle

•

2 + 4
4 + 6
11+6

3,8 + 1,7

•

10/10
10/10
am

1/10
2/10
1/10

DCHA

1
10
100

10 + 5
¹ Ξ 7 ■

3,0 + 0,3
2,3 + 0,4
1,7 + 0,3

0/10
1/10.
5/6^b

Levamisol

1
10
100

3,3 + 0,4
2,6 + 0,4
1,9+ 0,5

-13
-32,
-5O⁺

Indomethacin

1
3
9

2,1 + 0,2
3,2 + 0,4

III,
-45
,-16

^a höchste beobachtete Bewertung während der vier Tage

+ P^O,

^b Toxizität ·

++P^O,
+++ P * 0,

- alle Tiere

6 bis 10 Ratten für jede Dosis

24 1 M/24 016

• Die Ergebnisse zeigen, daß DCHA (1 bis 100 mg/kg) bei Verabreichung an den Tagen -2, -1 und O vor der Antigen-Gabe signifikant /Paralyse in Abhängigkeit von der Dosis inhibiert. Levamisol (1 bis 100 mg/kg; oral) zeigte ähnliche Ergebnisse, wohingegen Indomethacin die Paralyse signifikant nur bei 1 mg/kg inhibierte« Die Dosis von 9 mg/kg Indomethacin war toxisch (5/6 Tiere starben an perforiertem IntestineIuIcus bis zum Tag 7 nach der Antigen-Verabreichung).

Verbindungen, wie DCHA, zeigen demnach signifikante Aktivität bei der Inhibierung der Autoimmunreaktion an dem Modell der EAE-Autoimmunerltrankung.

Bei sr> i e 1 9

Der Mitogen-aktivierte Murin T- und B-Lymphozyten-Proliferationstest wird zur Bestimmung der Wirkung von immunmodulierenden Mitteln auf die Proliferation von Murin T- und B-Zellpopulationen verwendet. Man führt den Test durch, um zu bestimmen, ob die getesteten Verbindungen die Proliferation von T-Zellen, deren Proliferation anfänglich durch ein Mitogen,

wie Concavalin A (Con A), stimuliert wurde, und die Proliferation von B-Zellen, deren Proliferation durch ein Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurde, erhöhen oder verringern.
30

Der Test wird folgendermaßen durchgeführt. T-Lymphozyten werden aus der Milz von männlichen CBA/J- oder NZB-Mäusen isoliert. Man stellt Zellhomogenate in

M/24 016

Hank¹s balances salt solution (HBSS) her. Nach Entfernung der größeren Teilchen und wiederholtem Waschen der Zellen in HBSS werden diese in minimum essential medium (MEM) suspendiert und über eine Säule aus Glaswolle gegeben, um Makrophagen zu entfernen. Die Zellen werden dann auf einer Säule aus Nylonwolle bei 37⁰C, 9596 Luft, 5% CO₂ während 45 min inkubiert. Die nicht-adhärenten T-Lymphozyten werden dann von der Säule eluiert, gezählt und auf einen Gehalt von 20 χ 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Mit 50 yül Zellen legt man 48 h eine Kultur (37⁰C, 95% Luft, 5% CO₂) mit einer Verbindung oder mit einer Verbindung und Mitogen (0,025, 0,04 oder 0,05/Ug/Kultür Concavalin A) an, ehe man die letzten 16 h 0,5/uCi ^H-Thymidin zugibt. Das Gesamtvolumen des Kultursystems beträgt 200 /ul. Die Zellen werden dann mit Hilfe eines automatischen Probensammlers (Mash II) geerntet und die Glasfaser-Filterscheiben in 10 ml Xylol-Base-Szintillationsflüssigkeit gegeben. Man zählt dann 1 min mit einem Szintillationszähler für Flüssigkeiten. Die Ergebnisse werden als CPM + SE ausgedrückt. Man stellt dann einen Vergleich her zwischen den für die Kontrollkulturen und für die Kulturen, die eine Verbindung allein oder eine Verbindung und Concavalin A enthalten, erhaltenen Zählungen.

Um zu bestimmen, ob aktive T-Lymphozyten-Stimulantien einen Effekt auf die B-Lymphozyten-Proliferation ausüben, verwendet man ein Mitogen-Assaysystem, bei dem man das B-ZeIl-Mitogen Idpopolysaccharid (LPS) in der

20

30

Αβ Λ *

1 Μ/24 016

Kultur verwendet. Da man selbst mit einem B-ZeIl-Mitogen T-Zellen im Testsystem benötigt,.um B-Zellen zur Proliferation zu veranlassen, verwendet man angereicherte T-Zellen für diese Kulturen, worin für diesen Assay die optimale Verteilung der Zellen von 9096 T-Zellen und 10% B-Zellen beibehalten wird. Die zusammen mit den Verbindungen in diesen Kulturen verwendete LPS-Konzentration ist 1 /Ug/Kultur (nahezu optimal), so daß die Wirkungen dieser Verbindungen auf die B-Zellen-Proliferation eindeutig gezeigt werden kann.

35

ω CJl	ω ο	to CJl	01	O	Tabelle	1-· CJi	C	>	!+ 1+	429 770	C	),004	+	716	>	C	,05	+	1042	1—'	M/24 <	ff
			1				+	363			+	1261				+	3059
Verbindung	Konzentration der Verbindung (/Ug/Kultur)	0			CPM + S.A. Concavalin A-Konzentration	+	1416			+	1196		( /Uß/Kultur)		+	711
	0 0,			O₁02 \					+	392				+	1392
DCHA	0,	05		3804 ⁺7903			13	643	+	650		296	+	2162
	1,	1		6563			20	214	+	1121		141	+	674
	0	0	⁺8538			19	873			866
DCHA	0,	0				14	415		19	126		S
	0,	0				12	8$7		⁺32	465
	1,				⁺9	560		⁺29	011
	2,				18
	3,			22
			⁺13

Ρ<Ό,05,

9 » · λ

M/24 016

Tabelle 3 (Fortsetzung)

Verbindung

Konzentration d.Verbindung CuI tür)

(/ug/Ki

CPM + SE

Lipopolysaccharid-Konz. (yug/Kultur) ¹ 1.0

DCHA

0 29 978 + 3956

0,001 ⁺83 712 + 1096

0,01 ⁺86 725 + 3824

0,1 ⁺81 010 + 6486

1,0 ⁺71 382 + 5170

⁺P <0,.05

Diese Ergebnisse zeigen, daß "bei suboptimaler Konzentration an Concavalin A (0,025/Ug/Kultur) DCHA die T-Zell-Proliferation bei 0,01, 0,1 und 1,0/Ug/Kultur stimuliert. In gleicher Weise stimuliert DCHA die B-ZeIl-Proliferation in Gegenwart von 1/Ug/Kultur Lipopolysaccharid bei 0,001, 0,01, 0,1 und 1yUg/Kultur. Beim Test in Gegenwart von 0,04 und 0,05/ug/KuItür Concavalin A zeigt DCHA T-ZeIl-Proliferation bei 0,05, 0,1 und 1,0 /Ug/Kultur bzw. bei 0,05, 0,1 und 2/ug/Kultür. Bei Anwesenheit von 0,04 und 0,05/Ug/Kultür an Concavalin A inhibiert DCHA die T-Zell-Proliferation bei 2 und 3/Ug/Kultur bzw. bei 1 und 3 Aig/KuItür. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine dosisabhängige Stimulierung der Zellproliferation und eine Inhibierung der T-Zellen-Proliferation bei einer Dosisobergrenze vorliegen, was für viele Immunmodifikatoren charakteristisch ist.

* W Λ

M/24 016 1

Die experimentellen und Testassay-Ergebnisse zeigen, daß das signifikante, nicht-steroide, antiinflammatorische Mittel, (5H-Dibenzo[a,d]cycloheptan-5-yliden)-essigsäure, ein imraunmodulierendes Mittel mit signifikanter Aktivität ist, das eine deutliche Wirkung auf die zelluläre und humorale Immunreaktion zeigt,

10 welche derjenigen des bekannten Immunostimulans

Levamisol sehr ähnlich ist. Diese Eigenschaften machen die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen nicht nur zur Behandlung immumologisch induzierter, entzündlicher Bindegewebserkrankungen, wie rheumatischer Arthritis und systemischem Lupus erythematodes, sondern auch zur Behandlung von autoimmün-assoziierten Störungen, wie Multipler Sklerose und hämolytischer Anämie, sowie zur Behandlung von Erkrankungen, deren Ä'tiologie und/oder Verlauf in Zusammenhang mit der T-Zellfunktion, und T- und B-Zellfunktion steht, wie neoplastischen und metastatischen Erkrankungen, brauchbar. Die iiranunmodulierende Wirkung steht in deutlichem Gegensatz zum Wirkungsprofil üblicher, antiinflammatorischer Arzneimittel, wie Aspirin und Indomethacin, die keine direkte

25 immunmodulierende Aktivität aufweisen und die die zelluläre und humorale Immunreaktion nur durch die Reduktion des Prostaglandinspiegels beeinflussen.

Claims

10 Patentansprüche

worin R ein Wasserstoff atom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R¹ ein V/asserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, und der pharmazeutisch verträglichen Salze davon« zur Modulation der Immunreaktion bei Mensch

25 und Tier.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin R und R ein V/asserstoffatom bedeuten.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin R eine Äthylgruppe und R ein Wasserstoffatom bedeuten.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin R ein Wasser-

stoff a torn und R¹ eine Methylgruppe bedeuten.

5. Pharmazeutisches Mittel zur Modulation der Immunreaktion bei Mensch und Tier, enthaltend mindestens eine Verbindung der Formel I, gegebenenfalls in Kombination mit üblichen pharmazeutischen Trägern und Hilfsstoffen.